5359_ _TR. Kullanım Talimatı. Protein S Antigen Rocket EID. Kat. No. 5359

Transkript

1 Kullanım Talimatı Protein S Antigen Rocket EID Kat. No

2 KULLANIM AMACI Protein S prosedür Laurell roket elektroforezi kullanarak komplement bileşeni C-4 bağlayıcı protein (C4bp) sahip bir kompleks olarak ve serbest bir protein olarak insan plazmasında protein S konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır 1, 2. Protein S aktive Protein C için güçlü bir kofaktör gibi davranan bir vitamin K bağımlı plazma proteinidir. Koagülasyon işleminde, Faktörler V ve VIII:C formu trombin oluşumunu inhibe eder. Aşırı düşük Protein S düzeyi konjenital Protein S eksikliği 3-6, karaciğer rahatsızlıkları ve oral antikoagulan hastalarda bulunur. Protein S in kompleksliliği C4b-protein bağlayıcı ile dinamik dengenin oluşumu ile gösterilmektedir. C4b - BP plazmada iki farklı formlarda bulunabilir 4, 5. İlki Protein S için hiçbir ilgisi olmayan düşük bir molekül ağırlıklı formudur. İkincisi ise 1:1 komplekste Protein S e bağlanabilen yüksek bir molekül ağırlıklı formudur. Serbest Protein S toplam Protein S in yaklaşık % 40 (10 mg / l) ını içerir. Antikoagülan aktivite için taşıyıcı olarak ve aktive Protein C için kofaktör olarak davranır. C4b - BP bağlı Protein S normalde toplam Protein S in yaklaşık % 60 (15 mg / l) ını içerir ve herhangi bir antikoagülan aktivitesine sahip değildir. Helena Protein S Rocket EID Prosedürü protein S için spesifik antiserum içeren % 1 agaroz jel ortamında yapılır. Plazma örneği agarozda kuyulara uygulandıktan sonra, elektroforez antikor alanında proteinlerin göç etmesini sağlar. Bir roket şeklinde presipite patern göç ekseninde boyunca oluşur. Bu roket patern uzunluğu antijen konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Dahlback 7 tarafından yapılan araştırmalar gösterir ki plazmaya PEG eklenmesi C4b - BP kompleksini çöktürür ancak serbest Protein S çöktürmez. Helena Serbest Protein S Reaktif bağlı Protein S den serbest olarak ayrıştırır ve böylece fonksiyonel Protein S aktivitesi ve serbest Protein S in immünolojik düzeyleri arasındaki ilişkiyi sağlar. UYARILAR VE ÖNLEMLER Kitte bulunan reaktifler sadece in-vitro diagnostik kullanımı içindir- YUTMAYIN. Çalışma yaparken eldiven giyin. Atık bilgisi, risk ve güvenlik fazları için ürün güvenliği veri sayfasına bakın. Plazma ürünleri tarandı ve Hepatit B antijen (HbsAg) HIV 1 ve 2 antikorları ve HCV antikor varlığında negatif tespit edilmiştir (kit kutusu veya şişesi üzerinde belirtilmediği sürece); ancak insan plazma örneklerinde gözlenen aynı önlemler ile ele alınmalıdır. BİLEŞENLER 1. Protein S Antijen Rocket Plakalar (Kat. No. 5359) Koruyucu olarak sodyum azid ve Tris-trisin bufferde agaroz içinde insan protein S için koyun veya keçi antikoru içerir. Zehirli buhar oluşumunu önlemek için sodyum azid asidik solüsyonlar ile karıştırılmamalıdır. Hazırlama: Paketinden plakayı çıkarın ve C ye ulaşması için agarozu 5-10 dakika bekletin. 2. Tris-trisin Buffer (Kat. No dahil değil) Dilüe tampon 0.08 M Tris ve M trisin içerir. Hazırlama: Deiyonize veya distile su ile 1000 ml ye tamponun bir paketini dilüe edin. Tampon tüm materyaller tamamen çözüldüğünde kullanıma hazırdır. 3. Rocket Boya (Kat. No dahil değil) Rocket Boya Coomassie Brilliant Blue boyasıdır. Hazırlama: Şişe içeriğini 450ml deiyonize su, 450ml metanol ve 100ml asitik asit ile çözün. İyice karıştırın ve gerekirse kullanım öncesi filtreleyin. 2

