helena BioSciences Europe Kullanım Talimatları SAS-1 Pentavalent Tarama Katalog No: ( )

Transkript

1 helena BioSciences Europe Kullanım Talimatları SAS-1 Pentavalent Tarama Katalog No: ( )

2 KULLANIM AMACI SAS-I Pentavalent Tarama SAS-I Pentavalent Tarama kiti agaroz jel elektroforezi ve immunofiksasyon ile monoklonal gammopatiler için serum ve idrar örneklerinin taranmasını amaçlar. İmmünofiksasyon elektroforezi (IFE) iki adımlı bir prosedürdür, ilk adımında agoroz elektroforezin yüksek kararlılığını,ikinci adımda da immünopresipitasyonu kullanır. IFE nin kullanıldığı klinik laboratuvarda en büyük istek,monoklonal gammopatilerin tespitidir. Bir monoklonal gammopati,tek sınıf ve tip bir immünoglobulinin yükseltilmiş seviyelerini üreten plazma hücrelerinin tek bir kolonu olan bir hastalık durumudur. Böyle immünoglobulinler,paraproteinler veya M-proteinleri gibi monoklonal proteinlerin yerine geçer. Onların varlığı,tehlikesiz bir tabiatta veya şüpheli bir anlamda olabilir. Bazı durumlarda, çoklu myeloma veya Waldenström s makroglubinoma gibi bir tehlikeyi belirtebilir. Farklılaştırma,,kronik karaciğer hastalığı,kollajen hastalıkları,römatoid artirid ve kronik infeksiyon gibi klinik hastalıklara bağlı ikincil hastalık durumu olan poliklonal gammopatiler gibi poliklonal ve monoklonal gammopatiler arasında yapılmalıdır. Üriner proteinler,böbrek boyunca filtre edilen plazma proteinlerinden öncelikli olarak türetilirler. İdrarda anormal plazma proteinlerinin görülmesi renal fonksiyonun değerlendirilmesinde büyük öneme sahiptir. Uygun proteinuria çalışması, salgılanan proteinlerin miktarı ve tipinin kalitatif ve kantitatif keşfini kapsamalıdır 1-5. Alfonso,ilk kez 1964 yılında literatürde immünofiksasyonu tanımladı.alper ve Johnson,1969 yılında çok daha pratik bir prosedür ile bu tekniği kullanan çok sayıda çalışma yayınladı 6.İmmünofiksasyon,1976 dan beri immünoglobulinlerin araştırılması için bir prosedür olarak kullanıldı UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin,ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk,güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kağıdına başvurun. BİLEŞENLER : 1 - SAS-I Jel Koruyucu olarak sodyum azid ve thimersal ile bir Tris/Barbital tamponu içeren agaroz. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2 - Konsantre Mor Asid Boya Pentavalan tarama kiti ile kullanmayın. 3 - Konsantre Boya Arındırıcı Solusyon Konsantre boya arındırıcı solusyon içerir. Şişe içeriği 2 litre saf su ile dilüe edilir. Sıkı kapatılmış bir şişede saklanır.

3 4 Yıkama Solusyonu 100ml konsantre yıkama solusyonu içerir.1 litre serum fizyolojik ile 20 ml dilüe edilir. 5 Numune Dilüent Koruyucu olarak sodyum azid ve bromofenol mavisi ile Tris/Barbital tampon içerir. Dilüent paketinde kullanım için hazırdır. 6 Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanım için talimatlar ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda B,C,D,X kurutma kağıtları ve kurutma tarağı içerir : 1 - Konsantre Mavi Asid Boya Konsantre mavi asid boya içerir. Şişe içeriği 700ml saf su ile dilüe edilir. Kullanım öncesi karıştırılır ve filtre edilir. İyi kapatılmış bir şişede saklanır. 2 Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanım için talimatlar içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ : 1 - SAS-I IFE Jel Jeller derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulması: 1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya bakteriyal yada fungal kaynaklı agarozun kontaminasyonunu belirtir. 2 - Mor Asit Boya Pentavalan tarama kiti ile kullanmayın. 3 - Boya Arındırıcı Solüsyon Konsantre boya arındırıcı solüsyon derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boyadan arındırıcı solüsyon derecede 6 ay stabildir. 4 Yıkama Solusyon Konsantre yıkama solusyonu derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe yıkama solusyonu derecede 6 ay stabildir. Bulanıklık bozulmayı belirtebilir. 5 Numune Dilüenti Numune dilüenti derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Bulanıklık bozulmayı belirtebilir : 1 - Mavi Asid Boya Konsantre boya derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solusyonu derecede 6 ay stabildir.

