C V C. Biofortuna SSPGo TM HLA Tiplendirme Kitleri için Kullanım Talimatları CE Revizyon 5, Ocak Kullanım Amacı

Transkript

1 DOT120v8: Biofortuna SSPGo TM HLA Tiplendirme Kitleri için Kullanım Talimatları, CE Revizyon 5 Sayfa 1 / Kullanım Amacı Biofortuna SSPGo TM HLA Tiplendirme Kitleri için Kullanım Talimatları CE Revizyon 5, Ocak 2014 Biofortuna HLA SSPGo Kitleri, 'düşük çözünürlüklü' kitlerde HLA allellerini ya da 'ara / orta seviye' çözünürlüklü kitlerde gruba özgü allel amplifikasyonunu belirlemeye yönelik DNA tabanlı kalitatif kitlerdir. Orta seviye çözünürlüğün yaygın tanımı, sonuçların büyük bir kısmının iki basamak seviyesinde açıkça tanımlanmasıdır; örn. DQB1*02, DQB1*05 vb. Yüksek çözünürlük ise genellikle, allellerin büyük bir kısmının DQB1*02:01, DQB1*05:01 vb. gibi dört basamak seviyesinde olması şeklinde tanımlanır. Bu ürün, yalnızca eğitimli personel tarafından kullanılmak üzere tasarlanmış bir in vitro diagnostik üründür. 2. Giriş HLA molekülleri, immünitede ve kendi ile kendi olmayanın tanınmasında kilit rol oynar, bunun sonucunda çoğu transplantasyon biçimi öncesinde HLA genotipleme ve HLA eşleştirme uygulanması zorunludur. HLA antijenleri, T hücre aracılı immün yanıtlarının özgünlüğünü kısıtladığı için, HLA genotipleme her tür immün bozuklukta ya da patojenlere, aşılara ya da tıbbi tedaviye karşı immün yanıtında yararlı bir araştırma aracıdır. HLA genotipleme ayrıca belirli HLA allellerinin hastalık durumlarıyla belirgin şekilde ilişkili olduğunun gösterildiği durumlarda hastalık tanısını desteklemek için de kullanılabilir. Çoğu HLA geni yüksek derecede polimorfik olup HLA antijenlerinin doğru bir şekilde belirlenmesi için genellikle DNA genotiplemesi gerekmektedir. Dizilime Özgü Primerlerin (SSP) 1 kullanıldığı PCR genotipleme, özellikle orta seviyede çözünürlüğün gerektiği durumlara uygun, hızlı bir HLA genotipleme yöntemidir. Biofortuna SSP kitlerinin hepsi, polimeraz da dahil, tamamen kurutulmuş reaksiyonlar gösterir, bu sayede PCR öncesinde kullanıcının yapması gereken tek şey DNA eklemektir. Kitlerin yeni IMGT HLA uyumlulaştırma sürümleri ile güncellenmesi için her tür çaba gösterilmektedir. güncellemelerine adresinden ulaşılabilir. Kit 3. Test Açıklaması PCR SSP, yalnızca hedef dizilimle tamamen eşleşen 3' terminale sahip primerlerin amplifiye olacağı prensibine dayanır. Eşleşmeyen primerler pozitif amplifikasyon ürünleri vermez 2. Her bir PCR reaksiyon karışımında, bir housekeeping genin korunaklı bölgesini amplifiye eden bir dahili kontrol primer çifti bulunur; dahili kontrol primer çifti PCR reaksiyonunun bütünlüğünü belirtir. SSP genotiplemede genellikle, birlikte analiz edildiklerinde genotipi belirten birden fazla reaksiyon kullanılır. Amplifiye edilmiş ürünler, DNA fragmanlarını boyutlarına göre ayıran agaroz jel elektroforez sistemleri kullanılarak görüntülenir.

