SELEKSİYONA YARDIMCI MARKERLAR (Marker Assisted Selection)

Transkript

1

2 SELEKSİYONA YARDIMCI MARKERLAR (Marker Assisted Selection) Geleneksel olarak bireylerin kendisini, atalarını ve varsa döllerinin bilgilerini içeren kriterlere göre seleksiyon yapılmaktadır. Elde edilen tüm bu bilgiler geliştirilmiş istatistik metotlar ile değerlendirilerek bireyin damızlık değeri elde edilir.

3 MAS Son yıllarda moleküler genetik biliminde meydana gelen gelişmeler sayesinde belirli bir özellik için seleksiyon DNA işaretleyicilerinin sağladığı bilgiye göre yapılabilmektedir.

4 MAS Seleksiyona yardımcı işaretleyiciler seleksiyonda sağlanan ilerlemeyi iki şekilde artırmaktadır bunlar; 1. İstenen özellik için hangi hayvanın en iyi nitelikte olduğu daha isabetli tahmin edilir. Böylece gerçekten nitelikli hayvanların seçimindeki isabet artar. 2. Generasyon aralığı kısalır Seleksiyona yardımcı markerlar gelecekte geleneksel seleksiyon yönteminin yerini almasa da seleksiyona ek bilgi sağlaması bakımından önemlidir (DeNise, 1994).

5 Bazı durumlarda DNA nın bir bölgesi bireyin tam olarak fenotipini belirlemektedir. Bu tip DNA bölgeleri büyük etkili kantitatif karakter lokusları olarak adlandırılır. Avusturalya merinosu koyunlarında bulunan Booroola geni, Belçika mavi sığırında bulunan Çift kaslılık geni bu genlere örnek olarak verilebilir.

6 GEN AKTARIMI Genomda istenilen bir dizinin izole edilip başka bir genoma aktarılması ile gerçekleştirilmektedir. Bu teknolojide gen veya genler döllenmiş yumurtaya aktarılır.

7 Gen Aktarımının Çiftlik Hayvanları Yetiştiriciliğini Etkileyeceği Alanlar Genom haritalarının çıkarılması ile genler arasındaki ilişkiler, işleyiş mekanizmaları ve Kantitatif Karakter Lokusları belirlenebilmektedir. Hastalıklara ve parazitlere karşı direnç sağlayan genlerin hayvanlara aktarılması insan genlerinin hayvanlara aktarımı sağlanarak insan için yararlı tıpta kullanılacak biyomedikal maddeler, hücreler, dokular ve organlar elde edilebilir. Cinsiyetin belirlenmesinde rol alan genlerin aktarılması ile cinsiyetin kontrolü mümkün olabilecektir.

8 GEN AKTARIMI 1990 yılında Tracy adında bir koyuna, insanlarda bazı akciğer hastalıklarının tedavisinde kullanılan alpha-1- antitrypsin (AAT) enziminin genetik kodu aktarılmıştır. Ve Tracy büyüdükten sonra sütünün her litresinde yaklaşık 40 gram AAT salgılamaya başlamıştır. ( )

9 GEN AKTARIMI Büyüme Hormonu Aktarılmış Atlantik Salmon Balığı

10 GENETİK KOPYALAMA Bir canlının bütün özellikleri o canlının her hücresinin çekirdeğindeki genlerinde bulunur. Her canlının DNA yapısı farklı dolayısıyla özellikleri de farklıdır. Genetik kopyalama bir canlı ile aynı genetik bilgiye yani aynı DNA yapısına dolayısı ile aynı özelliklere sahip başka bir canlı üretmektir.

11 KOPYALAMA 1997 yılında İskoçya'nın Edinburg şehrindeki Roslin Enstitüsünden Dr. Ian Wilmut ve ekibi bir koyunun meme bezinden aldıkları hücrenin çekirdeğini metafaz safhasındaki yumurta hücresine aktararak genetik kopyalamayı gerçekleştirmişler ve bunun sonucunda Dolly adlı kuzu dünyaya gelmiştir.