3 4. Free Protein S Reaktif (Kat. No. 5363) Reaktif % 25 polietilen glikol içerir. Reaktif paketli ve kullanım için hazırdır. 5. Diğer kit bileşenleri Her bir kit kullanım talimatları, bir roket cetvel ve rapor formatı içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ Açılmamış reaktifler şişe veya kit etiketi üzerinde belirtilen koşullar altında saklandığında verilen son kullanım tarihine kadar stabildir. 1. Protein S Antijen Rocket Plakalar (Kat. No. 5359) Rocket Plakalar C de SAKLANMALIDIR ve torba içerisinde nemli durumda korunmalıdır. DONDURMAYIN. Plakalar ambalaj üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Bozulma göstergesi: Eğer plakalar görünüm olarak kuruysa veya kuyular yuvarlak değilse atın. Bir kristal görünümü donmuş agarozu gösterir. 2. Tris-trisin Buffer (Kat. No. 5358) Ambalajlı tampon C'de saklanmalıdır ve bir etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Dilüe tampon C de 2 ay boyunca stabilidir. Bozulma göstergesi: Eğer materyalde renk değişikliği veya nem varsa ambalajlı tamponu atın. Eğer bulanıklık oluşursa, dilüe tamponu atın. 3. Rocket Boya (Kat. No. 5362) Boya C'de saklanmalıdır ve bir etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Bozulma göstergesi: Eğer metanolde buharlaşma oluşursa, bir metalik parlaklık boya yüzeyinde görünür. Eğer boya bu prosedürde belirtilen protein rockets için yetersizse boyayı atın. 4. Free Protein S Reaktif (Kat. No. 5363) Reaktif C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Bozulma göstergesi: Eğer mikrobiyal kirlenme gözlenirse reaktifi atın. GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN ÖĞELER Kat. No Tris - Tricine Buffer Kat. No Rocket Stain Cat. No Free Protein S Reagent Kat. No SARP reference plasma Kat. No Titan Gel Chamber Kat. No Development Weight Kat. No EWS Power Supply Kat. No Sponge Wicks Kat. No Blotter Pads Kat. No IEP VuBox Kat. No I.O.D. - Incubator, Oven, Drier Kat. No TITAN GEL Multi-staining Set Kat. No. 6210, 6211 Microdispenser and Tubes (10μl) Lint free tissue Arındırıcı solüsyon: 200ml deiyonize su, 200ml metanol ve 50ml glacial asidik asit karıştırın. 3

