agalactiae (S. agalactiae), Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli (E. coli), Streptococcus uberis (S. uberis), Streptococcus

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Meme başı kanalı kaplayıcıları ve vitamin E nin, kuru dönem yeni enfeksiyonlara karşı koruyucu etkinliğinin araştırılması Prof. Dr. Ayhan BAŞTAN Araş. Gör. Mehmet CENGİZ Araş. Gör. Dr. Duygu Baki ACAR Doç. Dr. Örsan GÜNGÖR Yard. Doç. Dr. Erhan ÖZENÇ Araş. Gör. Dr. Ömer KORKMAZ Vet. Hek. Berkant TOPUZOĞLU Vet. Hek. Burcu TOPUZOĞLU Araş. Gör. Mert POLAT Proje Numarası: Başlama Tarihi: 2008 Bitiş Tarihi: 2009 Rapor Tarihi: 2010 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara 2010

2 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Proje adı: Meme başı kanalı kaplayıcıları ve vitamin E nin, kuru dönem yeni enfeksiyonlara karşı koruyucu etkinliğinin araştırılması. Project title: Evaluation of the protective effects of internal teat sealent and vitamin E against new dry period infections. Özet: Bu çalışma sağmal inek sayıları, yıllık ortalama yem tüketimleri ve süt verimleri birbirine yakın 3 ayrı süt inekçiliği işletmesinde yürütüldü. Çalışmada, kuru dönem başlangıcındaki 187 adet inekten bakteriyolojik muayene için 748 adet süt örneği toplandı. Doksanbeş inekten alınan süt örneklerinden yapılan bakteriyolojik muayenede, negatif 322 adet meme lobu çalışmaya alındı. Bakteriyolojik negatif meme lobları kendi içinde 8 gruba ayrıldı. Birinci gruptaki (K) meme loblarına sadece meme içi kaplayıcı (Orbeseal, Pfizer Hayvan Sağlığı, Dublin, İrlanda), 2. gruptakilere (A) sadece meme içi kuru dönem antibiyotik (Orbenin DC, Pfizer Hayvan Sağlığı, San Michael, İtalya), 3. gruptakilere (KE) meme içi kaplayıcı ve 3000 IU vitamin E (Selen E Sol, Richter Pharma AG, Wels, Avusturya), 4. gruptakilere (AE) meme içi antibiyotik ve vitamin E, 5. gruptakilere (KA) meme içi kaplayıcı ve meme içi antibiyotik, 6. gruptakilere (AKE) meme içi antibiyotik, kaplayıcı ve vitamin E, 7. gruptakilere (E) yalnızca vitamin E kullanıldı. 8. grup (Kont.) ise kontrol grubu olarak düzenlendi ve herhangi bir uygulama yapılmadı. Doğum sonrası laktasyon başlangıcında yapılan bakteriyolojik muayenede, AKE grubu kuru dönem yeni meme içi enfeksiyonların en az görüldüğü gruptu (P<0,05). Kuru dönem başlangıcında meme içi enfeksiyonlardan koruma amacıyla uygulanan meme içi kaplayıcıların yeni enfeksiyonları önlemede oldukça etkili olduğu belirlendi (P<0,05). Kuru dönem meme içi antibiyotik uygulamasının, çevresel etkenlere karşı yeterli bir koruma sağladığı görülürken, bulaşıcı etkenlere karşı tek başına yeterli koruma sağlamadığı belirlendi. Vitamin E ise bulaşıcı mastitis etkenlerine karşı etkili, çevresel bakterilere karşı ise etkisiz bulundu. Sütte en yüksek alfa- tokoferol yoğunluğu AKE grubunda saptandı (P<0,05). Sonuç olarak, vitamin E ve meme içi kaplayıcıların antibiyotiklerle birlikte kullanıldığında, kuru dönem yeni meme içi enfeksiyonları önlemede etkili olduğu belirlendi. Abstract: This study was carried out in 3 dairy farms which had similar milk production, feding consumption and population. Seven hundered forty six milk samples were collected

3 from 187 cows, at the beginning of dry period for bacteriologic tests. According to the test results, uninfected 322 mammary quarters from 95 cows were taken for the study. These quarters were divided into 8 groups. In group 1 (K) intramammary teat sealent (Orbeseal, Pfizer Animal Health, Dublin, Ireland) were applied to the mammary quarters, in group 2 (A) intramammary dry cow antibiotic (Orbenin DC, Pfizer Animal Health, San Michael, Italy), in group 3 (KE) the teat sealent and 3000 IU vitamin E (Selen E Sol, Richter Pharma AG, Wels, Austria), in group 4 (AE) the antibiotic andvitamin E, in group 5 (KA) the teat sealent and antibiotic, in group 6 (AKE) the antibiotic, teat sealent and vitamin E, in group 7 (E) only vitamine E were used. Group 8 was designed to be control group any treatment was not used. Bacteriologic examination results showed that, group AKE were the most successful group against new dry period infections (P<0,05). The teat sealent that used at the beginning of dry period were effective (P<0,05). The antibiotic treatment that was an usual protective protocol were found effective against environmental pathogens but it was unsufficient against contagious pathogens. Vitamin E administration was obtained to be effective against contagious pathogens bu it didn t maintain enough protection against environmental bacteria. The highest milk alpha-tocopherol (α-tocopherol) concentrations were measured in group AKE. In conclusion, vitamine E and teat sealent together with antibiotic treatment maintained a good protection against new dry period infections and it must be used definitely although its expense. II. Amaç ve Kapsam