2 DOT120v8: Biofortuna SSPGo TM HLA Tiplendirme Kitleri için Kullanım Talimatları, CE Revizyon 5 Sayfa 2 / Kit İçeriği Polipropilen PCR plakası ya da şeridi, 8 ila 96 PCR kuyusundan oluşur (kite bağlı), her kuyu önceden dispens edilmiş ve dondurularak kurutulmuş primer, polimeraz, dntp'ler* ve tampon içerir. Her bir plaka ya da şerit, sızdırmaz bir katman veya kapakla kapatılmış biçimde, kurutucu torba içeren bir folyo poşetin içinde ayrı olarak paketlenir. PCR yalıtım katman veya kapakları 1x Kullanım talimatları. Analiz sertifikası Yorum tabloları ve MSDS, Biofortuna web sitesinin bulunduğu adresinden indirilebilir. Web sitesinden içerik indiremiyorsanız lütfen yerel ürün sağlayıcınız ile iletişim kurun. *CleanAmp dntp'leri, Trilink Biotechnologies Inc tarafından Biofortuna SSPGo ürünlerinde kullanılmak üzere lisanslanmıştır. 5. Temin Edilmeyen Reaktifler ve Donanım Kalibre edilmiş uygun pipetleyici ve steril uçlar örn. 10 µl'lik filtre uçlarına sahip P10 pipetleyici. DNA izolasyon kiti/donanımı. UV spektrofotometresi. Polipropilen tüpler. Steril moleküler kalitede su. Aşağıdaki özelliklere sahip bir termal sayklır kullanılmalıdır: Isıtılmış kapağı bulunan 96 kuyulu termal sayklır. Yağsız işlem için 104 C sıcaklıkta olmalıdır. 1,0 o C/saniye rampa hızı 4,0 C - 99,9 C sıcaklık aralığı 35 C - 99,9 C sıcaklıklar arasında ±0,25 C sıcaklık hassasiyeti Bir referans standardıyla izlenebilen sıcaklık kalibrasyonu Termal sayklır, aşağıdaki Bölüm 8 de belirtilen PCR Döngü Parametrelerine göre programlanmalıdır Not: Termal sayklır ile ilgili ayrıntılı bilgi için üretici firmanın kullanım kılavuzuna başvurunuz. Termal sayklır, ASHI (American Society of Histocompatibility and Immunogenetics) veya EFI (European Federation of Immunogenetics) akreditasyon kurallarına göre kalibre edilmelidir. Jel elektroforez reaktifleri (agaroz, 0.5x TBE, 1000 bp DNA m oleküler ağırlık belirleyicisi, 10 mg/ml Etidyum Bromür). Jel elektroforez donanımı (jel depoları, güç kaynağı, UV transillüminatörlü jel dokümantasyon sistemi). SSPGo kit testi sonuçlarının manuel analiz ve arşiv veri depolama yardımcı Yazılım Biofortuna web sitesinden indirilebilir. Not: Belirtilen koşullarda yapılan herhangi bir değişiklik; örneğin sayklır rampa hızının değiştirilmesi, test sonuçlarının yorumlanmasını etkileyebilir. 6. Güvenlik ve Uyarılar İn vitro diagnostik kullanım içindir. Testler yalnızca uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından yapılmalıdır. Tüm tiplendirme sonuçları vasıflı personel tarafından doğrulanmalı ve eğer klinik karar için kullanılıyorsa sonuçlar başka bir tiplendirme yöntemi kullanılarak onaylanmalıdır. Tüm reaktifleri İyi Laboratuvar Uygulaması uyarınca ele alın. PCR öncesi ve sonrası alanları birbirinden ayrı tutun. PCR sonrası malzemeleri PCR öncesi alana getirmeyin. Biyolojik Tehlike Uyarısı: Tüm kan ürünlerini potansiyel bulaşıcı olarak işleme alın. Biyolojik Tehlike Uyarısı: Etidyum Bromür potansiyel bir karsinojendir. Bu maddeyi kullanıyorsanız, daima eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük kullanın. Biyolojik Tehlike Uyarısı: UV kaynaklar kullanırken dikkatli olun - daima eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük kullanın. Doğrudan UV ışık kaynağına bakmayın.