12 Hayvancılıkta Genetik Kopyalama Meme hücresinin alınması Hücre Çekirdeği Verici Hayvan İki Hücre Elektik Şoku ile Birleştirilmesi Birleştirilmiş Hücre Yumurta Hücresi Ergin Koyundan Yumurta Hücresinin Alınması Yumurta Hücresinin Çekirdeğinin Çıkarılması Birleştirilmiş Hücrenin Normal Olarak Bölünmeye başlaması Taşıyıcı Hayvan Embriyo Embriyonun Taşıyıcı Hayvana verilmesi Klonlanmış Kuzu

13 Moleküler biyoloji ve istatistik bilimindeki son gelişmeler Büyük etkili kantitatif karakter lokuslarının (QTL) tanımlanması ve kullanılması Genomik varyasyonun tanımlanmasını ve kullanılması

14 Hayvansal üretimde hayvanların bireysel olarak tanımlanması hayvan ıslahı programları için oldukça önemlidir. Hayvanların tanımlaması için başlangıçta kullanılan kan gruplarının tiplendirilmesi ve biyokimyasal polimorfizmlerin izlenmesi, DNA işaretleyicileri (marker) kadar etkili olmamıştır.

15 Bu DNA baz dizisinde meydana gelen varyasyonunu tanımlamak için DNA temeline dayalı çeşitli teknolojiler geliştirilmiştir. Bu teknolojiler moleküler genetik işaretleyiciler (Marker) olarak bilinmektedir.

16 Genetik Varyasyon tanımlanması DNA baz sıralarının belirlenmesi Babalık testleri Evrim tarihi Hayvasal ürünlerin orjinlerinin belirlenmesi Moleküler Markerların kullanımı Gen haritaları çıkarılması Genlerin tespiti QTL Tespiti Rekombinant DNA teknolojisi

17 RAPD Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA RFLP Kesilmiş Parça Uzunluk Polimorfizmi AFLP Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi STR Mikrosatellit SNP Tek Nükleotit Polimorfizmi

18 RAPD Yöntemi (Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA) İlk olarak Williams ve arkadaşları tarafından 1990 yılında insan DNA sında kullanılan RAPD yöntemi nükleotit dizileri hakkında herhangi bir bilgiye gereksinim duyulmadan şansa bağlı primerler kullanılarak her canlı türünde uygulanabilmektedir.

19 Bu teknikte genellikle 10 nükleotid uzunluğundaki primer (başlatıcı) kullanılarak genom üzerinde rastgele bölgelerin DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir. Reaksiyon şartlarının spesifik olmaması rastgele çoğaltıma izin verir. Üretimi yapılan DNA parçaları (amplikon) agaroz jel üzerinde elektroforeze tabi tutulduğunda bazı parçaların bazı genotiplerde üretilip bazılarında üretilmediği gözlenir

20 RAPD YÖNTEMİNİN AVANTAJLARI DNA üzerinde tesadüfi bölge çoğaltılmasını sağlar Düşük miktarda DNA yeterlidir (5 50ng) Çabuk sonuç veren bir analiz yöntemidir Diğer tekniklere göre düşük maliyetlidir Yüksek polimorfizm gösterir Çok yönlü bantlar üretir Diğer yöntemlerin aksine radyoaktif madde kullanılmaz

21 RAPD YÖNTEMİNİN DEZAVANTAJLARI Saf, yüksek molekül ağırlıklı DNA gerektirir DNA parçalarının çoğaltılabilmesi için tesadüfi primerler kullanılır Reaksiyon hassas olduğundan deneme için kullanılan yöntemin son derece standartize olması gerekir Polimorfizm oranı diğer işaretleyicilerden düşüktür Tekrarlanabilirliği zayıftır.

22 RAPD YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI Genetik Çeşitlilik Çalışmaları Binbaş ve Cemal, 2006; Elmacı ve ark., 2007; Ali, 2003; Kumar ve ark., 2008 Akrabalık Düzeyinin Belirlenmesi Bhattacharya, 2003 Genom Haritalarının Çıkarılması Botstein ve ark., Genetik Markerların Tespiti Rao, ve ark., 1996 Hayvansal Ürünlerin Orjinlerinin Ahmed, 2005 Belirlenmesi

23 RFLP YÖNTEMİ (Kesilen Parça Uzunluk Polimorfizmi) RFLP yöntemi 1960 lı yıllarda restriksiyon endonükleazların keşfini takiben geliştirilmiştir. İlk başarılı genetik haritalama çalışmalarında RFLP işaretleyicileri kullanılmıştır. DNA da oluşan mutasyonları veya polimorfizmi ortaya koyan ve restriksiyon enzimi ile kesim sonucu oluşan değişik boydaki DNA segmentlerini belirlemeye yönelik bir yöntemdir.