4 NUMUNE ALMA VE HAZIRLAMA Plastik veya silikonlu cam boyunca kullanılmalıdır. Kan (9 parça) % 3.2 veya% 3.8 sodyum sitrat antikoagülan (1 kısım) içine toplanmalıdır xg de 15 dakika boyunca santrifüj sonrası plazmayı ayırın. Plazma 2 6 C de tutulmalıdır. Testin yapılması için -70 C de 1 ay veya -20 C de 2 hafta boyunca dondurularak saklanan plazma veya örnek alma 2 saat içinde tamamlanmalıdır. Test öncesi 37 C de hızlıca eritin. 5 dakikadan daha fazla 37 C'de tutmayın. ADIM-ADIM PROSEDÜRE 1. Adım 1 için serbest Protein S tespiti veya Toplam Protein S tespitine göre prosedürü takip edin. Serbest Protein S Tespiti i. Standart malzeme ve kontrolleri dahil olmak üzere tüm örnekler 85ml plazmaya 15ml Serbest Protein S Reaktif ekleyerek ön çalışma yapmalıdır. Bu miktarlar değişebilir ama oranı aynı kalmalıdır. ASLA ön çalışma öncesi hasta ve kontrol örneklerini dilüe etmeyin. ii. Her bir örneği vorteksleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde tutun. iii. 10 dakika minimum1000 XG da her bir örneği santrifüj edin. Standart dilüsyonlar ve hasta dilüsyonları için süpernatantı ayırın. iv. Standart eğri yapmak için, aşağıdaki talimatlara göre 0.85% serum fizyolojik ile standart malzeme süpernatantı dilüe edin. v. Adım 2'ye geçin. Toplam Protein S Tespiti i. 1.0ml deiyonize veya distile su ile S.A.R.P. ın bir şişesini çözün. Aşağıdaki gibi Standart Eğri in hazırlanması için dilüsyonlar yapın: ii. 0.85% serum fizyolojik ile her bir hasta örneğini dilüe edin. Bir 1:2 oranında dilüsyon (1 part hasta örneği ve 1 part serum fizyolojik ) ve bir 1:4 oranında dilüsyon (1 part hasta plazması ve 3 parts serum fizyolojik ) hazırlayın. Ek dilüsyonlar hasta geçmişine bağlı olarak gerekli olabilir. Dilüe edilmemiş test edilecek şüpheli anormal örnekler gerekebilir. iii. Adım 2'ye geçin. NOT: Buzdolabından plakayı alın, kullanım öncesi aşırı nemin emilmesi ve C ye ulaşması için yaklaşık 5-20 dakika plakayı bekletin. 2. Tankın her bir iç kısmına 65ml Tris-trisin tamponu dökün. 3. Plaka kuyularından fazla olan tamponu alın. Plaka üzerindeki fazla nem kötü roketlere neden olabilir. 4. İlgili kuyulara 10μl dilüe hasta örnekleri ve kontrolleri uygulayın. 4

5 NOT: Standart eğri örnekleri her plaka üzerinde çalıştırılmalıdır. Hasta örnekleri için çift çalışma önerilir. Plaka kuyulara örnekler uygulandığında, pipet ucunu kuyuların köşesine değdirmeden çalışın, bu durum kuyulara zarara neden olabilir. 5. Agaroz içinde diffüze olması için örnekleri 5 dakika bekletin. 6. Yerine jeli yavaşça koyarak tankın iç kısmına, agaroz tarafı aşağı, plakayı yerleştirin. Kuyular tankın katot (-) tarafında ve agarın köşesi tamponun içinde olacak şekilde jeli (leri) yerleştirin saat için plaka başına 16mA sabit bir akımda plakaları elektroforez yapın. 