4 Mastitis, süt inekçiliği işletmelerinde uzun bir süreden beri bilinen, değişik mikroorganizmaların neden olduğu ve günümüzde hala önemini koruyan pahalı bir sürü hastalığıdır. Mastitis, ister klinik, ister subklinik formda olsun, süt üretimindeki azalma ve kalitesindeki düşme, ilaç, veteriner, laboratuvar masrafları ve sürüden çıkarmadan dolayı büyük ekonomik kayba neden olmaktadır (Hogeveen ve Osteras, 2007). Mastitise neden olan patojenler bölgesel farklılık göstermekle birlikte, yapılan çalışmalarda Streptococcus agalactiae (S. agalactiae), Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli (E. coli), Streptococcus uberis (S. uberis), Streptococcus dysgalactiae (S. dysgalactiae) ve koagulaz negatif stafilokoklar (KNS) en sık rastlanan mastitis patojenleri olarak bildirilmiştir (Oliver ve Mitchel, 1984; Wilson ve ark., 1997; Dingwell ve ark., 2002; Olde Riekerink ve ark., 2008). Coğrafik özellikler, yönetim şekli, ahır düzeni, laktasyon dönemi gibi faktörler, mastitis patojenlerinin yaygınlığı ve enfeksiyon insidensi üzerine etkili bulunmuştur. Bağlı sistem işletmelerde, S. aureus, S. uberis ve KNS kaynaklı mastitislere sık rastlanırken, serbest dolaşımlı işletmelerde Klebsiella spp. ve E. coli daha sık izole edilmektedir (Olde Riekerink ve ark., 2008). Laktasyon döneminin aksine, kuru dönemde yeni meme içi enfeksiyonların asıl nedeni olarak koliformlar ve S. agalactiae dışındaki streptekoklar gösterilmektedir (Oliver, 1988; Dingwell ve ark., 2004). Bunlara ek olarak, geleneksel mastitis kontrol programları uygulayan işletmelerde, son 40 yılda kontagiyöz mastitis patojenlerine bağlı mastitis insidensinde azalma görülürken, E. coli ve S. uberis gibi çevresel kaynaklı bakterilere bağlı mastitis oranında önemli artış olduğu bildirilmiştir (Bradley ve Green, 2004). Bu açıklamalardan da anlaşıldığı üzere çevre, mikroorganizma, inek ve sürü yönetimi arasında sıkı bir etkileşim söz konusudur. Meme bezi fizyolojik, immunolojik ve biyokimyasal değişikliklerin şekillendiği karmaşık bir organdır. Bir meme bezi, laktasyon siklusu boyunca involusyondan kolostrogeneze, laktogenezden laktasyona, laktasyondan involusyona olmak üzere üç ayrı fizyolojik değişikliğe uğrar. İneklerde kuru dönem ise, meme bezinde biyokimyasal ve hücresel değişikliklerin gözlendiği bir geçiş sürecidir. Meme bezi, involusyon ve kolostrogenez ile ilişkili olarak kuru dönem başlangıcında ve sonunda özellikle yeni meme içi enfeksiyonlara karşı oldukça duyarlıdır. Kuruya çıkışta süt yapımı, meme involusyon hızı, meme başının durumu ve meme başı kontaminasyonu gibi faktörler enfeksiyon riskini etkilemektedir (Oliver ve Sordillo, 1989; Dingwell ve ark. 2004).

5 Genellikle mastitise yol açan enfeksiyon etkenlerinin memeye girişi kuru dönemde (özellikle kuru dönem başı ve sonunda) olmakta ve izleyen laktasyon döneminde vücut savunma sisteminin zayıflamasıyla klinik mastitislere yol açmaktadır. Bu etkenler süt kalitesinin bozulmasından sürüden çıkarmaya kadar giden pek çok olumsuzluklara sebep olmaktadır. Bu nedenden dolayı kuru dönem antibiyotik tedavisi, mastitis korunma protokolünün değişmez parçası olmuştur (Huxley ve ark., 2002; Bansal ve ark., 2007; Williamson ve ark., 1995). Fakat bu korunma yöntemi etkili olduğu kadar da ekonomik maliyeti olan bir işlemdir. Son zamanlarda kuru dönem antibiyotik tedavisine alternatif olabileceği düşüncesiyle, meme içi kaplayıcılar geliştirilmiş, bu preparatlar kuru dönemde antibiyotiklerle birlikte kullanılmış, birlikte etkili olmasına karşın, işletmenin giderlerini arttırdığı belirlenmiştir. Meme içi film tabakasının tek başına etkili olduğunun kanıtlanması durumunda, antibiyotik tedavisine, alternatif olabilecek ucuz bir yöntem olacağı düşünülmektedir. Hatta meme başı kanalı kaplayıcılarının kullanıldığı çalışmalarda, uygulama yapılamayan gruplara göre, kaplayıcı kullanılan gruplarda somatik hücre sayısının %25 daha az olması, eldeki bilgilerin yetersiz olmasına rağmen, alternatif olabileceği düşüncesini desteklemektedir (Berry ve ark., 2003; Godden ve ark., 2003; Cook ve ark., 2004; Sanford ve ark., 2006; Bradley ve ark., 2007). Vitamin E, organizmada fagositik etkinliği arttırarak, savunma sistemini güçlendiren bir vitamindir. Ayrıca dokuları oksidatif hasara karşı da korumaktadır. Meme savunma sistemi kuru dönemde ve laktasyon dönemi başlangıcında zayıflamakta, bu dönemde kullanılan vitamin E meme savunma sistemini güçlendirerek, mastitis oluşumunu önleyebilmektedir (Hogan ve ark., 1993; LeBlanch ve ark. 2002; Weiss ve ark., 2002; Moeini ve ark., 2009). Meme içi kaplayıcılarının, ülkemizde işletme bazında kullanımı henüz yaygın değildir. Bu maddelerin kuru dönemde yeni meme içi enfeksiyonları önlemek için ülkemizde yapılan bilinen ilk çalışma olmakla birlikte, etkileri konusundaki bilgiler de sınırlıdır. Çalışma, bu konudaki bilgilerin zenginleştirilmesine katkı sağlamak amacı ile planlanmıştır. Bu çalışma planlanırken şu çıktılar amaçlanmıştır; 1) Meme başı kanalı kaplayıcılarının yeni enfeksiyon girişini engellemedeki etkinliğinin belirlenmesi, meme içi antibiyotik uygulamasına alternatif olup olamayacağının ortaya konması, daha ekonomik olan bu yöntemin, diğer yöntemlere alternatif olabileceğinin kanıtlanması durumunda, meme başı kaplayıcılarının mastitis korunma protokolü