3 DOT120v8: Biofortuna SSPGo TM HLA Tiplendirme Kitleri için Kullanım Talimatları, CE Revizyon 5 Sayfa 3 / 11 Madde Güvenlik Veri Sayfalarına adresinden ulaşılabilir. 7. Saklama ve Stabilite Biofortuna SSPGo kitleri 2-28 C'de saklanmalıdır. PCR kapları, folyo torbalardan çıkarıldıktan sonra reaktifler 3 saat içinde DNA ile rehidrasyona tabi tutulmalıdır. Son kullanma tarihi için ambalaja bakın. Basılı tarih geçtikten sonra ürünleri kullanmayın. Folyo torba yırtılmış ya da delinmişse veya içinde kurutucu torba bulunmuyorsa kitleri kullanmayın. Sadece kutuda bulunan sızdırmazlık katman ve kapaklarını kullanın, bu aşama atlandığında PCR amplifikasyonu sırasında buharlaşmaya sebep olabileceği için, DNA ekledikten sonra PCR kaplarının sızdırmazlığının sağlam bir şekilde sağlandığından emin olun. Kenarlara ve köşelere özellikle dikkat edin. Not (1): Gerektiğinde, poşetinden çıkarılmış non-hidrate PCR plakaları ve şeritleri DNA eklenmesinden en fazla 3 saat öncesine kadar 21 o C ye kadar sıcaklıkta ve %60 ın altında nem oranında saklanabilir. Not (2): Yeni açılmış poşetlerden çıkarılan PCR şerit ve plakaları, DNA ile hidrate edildikten s onra, kuyular buharlaşmayı önleyecek şekilde kapatıldığı takdirde 24 saate kadar, 2 8 C de PCR basamağı öncesinde bekletilebilir. 8. Kullanım Yönergeleri DNA Numunesi Gereklilikleri Testteki her reaksiyon ng arası DNA kullanılacak şekilde optimize edilmiştir, ancak her bir reaksiyonun tam olarak 10 µl sıvıyla rehidrasyona tabi tutulması büyük önem taşır. Dolayısıyla test, yalnızca 10 µl DNA ile 5-10 ng/µl'de yapılabilir. DNA, gerekli konsantrasyona yalnızca steril moleküler kalitede su ile dilüe edilmelidir. Dikkat: Son DNA örneğinin 2,5mM Tris/0,25mM EDTA dan fazlasını içermediğinden emin olunuz. Yalnızca Sitrat ve EDTA ile toplanmış örneklerden ekstrakte edilmiş DNA kullanınız. Heparin PCR'yi engelleyebileceği için, DNA'nın heparinize edilmiş kan numunelerinden ekstrakt edilmemesi önerilir. DNA örneklerinde 1 mg/dl den çok hemoglobin bulunduğunda, SSPGo HLA kitleriyle etkileştiği gösterilmiştir. DNA, tüm geleneksel ekstraksiyon yöntemleriyle ekstrakte edilebilir. DNA numunesindeki OD 260/280, UV spektrofotometrisi ölçümüne göre 1,66 ile 1,94 arasında olmalıdır. PCR Öncesi Yönergeleri i. Sızdırmazlığı sağlanmış bir poşetten bir SSPGo plakası ya da şeridini çıkarın. ii. Tetkiğin ürün lot numarasını not alın. iii. Katman veya kapağı açmadan önce, dondurularak kurutulmuş tüm peletlerin (PCR reaktifleri) plaka veya tüp kuyularının dibinde olduğundan emin olun. Değilse; peleti tüpün altına indirmek için hafifçe vurun. Her bir test lokusuna ait ilk reaksiyon renginin kitin geri kalanına göre daima soluk pembe olduğuna dikkat edin. (Hidrateyken kırmızı).bazı PCR plakaları, plakanın son kuyusunda mor renkli bir tümleşik şablonsuz kontrol reaksiyonu içerir. iv. Steril donanım kullanarak plaka ya da şeridin her bir reaksiyonuna 10 µl DNA çözeltisi pipetleyin. Bölüm 8'de, DNA Numunesi Gerekliliklerine ilişkin nota bakın. Plaka mor renkli bir tümleşik şablonsuz kontrol içeriyorsa, bu durumda 10 µl numune dilüenti (DNA'sız) gözeneğe pipetleyin. Bölüm 8'de, Şablonsuz Kontrole ilişkin nota bakın. v. Termal döngüden önce, DNA'nın her bir reaksiyondaki kuru reaktiflere temas ettiğinden emin olun. vi. Kutudan çıkan sızdırmazlık katmanıyla ya da PCR tüpü kapaklarıyla reaksiyonların sızdırmazlığını sağlayın. Buharlaşmayı önlemek için sızdırmazlık mührünün mümkün olduğunca sıkı olduğundan emin olun. Kenarlara ve köşelere özellikle dikkat edin.