8. Elektroforezin ardından tanktan plakaları çıkarın. Her bir çalışma sonrası tanktaki tamponu atın. NOT: Tankı boyamak ve durulamak için TITAN GEL Multi-Boyama Seti (Kat. No 1558) kullanın. 9. Deiyonize su ile plakayı durulayın ve 0,85% serum fizyolojikte bir gece yıkayın. 10. Gecelik yıkama sonrasında, deiyonize su ile plakayı durulayın. 11. Agaroz tarafı yukarı olacak şekilde düz bir yüzeye plakayı koyun. Tüysüz bir doku ile agarozu kapatın dakika için plaka üzerinde Development Weight ve 2-3 Blotter Pads koyun ve sonra alın. 13. Kuru bir plaka C'de dakika kurutma fırında plakayı kurutun. Plakaların üzerini kurutmayın. Plakaların kuruması tamamlandığında saydam olacaktır. NOT: Eğer bir kurutma makinesi / fırın yoksa, plakalar ıslak tüysüz doku ile örtülebilir ve C'de bir gece ya da iklim koşullarına göre C de 3 saat boyunca bir fan altında kuruması için bırakılabilir. 14. Kurutma ardından Rocket Boya içinde 20 dakika kadar daldırarak plakayı boyayın. 15. Plakayı 1-3 dakika boyunca boya arındırıcı solüsyon içine koyun. NOT: Kolayca roket pikleri ayırmak için arka plan yeterince temizlendiğinde boya arındırma tamamlanır. NOT: Aşırı boya arındırma zor doğru ölçüm yapan roketlerin rengini soldurabilir. Eğer boya arındırıcı üzerinde oluşursa, Adım 14 tekrarlayın ve yine roketleri boyayın. 16. Her bir durulama için 5-10 dakika saf su içinde plaka iki kez durulanır. 17.Kuruyana kadar C de ya da 5 dakika boyunca 37 C'de plakaları çıkarın. 18. Roketleri daha kolay görüntülemek için VuBox altına beyaz bir kağıt kullanarak Helena I.E.P. VuBox üzerine plakayı yerleştirin. İşaretleyici ile her bir roket pikin ucunu işaretleyin. 19. Helena Rocket Ruler kullanarak milimetre olarak her bir pikin uzunluğunu ölçün. Pik her bir kuyunun başından roketin uç tepesine kadar ölçülür. 20. Rocket Antijen Report Formunda yada 3 siklus yarı logaritmik kağıt üzerinde her roket yüksekliğine karşı standart eğri değerlerini çizin. Dört nokta için en uygun best line çizin. Tamamlanmış Rocket Plate in bir örneği için ve Rocket Antijen Report Formu üzerinde standart bir eğri çizmek için Şekil 1 ve 2 de SONUÇLARIN YORUMLANMASINA bakın. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Standart eğriden hasta değerlerini okuyun ve uygun dilüsyon faktörü ile her birini çarpın. S.A.R.P. standart eğrisi hazırlamak için kullanılırsa, dilüsyon faktörü yanında S.A.R.P. uygun lotunun atanmış Protein Antijen değeri ile çarpılan eğriden hasta değeri okunur. Eğriden alınana hasta değeri=30% Dilüsyon faktörü =2 S.A.R.P. verilen değer =98% Mevcut Hasta Faktör Protein S Antijen=30% x 2 x 0.98 = 58.8% Standart eğri aralığından daha büyük olan Protein S Antijen seviyeli hasta örnekleri uygun dilüsyonları kullanarak tekrar test edilmelidir. 5