6 içerisinde yer alması için işletmelerin bu konuda bilgilendirilmesi ve bu maddelerin kullanımının özendirilmesi. 2) Yapılması planlanan çalışma sonrasında vitamin E prekürsörü α-tokoferole ait parametreler ile yeni meme içi enfeksiyon oranı arasında anlamlı ilişkinin olup olmadığının ortaya konması, enjeksiyon tarzında uygulanan E vitamininin bakteriyolojik üreme olmayan meme loblarında kan süt bariyerinden hangi oranda memeye geçtiği, ne kadar süre koruyucu etkinliğini sürdürdüğünün belirlenmesi ve sonuç olarak Vitamin E nin mastitis korunma protokolünde yer alıp alamayacağının ortaya konması. 3) İşletmelerde somatik hücre sayısı düşük, kaliteli, süt üretimine yönelik gerçekçi ve yeni stratejilerin oluşturulması ve bu stratejiler izlenerek mastitisten kaynaklı ekonomik kayıpların önüne geçilmesi. 4) Bu çalışmada elde edilecek verilerin mastitisten korunmada etkili bulunduğu durumda, normal süt üretimi yapan işletmeler yanında ülkemizde henüz kurulan, organik süt üretimi yapan işletmelerinde meme içi kaplayıcı kullanımının teşviki ve bu anlamda gerekli bilimsel desteğin sağlanması. Bu amaçlar doğrultusunda süt inekçiliği işletmelerindeki inekler bu çalışmanın kapsamını oluşturmuştur. III. Materyal ve Yöntem Bu çalışma sağmal inek sayıları, yıllık ortalama yem tüketimleri ve süt verimleri birbirine yakın 3 ayrı süt inekçiliği işletmesinde yürütülmüştür. Çalışmada, kuru dönem başlangıcındaki 187 adet inekten bakteriyolojik muayene için 748 adet süt örneği toplanmıştır. Kuru dönem başlagıcında yapılan bakteriyolojik muayenede 95 ineğe ait, bakteriyolojik yönden negatif (herhangi bakteri izole edilmeyen) 322 adet meme lobu çalışmaya alınmıştır. Doğumdan sonra, çalışmaya alınan meme loblarından, bakteriyolojik muayene ve vitamin E analizi için tekrar süt örnekleri toplanmıştır. Bakteriyolojik muayeneler, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı laboratuarında, vitamin E analizleri Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı HPLC laboratuarında yapılmıştır.

7 Süt inekçiliği işletmelerinin belirlenmesi Çalışmanın yürütüleceği işletmeler, sağmal hayvan sayılarına, yıllık süt verimi ortalamalarına ve rasyon düzeylerine bakarak belirlendi ve araştırma süt verimi ortalamaları bir yıl boyunca litre/gün arasında değişen, rasyonları başlıca mısır silajı, yonca, saman ve konsantre yemden oluşan, sağmal hayvan sayıları arasında değişen 3 adet süt inekçiliği işletmesinde yürütüldü. Bu işletmelerde kayıtlar düzenli tutulmakta, sağımlar sağım makinaları ile yapılmakta ve düzenli olarak kuru dönem mastitis programları düzenli takip edilmekte idi. Ayrıca her üç işletmede de tam zamanlı çalışan veteriner hekimler vardı. Çalışmaya alınacak hayvanların ve meme loblarının belirlenmesi Holştayn ve Holştayn melezi, 3 yaşından büyük, en az 1 doğum yapmış, kuru dönem uzunluğu gün arasında değişen, 4 meme lobu işlevsel, klinik mastitis bulgusu göstermeyen, tedavi başlangıcından önceki 30 gün boyunca antibiyotik ve antienflamatuar tedavi görmemiş inekler çalışmada kullanıldı. Bu şartlara uyan 187 adet inekten 748 adet süt örneği steril şekilde toplandı. Bakteriyolojik muayene sonucunda 95 inekten üremenin olmadığı 322 adet meme lobu çalışmaya alındı. Süt örneklerinin toplanması Süt örnekleri National Mastitis Council (NMC) (Harmon ve ark., 1990) tarafından bildirilen şartlarda steril bir şekilde toplandı. Meme başları dışkı ve çamurla bulaşık ise ılık su ile yıkandı ve kağıt havlular ile kurulandı. Temiz meme başlarına ise herhangi bir yıkama işlemi yapılmadı. Meme başlarının asepsisi için %70 isopropil alkol kullanıldı. Örnek almadan önce alkol emdirilmiş pamuk ile meme başları silindi, asepsi işlemine daima uzak meme loblarından başlandı. İlk birkaç sağım süt bir kaba sağıldıktan sonra, 15 ml lik steril plastik tüplere (LP ITALIANA, katolog no: , İtalya) yaklaşık 10 ml kadar süt örnekleri toplandı. Örneklemeye daima yakındaki meme loblarından başlandı, örnekleme sırasından çevresel kontaminasyonu engellemek için tüpler meme başına yaklaşık 45 eğimle yaklaştırıldı. Tüp üzerine hayvanın kulak numarası ve meme lobu yazıldı ve soğuk zincirde laboratuara götürüldü. Vitamin E ölçümü için toplanan sütlerde steril olma şartı aranmadı. Meme başları dışkı ve çamur ile bulaşıksa yıkandı ve kağıt havlularla kurulandı. Eğer meme başları kirli değilse herhangi bir yıkama yapılmadı. Birkaç sağım süt dışarı atıldıktan sonra 15 ml lik plastik tüplere (LP ITALIANA, katalog no: , İtalya) yaklaşık 10 ml süt örneği