4 DOT120v8: Biofortuna SSPGo TM HLA Tiplendirme Kitleri için Kullanım Talimatları, CE Revizyon 5 Sayfa 4 / 11 vii. viii. Tepsi ya da şeritleri doğrudan termal sayklırın içine yerleştirin. Kapların blok içine tamamen girdiğinden ve kapağın tam olarak sıkıştırıldığından emin olun. Bunların yapılmaması PCR buharlaşması ve kondensasyonuna bağlı tekil PCR arızalarına yol açabilir. PCR programını çalıştırın (bkz. PCR Parametreleri). YENİDEN SÜSPANSİYON HALİNE GETİRME NOTU: PCR kuyularının folyo poşetten çıkarılmasını takiben reaktifler DNA ile hemen yeniden hidrate edilmelidir. Ek bilgi içi Not (1) ve Not (2) ye başvurun. ŞABLONSUZ KONTROL NOTU: Bazı kitler, plaka üzerindeki nihai reaksiyon olarak bir Şablonsuz Kontrol (NTC) içerir. Bu reaksiyon kendini diğer reaksiyonlardan ayıracak bir mor renklendirici içerir. NTC, PCR kontaminasyonunu ya da DNA'nızı yeniden süspansiyon haline getirmek için kullanılan suda mevcut olabilen genomik DNA kontaminasyonunu saptamak için tasarlanmıştır. PCR kontaminasyonu mevcutsa çeşitli boyutlarda amplikonlar gözlemlenir. PCR PLAKA/ŞERİT YÜKSEKLİK PROFİLİ NOTU: Aynı PCR makinesine yerleştirildiklerinde plakaların ve şeritlerin yükseklik profilinin eşdeğer olması önerilir. Yükseklik profillerinin farklı olması PCR makinesinin ısıtılan kapağıyla yeterli temas sağlanmamasına sebep olabilir. Bu da, yetersiz ya da başarısız PCR amplifikasyonuna yol açabilir. PCR Parametreleri Aşağıdaki PCR parametrelerinin kullanılması gerekir. Rampanın saniyede 1 C hıza sahip olduğundan emin olun ve ısıtılan kapağı etkinleştirin. Kullanım talimatları için lütfen termal sayklır üreticisinin kullanım kılavuzuna bakın. Termal sayklırlar, American Society of Histocompatibility and Immunogenetics (ASHI) veya European Federation of Immunogenetics (EFI) akreditasyon kuralları uyarınca kalibre edilmelidir. 94 C'de 5 dakika denatüre edin 96 C'de 15 saniye denatüre edin 66 C'de 50 saniye sertleştirin 10 döngü 72 C'de 30 saniye genişletin 96 C'de 15 saniye denatüre edin 64 C'de 50 saniye sertleştirin 20 döngü 72 C'de 30 saniye genişletin Jelleri çalıştırmadan önce 15 C de en fazla 72 saate kadar bekletebilirsiniz. Gerektiğinde PCR plakası, jeller çalıştırılmadan önce 2 8 C de 24 saate kadar saklanabilir. Plakaların sızdırmazlığından her zaman emin olunuz. Jel Elektroforezi Bu talimatlar yatay agaroz jel elektroforezi için geçerlidir: 0.5x TBE tampon içinde %2'lik agaroz jeli hazırlayın. Jel soğuyarak yaklaşık 60 C'ye düştüğünde, 0.5 µg/ml'lik nihai konsantrasyona sahip olacak şekilde etidyum bromür ekleyin. Jeli eritin ve içine mikrotitre biçimlendirme tarakları sokun (örn. 9 mm boşluklu 12x8 kuyu). Katılaştıktan sonra, tarakları çıkarın ve jeli 0.5x TBE tampon içine kapatın. Tüm PCR ürününü sırayla, her reaksiyonun pozisyonuna dikkat ederek, %2 agaroz jele yükleyin bp'lik bir merdiven kullanımı, boyutun belirlenmesine yardımcı olarak önerilir. Jeli 20 dakika boyunca 10 V/cm'de çalıştırın. Özel donanım ayrıntıları için elektroforez sistem üreticisinin kullanım talimatlarına bakın. Jeller, UV transillüminatörlü bir UV jel dokümantasyon sistemi kullanılarak görüntülenmelidir. Not: Yetersiz elektroforez, 600bp üzerindeki büyük amplikonların kontrol amplikonuyla birleşmesine neden olabilir. Böyle amplikonların gözlenmesi için elektroforezin yeterli olduğundan emin olun. Çok uzun süreli elektroforez, küçük amplikonların jelde bulunan önceki kuyulara geçmesiyle sonuçlanabilir.