24 Restriksiyon enzimleri, restriksiyon bölgeleri olarak bilinen çift zincirli DNA'nın sadece spesifik baz dizilerini tanımakta ve diziyi bu bölgelerden kesmektedir.

25 RFLP YÖNTEMİNİN AVANTAJLARI RAPD yöntemine göre iki kat fazla bilgi sağlar Prob olarak cdna klonları kullanılabilir. Laboratuarlar arasındaki uyum oldukça iyidir RFLP YÖNTEMİNİN DEZAVANTAJLARI Diğer marker metotlarına göre pahalı ve zaman alıcıdır. Her prob ile sadece bir polimorfizm ortaya konmaktadır. Bazı durumlarda mutasyonlar restriksiyon endonükleaz tanımlama bölgesinde herhangi bir değişime neden olmaz bu nedenle bazı mutasyonlar bu yöntemle tanımlanamazlar

26 RFLP YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI Genetik Polimorfizmlerin Tanımlanması Yılmaz ve ark., 2014a; Yılmaz ve ark., 2014b; Yılmaz ve ark., 2013; Sevim ve ark., 2012, Cemal ve ark., 2009; Ahmed, 2005 Rekombinant DNA teknolojisi Solak ve ark., 2000 Genom Haritalarının Çıkarılması Botstein ve ark., 1980.

27 AFLP YÖNTEMİ (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi) Bu yöntem SRAF (Selective Restriction Fragment Amplification) olarak da bilinmektedir. Genomik DNA nın restriksiyon enzimi ile kesimi sonucu oluşan DNA parçalarının bir grubunun selektif çoğaltılması esasına dayanan bir genotipleme metodudur

28 Bu teknik RFLP'den daha hızlı çalışır ve Değişken sayılı bitişik tekrar (VNTR) polimorfizmlerine dayalı aleller ayırdedilir, bunlar poliakrilamit jel elektroforezi ile ayrıştırılır. Bantlar gümüş boyaması ile görülür. Analiz jelde yapıldığı için, çok yüksek sayılı tekrarlar jelin üst kısmında sıkışabilirler ve birbirlerinden ayırdedilmeleri zor olabilir.

29 AFLP YÖNTEMİNİN AVANTAJLARI Daha önceden baz dizilerinin bilinmesine gereksinim yoktur. Her reaksiyonda çok fazla miktarda polimorfizm tanımlanabilir. Güvenilir bir yöntemdir. Standardizasyonu sağlanabilir. Elde edilen ürün sürekli olarak çoğaltılabilir.

30 AFLP AFLP YÖNTEMİNİN DEZAVANTAJLARI Sadece seçilen alleller tanımlanır. Genomların büyüklüğüne göre adapte edilebilen farklı kitlere gereksinim duyarlar.

31 AFLP YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI Genetik Polimorfizmlerin Tanımlanması Parmak izi teknolojisi Mikrosatelitlerin bulunması Genetik haritalama ve QTL tarama Foulley ve ark., 2006; Sheng ve ark., 2004 Marsan ve ark., 1997; Negrini ve ark., 2007; Utsunomiya ve ark., 2014 Nijiman ve ark., 1999, Santana ve ark., 2009 Otsen ve ark., 1996; Barendse ve ark., 1994

32 MİKROSATELİTLER (STR) Birçok ökaryotik genomunda nispeten homojen aralıklarla bulunan, 2-5 bazlık ardışık basit tekrarlardan oluşan kısa DNA zincirleri mikrosatellit olarak adlandırılmaktadır. Yapılan çalışmalarda mikrosatelitlerin genellikle dinükleotit tekrarları şeklinde olduğu bildirilmiştir

33 Mikrosatellitler standart PCR yöntemleri ile çoğaltılabilirler Yüksek düzeyde polimorfizm gösteren mikrosatellitler mutasyonların detaylı olarak analizine olanak tanır.

