Serotonin Transporter Gen Polimorfizmi

Transkript

1 Serotonin Transporter Gen Polimorfizmi M. Emin ERDAL*, Hasan HERKEN **, Ömer BARLAS***, Nurten ERDAL**** ÖZET Serotonin transporter (5-hydroxytryptamine transporter, 5-HTT, SERT) gen, serotoninin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) taþýnmasýndaki rolü nedeniyle psikiyatrik bozukluklarýn etyolojisinde rol oynadýðý öne sürülmektedir. SERT gen polimorfizmlerinin, serotoninle ilgili davranýþlarýn düzenlenmesinde özellikle, anksiyete, depresyon, þizofreni, otizm, bipolar bozukluk ve mevsimsel affektif bozukluðunu içeren bazý psikiyatrik bozukluklarda ve fibromyalji ve migren gibi psikosomatik bozukluklarda etkili olabileceði bildirilmektedir. Bu gen için iki polimorfizm tanýmlanmýþtýr. Bunlardan birincisi; genin 2. intronunda 17 bp'lik bir bölgenin 9, 10 veya 12 defa tekrar etmesine baðlý VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) polimorfzmi, ikincisi ise; transkripsiyonel kontrol bölgesinde (5-HTT gene-linked polymorphic region 5-HTTLPR) 44 bp'lik bir dizinin farklý sayýda insersiyon/delesyon tekrarýna baðlý olarak S ve L alellerinin oluþturduðu polimorfizmdir. SERT genindeki polimorfizmler, akraba olmayan 121 saðlýklý Türk bireyde, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR, Polymerase Chain Reaction) yöntemiyle belirlendi. SERT genine ait 9, 10, 12, S ve L alellerinin gen sýklýðý sýrasýyla 0.000, , , ve olarak saptandý. Anahtar Sözcükler: Serotonin transporter gen, genetik polimorfizm, PCR. SUMMARY Polymorphisms in the Serotonin Transporter Gene The serotonin transporter (5-hydroxytryptamine transporter, 5- HTT, SERT) gene is considered to be a promising candidate for genetic involvement in psychiatric disorders owing to its role in the regulation of serotoninergic neurotransmission. The serotonin transporter (SERT) gene has long been implicated to be involved in the pathogenesis of major psychiatric disorders including anxiety, depression, schizophrenia, autism, bipolar affective disorder, seasonal affective disorder and some psychosomatic disorders as fibromyalgia, and migrain. Two polymorphic sites in serotonin transporter gene have attracted much interest: a variable-number-tandem-repeats (VNTR) of 17 bp sequence in intron 2 creating 9, 10 and 12 repeat alleles, and a 44 bp insertion/deletion in 5'-flanking promoter region (5-HTT gene-linked polymorphic region, or 5-HTTLPR) creating a short (S) and a long (L) allele. The polymorphisms of the SERT gene were detected by the polymerase chain reaction (PCR) in 121 healthy unrelated controls, all were Turkish origin. The frequencies of alleles 9, 10, 12, S and L of the SERT gene were observed 0.000, , , and , respectively. In this study we aimed to evaluate the frame of serotonin transporter gene polymorphism in Turkish healthy controls. Key Words: Serotonin transporter gene, genetic polymorphism, PCR. GÝRÝÞ * Doç. Dr., Mersin Üniversitesi Týp Fakültesi Týbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalý, **** Doç. Dr., Biyofizik Anabilim Dalý, MERSÝN ** Yrd. Doç. Dr., Gaziantep Üniversitesi Týp Fakültesi Psikiyatri Anabilim Dalý, *** Dr., Týbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalý, GAZÝANTEP Serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) merkezi ve periferal sinir sisteminde önemli nörotransmiter bir maddedir. 5-HT, beyin sinapslarýna salýndýktan sonra, presinaptik nöronal membranlarda lokalize olmuþ Na + ve Cl - iyonlarýna baðýmlý yüksek afiniteli sero- 192