5 DOT120v8: Biofortuna SSPGo TM HLA Tiplendirme Kitleri için Kullanım Talimatları, CE Revizyon 5 Sayfa 5 / Yorum SSPGo kitleri, adresinde bulunan yorum tablolarının kullanılmasıyla sonuçların manuel olarak belirlenebileceği şekilde tasarlanmıştır. Web sitesine ulaşmakta sorun yaşarsanız lütfen yerel ürün sağlayıcınız ile iletişim kurun. Yorum tabloları, yorumla ilişkili olabilecek lota özgü notlar içerebilir. Jelin fotoğrafını, kit ve lot numaralarını eşleştirerek ilgili yorum formuna tutturun. Jel resmini inceleyin. Her reaksiyon bir pozitif kontrol bandı içermelidir. Bu farklı SSPGo ürünlerinde farklı boyutta olabileceği için yorum tablolarına bakın. Allele özgü bantlar mevcut olduğunda dahili kontrol bantları çok daha zayıf görünebilir. Eğer allele özgü bir bant mevcutsa fakat kontrol bandı mevcut değilse, bu yine de pozitif sonuç olarak değerlendirilmelidir. 70 bp'den düşük bantları, bunlar bağlanmamış primerler olduğu için yoksayın. Pozitif reaksiyonları belirleyin. Pozitif reaksiyonları, yorum tablolarında belirtildiği gibi, beklenen boyutlardaki bantlar ifade eder. Verili bir reaksiyonda birden fazla ürün boyutu olabileceğini aklınızda tutun bunlar çoklamalı reaksiyonlar olup yorum tablolarında belirtilmektedir. Pozitif reaksiyonları yorum tablolarıyla karşılaştırın. Reaksiyonda görülen bir pozitif sonuç, yorum tablosunda bunun karşısında listelenen allellerden en az birinin mevcut olduğunu belirtir. Herhangi bir verili allel çeşitli tüplerde amplifiye olabilir allel mevcutsa, ilgili tüm reaksiyonlarda bir pozitif reaksiyon olmalıdır. Kontrol Bandı Allele Özgü Bant Elektroforez yönü Şekil 1 Allele özgü bantlar ve kontrol bantlarının mevcudiyeti ile belirtilen pozitif reaksiyon (reaksiyon 1-3); kontrol bantlarının mevcudiyeti allele fakat özgün bantların mevcut olmaması ile belirtilen negatif reaksiyon (reaksiyon 4-7); ve herhangi bir bandın mevcut olmamasıyla belirtilen başarısız reaksiyon (reaksiyon 8) örnekleri. Kit lot numarasının yorum tablosundaki lot numarasıyla doğru bir şekilde eşleştiğinden emin olun. SSPGo kit testi sonuçlarının manuel analiz ve arşiv veri depolama yardımcı Yazılım Biofortuna web sitesinden indirilebilir. 10. Kalite Güvence ve Kalite Kontrol Herhangi bir ürün Biofortuna'dan ayrılmadan önce her SSPGo lotukalite kontrolünden geçer. Doğruperformanstan emin olmak için, her kit lotundaki numuneler, tanımlı bir insan DNA numunesi paneli ile karşılaştırılarak kontrol edilir. Her reaksiyon en az 47 adet iyi karakterize edilmiş hücre çizgisi DNA numunesiyle karşılaştırılarak doğrulanmıştır. Biofortuna, her laboratuvarın tüm tiplendirme ürünlerini klinik numuneler üzerinde kullanmadan önce dahili olarak doğrulamasını önerir. Diagnostik tiplendirme işlemini yalnızca tam olarak eğitilmiş ve vasıflı personel uygulamalı ve sonuçlar, başka bir eğitimli üye ya da çalışan tarafından çapraz kontrolden geçirilmelidir. 11. Klinik veri Beş test merkezinde; SSPGo HLA Tiplendirme Kitlerini, doğrulama cihazı One Lambda Labtype SSO ile karşılaştıran in vitro tetkik cihazı çalışması gerçekleştirilmiştir. SSPGo çalışması için yapılan lokus tiplendirmede HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DPB1, DPA1 ve HLA-DQA1*05, DQB1*02, DQ8 için sonuç sağlanmıştır. SSPGo HLA Tiplendirme Kitlerinin klinik performansı, tam kandan 5-10ng/μl da derive edilen DNA testlerinde -Klas I ve Klas II HLA allellerinin genotiplendirilmesinde %95 üzerinde güvenilirlikle- doğrulama cihazıyla (SSO yöntemi) toplamda %98,3 %100 konkordans göstermiştir.