4 Boya kapasitesinin azalmasını önlemek için derhal kullanılan boyanın çıkarılması tavsiye edilir. Zayıf boyama performansı, boya solusyonunun bozulduğunu belirtebilir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Katalog No Numune Aplikatör Ucu (1x10) Katalog No Numune Aplikatör Ucu (5x10) Katalog No Pentavalent Antiserum (İdrar ve serum örnekleri için) 3mL Katalog No Pentavalent Antiserum (İdrar ve serum örnekleri için) 10 x 3mL Katalog No Tek kullanımlık numune kapları (100) Katalog No.3100 REP Prep NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune taze toplanmış idrar veya serumdur. Standart 5 bant paterns 6, beta 2-globulin bant (Komplement C3) çabuk bozulacağı için numuneler 4 güne kadar derecede,2 haftaya kadar 2-6 derecede veya 6 aya kadar 20 derecede saklanmalıdır. İdrar numuneleri C de 72 saate kadar veya -20 C de 2 hafta buzdolabında saklanmalıdır. İdrar örnekleri başlangıçta total protein 1000mg/L aşmadıkça dilüsyonsuz veya konsantrasyonsuz kullanılmalıdır. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. İDRAR: Uygun tek kullanımlık numune kaplarına numunenin 35 mikrolitresi pipetlenir. Numunelerden buharlaşmayı koruyun. SERUM: IFE dilüent kullanarak dilüsyon oranında her bir numuneyi dilüe edin. Uygun tek kullanımlık numune kaplarına dilüe edilen numuneden 35 mikrolitre pipetlenir. Numunelerden buharlaşmayı koruyun. 2. Elektroforeze başlayın ve: İ) SAS- I Plus kullanıcıları: Aplikatör çekmecesinde numune tepsisi dikkatlice yerleştirilir. Tepisinin pozisyonuna kuvvetlice itilmesi sağlanır. İİ) SAS-3 kullanıcıları: Kullanılan numune dikkatlice numune tepsisine yerleştirilir. Tepsinin güvenli bir şekilde yerleştirilmiş olduğundan emin olun. 3. Jel paketinden alınır, çıkarılıp yerleştirilir ve: İ) SAS-1 Plus kullanıcıları: Jel tablasına REP Prep ten 400 mikrolitre boşaltılır. Agaroz jel düzgün ve hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerleştirilir, uygun elektrod çubukları pozitif ve negatif kısımlara yerleştirilir. İİ)SAS-3 kullanıcıları: Havuza ayarlama klavuzunu yerleştirin ve REP prep in 400 mikrolitresini odanın merkezine boşaltın. Jeli agarozun toplandığı kuyuya yerleştirin,klavuzu kullanın,uygun elektrod uçları ile negatif ve pozitif uçları ayarlayın, jelin altında hava kabarcığından sakınmak için dikkat edin. 4.Jelin yüzeyi kurutma kağıdı C ile kurutulur, kurutma kağıdı alınır. 5. İ)SAS-1 Plus kullanıcıları: Jelin ve elektrodların üzerine kapak yerleştirilir ve teması sağlamak için 5 sn kuvvetlice bastırılır. İİ)SAS-3 kullanıcıları: Elektrod kollarına elektodlar eklenir böylece jel blokları ile temasa gelirler. 6.Cihaz üzerindeki pozisyonda iki aplikatör ucu bir araya getirilerek yerleştirilir.(sas-3 kullanıcıları: kısım A ve 10) 7. Pentavalent Tarama elektroforezi yapılır: İ)SAS-1 Plus kullanıcıları:elektroforez:100 volt,18dk,20 derece

5 İnkübasyon adım 1: 8 dk, 37 derece İnkübasyon adım 2: 8 dk, 40derece (D kurutma kağıdı ile) Not: Serum Tarama için, 1 numune aplikasyonuna gereksinim duyulur. İdrar Tarama için 10 numune aplikasyonuna gereksinim duyulur. İİ)SAS-3 kullanıcıları: Adım Zaman(dk:sn) Sıcaklık(derece) Voltaj Diğer Numune Yükleme 00:30 21 Hız 1 Numune Uygulama 00:30 21 Hız 1* Elektroforez 17: Antiserum uygulama 10:00 21 Tarak ekleme 02:00 21 Kurutucu D 05:00 40 Kurutma 08:00 54 * Yerleştirme 2 kullanılır Not: Serum Tarama için, 1 numune aplikasyonuna gereksinim duyulur. İdrar Tarama için 10 numune aplikasyonuna gereksinim duyulur. Kurutma öncesinde jel blokları geri alınır. 8. Elektroforezin ardından: (SAS-1 plus kullanıcıları: kapak alınır), jel yüzeyinden elektrodlar alınır.(sas-3 kullanıcıları:ayar klavuzunu geri alır.) Jel yüzeyinde antiserum aplikasyon tablası pozisyonlandırılır. Not:Numunelerin uygulandığı jel üzerinde yazılı kutu merkezine doğru antiserum kanalları ayarlanmalıdır μL Pentavalent Antiserum antiserum uygulama templetinin deliğine damlatılır. Antiserumun tamamen kanalları doldurduğundan emin olunur. 10. Jel inkübe edilir. 11.İnkübasyonu takiben antiserum tablasının deliklerine bir kurutma tarağı yerleştirilir. Fazla antiserumu aspirasyonu için 2dk izin verilir, tarak ve tabla jel yüzeyinden geri alınır. 12.Jelin yüzeyine bir kurutucu D (düz tarafı yukarı) yerleştirilir,10 saniye bırakılır ve geri alınır. 13. Jelin yüzeyine bir kurutucu D (düz tarafı yukarı) yerleştirilir ve düz kurutma kâğıdı tutarak antiserum templeytini değiştirin. Jeli kurutun. Not: kullanımdan sonra derhal, antiserum templeyti temizlenir. 14. Kurutucu D geri alınır. SAS-3 kullanıcıları: Jeli kurutun, SAS-4 de 3 saniyelik ilk yıkamayı başlatın. 15. Jel bloklarını çıkarın ve boyama odasına jeli koyun ve SAS-2 veya SAS-4 de final adımını tamamlayın. 16. Boyama siklusunun sonunda, boyama alanından jeli alın. Jel şimdi incelenmek için hazırdır. a) SAS-2 (Oto-Boyayıcı) : Adım Solüsyon Zaman(dk:sn) Port Sıcaklık(derece) Kurutma - 10:00 55 Yıkama Yıkama solüsyonu 07:00 4 Boya Mavi asit Boya 03:00 6 Boya arındırma Boya arındırma solüsyon 02:00 2 Kurutma - 05:00 65