2 SEROTONÝN TRANSPORTER GEN POLÝMORFÝZMÝ tonin transporter (5-hydroxytryptamine transporter, 5- HTT, SERT, SLC6A4) protein adý verilen bir madde aracýlýðýyla sinaptik boþluktan etkin þekilde temizlenir (Stahl 1996, Gelernter ve ark. 1998, Catalano 1999). Böylece, 5-HT'nin sinaptik etkinliði 5-HTT tarafýndan sonlandýrýlýr ve yeniden kullanýlmak üzere nörotransmiter havuz içine yeniden gönderilir. Yani, 5-HTT, serotoninin geri alýnýmýnda ve serotonerjik fonksiyonun yürütülmesinde önemli role sahiptir. 5-HTT geni, SLC6A4 (Solute Carrier Family 6 Member 4) gen koduyla, kromozom 17q 11.1-q12'ye haritalanmýþtýr. 5-HTT geni 31 kb uzunluðunda ve 14 ekson içermektedir. Bu gen için iki genetik polimorfizim tanýmlanmýþ ve bu polimorfizmin serotoninle ilgili davranýþlarýn düzenlenmesinde özellikle, anksiyete, depresyon, þizofreni, otizm, bipolar bozukluk ve mevsimsel affektif bozukluðunu içeren bazý psikiyatrik bozukluklarda (Lesch ve ark. 1996, Klauck ve ark. 1997, Flory ve ark. 1999, Lenziger ve ark. 1999, Ohara ve ark. 1999), fibromiyalji ve migren gibi psikosomatik bozukluklarda (Offenbeacher ve ark. 1999, Ogilvie ve ark. 1998) etkili olabileceði bildirilmektedir. 5-HTT geni ile ilgili olarak iki polimorfizmden birincisi, genin 2. intronunda 17 bp'lik bir bölgenin 7, 9, 10 veya 12 defa tekrar etmesine baðlý VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) polimorfizmidir. Bu polimorfizme göre genotipler 12/12, 12/10, 10/10, 12/9, 10/9, 9/9, 12/7, 10/7, 9/7 ve 7/7 olarak deðerlendirilmektedir. Fakat 7 ve 9 alelinin sýklýðý çok az olduðundan bazý populasyonlarda rastlanmayabilir. Ýkinci polimorfizm ise 5-HTT geninin transkripsiyonel kontrol bölgesinde (5-HTT gene-linked polymorphic region 5-HTTLPR) 44 bp'lik GC (guanin, sitozin) zengin bir dizinin farklý sayýda insersiyon/delesyon tekrarýna baðlý olarak tanýmlanan polimorfizimdir. 44 bp'lik tekrar dizisi 16 defa tekrarlanýrsa Long (L) formu, 14 defa tekrarlanýrsa Short (S) formu olarak adlandýrýlan alelleri meydana gelir. Bu polimorfizme göre genotipler; L/L, L/S ve S/S olarak deðerlendirilmektedir. Bu polimorfizmin de ender görülen bazý alelleri tanýmlanmýþtýr. Bu aleller LJ (17 defa tekrar), XL (18 defa tekrar), XXL (20 defa tekrar) olarak adlandýrýlmaktadýr (Michaelovsky ve ark. 1999). Bu ender görülen alellere de bazý populasyonlarda rastlanmayabilir. 5-HTT geninde tanýmlanan bu iki polimorfizmin, psikiyatrik bozukluklarýn etiyolojisinde rol oynadýðý ayrýca, ýrksal deðiþim gösterdiði bildirilmektedir. Bu çalýþmada, 5-HTT gen polimorfizminin toplumumuzdaki saðlýklý kiþilerdeki genotip daðýlýmýný ve diðer populasyonlarla benzerlik veya farklýlýklarýnýn araþtýrýlmasý amaçlanmýþtýr. GEREÇ VE YÖNTEM Bu çalýþmada, akraba olmayan 121 saðlýklý gönüllü bireyden, uygun bilgilendirme iþleminden sonra 10 ml EDTA'lý kanlar kullanýldý. DNA, Fenol/Kloroform standart ekstraksiyon yöntemine göre elde edildi. 5-HTT geninin, intron 2'sindeki VNTR polimorfizmi ve transkripsiyonel kontrol bölgesindeki insersiyon / delesyon polimorfizmi (5-HTTLPR), Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR, Polymerase Chain Reaction) yöntemiyle belirlendi. 