6 DOT120v8: Biofortuna SSPGo TM HLA Tiplendirme Kitleri için Kullanım Talimatları, CE Revizyon 5 Sayfa 6 / 11 Üç (3) doğrulanmış non -konkordan genotiplendirme sonucu dışında, ABD ve Birleşik Krallık klinik test sahalarında çalışılan 1222 örnek, her test kitinin 3 lotunda %100 konkordans göstermiştir. SSPGo HLA Tiplendirme kitlerinin sahadan sahaya tekrar edilebilirliği, test kiti konsantrasyon aralığının iki uç noktası olan 4ng/μl ve 11ng/μl de formüle edilmiş DNA örneklerine karşı 8 SSPGo PCR reaksiyonundan oluşan bir temsil paneli kullanılarak üç merkezce değerlendirilmiştir. Üç dış sahaya eşit olarak dağıtılmış 960 tekil reaksiyondan 958 i DNA örnekleriyle konkordans göstererek toplamda %99,7 konkordansla (0,995 LCL) sonuçlanmıştır. Lottan lota tekrar edilebilirlik, bir örnek SSPGo HLA Tip kitinin 3 lotunda tek bir saha/operatör tarafından 5-10 ng/μl konsantrasyon aralığında DNA kullanılarak değerlendirilmiştir. SSPGo HLA Tip testi için lottan lota tekrar edilebilirlik, toplam 390 testte örnek SSPGo HLA Tip testlerinin üç (3) lotunda test edilen 130 DNA örneğinin tamamında (130/130) doğrulama cihazıyla %100 konkordan bulunmuştur. LABType SSO ile test edilmiş klinik örneklerle karşılaştırmalı test yapılarak Klas I ve Klas II allelleri için konkordan SSPGo HLA pozitif doğrulaması alınmıştır. SSPGo dahili testinde; bazı nadir HLA-DPB1 allelleri, nadir HLA-B allelleri ve B*59:01, B*78, B*83:01 allel grupları gibi bulunmayan bazı örnekler dışında, referans DNA örnekleriyle konkordan sonuçlar elde edilmiştir. Aşağıdaki nadir allel grupları doğrulanmamıştır: B*59, B*78, B*83, DPB*21:01, DPB*26:01:02, DPB*27:01, DPB*28:01, DPB*29:01, DPB*31:01, DPB*34:01, DPB*35:01:01, DPB*39:01, DPB*45:1, DPB*46:01, DPB*51:01, DPB*55:01, DPB*59:01, DPB*63:01, DPB*81:01, DPB*85:01 & DPB*105: Referanslar 1) Bunce M et al Tissue Antigens Nov;46(5): ) Saiki RK et al. Nature Nov 13-19;324(6093): SSPGo Sorun Giderme Kılavuzu Sorun Olası Neden Çözüm Yolu Hiçbir reaksiyonda amplifikasyon olmuyor Yanlış DNA konsantrasyonu kullanılmaktadır DNA miktarını OD 280 de ölçerek ölçün ve reaksiyon başına 10 µl'lik bir hacme toplamda ng DNA'nın eklendiğinden emin olun. DNA numunesinde PCR inhibitörleri vardır Heparinize edilmiş kan kullanmayın. 1 mg/dl nin üzerinde hemoglobin içeren DNA numunelerinden kaçının. Düşük kaliteli DNA numunesi kullanılmaktadır DNA kalitesini ölçün. OD 260/280 oranı, UV spektrofotometrisiyle ölçüldüğünde 1,66 1,94 olmalıdır. Kullanmadan önce DNA'nın çözelti içinde tamamen yeniden süspansiyon haline geldiğinden emin olun. Reaktifler tamamen yeniden süspansiyon haline gelmemiştir Termal sayklır doğru bir şekilde ayarlanmamıştır DNA örneğinin moleküler kalitede su ile dilüe edildiğinden ve en fazla 2,5mM Tris/0,25 mm EDTA içerdiğinden emin olun. DNA eklendikten sonra peletlerin tamamen rehidrasyona tabi tutulduğundan emin olun. Reaksiyon başına 10 µl DNA çözeltisi kullanıldığından emin olun. PCR programının kullanım talimatları uyarınca doğru bir şekilde girildiğinden emin olun.

7 DOT120v8: Biofortuna SSPGo TM HLA Tiplendirme Kitleri için Kullanım Talimatları, CE Revizyon 5 Sayfa 7 / 11 Sorun Olası Neden Çözüm Yolu Termal sayklırın ısıtılmış kapağının yerine geçmiş olduğundan ve yeteri kadar sıkıldığından emin olun. Elektroforez sorunları Daha fazla yardım için termal sayklırın kullanım talimatlarına bakın. Elektroforez deposuna güç gittiğinden emin olun güç paketini kontrol edin ve elektrotları temizleyin. Kontrol ve/veya allele özgü amplikonların rasgele atlanması. Plakaların sızdırmazlığı doğru bir şekilde sağlanmamıştır. Jel hataları Termal sayklır sorunları Jeli 0,5X TBE tampon içinde çalıştırın. 