6 Yıkama Yıkama solüsyonu 03:00 4 Yıkama Yıkama solüsyonu 03:00 4 Kurutma - 05:00 65 b) SAS-4 (Oto-Boyayıcı) : Adım Zaman(dk:sn) Sıcaklık(derece) Diğer Yıkama 00:03 dolaşım AÇIK Yıkama 10:00 dolaşım AÇIK Boya 04:00 dolaşım AÇIK Boya Arındırma 02:00 dolaşım AÇIK Boya Arındırma 02:00 dolaşım AÇIK Kurutma 12:00 63 SONUÇLARIN YORUMLANMASI Monoklonal proteinlerin çoğunluğu protein modeli alanında gama bölgesine göç eder fakat onların anormal doğasına göre protein elektroforezinde globulin bölgesinde herhangi bir yere göç edebilirler. Anormal protein, şimdi tam bir IFE ile tanımlandırılır. Mevcut anormal proteinin düşük konsantrasyonları olduğu zaman, anormal band normal poliklonal immünoglobulin içinde bir band gibi görülebilir. Ayrıca bir band, bir büyük poliklonal immünoglobulin mevcut olduğunda bir poliklonal içinde görülebilir. KALİTE KONTROL Kemtrol Anormal (Kat. No 7025), poliklonal arka plan içinde tek bir monklonal bant verecektir. SINIRLAMALAR 1. Antijen fazlalığı Presipitasyon alanında antijen fazlalığı, eğer antikor miktarı az veya antijen/antikor eşitsizliği varsa meydana gelecektir. IFE de antijen fazlalığı genellikle hasta numunesindeki immünoglobulin fazlalığına dayanır. Antijen fazlalığı prozoning ile karakterize edilir. Numunenin yüksek dilüsyonu immünoglobulin konsantrasyonunu optimize etmek için kullanılmalıdır. PERFORMANS ÖZELLİKLER a) Duyarlılık İdrar yöntemi kullanılarak (10 uygulama), 10 mg / L tamamlanan jel üzerinde ayrık bir bant olarak görünen proteinin en düşük konsantrasyonu olarak tespit edilmiştir. b) Doğrusallık Doğrusallığı, jel performansı gibi densitometre özelliğinin bir fonksiyonudur. Laboratuvarda kullanılan densitometreye bağlı metodun doğrusallığının belirlenmesi her müşteriye tavsiye edilir.

7 BIBLIYOGRAFİ 1. Fauchier, P. and Catalan, F. Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis Alfred Fournier Institute, Paris, France, Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. Finding Clues to Disease in Urine Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : Umbreit, A. and Wiedemann, G. Determination of Urinary Protein Fractions. A Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : Wiedemann, G. and Umbreit, A. Determination of Urinary Protein Fractions by Different Electrophoretic Methods, Clin. Lab.; 1999, 45 : Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and Lockhart, S. A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : Alfonso, E., Quantitation Immunoelectrophoresis of Serum Proteins, Clin. Chim. Acta., 1964; 10 : Alper, C.A and Johnson, A.M., Immunofixation Electrophoresis: A Technique for the Study of Protein Polymorphism, Vox. Sang., 1969; 17 : Alper, C.A., Genetic Polymorphism of Complement Components as a Probe of Structure and Function, Progress in Immunology. First International Congress of Immunology : , Academic Press, New York. 9. Johnson, A.M., Genetic Typing of Alpha(1)-Antitrypsin in Immunofixation Electrophoresis. Identification of Subtypes of Pi M., J. Lab. Clin. Med., 1976; 87 : Cawley, L.P., Minard, B.J, Tourtellotte, W.W., Ma, B.I. and Chelle, C., Immunofixation Electrophoretic Technique Applied to Identification of Proteins in Serum and Cerebrospinal Fluid, Clin. Chem., 1976; 22 : Ritchie, R.F and Smith, R. Immunofixation III, Application to the Study of Monoclonal Proteins, Clin. Chem., 1976; 22 :