34 Mikrosatellitlerle yapılan analizlerde, alleller arasındaki küçük farklılıklar oldukça önemlidir bu nedenle allel uzunluklarının belirlenmesinde genetik analizörler gibi otomasyon sistemlerinin kullanılması çalışmanın hassasiyetini artırmaktadır. Mikrosatellitler; DNA nın kodlanmayan bölgelerinde tüm genoma yayılmış durumda bulunurlar ve çok sayıda kodominant allele sahiptirler.

35 Irk içi ve ırklar arası genetik çeşitliliğin saptanmasında MİKROSATELLİT YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI Yilmaz ve ark., 2014; Yilmaz ve ark., 2015; Cemal ve ark., 2013; Öner ve ark., 2014; Hoda ve Marsan, 2012; Özşensoy ve Kurar, 2014 Babalık Testleri Yılmaz ve Karaca, 2012; Araujo ve ark., 2010; Tian ve ark., 2008; Sherman ve ark., 2004 Tehlike altındaki populasyonların durumlarının belirlenmesinde Genom Haritalama Whitehouse ve Harley, 2001; Mahmoudi ve ark., 2012; Mahmoudi ve ark., 2013 Groenen ve ark., 2000; Rohrer ve ark 1994;

36 SNP (Tek Nükleotit Polimorfizmi) DNA daki tek nükleotit değişiklikleri olarak adlandırılır. Genetik koddaki tek bir nükleotit değişimine bağlı olması nedeniyle SNP deki DNA varyasyonunun formu mikrosatellitlere göre daha basittir.

37 Genetik varyasyonun %90 ını oluşturan SNP ler otomasyona yüksek düzeyde uyum sağlamaları ve diğer işaretleyicilere göre daha duyarlı analizlerin yapılmasına olanak tanımaları nedeniyle hayvancılıkta son yıllarda oldukça geniş bir kullanım alanı bulmuşlardır. Gen kodlayan bölgelerde görülen SNP varyantları, bir proteinin amino asit sekansını değiştirmekte ve protein fonksiyonunu doğrudan etkilemektedir

38 Gen kodlayan bölgelerdeki SNPs in sayısının dolaylarında olduğu tahmin edilmektedir. Günümüzde aynı anda çok fazla sayıda SNP in analizine olanak tanıyan otomasyon sistemleri geliştirilmiştir. Meydana gelen bu gelişmeler sayesinde yüksek çözünürlüğe sahip SNP çipleri sayesinde genom boyu ilişki analizleri gerçekleştirilebilmektedir. Elde edilen bilgiler ışığında genomik seleksiyon olanaklı bir hale gelmiştir.

39 Genetik Çeşitlilik SNP YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA KULLANIMI Pariset ve ark., 2006; Pryce ve ark., 2012 Babalık Testleri Hill ve ark., 2008; Harlizius ve ark., 2011; Heaton ve ark., 2014 Genomik Seleksiyon Çalışmaları Daetwyler ve ark., 2012; Eggen, 2012; Goddard ve Hayes, 2007; Slack-Smith ve ark., 2010 Genom Haritalama Kijas ve ark., 2009

40 Tarama Yöntemi Primer Tipi Polimorfizm Tipi RAPD RFLP AFLP STR SNP PCR PCR PCR PCR PCR Rastgele Primer Orta- Yüksek Diziye Özel Primer Düşük Diziye Özel Primer Orta- Yüksek Diziye Özel Primer Yüksek Diziye Özel Primer Yüksek Otomasyona Evet Evet Evet Evet Evet uyum Güvenilirlik Düşük Yüksek Orta Yüksek Yüksek Fenotipik ifadesi MOLEKÜLER İŞARETLEYİCİLERİN KARŞILAŞTIRILMASI Dominant Kodomina nt Dominant Kodomina nt Kodomina nt

41

42 DNA DİZİ ANALİZİ? Gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizi sağlamıştır Herhangi bir canlıya ait DNA örneğindeki baz diziliminin ortaya çıkartılması işlemidir. Bir bölgenin dizilimi çıkartılabileceği gibi canlıya ait tüm genom dizilişi de çıkartılabilmektedir