5-HTT geninin intron 2'sindeki VNTR polimorfizmi F 5'-TGGATTTCCTTCTCTCAGTGA TTGG-3 ve R 5'-TCAT- GTTCCTAGTCTTACGCCAGTG-3' primerleri kullanýlarak PCR yöntemiyle belirlendi (Klauck ve ark. 1997). PCR iþlemi; ng DNA, 100 µm dntps, 20 pmol primer (F ve R'nin herbirinden), 1.0 mm MgCl 2, 20 mm Tris-HCl PH 8.6, 50 mm KCl, %0.2 (w/v) bovine serum albumin ve 1 U Taq polymerase (MBI Fermentas) içerecek þekilde distile su ile 50 µl hacminde gerçekleþtirildi. PCR þartlarý: 94 C'de 2 dk ilk denaturasyondan sonra, 40 siklus; 94 C'de 1 dk denaturasyon, 57 C'de 1 dk primer baðlanma (annealing) ve 72 C'de 2 dk sentez (extension), en son 1 siklus 72 C'de 10 dk son sentez iþlemleriyle gerçekleþtirildi. PCR ürünleri; 0.5 µg/ml ethidium bromide içeren %2'lik agarose jelde 100 Voltta elektroforez iþleminden sonra bir jel görüntüleme sistemiyle (Vilber Lourmat) 390 bp'lik ürün 12 aleli ve 360 bp'lik ürün 10 aleli olarak deðerlendirildi. 7 ve 9 alellerine rastlanmadý. Buna göre genotipler, 12/12, 12/10, 10/10 olarak belirlendi. insersiyon/delesyon polimorfizmi (5-HTTLPR)F 5'- GGCGTTGCCGCTCTGAATGC-3' ve R 5'-GAGGGACT- GAGCTGGACAA CCAC-3' primerleri kullanýlarak PCR yöntemiyle belirlendi (Klauck ve ark. 1997). PCR ortamý GC-Rich PCR Sistemi (Roche Molecular Biochemicals) ile ng DNA, 100 µm dntps, 20 pmol primer (F ve R'nin herbirinden), 1.5 mm MgCl 2. kullanýlarak distile su ile 50 µl'ye tamamlanarak gerçekleþtirildi. PCR þartlarý ise; 1 siklus 95.5 C'de 3 dk ilk denaturasyon, sonra 35 siklus, 95.5 C'de 1 dk denaturasyon, 60 C'de 1 dk primer baðlanma (annealing) ve 72 C'de 1 dk sentez (extension), en son 1 siklus 72 C'de 7 dk son sentez kademelerinde gerçek- 193

3 ERDAL ME, HERKEN H, BARLAS Ö, ERDAL N. leþtirildi. PCR ürünleri; 0.5 µg/ml ethidium bromide içeren %2'lik agarose jelde 100 Voltta elektroforez iþleminden sonra bir jel görüntüleme sistemiyle (Vilber Lourmat), 484 bp'lik ürün S ve 528 bp'lik ürün L formu olarak deðerlendirildi. xl, xxl ve LJ alellerine rastlanmadý. Buna göre, genotipler, L/L, L/S ve S/S olarak belirlendi. (Lesch ve ark. 1996). Her iki polimorfizim için de genotipleme iþlemi sýrasýnda aleller belirlenirken örneklerin yanýnda DNA Markýrý (100 bp DNA Ladder, MBI Fermentas) kullanýlarak elektroforez iþlemi gerçekleþtirildi. BULGULAR Akraba olmayan 121 saðlýklý gönüllü bireyde, 5-HTT geninin intron 2'deki VNTR polimorfizmi ve transkripsiyonel kontrol bölgesindeki insersiyon/delesyon polimorfizmi (5-HTTLPR), PCR yöntemiyle araþtýrýldý. Bu gendeki polimorfizmler için genotipleme yapýlarak, gen frekanslarý hesaplandý. Buna göre; toplam 121 kiþinin 5-HTT geninin intron 2'sindeki VNTR polimorfizmi genotiplenmesi yapýldýðýnda; 63 (%52.07) bireyin 12/12, 51 (%42.15) bireyin 12/10 ve 7 (%5.78) bireyin 10/10 genotipinde olduðu saptandý. Araþtýrma grubumuzda ender görülen 9 ve 7 aleline sahip bireye rastlanamadý. Araþtýrýlan populasyonda 12 alelinin gen frekansý ve 10 alelinin gen frekansý olarak hesaplandý. Bazý bireylere ait 5-HTT geninin intron 2'sindeki VNTR polimorfizmini içeren elektroforez örnekleri Þekil 1'de gösterilmiþtir. Toplam 121 kiþinin, 5-HTT geninin transkripsiyonel kontrol bölgesindeki insersiyon/delesyon polimorfizminin (5-HTTLPR), genotiplenmesi yapýldýðýnda; 36 Þekil 1. Bazý bireylere ait 5-HTT geninin intron 2'deki VNTR polimorfizmini içeren elektroforez örnekleri (M: 100 bp DNA Ladder; 1, 2, 3, 4, 5 ve 10 numaralý örnekler 12/10; 6, 8 ve 9 numaralý örnekler 12/12; 7 numaralý örnek ise 10/10 genotipinde). Þekil 2. Bazý bireylere ait 5-HTT geninin transkripsiyonel kontrol bölgesindeki insersiyon/delesyon polimorfizmini (5- HTTLPR) içeren elektroforez örnekleri (M: 100 bp DNA Ladder; 1 ve 6 numaralý