6 Şekil 1: Bir Protein S Antijen Rocket Plaka üzerinde Rocket paternler. Standart dilüsyonların roket uzunlukları (milimetre olarak) Standart eğrisi hazırlamak için kullanılır. Hasta sonuçları eğriden okunur. Şekil 2: 3 siklüs yarı logaritmik kağıt üzerinde S.A.R.P. ile hazırlanan bir standart eğri örneği. İster doğuştan veya sonradan kazanılmış Protein S deki tüm azalma tromboemboli riskinde artışa neden olmaktadır. Tekrarlayan trombotik episod antikoagülan potansiyelinin azalmasından dolayı oluşur 3-6. Protein S düzeylerinde azalma aşağıdakiler sonucunda oluşur: * Protein S konjenital eksikliği tip I, biraz azalmış antijen düzeyi için normal ve antikoagülan aktivitede (serbest Protein S) bir azalma gösterilir. -tip II, her iki aktivitede ve Protein S in antijen düzeylerinde önemli bir azalma gösterir. * Karaciğer bozuklukları. * Oral antikoagülan tedavi. 6

7 KALİTE KONTROL Her bir laboratuar bir kalite kontrol programı oluşturmalıdır. Normal ve anormal kontrol plazmalar cihaz yeterliliğini ve işlem performansını sağlamak için hasta numunelerinin her bir lotu öncesi test edilmelidir. Eğer kontroller beklenildiği gibi yapılmazsa, hasta örnekleri geçersiz kabul edilir. Helena BioSciences bu ürünlerin kullanımı için aşağıdaki kontrolleri sağlar: Kat. No S.A.C.-1 Kat. No S.A.C.-2 REFERANS DEĞERLER Referans değerleri kullanılan tekniklere ve sistemlere bağlı laboratuarlar arasında değişebilir. Bu nedenle, her laboratuar kendi normal aralığını oluşturmalıdır. Protein S antijen değerleri genelde toplanmış normal plazma standardına göre relatif yüzde olarak ifade edilir. Toplam Proteinler: Normal aralık çalışması 25 erkek ve 25 kadın olan elli (50) normal sağlıklı yetişkinden oluşmuştur. Sağlıklı kadın ve erkekler arasında Protein S antijen aralık düzeylerinde hiçbir fark görünmez. Roket elektroforezi çalışılması ile Protein S antijeni için beklenen normal aralık % idi. Örnekler sağlık durumları iyi olan 18 ve 65 yaşları arasında olan bağışçılardan alınır; bağışçılar 6 ay içinde herhangi bir cerrahi operasyon geçirmemiş olmalıdır ve normal hemoglobin, hematokrit ve sıcaklığa sahip olmalıdır ve antibiyotik gibi hiçbir ilaç almamış olmalıdır. Serbest Protein S: Bu yöntem ile oluşturulan normal serbest Protein S düzeyi 57% - 120% aralığında rapor edilmiştir 5. Helena 31 plazmayı test etti ve 42% den 147% ye örnek konsantrasyonunun gerçek aralığını tespit etti. Her laboratuar kendi normal aralığını oluşturmalıdır fakat Protein S antijen için henüz uluslararası standart kabul edilmemiştir. SINIRLAMALAR 10 IU / ml ye kadar heparinli örnekler Helena Protein S antijen testinin sonuçlarını etkilemez. Oral antikoagülan tedavisi olan hastalar protein S antijen düzeyinde azalma işareti gösterir. Serbest Protein S düzeyi toplam Protein S in ölçümünü etkilemez. Başka hiçbir madde bu prosedürü ile müdahalede bulunmamıştır. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Helena BioSciences veya temsilcileri bir kılavuz olarak aşağıdaki performans özelliklerini belirlemiştir. Her laboratuvar kendi performans verilerini oluşturmalıdır. Presizyon Araştırmalar bir plaka üzerinde tekrarlanma kullanılarak bir kontrol materyali ile yapıldı. 7

8 Karşılaştırma Korelasyon çalışmaları Helena Protein S yöntemi ve referans yöntemi kullanarak yapılmıştır. Örnekler normal çalışma için aynı kriterler ile birlikte kullanıldı. Aşağıdaki veriler elde edildi. Duyarlılık Bu prosedür için duyarlılık S.A.R.P gibi toplanmış normal plazmaya göre relatif yüzde olarak ifade edilir. Normal standart eğride en yüksek değerinden daha büyük hasta değerleri dilüe edilmeli ve tekrar test edilmelidir. Helena Protein S Kit için duyarlılık eşiği % 6 oranında normal insan seviyesine sahiptir. Özgüllük Özgüllük bilinen Protein S eksikliği plazmalar üzerinde yapıldı Çift Difüzyon (Ouchterlony) plaka ve pıhtılaşma proteinleri ile ilişkili antiserumların çeşitli dilüsyonlarını kullanarak doğrulandı. Helena Protein S Kit optimum konsantrasyonda keçi antihuman Protein S kullanır. BİBLİYOGRAFİ 1. Laurell, C.B., Electroimmuno Assay, Scan J Clin Lab Invest, 29 Suppl 124:21-37, Laurell, C.B., Quantitative Estimation of Proteins by Electrophoresis in Agarose Gel Containing Antibodies. Anal Biochem, 15:45-52, Schwarz H.P., et al, Plasma protein S deficiency in familial thrombotic disease. Blood, 64: , Comp P.C., et al., Familial protein S deficiency is associated with recurrent thrombosis. J Clin Invest, 74: , Comp P.C., et al., An abnormal plasma distribution of protein S occurs in functional protein S deficiency. Blood, 67: , Kamiya T., et al., Inherited deficiency of protein S in a Japanese family with recurrent venous thrombosis: a study of three generations. Blood, 67: , Dahlback, B., Purification of human vitamin K-dependent protein S and its limited proteolysis by thrombin. Biochem Jour, 209:827,