43 DNA Dizi Analizi İle İlgili Çalışmalar Robert HOLLEY 74 nükleotidlik bir trna molekülünün dizi analizi Allan MAXAM - Walter GILBERT Frederick SANGER Akiyoshi WADA (Otomatik Analiz Önerisi) Leroy HOOD ve Llyod SMITH -Tam otomatik analiz makinasının bulunması Edward UBERBACHER tarafından bir gen bulma programı olan GRAİL kullanılmaya başlanmıştır kromozomun DNA Dizi Analizi tamamlanmıştır İnsan Genom Projesi katılımcıları ve Celera nın insan gen haritası taslağını tamamladığı açıklanmıştır yılında Whitehead Enstitüsünde görevli David PAGE ve arkadaşları Y kromozomunun dizi analizini tamamlamışlardır

44 DNA DİZİ ANALİZİ Geleneksel Yöntem Yeni Nesil Yöntemler Maxam Gilbert Sanger Coulson Her iki geleneksel yöntem üç temel basamaktan oluşmaktadır. DNA nın hazırlanması Reaksiyonlar Yüksek voltajlı jel elektroforezi Günümüzde Sanger Coulson yöntemi daha yaygın kullanılmaktadır.

45 GELENEKSEL YÖNTEMLER

46 MAXAM GİLBERT YÖNTEMİ (Kimyasal Kırılma Yöntemi) Walter GILBERT Allan MAXAM ve Walter GILBERT tarafından geliştirilmiş bir yöntemdir. DNA nın kimyasal yöntemlerle istenen bazlardan kırılması ve hedef nükleotidlerden kırılmış DNA parçaları elde edilmesine dayalı bir yöntemdir.

47

48 Purin bazlarının (G-A) kırılmasında dimetil sülfat Pirimidin bazlarının (C-U-T) kırılması ise hidrazin enzimi ile yapılır.

49 a. Baz sıraları saptanması istenen DNA, spesifik restriksiyon endonukleaz (Örn., EcoRI) ile kesilerek değişik boylarda çift iplikçikli DNA fragmentleri elde edilir. b. Nükleotid dizisi saptanacak olan DNA fragmenti 5 - ucundan 32P ile ya da floresan bir boya ile işaretlenir.

50 c. Radyoktif fosforla işaretli olan bu çift iplikçikler çeşitli yöntemlerle (ısı, NaOH, vs.) denatüre edilerek tek iplikçikli hale getirilirler. Bu denatüre süspansiyon, 4 eşit kısma ayrılarak tüplere taksim edilirler. Tüplerin her birine, çok kontrollü miktar ve süre de spesifik bazları parçalayan bazı kimyasal maddeler (dimetil sulfat, hidrazin, formik asit, piperidin, vs.) katılarak etkilemeleri sağlanır. Bu maddeler, bir DNA segmentinde sadece bir tür baza etkileyecek tarzda ayarlanmışlardır.

51 Birinci tüpteki işaretli ve tek iplikçik DNA fragment süspansiyonuna guaninine (G) etkileyen dimetil sülfat (DMS) eklersek bu madde bir segmentte bulunan guaninlerden birine etkileyecek diğerleri ise sağlam kalacaktır. İkinci tüpe hem guanin (G) ve hem de adenini (A) etkileyen kimyasal maddeler katılır ve reaksiyonunun sağlanması beklenir. Reaksiyonunun sonunda DNA segmentlerindeki hem guanin ve hem de adenin bazları parçalanır. Üçüncü tüpe sadece timini (T) etkileyen madde katılır. Bu baz parçalanır. Dördüncü tüpe ise hem timin (T) ve hem de sitozini(c) etkileyen maddeler katılarak reaksiyona bırakılır. Bu tüpte timin ile sitozin bazları parçalanır. G G+A T T+C

52 Bu 4 tüpte reaksiyonların sonunda çok değişik boylarda DNA segmentleri meydana gelecektir. Ancak, bunların içinde uçları 32P ile işaretlenmiş olanlar önemlidir. Birinci tüpte değişik boyda ve sadece G- bazlarından kesilmiş segmentler bulunacaktır, İkinci tüpte, hem G ve hem de A bazlarından kesilmiş fragmentler vardır. Üçüncü tüpte,sadece T-bazlarından kesilmiş fragmentler bulunur. Dördüncü tüpte de, hem T- ve hem C bazlarından kesilmiş DNA segmentleri vardır.