8 toplandı. Toplanan sütler daha sonra vitamin E prekürsörü olan α- tokoferol ün analizi için - 80 C de muhafaza edildi. Bakteriyolojik muayene için süt örneklemeleri kuru dönem başlangıcında, doğum sonrası 3-5 ve günler arasında toplam 3 kez yapıldı. Alfa-tokoferol analizi için süt örneklemesi sadece doğum sonrası 3-5. günler arasında 1 kez yapıldı. Bakteriyolojik muayene Süt örneklerinin bakteriyolojik muayenesi NMC (Harmon ve ark., 1990) de belirtilen protokollere göre yapılmıştır. Örnekler oda ısısında homojenize edildi, steril öze yardımıyla %6 koyun kanı içeren kanlı agara ve MacConkey agara ekildi (0,01mL). Ekim yapılan pileytler 37 C de saat inkubasyona bırakıldı. Elde edilen koloniler gram boya ile boyandı ve gram pozitif kolonilere katalaz testi uygulandı. Katalaz pozitif koloniler Staphylococcus spp, katalaz negatif koloniler Streptococcus spp. olarak kabul edildi. Staphylococcus aureus ve koagulaz negatif stafilokokları (KNS) ayırt etmek için koagulaz testi uygulandı. Koagulazı hidrolize eden bakteriler S. aureus olarak kabul edildi. Streptococcus spp. koloni morfolojilerine, hemolitik özelliklerine, CAMP (Cristie, Atkins, Munch-Peterson) testi sonuçlarına, Lancefield serogruplandırmaya, eskulin ve hippuratı hidrolize etme yeteneklerine göre ayırt edildi. Escherichia coli katalaz, indol, metil red ve laktoz testlerine verdiği pozitif reaksiyonlarla ayırt edildi. Bacillus spp. ve Corynebacterium bovis kanlı agardaki koloni morfolojilerine göre ayırt edildi. Süt örneklerinde alfa-tokoferol analizi Süt örneklerinde α-tokoferol analizi Rammell ve ark. (1983) tarafından bildirilen metoda göre yapılmıştır. Bu analizde α-tokoferol ekstraksiyonu Wheaton tüpler içerisinde gerçekleştirilmiştir. Süt örneklerindeki yağların sabunlaştırılması için, tüp içerisine 2 ml etanol, 1 ml metanol, 1 ml KOH (10 M), alfa-tokoferol oksidasyonunu engellemek için 1 ml askorbik asit (%15) kondu. Hazırlanan karışıma analizi yapılacak süt örneğinden 1 ml ilave edildi ve 10 sn vortekslendi. Vortekslenen örnekler 60 C de 10 dk süreyle su banyosunda bekletildi. Süre sonunda su banyosundan alınan karışım tekrar 10 sn vortekslendi ve su banyosuna kaldırıldı. Bu işlem art arda 3 kez tekrarlandı. Örnekler su banyosu işlemi sonunda tekrar vortekslenip buz kabında hızlı soğumaya bırakıldı. Yaklaşık 5 dk buz kabında bekletilen karışım üzerine 5 ml hekzan eklendi, 10 sn vortekslendi ve 2 dk kuvvetlice çalkalandı. Homojenize edilen karışım 4 C de 500 G de 3 dk santrifüj edildi. Ardından karışım üzerinde kalan berrak hekzan fazı cam enjektör ile 20 ml lik cam vial içerisine

9 toplandı. Hekzan fazı içerisinde çözünmüş α-tokoferol ün elde edilmesi için, hekzan fazı 60 C vakumlu etüvde uçuruldu. Cam vial içerisindeki kalıntının çözdürülmesi için 1 ml metanol eklendi ve 10 sn çalkalandı. Vial içerisindeki metanol plastik enjektör yardımıyla toplandı ve 0,2 µl filtrelerden geçirilerek 2 ml lik plastik tüplere alındı. Ölçüme hazır hale gelen örneklerden, 0,1 ml alınarak yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) cihazına yüklendi ve sonuçlar floresan detektörde mg/l biriminde okundu. Çalışmada kullanılan ilaçlar Çalışmada kuru dönem meme içi antibiyotik, meme içi kaplayıcı ve dl-α tokoferol içeren preparatlar kullanıldı. Meme içi antibiyotik olarak, mineral yağ ile formüle edilmiş, 600 mg kloksasilin içeren 3,6 gramlık iritan olmayan kuru dönem meme içi süspansiyon (Orbenin DC, Pfizer Hayvan Sağlığı, San Michael, İtalya) kullanıldı. Kuru dönem antibiyotik tedavi, kuru dönem başlangıcında son sağımdan hemen sonra, meme başı %70 alkol emdirilmiş pamukla silindikten sonra, meme içine verildi. Uygulama sonrası meme başlarına %1 iyot içeren daldırma solusyonları uygulandı ve inekler kuruya çıkartıldı. Meme içi kaplayıcı olarak 4 gr içinde mineral madde ile birlikte %65 bizmut subnitrat içeren yağlı süspansiyon (Orbeseal, Pfizer Hayvan Sağlığı, Dublin, İrlanda) kullanıldı. Bu parafin macun tıpkı antibiyotik uygulamasında olduğu gibi son sağımdan sonra uygulandı. Meme içi antibiyotik ile beraber uygulamalarda ise, meme içi antibiyotiği takiben meme başına enjekte edildi. Vitamin E uygulaması için her 1 ml si 1500 mg dl-α-tokoferol ve 0,5 mg Selenyuma eşdeğer 1,67 mg Pentahidra-disodyum selenit içeren homojen enjeksiyonluk çözelti (Selen E Sol, Richter Pharma AG, Wels, Avusturya) kullanıldı. Vitamin E enjeksiyonu kuru dönem başlangıcında ve muhtemel doğum zamanına 15 gün kala olmak üzere hayvan başına 3000 mg dozda iki kez uygulandı. Çalışma gruplarının oluşturulması Kuru dönem başlangıcında bakteriyolojik muayeneler sonucu enfekte olmayan meme 95 Holştayn ineğe ait 322 adet meme lobu, 8 gruba ayrıldı. Gruplar şu şekilde oluşturuldu; 1. Grup (K): Kuru dönem başlangıcında enfekte olmayan meme loblarına sadece meme içi kaplayıcı uygulandı ve inekler kuruya çıkartıldı. 2. Grup (A): Kuru dönem başlangıcında enfekte olmayan meme loblarına sadece kuru dönem meme içi antibiyotik uygulandı ve inekler kuruya çıkartıldı.