0,5 µg/ml taze etidyum bromür kullanıldığından emin olun. Jelleri görüntülerken yeterli UV illüminasyonu olup olmadığını kontrol edin. Daha fazla yardım için jel deposu ve güç paketi üreticisinin talimatlarına bakın. Plaka dokunulmazlığının yeterli bir şekilde sağlanmaması PCR sırasında buharlaşmaya sebep olabilir. Biofortuna önerilen sızdırmazlık katmanlarını kit dâhilinde temin eder. Daha fazla malzeme için lütfen yerel ürün sağlayıcınızla iletişime geçin. Tüm kuyular arasında yeterli sızdırmazlık materyali olduğundan emin olun. PCR plaka ya da şerit kenarlarına yakın kuyulara özellikle dikkat edin. Tüm kuyuların jel üzerine doğru sırayla yüklendiğinden ve her birine aynı hacimde PCR reaksiyonu eklendiğinden emin olun. Pipetleyicileri üretici talimatlarında açıklanan şekilde kalibre edin. Jel içinde kuyuların düzgün bir şekilde oluşup oluşmadığını kontrol edin. Kuyuların alt kısmı yırtılabileceği için tarakları çıkarırken dikkatli olun. Jeli eritmeden önce agarozun tamamen çözündüğünden emin olun. Küçük amplikonlar uçtan kaçabileceği için jelin fazla uzun bir süre çalıştırılmadığından emin olun. Jelin, bantların ayrılmasına yetecek kadar uzun süre çalıştırıldığından emin olun. Taze etidyum bromür çözeltisi kullanın. Özellikle tetkik kenarı çevresindeki arızalar kapağın yeteri kadar sıkılmamasından kaynaklanabilir. Bu durum, PCR reaksiyonunun buharlaşmasına ve PCR kuyusunun

8 DOT120v8: Biofortuna SSPGo TM HLA Tiplendirme Kitleri için Kullanım Talimatları, CE Revizyon 5 Sayfa 8 / 11 Sorun Olası Neden Çözüm Yolu yarısına kadar yoğunlaşmasına sebep olabilir ve PCR arızasına yol açabilir. Termal sayklırınızın bakımı ve kalibrasyonu için üretici talimatlarına uyduğunuzdan emin olun. Buharlaşma sorunları DNA sorunlarına bağlı sporadik arıza PCR parametrelerinin kullanım talimatları uyarınca doğru olup olmadığını kontrol edin. Tüm kuyular arasında yeterli sızdırmazlık materyali olduğundan emin olun. PCR plaka ya da şeritlerinin kenarlarına yakın kuyulara özellikle dikkat edin. Isıtılmış kapağın etkinleştirildiğinden ve kapak aracılığıyla yeterli sıkıştırma uygulandığından emin olun. Kitten çıkan Biofortuna sızdırmazlık katmanlarının kullanıldığından emin olun. Daha fazla malzeme için lütfen yerel ürün sağlayıcınızla iletişime geçin. DNA yoktur: Tüm kuyularda DNA olduğundan emin olun. Yanlış hacim: Her reaksiyona 10 µl DNA çözeltisi eklendiğinden emin olun. Fazla DNA eklenmiştir: 200 ng'den yüksek veya 20 ng den düşük konsantrasyonlar PCR arızasına sebep olabilir. DNA'daki kontamine edici maddeler sporadik ya da yaygın amplifikasyon arızasına sebep olabilir. Lekeli Jel Görüntüsü DNA DNA konsantrasyonu ve saflığını kontrol edin. PCR reaksiyonlarına fazla DNA eklenmesi lekeli jel görüntülerine sebep olabilir. Düşük veya degrade saflık derecesi sorunun nedeni olabilir. Yeni bir DNA örneği elde edin. Zayıf amplifikasyon. DNA konsantrasyonu sorunu DNA konsantrasyonunu kontrol ederek ne fazla yüksek ne de fazla düşük olduğundan emin olun. Reaksiyon başına, 10 µl içinde ng DNA hedefleyin. Termal sayklır sorunları Termal sayklırınızın bakımı ve kalibrasyonu için üretici talimatlarına uyduğunuzdan emin olun. Jel hataları PCR parametrelerinin kullanım talimatları uyarınca doğru olup olmadığını kontrol edin. Her kuyuya, 5 µl ila 10 µl arasında olacak şekilde, aynı hacimde reaksiyon eklendiğinden emin olun. Pipetleyicileri üretici talimatlarında açıklanan şekilde kalibre edin. Taze etidyum bromür çözeltisi kullanın. Özgün olmayan DNA konsantrasyonu sorunu DNA konsantrasyonunu kontrol ederek ne fazla yüksek