53 Bu tüpler ayrı ayrı agarose gel elektroforezise (veya poliakrilamid gel elektroforezis, PAGE) tabi tutularak, elektriksel ortamda, boylarına göre (molekül ağırlıklarına göre) büyükten küçüğe doğru bir seperasyona tabi tutulurlar. Jel üzerinde, büyük segmentler baş tarafta ve küçük segmentler de karşı uç da yer alacaklardır.

54 Dört tüp için elde edilen bantlar birbirleriyle karşılaştırılır ve değerlendirilmesi yapılır. 1.tüpe ait sütunda, 3 tane G bandı, 2. tüpe ait sütunda, 3 tane G bandı ve 3 tane de A bandı (toplam 6 bant), 3. tüpe ait sütunda, 2 tane T bantı, 4. tüpe ait sütunda, 2 tane T bantı ve 2 tane de C bandı bulunacaktır (toplam 4 bant). G C A G T A C G A T G C A G T A C G A T

55 SANGER COULSON YÖNTEMİ (Zincir Sonlandırma Yöntemi) Fred SANGER DNA dizi analizinde kullanılan diğer bir yöntem de Fred SANGER ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntem olan zincir sonlanma yöntemidir (Sanger et al., 1977). Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve günümüzün en yaygın kullanılan DNA dizi analizi tekniğidir. Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır.

56 Bu yöntem için; dntp lere ddntp lere Tek iplikli kalıp DNA ya Klenov, Taq DNA polimeraz, ters transkriptaz veya sekuenaz enzimine Serbest OH grubu içeren primere ihtiyaç duyulur

57 Sanger metodu PCR ınişleyişine benzemektedir. DNA tek zincir haline getirilir. Reaksiyona girecek olan karışımda 4 çeşit normal nükleotid bol miktarda bulunur. Bunlar: datp - dgtp dctp - dttp Karışımda aynı zamanda dizilimi rastgele sonlandırmak için farklı renklerde floresan ile işaretlenmiş dideoxynucleotidler bulunmaktadır. Bunlar ddatp ddgtp ddctp - ddttp

58 Sekanslama reaksiyon karışımı İşaretli primer Kalıp DNA yı içerir. Hem çift, hem de tek zincirli DNA kullanılabilir. Yöntemin birinci aşamasında polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA olarak adlandırılır Primer 5 OP- -3 OH TCGACGGGC Kalıp DNA Sekanslanacak kalıp bölgesi

59 Dideoksinükleotidler dört tüpün her birine ayrı ayrı ilave edilmiştir A ddatp + DÖRT (4) dntps dda dadgdcdtdgdcdcdcdg C ddctp + DÖRT (4) dntps dadgddc dadgdcdtdgddc dadgdcdtdgdcddc dadgdcdtdgdcdcddc G ddgtp + DÖRT (4) dntps daddg dadgdcdtddg dadgdcdtdgdcdcdcddg T ddttp + DÖRT (4) dntps dadgdcddt dadgdcdtdgdcdcdcdg

60 Sanger Yöntemi 5 OP- Primer -3 OH Kalıp DNA DNA Polimeraz dntps ddgtp ddatp ddctp ddttp 1.Tüp 2. Tüp 3. Tüp 4. Tüp

61 Enzim eklenir (DNA polymerase), primer ddntp ler karşılaşıncaya kadar uzatılır. Zincir ddntp lerin birleşmesi ile son bulur. Sonlanan zincirlerin sonunda reaksiyona eklenen ddntp ler bulunmaktadır. Toplanan fragmentler sekanslama merdivenini (sequencing ladder) oluşturur. Sonlanan zincirler elektroforez yöntemi ile gözlenebilir Uzun fragmentler Kısa fragmentler ddg ddg G A T C 3 G G T A A A T C A T G 5

62 YENİ NESİL YÖNTEMLER

63 Otomatik DNA cihazlarının gelişmesi ile poliakrilamid jellerin yerini polikarbon bileşikleri olan polimerler almıştır. Bu polimerler yoğunluklarına göre farklı ayrım gücüne sahiptirler. Kullanılan polimer otomatik cihazlarda çapları milimetreden küçük olan cam kapilerler içine yüklenirler. Cihazlarda kapiller elektroforez gerçekleştirilir.