10 3. Grup (KE): Kuru dönem başlangıcında enfekte olmayan meme loblarına meme içi kaplayıcı, parenteral olarak da vitamin E yapıldı. Beklenen doğum zamanından yaklaşık 15 gün önce vitamin E enjeksiyonu tekrar edildi. 4. Grup (AE): Kuru dönem başlangıcında enfekte olmayan meme loblarına meme içi kuru dönem antibiyotik, parenteral olarak da vitamin E yapıldı. Beklenen doğum zamanından yaklaşık 15 gün önce vitamin E enjeksiyonu tekrar edildi. 5. Grup (AK): Kuru dönem başlangıcında enfekte olmayan meme loblarına önce meme içi kuru dönem antibiyotik, ardından meme içi kaplayıcı uygulandı. 6. Grup (AKE): Kuru dönem başlangıcında enfekte olmayan meme loblarına önce meme içi kuru dönem antibiyotik, ardından meme içi kaplayıcı uygulandı Beklenen doğum zamanından yaklaşık 15 gün önce vitamin E enjeksiyonu tekrar edildi. 7. Grup 7 (E): Kuru dönem başlangıcında ve beklenen doğum zamanından yaklaşık 15 gün önce vitamin E enjeksiyonu uygulandı. 8. Grup 8 (Kont.): Kontrol grubu olarak düzenlendi ve kuru dönem başlangıcında enfekte olmayan meme loblarına herhangi bir tedavi uygulanmadı. Ayrıca bu inekler kuruya çıkartılırken parenteral olarak herhangi bir ilaç uygulanmadı. Doğum sonrası 3-5 ve günlerde bu ineklerden, vitamin E stabil metaboliti olan α- tokoferol analizi ve bakteriyolojik muayene için süt örnekleri toplandı. Üç-5 ve 8-10.günlerde alınan süt örneklerinden bakteriyolojik muayene yapılırken, α- tokoferol analizleri sadece 3-5. günlerde toplanan örneklerden yapıldı. İstatistiksel analiz Yapılan çalışmada grup ortalamaları ve ortalamalar arasındaki farklılıkların belirlenmesi amacıyla, tek yönlü variyans analizi kullanıldı. Çoklu karşılaştırma sonuçları Dunnett s T3 e göre yorumlandı. Yapılan ilaç uygulamalarının meme enfeksiyonları üzerine etkilerini belirlemek için regresyon ve ki-kare analizlerinden faydalanıldı. Elde edilen sonuçlar, P<0,05 ise istatistiksel olarak önemli, P>0,05 ise önemsiz olarak yorumlandı. İstatistiksel analizler SPSS (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) paket program kullanılarak gerçekleştirildi. Aşağıda araştırma planı gösterilmiştir. GRUP 1 (K) 3 gün Kuru D. Başl. K. Dönem 15 gün Doğum 3. gün L gün

11 I I I I I B K B B α-t GRUP 2 (A) 3 gün Kuru D. Başl. K. Dönem 15 gün Doğum 3. gün L gün I I I I I B A B B α-t GRUP 3 (KE) 3 gün Kuru D. Başl. K. Dönem 15 gün Doğum 3. gün L gün I I I I I B KE B B α-t GRUP 4 (AE) 3 gün Kuru D. Başl. K. Dönem 15 gün Doğum 3. gün L gün I I I I I B AE B B α-t GRUP 5 (AK) 3 gün Kuru D. Başl. K. Dönem 15 gün Doğum 3. gün L gün I I I I I B AE B B α-t GRUP 6 (AKE) 3 gün Kuru D. Başl. K. Dönem 15 gün Doğum 3. gün L gün I I I I I B AKE B B α-t GRUP 7 (E) 3 gün Kuru D. Başl. K. Dönem 15 gün Doğum 3. gün L gün I I I I I B E B B α-t GRUP 8 (Kont.) 3 gün Kuru D. Başl. K. Dönem 15 gün Doğum 3. gün L gün I I I I I B B B α-t IV. Analiz ve Bulgular

12 Kuru dönem sonrası, gruplara göre meme loblarının değerlendirilmesi Doğum sonrası yapılan bakteriyolojik muayenede, çalışmaya alınan 322 meme lobunun 96 sında (%29,8) kuru dönem yeni meme içi enfeksiyon geliştiği gözlenirken, 226 adet (%70,2) meme lobunda herhangi bir enfeksiyon saptanmadı. En düşük enfeksiyon oranı AKE (%12,5) grubunda belirlendi. Diğer gruplara göre oluşan bu belirgin fark, istatistiksel olarak önemli bulundu (P<0,05). En yüksek enfeksiyon oranı, hiçbir tedavinin yapılmadığı kontrol grubunda (%47) saptandı (P<0,05). Meme içi kaplayıcının tek başına ve antibiyotik ile birlikte uygulandığı (Grup K ve Grup KA) gruplarda, kuru dönem yeni meme içi enfeksiyon oranı, tek başına antibiyotik (A) uygulanan gruptan daha düşük bulundu. Meme başı kanalı kaplayıcısı ve E vitaminin birlikte uygulandığı (Grup KE) grupta, yeni meme içi enfeksiyon oranı, ASE dışındaki gruplardan daha düşük bulundu, ancak istatistiksel olarak bir fark bulunmadı (P>0,05). Tek başına vitamin E (Grup E) uygulanan grupta, yeni meme içi enfeksiyon oranı, tek başına antibiyotik (Grup A) uygulanan grup ile aynı bulundu (Çizelge 1). Çizelge 1. Kuru dönem sonrası, gruplara göre meme loblarının değerlendirilmesi Grup Toplam n Enfekte Meme Lobu n (%) Sağlıklı Meme Lobu n (%) K (%26,2) 31 (%73,8) A (%35) 26 (%65) KE 40 9 (%22,5) 31 (%77,5) AE (%35) 26 (%65) KA (%25) 30 (%75) AKE 40 5 (%12,5) 35 (%87,5) E (%35) 26 (%65) Kont. Toplam (%47,5) 96 (%29,8) 21 (%52,5) 226 (%70,2)