9 DOT120v8: Biofortuna SSPGo TM HLA Tiplendirme Kitleri için Kullanım Talimatları, CE Revizyon 5 Sayfa 9 / 11 Sorun Olası Neden Çözüm Yolu amplifikasyon ne de fazla düşük olduğundan emin olun. Reaksiyon başına, 10 µl içinde ng arası DNA hedefleyin. Reaksiyonlar yanlış sırada yüklenmiştir PCR ve jel şeritlerinin hizasını kontrol edin. Fazla yükleme yapmamak ve tarakları çıkarmadan önce jelin katılaştığından emin olmak suretiyle elektroforezde bitişik kuyulardan fiziksel taşmayı önleyin. Amplifikasyon yapısı yorumlanabilir değil Yeni allel tanımlanmıştır Bir artefaktın özgün bir bant olarak yanlış yorumlanması Reaksiyonlar yanlış sırada yüklenmiştir Tekil PCR arızası Küçük amplikonlar eksiktir Numunede yeni allel tanımlanmıştır Yeni bir amplifikasyon yapısıyla, önceden dizilime tabi tutulmamış alleller mevcut olabilir. Eski yorum sayfaları kullanıyorsanız, bu durumda adresinden daha güncel bir uyumlulaştırma güncellemesi indirin. Bu yeni yapıyla uyum sağlamazsa, farklı bir Biofortuna kiti kullanarak kontrol etmeniz ya da dizilimi dizilim tabanlı tiplendirme ile tanımlamanız gerekir. Doğru bant boyutu için ilgili Yorum Tablolarını kontrol edin. Tüm özgün amplifikasyonların doğru boyutta olup olmadığını ya da bir artefaktın (taşınma, primer dimer) amplifikasyon olarak yanlış yorumlanıp yorumlanmadığını kontrol edin. PCR ve jel şeritlerinin hizasını kontrol edin. Tüm dahili pozitif kontrollerin mevcut olup olmadığını kontrol edin. Herhangi bir reaksiyonu eksik bırakmadan yeniden yorumlayın. Fazla elektroforez uygulanmıştır, küçük amplikonlar jelin ucundan kaçmış ya da etidyum bromürden oluşan ön kısmı geçmiştir veya önceki jel kuyusuna girerek dağılmıştır. Jel sisteminiz için uygun elektroforez koşulları kullanın. Mevcut allellere karşılık gelmeyen bir amplifikasyon yapısına yol açacak şekilde, kimi zaman yeni alleller keşfedilebilir. Lütfen yerel ürün sağlayıcınız ile iletişim kurun.

10 DOT120v8: Biofortuna SSPGo TM HLA Tiplendirme Kitleri için Kullanım Talimatları, CE Revizyon 5 Sayfa 10 / Revizyon Geçmişi Revizyon: 4. Versiyondan 5. Revizyona Revizyon tarihi: 21 Ocak 2014 Bölüm Bölüm 4: Kit içeriği Bölüm 5: Temin Edilmeyen Reaktifler ve Donanım Revizyon açıklaması Plaka sızdırmazlık malzemelerinin kite dahil edilmesi 96 kuyulu termal sayklır özellikleri güncellendi Kit saklama koşulları 2-28 o C ye güncellendi Non-hidrate PCR plaka ve şeritlerinin kullanımı Hidrate PCR plaka ve şeritlerinin kullanımı Bölüm 8: Kullanım Yönergeleri DNA nın steril moleküler kalitede suda dilüasyonu Etkileşime giren maddelere ekleme ve DNA saflık kılavuzları güncellemesi Güncellenmiş OD 260/280 ölçümü Örnek eklenmesi öncesinde dondurularak kurutulmuş peletlerin konumuna ilişkin ekleme Amplifiye ürün saklama koşullarının eklenmesi Jel elektroforez sürelerine ilişkin not eklenmesi Bölüm 9: Yorum Seriye özgün notlara dair yorum Yorum tablosundaki lot numarasıyla kit lot numarasının eşleşmesi. Bölüm 11: Klinik Veri Bölüm 14: Revizyon Geçmişi Yeni bölüm eklenmesi Yeni bölüm eklenmesi

11 DOT120v8: Biofortuna SSPGo TM HLA Tiplendirme Kitleri için Kullanım Talimatları, CE Revizyon 5 Sayfa 11 / Kullanılan Semboller için Kılavuz X Test sayısı P EC Temsilcisi kullanım talimatlarına bakın i M V H Üretim Tesisi İn Vitro Diagnostik Son Kullanma Tarihi 4: s28 : Saklama Sıcaklığı g Lot Numarası Distribütör Küresel Ticari Ürün Numarası 16. Üretici İletişim Bilgileri Biofortuna Ltd 1 Hawkshead Road Croft Business Park Bromborough, CH62 3RJ, İngiltere T: +44 (0) E: info@biofortuna.com W: Çeviriler FranÇaise: Deutsch: Español: Italiano: České: Danske: Έλληνες: Magyar: Norske: Polska: Português: Россию: Slovenskému: Türkçe: Svenska: Traductions disponibles Übersetzungen verfügbar Traducciones disponibles Traduzioni disponibili Překlady k dispozici Tilgængelige oversættelser διαθέσιμες μεταφράσεις Fordítások Oversettelser tilgjengelig Dostępne tłumaczenia Traduções disponíveis Переводы доступны Preklady k dispozícii Çeviriler mevcut Översättningar tillgängliga