örnekler S/S; 2 ve 3 numaralý örnekler L/L; 4, 5 ve 7 numaralý örnek ise L/S genotipinde). (%29.8) bireyin L/L, 47 (%38.8) bireyin L/S ve 38 (%31.4) bireyin S/S genotipinde olduðu saptanmýþtýr. Araþtýrma grubumuzda ender görülen LJ, XL ve XXL alellerine sahip bireylere rastlanamadý. Araþtýrýlan populasyonda L alelinin gen frekansý ve S alelinin gen frekansý ise olarak hesaplandý. Bazý bireylere ait 5-HTT geninin transkripsiyonel kontrol bölgesindeki insersiyon/delesyon polimorfizmini (5- HTTLPR) içeren elektroforez örnekleri Þekil 2'de gösterilmiþtir. TARTIÞMA Farklý populasyonlarda 5-HTT geninin intron 2'sindeki VNTR polimorfizmi saðlýklý bireylerde çalýþýlmýþtýr. Almanya'da (Klauck ve ark. 1997) gen frekanslarý 12 aleli için 0.541; 10 aleli için ve 9 aleli için olarak, Ýspanya'da (Gutierrez ve ark. 1998) 12 aleli için ; 10 aleli için ve 9 aleli için ; Avrupa kökenli Amerikalýlarda (Gelernter ve ark. 1998) 12 aleli için 0.63; 10 aleli için 0.34 ve 9 aleli için 0.03; Afrika kökenli Amerikalýlarda (Gelernter ve ark. 1998) 12 aleli için 0.75; 10 aleli için 0.24 ve 9 aleli için 0.01 olarak hesaplanmýþtýr. Bizim çalýþma populasyonunda ise 12 alelinin gen frekansý ve 10 alelinin gen frekansý olarak hesaplandý. Bu polimorfizmin fonksiyonel etkileri halen gösterilememiþtir. insersiyon/delesyon polimorfizmi (5-HTTLPR) de farklý populasyonlarda çalýþýlmýþ olup elde edilen gen frekanslarý: Almanya'da (Klauck ve ark. 1997) gen frekanslarý L aleli için 0.60; S aleli için 0.40 olarak; yine 194

4 SEROTONÝN TRANSPORTER GEN POLÝMORFÝZMÝ Almanya'da (Collier ve ark. 1996) L aleli için 0.60, S aleli için 0.40 olarak; Ýtalya'da (Collier ve ark. 1996) L aleli için 0.57, S aleli için 0.43 olarak; Ýngiltere'de (Collier ve ark. 1996) L aleli 0.55 ve S aleli 0.45 olarak; Avrupa kökenli Amerikalýlarda (Gelernter ve ark. 1998) L aleli için 0.53; S aleli için 0.47; Afrika kökenli Amerikalýlarda (Gelernter ve ark. 1998) L aleli için 0.66; S aleli için 0.26 ve XL aleli için 0.08 olarak; Ýspanya'da (Gutierrez ve ark. 1998); L aleli için 0.57; S aleli için 0.43 olarak; yine Ýspanya'da (Benedetti ve ark. 1999) L aleli 0.544, S aleli olarak; Fransa'da (Hammoumi ve ark. 1999); L aleli için 0.61 ve S aleli için 0.29 olarak; Libya'da (Michaelovsky ve ark. 1999) L aleli için 0.52 ve S aleli için 0.46 olarak; Tunus'da (Michaelovsky ve ark. 1999) L aleli için 0.53 ve S aleli için 0.43 olarak; Fas'da (Michaelovsky ve ark. 1999) L aleli için 0.51 ve S aleli için 0.49 olarak; Ýsrail'de (Michaelovsky ve ark. 1999) L aleli için 0.44 ve S aleli için 0.56 olarak hesaplanmýþtýr. Bizim çalýþma populasyonunda ise L alelinin gen frekansý ve S alelinin gen frekansý olarak hesaplandý. Bizim toplumumuz, SERT geninin 5-HTTLPR polimorfizmi bakýmýndan Fas ve Ýsrail'de yapýlan çalýþma sonuçlarýna benzerlik göstermektedir. 5-HTT geninin polimorfizmleri; anksiyete, depresyon, þizofreni, otizm, bipolar bozukluk ve mevsimsel affektif bozukluðu içeren major psikiyatrik (Lesch ve ark. 1996, Klauck ve ark. 1997, Flory ve ark. 1999, Lenziger ve ark. 1999, Ohara ve ark. 1999) ve psikosomatik bozukluklarda (fibromiyalji ve migren) (Offenbeacher ve ark. 1999, Ogilvie ve ark. 1998) çalýþýlmýþtýr. insersiyon/delesyon polimorfizmi, uzun (L, Long, 16 tekrar) veya kýsa (S, Short, 14 tekrar) alellerden oluþur. S aleline sahip bireylerde, 5-HT gerialým aktivitesinin L aleline sahip bireylere göre iki kat daha düþük olduðu ileri sürülmektedir. S alelinin, gende