13 Kuru dönem sonrası, gruplara göre bakteriyolojik muayene sonuçları Kuru dönem sonrası, laktasyon başlangıcında yapılan bakteriyolojik muayene sonuçlarına göre KNS (%33,3) ve S. aureus (%10,4) en fazla izole edilen bakteri türü oldu. Bu bakterilere ek olarak, Bacillus spp. (%10,4), S. uberis (%10,4), S. agalactiae (%7,2), E. coli (%6,2) ve S. dysgalactiae (%3,1) izole edildi. Grup A ve grup K de çevresel etkenler çoğunlukta izole edilirken, grup KA da çevresel etken olarak sadece KNS izole edildi. Sadece kuru dönem antibiyotik uygulaması (Grup A) tek başına bakteriyel enfeksiyonlara karşı zayıf bir koruma sağlarken, vitamin E ile kombine edildiğinde (Grup AE), KNS dışındaki çevresel etkenlere karşı etkili bir koruma sağladığı görüldü. Ancak bu uygulamanın stafilokoklara karşı etkisiz olduğu belirlendi. Çevresel etkenlere karşı iyi koruma sağlayan antibiyotik ve kaplayıcı uygulamasına (Grup AK), stafilokoklara karşı iyi koruma sağlayan vitamin E uygulaması eklendiğinde (Grup AKE) başarılı sonuçlar alındı, özellikle S. aureus ve çevresel etkenlerin oluşturması muhtemel yeni meme içi enfeksiyonlara karşı iyi bir koruma sağladı. Hiçbir uygulamanın yapılmadığı kontrol grubunda ise, daha çok kontagiyöz etkenler (S. aureus ve S. agalactiae) izole edildi (Çizelge 2.). Çizelge 2. Kuru dönem sonrası, gruplara göre bakteriyolojik muayene sonuçları. Bakteri (n) K A KE AE KA AKE E Kontrol KNS S. aureus S. dysgalactiae S. agalactiae Bacillus spp S. uberis E. coli Toplam Kuru dönem sonrası, gruplara göre süt alfa-tokoferol konsantrasyonlarının değerlendirilmesi Doğum sonrası süt örneklerinde α-tokoferol konsantrasyonları belirlendi. Ölçüm sonuçlarına göre, kuru dönem başında ve sonunda iki doz vitamin E uygulanan gruplarda (Grup E, AE, KE, AKE) ortalama α-tokoferol düzeyleri, uygulama yapılmayan gruplara (Grup A, K, AK, Kont.) göre daha yüksek bulundu (Çizelge 3 ve şekil 1). Bu farkın istatiksel olarak önemli olduğu görüldü (P<0,05) (Çizelge 4). Vitamin E uygulanan grupların ortalama

14 α-tokoferol düzeyleri kendi aralarında kıyaslandı, ASE ve E gruplarında diğer gruplara göre belirgin bir fark tespit edildi (P<0,05) (Çizelge 4). Kontrol grubunda ölçülen ortalama α- tokoferol düzeyi ile grup A, K, KA arasında istatistiki bir fark bulunmadı (P>0,05) (Çizelge 4). Çizelge 3. Kuru dönem sonrası, gruplara göre süt alfa-tokoferol konsantrasyonlarının değerlendirilmesi. Gruplar Alfa-tokoferol Ortalama (mg/l) Standart sapma (mg/l) K 0,31 0,18 A 0,26 0,18 KE 0,67 0,31 AE 0,47 0,38 KA 0,34 0,23 AKE 1,13 0,61 E 0,87 0,43 Kont. 0,25 0,14 Şekil 1. Gruplara göre α-tokoferol konsantrasyonlarının değerlendirilmesi 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 K A KE AE KA AKE E Kont. K A KE AE KA AKE E Kont. Çizelge 4. Alfa-tokoferol konsantrasyonları bakımından gruplar arası farklılığın belirlenmesi.

15 Grup Alfa-tokoferol Ortalama fark Standart hata Önemlilik (P) (mg/l) (mg/l) K -0,06 0,03 >0,05 A -0,01 0,03 >0,05 KE -0,42 0,05 <0,05 AE -0,21 0,06 <0,05 KA -0,09 0,04 >0,05 AKE -0,87 0,09 <0,05 E -0,61 0,07 <0,05 Kuru dönem sonrası izole edilen bakteri türüne göre ortalama alfa-tokoferol konsantrasyonlarının belirlenmesi Kuru dönem sonrası, izole edilen bakteri türüne göre süt α-tokoferol düzeyleri belirlendi (Çizelge 5 ve şekil 2). Buna göre S. aureus ve E. coli ile enfekte süt örneklerinde ortalama α-tokoferol konsantrasyonunun, üreme olmayan süt örneklerine göre belirgin şekilde düşük olduğu görüldü (P<0,05) (Çizelge 6). Streptococcus dysgalactiae enfeksiyonlarında ise ortalama α-tokoferol konsantrasyonu belirgin şekilde yüksek ölçülmüştür (P<0,05) (Çizelge 6). Çizelge 5. Kuru dönem sonrası izole edilen bakteri türüne göre ortalama alfa-tokoferol konsantrasyonlarının belirlenmesi. Bakteriyolojik sonuç Alfa-tokoferol Ortalama (mg/l) Standart hata (mg/l) KNS 0,42 0,09 S. aureus 0,33 0,04 S. dysgalactiae 0,73 0,05 S. agalactiae 0,49 0,07 Bacillus spp. 0,61 0,12 S. uberis 0,45 0,10 E. coli 0,32 0,03 Üreme yok 0,58 0,03 Şekil 2. Enfekte olan ve enfekte olmayan meme loplarına ait süt örneklerinde alfa-tokoferol konsantrasyonlarının gösterilmesi.