transkripsiyonal etkinliðinin azalmasýyla; nöronda, 5- HTT ekspresyonunu azalacaðý ve bunun sonunda da psikiyatrik bozukluklarýn ortaya çýkabileceði ileri sürülmektedir (Collier ve ark. 1996, Lesch ve ark. 1996). Sonuç olarak; farklý 5-HTT gen polimorfizmine sahip bireylerde, biyolojik aktiviteleri farklý 5-HTT proteini oluþmaktadýr. Bu proteinlerin özellikle serotonerjik reaksiyonlarda önemli rol almalarý nedeniyle; serotonerjik bir çok hastalýðýn etiyolojisinin anlaþýlmasýnda, tanýsýnda ve tedavisinde bu polimorfizmlerin önemi giderek daha iyi anlaþýlmaktadýr. Bu polimorfizmin serotonin üzerinden etkili antipsikotik ve antidepresanlarýn etkisinin önceden öngörülebileceði beklentisini doðurmuþtur. Önümüzdeki dönemde SERT gen polimorfizminin tedaviye etkisi ve bununla iliþkisi açýklýk kazandýrýlmayý beklemektedir. Benedetti F, Serretti A, Colombo C ve ark. (1999) Influence of a functional polymorphism within the promoter of the serotonin transporter gene on the effects of total sleep deprivation in bipolar depression. Am J Psychiatry, 156: Catalano M (1999) Psychiatric Genetics'99. The Challenges of Psychopharmacogenetics. Am J Hum Genet, 65: Collier DA, Stober G, Li T ve ark. (1996) A novel functional polymorphism within the promotor of the serotonin transporter gene : possible role in susceptibility to affective disorders. Mol Psychiatry, 1: Flory JD, Manuck SB, Ferrell RE ve ark. (1999) Neuroticism is not associated with the serotonin transporter (5-HTTLPR) polymorphism. Mol Psychiatry, 4: Gelernter J, Kranzler H, Coccaro EF ve ark. (1998) Serotonin transporter protein gene polymorphism and personality measures in African American and European American subjects. Am J Psychiatry, 155: Gutierrez B, Pintor L, Gasto C ve ark. (1998) Variability in the serotonin transporter gene and increased risk for major depression with melancholia. Hum Genet, 103: KAYNAKLAR Hammoumi S, Payen A, Favre JD ve ark. (1999) Does the short variant of the serotonin transporter linked polymorphic region constitute a marker of alcohol dependence? Alcohol, 17: Klauck SM, Pautska F, Benzer A ve ark. (1997) Serotonin transporter (5-HTT) gene variants associated with autism. Hum Mol Genet, 6: Lenzinger E, Neumeister A, Praschak-Reider N ve ark. (1999) Behavioral effects of tryptophan depletation in seasonal affective disorder associated with the serotonin transporter gene. Psychiatry Res, 22: Lesch K-P, Bengel D, Heils A ve ark. (1996) Association of anxiety-related traits with a polymorphism in the serotonin transporter gene regulatory region. Science, 274: Michaelovsky E, Frisch A, Rockah R ve ark. (1999) A novel allele in the promoter region of the human serotonin transporter gene. Mol Psychiatry, 4: Offenbaecher M, Bondy B, de Jonge S ve ark. (1999) Possible association of fibromyalgia with a polymorphism in the serotonin transporter gene regulatory region. Arthritis Rheum, 42:

5 ERDAL ME, HERKEN H, BARLAS Ö, ERDAL N. Ogilvie AD, Russel MB, Dhall P ve ark. (1998) Altered allelic distribution of the serotonin transporter gene in migrain without aura and migrain with aura. Cephalagia, 18: Ohara K, Suzuki Y, Ochiani M ve ark. (1999) A variable-number tandem repeat of the serotonin transporter gene and anxiety disorder. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23: Stahl SM (1996) Essential Psychopharmacology. Neuroscientific Basis and Practical Applications. Cambridge University Press, s