16 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 KNS S. aureus S. dysgalactiae S. agalactiae Bacillus spp. S. uberis E. coli Üreme yok Çizelge 6. Bakteri türüne bağlı alfa-tokoferol konsantrasyonlarının, üreme olmayan örneklerden ortalama farkı Bakteri Alfa-tokoferol Ortalama fark (mg/l) Standart hata (mg/l) Önemlilik (P) CNS -0,16 0,09 >0,05 S. aureus -0,25 0,05 <0,05 S. dysgalactiae 0,14 0,05 <0,05 S. agalactiae -0,08 0,08 >0,05 Bacillus spp. 0,02 0,13 >0,05 S. uberis -0,13 0,11 >0,05 E. coli -0,26 0,13 <0,05

17 Vitamin E uygulanan gruplarda enfeksiyon durumu Vitamin E uygulanan gruplar (Grup E, AE, KE, AKE) ile uygulanmayan gruplar (Grup A, K, KA, Kont.), (Çizelge 7), kuru dönemde yeni enfeksiyonlara karşı koruyuculuk bakımından kıyaslanmış, vitamin E uygulamasının enfekte meme lobu sayısını belirgin oranda azaltmadığı görülmüştür (P>0,05). Çizelge 7. Vitamin E uygulamasının yeni meme enfeksiyonlar üzerine etkisi. Grup Bakteriyolojik analiz E Üreme + meme lobu Üreme meme lobu Uygulanan * Önemlilik E Uygulanmayan >0,05 Toplam * Bu sınıflamada E, AE, KE ve AKE gruplarındaki meme lobları yer almaktadır. Meme içi kaplayıcı uygulanan gruplarda enfeksiyon durumu Kuru dönem başlangıcında kaplayıcı uygulanan gruplar (Grup K, AK, KE, AKE) ile uygulanmayan gruplar (Grup A, AE, E, Kont.), kuru dönemde yeni enfeksiyonlara karşı koruyuculuk bakımından kıyaslanmış (Çizelge 8), kaplayıcı uygulanan gruplarda, yeni enfeksiyon riskinin 0,6 kat daha düşük olduğu görülmüş, bu sonuç istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (P<0,05).

18 Çizelge 8. Meme içi kaplayıcı uygulamasının yeni enfeksiyonlar üzerine etkisi. Grup Bakteriyolojik analiz Üreme + meme lobu (n) Üreme meme lobu (n) Önemlilik (P) Göreli risk oranı K Uygulanan * <0,05 0,6 K Uygulanmayan Toplam * Bu sınıflamada kaplayıcının uygulandığı K, KA, KE ve AKE gruplarındaki meme lobları yer almaktadır. Meme içi kuru dönem antibiyotik uygulanan gruplarda enfeksiyon durumu Kuru dönem başında meme içi kuru dönem antibiyotik uygulanan gruplar (Grup A, AE, AK, AKE), antibiyotik uygulanmayan gruplar (Grup K, E, KE, Kont.), kuru dönemde yeni enfeksiyonlara karşı koruyuculuk bakımından kıyaslanmış (Çizelge 9), antibiyotik uygulamasının enfekte meme lobu sayısını belirgin olarak azaltmadığı görülmüştür (P>0,05). Çizelge 9. Antibiyotik uygulamasının yeni enfeksiyonlar üzerine etkisi. Grup Bakteriyolojik analiz Üreme + Üreme meme lobu meme lobu A Uygulanan * Önemlilik A Uygulanmayan >0,05 Toplam * Bu sınıflamada antibiyotiğin uygulandığı A, AE, AK ve AKE gruplarındaki meme lobları yer almaktadır.

19 Meme içi kaplayıcı ve kuru dönem antibiyotiğin birlikte uygulandığı gruplarda enfeksiyon durumu Kuru dönem başlangıcında meme içi kaplayıcı ve antibiyotiğin birlikte uygulandığı gruplar (Grup KA, AKE) ile diğer gruplar (Grup A, K, AE, KE, E, Kont.), kuru dönemde yeni enfeksiyonlara karşı koruyuculuğu bakımından kıyaslanmış, birlikte uygulamanın enfeksiyon riskini 1,5 kat azalttığı görülmüş, bu sonuç istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. Grup Bakteriyolojik analiz Üreme + meme lobu (n) Üreme meme lobu (n) Önemlilik (P) Göreli risk oranı KA Uygulanan * KA Uygulanmayan <0,05 1,5 Toplam * Bu sınıflamada antibiyotik ve kaplayıcının birlikte uygulandığı KA ve AKE gruplarındaki meme lobları yer almaktadır. V. Sonuç ve Öneriler Sunulan çalışma, süt inekçiliği işletmelerinin en önemli sorunlarından biri olan kuru dönem yeni meme içi enfeksiyonlara karşı alınabilecek önlemleri ve bu önlemlerin birbirlerine karşı üstünlüklerini irdelemektedir. Çalışmada klasik önlemler, güncel yeni yaklaşımlarla kıyaslanmıştır. Kuru dönem meme hastalıklarına karşı uygulanan en klasik önlem, kuru dönem meme içi antibiyotiklerin, laktasyonun son sağımından sonra uygulanmasıdır. Bu çalışmada antibiyotik uygulamasının tek başına özellikle çevresel etkenlere karşı yeterince koruyucu olmadığı görülmüştür. Bu sonuç daha önce de bahsedildiği gibi, antibiyotiklerin kuru dönemin başlangıcında kanda yeterli konsantrasyon sağlamadan önce çevresel bakterilere bağlı meme içi enfeksiyon şekillenmesi ve antibiyotiklerin kuru dönem sonuna doğru meme lobunda, minimum inhibitör konsantrasyonu kaybetmesiyle ilişkilendirilmiştir. Meme içi kaplayıcıların uygulanması son yıllarda önem kazanan yeni bir korunma yöntemidir. Meme başında fiziksel bariyer oluşturma prensibine dayanarak yapılan bu uygulama nispeten antibiyotik uygulamalara göre daha başarılı bulunsa da hedeflenen

20 korumayı sağlayamamıştır. Ancak bu iki yöntem birlikte uygulandığında, çevresel ve kontagiyöz etkenlere bağlı yeni meme içi enfeksiyonlara karşı istenen sonuç elde edilmiş, özellikle kuru dönem meme hastalıklarının başlıca nedeni olarak gösterilen çevresel etkenlere karşı oldukça başarılı olduğu görülmüştür. Meme hastalıklarına karşı koruyuculuğu üzerine çok araştırma yapılan bir diğer yöntem, vitamin E uygulamalarıdır. Bu çalışmada tek başına vitamin E uygulamalarının meme içi çevresel enfeksiyonlara karşı koruyucu olmadığı belirlenmiştir. Kuru dönem meme enfeksiyonlarına karşı en başarılı sonuç bu üç korunma yönteminin birlikte uygulanmasıyla alınmıştır. Bu uygulamada sadece 5 meme lobunda enfeksiyon izlenmiş, istenen sonuç elde edilmiştir. Bu çalışmada incelenen bir başka konu, uygulanan vitamin E nin hangi konsantrasyonda meme lobuna geçtiği ve bu konsantrasyonun enfeksiyon riskine karşı ne kadar koruyucu olduğudur. Sonuçta, en yüksek α-tokoferol konsantrasyonu AKE grubunda ölçülmüştür. Doğal olarak vitamin E uygulanan gruplarda, uygulama yapılmayan gruplara göre α-tokoferol konsantrasyonu belirgin şekilde yüksek ölçülmüş, ancak enfeksiyon riskini azaltmada yetersiz bulunmuştur. Sonuç olarak, en iyi korunma antibiyotik, meme içi kaplayıcı ve vitamin E nin birlikte yapıldığı grupta elde edilmiştir. Her ne kadar bu korunma yöntemleri işletmelere mali bir yük getirse de, meme enfeksiyonlarından meydana gelebilecek ekonomik kayıp göz önüne alındığında, bu uygulamalar işletmelere önemli ekonomik avantajlar sağlamaktadır.

21 V. Kaynaklar Bansal BK., Dhaliwal PS., Bajwa NS., Randhawa SS Role of selective dry cow therapy in prevention of mastitis in dairy herds with high disease prevalence. In Mastitis in Dairy Production: Current Knowledge and Future Solutions, Ed., H Hogeveen, Wageningen Academic Publishers, The Netherlands. Berry EA., Johnston WT., Hillerton JE Prophylactic effects of two selective dry cow strategies accounting for interdependence of quarter. J. Dairy Sci., 86, Bradley A., Newton H., Bechaoui H., Tilt N., Cracknell V., Rowan T Orbeseal and Orbenin EDC in combination for the treatment of intra-mammary infections at drying off and prevention of new infections during the dry period and early lactation in dairy cows. In Mastitis in Dairy Production: Current Knowledge and Future Solutions, Ed., H Hogeveen, Wageningen Academic Publishers, The Netherlands. Bradley AJ., Green MJ The importance of the nonlactating period in the epidemiology of intramammary infection and strategies for prevention. J. Dairy Sci., 20, Cook NB., Wilkinson A., Gajewski K., Weigel D., Sharp P., Pionek D The prevention of new intramammary infections during the dry period when using an internal teat sealant in conjunction with a dry cow antibiotic. In Proceedings of National Mastitis Council, Charlotte, North Carolina. Dingwell RT., Duffield TF., Leslie KE., Keefe GP., DesCoteaux L., Kelton DF., Lissemore KD., Schukken YH., Dick P., Bagg, R The efficacy of intramammary tilmicosin at drying-off, and other risk factors for the prevention of new intramammary infections during the dry period. J. Dairy Sci., 85, Dingwell RT., Leslie K. E., Schukken YH., Sargeant JM., Timms LL., Duffield TF., Keefe GP., Kelton DF., Lissemore KD., Conklin J Association of cow and quarterlevel factors at drying-off with new intramammary infections during the dry period. Preventive Veterinary Medicine, 63, Godden S., Rapnicki P., Stewart S., Fetrow J., Johnson A., Bey R., Farnsworth R Effectiveness of an internal teat seal in the prevention of new intramammary infections during the dry and early-lactation periods in dairy cows when used with a dry cow intramammary antibiotic. J. Dairy Sci., 86, Harmon, R.J., R.J. Eberhart, D.E. Langlois and R.A. Wilson, Microbiological Procedures for the Diagnosis of Udder Infection. National Mastitis Council, Arlington, VA., pp: Hogan JS., Weiss WP., Smith KL Role of vitamin E and selenium in host defense against mastitis. J. Dairy Sci., 76, Hogeveen H., Osteras O Mastitis management in an economic framework. In Mastitis in Dairy Production: Current Knowledge and Future Solutions, Ed., H Hogeveen, Wageningen Academic Publishers, The Netherlands.

22 Huxley JN., Green MJ., Green LE., Bradley AJ Evaluation of the efficacy of an internal teat sealer during the dry period. J. Dairy Sci., 85, LeBlanc SJ., Duffield TF., Leslie KE., Bateman KG., TenHag J., Walton JS., Johnson WH The effect of prepartum injection of vitamin E on health in transition dairy cows. J. Dairy Sci., 85, Moeini MM., Karami H., Mikaeili E Effect of selenium and vitamin E supplementation during the late pregnancy on reproductive indices and milk production in heifers. J. Dairy Sci., 114, Olde Riekerink RGM., Barkema HW., Kelton DF., Scholl DT Incidence rate of clinical mastitis on Canadian dairy farms. J. Dairy Sci., 91, Oliver SP., Sordillo LM Approaches to the manipulation of mammary involution. J. Dairy Sci., 72, Oliver SP Frequency of isolation of environmental mastitis-causing pathogens and incidence of new intramammary infection during the nonlactating period. Am. J. Vet. Res., 49, Oliver SP., Mitchell BA Prevalence of mastitis pathogens in herds participating in a mastitis control program. J. Dairy Sci., 67, Sanford CJ., Keefe GP., Dohoo IR., Leslie KE., Dingwell RT., DesCôteaux L., Barkema H.W Efficacy of using an internal teat sealer to prevent new intramammary infections in nonlactating dairy cattle. 228, Weiss WP Relationship of mineral and vitamin supplementation with mastitis and milk quality. National Mastitis Council Annual Meeting Proceedings. Williamson JH., Woolford MW., Day AM The prophylactic effect of a dry-cow antibiotic against Streptococcus uberis. New Zealand Veterinary Journal. 43, Wilson DJ., Gonzalez RN., Das HH Bovine mastitis pathogens in New York and Pennsylvania: prevalence and effects on somatic cell count and milk production. J. Dairy Sci., 80,