64

65 Kapiller elektroforez degrade DNA larla yapılan çalışmalarda, düşük miktarda PCR ürünü bulunduğu durumlarda geleneksel jel elektroforezine göre daha etkin sonuç vermektedir. Bu yöntemin standart sapması 0,075-0,1175 baz çifti arasında değişmektedir. Bu nedenle kapiller elektroforez standart sapması 0,2 baz çifti olan geleneksel jel elektroforezinden daha etkin ayrım yapılabilmektedir.

66 ABI 310 Genetik Analiz Cihazı (5 farklı flüoresan) veya Beckman Coulter cihazı (4 farklı flüoresan) rengi aynı anda algılayabilir. Bu özelliği nedeniyle dizi analiz reaksiyonu tek bir reaksiyon tüpünde gerçekleştirilir. Genotip belirlemede çoklu renk algılama sistemi değişik renklerle işaretlenmiş çeşitli büyüklüklerdeki birden fazla PCR ürününü aynı anda inceleme imkanı sağlar.

67 Yeni nesil sekanlama yöntemlerinde Sanger in DNA dizilimi çözme yöntemi geliştirilerek her bir tepkimede kullanılan ddntp ler değişik renkli floresanlarla etiketlenir. Bu teknoloji ile binlerce nükleotidlik bir DNA nın dizilimi birkaç saatte çözümlenmektedir. Bu sayede daha büyük DNA dizilimleri bulunmaya başlanmıştır

68 Yeni Nesil Analiz Sistemlerinden Bazıları ABI 310 Beckman Coulter SEQ GXP ABI Solid Illumina Solexa Roche 454 HeliScope Ion Torrent

69 Ion Torrent İle Gen Analizi

70 Full insan genom sekanslaması için çıkarılmıştır. Çalışma prensibi olarak ph metre ile aynı prensibi kullanmaktadır. Çipin içine sekanslayacağımız örneği yükleriz. Yüklediğimiz örnek, çipin altındaki çok sayıdaki kuyucuklara şansa bağlı bir şekilde dağılır.

71 Cihaz bu kuyucukların içine her bir seferde dntp lerden (A,T,C,G) birini gönderir. İçerideki tek iplik halinde bulunan DNA nın komplomentlerini oluştururken bağlanan baz ile birlikte H+ iyonu açığa çıkar. Bu açığa çıkan H+ iyonu sayesindeki meydana gelen ph değişimi ile cihaz kuyuya gönderilen NTP (A,T,C,G) bazlarından hangisinin bağlandığını tespit eder. Aynı bazın birden fazla bulunduğu durumlarda çıkan H+ iyonuna göre oluşan pik yüksekliği kaç bazın ard arda bulunduğunu gösterir.

72 Çiftlik Hayvanlarında DNA Dizi Analizi Hayvan genomunda varyasyonların varlığının saptanmasından sonra moleküler genetikte verimlerden sorumlu genlerin yerlerinin tespitinde kullanılan başlıca yöntemler bağlantı ve asosiasyon analizlerini içeren LD (Linkage Disequilibrium) haritalaması yöntemleridir. Bu yöntemlerin hedefi gen işlevi hakkında bir önbilgi olmadan verim veya hastalık ile ilişkili olan genlerin genomdaki adreslerinin belirlenmesidir.

73 DNA dizi analizi ile bütün genomun veya bazı DNA bölgelerinin dizilişi çıkartılarak verimle ilişkilendirilmeye çalışılmaktadır. DNA dizi analizi temelli yeni yöntemler gen-verim veya genhastalık bağlantılarının kurulmasında LD-haritalama yöntemlerinin yerini almaya başlamıştır. Genom diziliminin çıkartılması bireyler arası tek nükleotid farklılıklarının (SNP: Single Nucleotide Polymorphisms) belirlenmesine ve bu farklılıklarla verim ilişkilerinin belirlenmesine olanak tanımıştır. Son zamanlarda geliştirilen SNP çipleri ile aynı anda bir DNA örneğinde yüz binlerce hatta birkaç milyon nükleotid farklılığının belirlenmesi, bu bilgilerin ıslah programlarında kullanılmasının yolunu açmıştır.

74 Tüm bu gelişmeler doğrultusunda DNA dizi analizinin çiftlik hayvanlarında uygulanması ile; Babalık testleri yapılabilmekte Irklar arası farklılık daha ayrıntılı tanımlanmakta Irklarda bireyler arası farklılıklar belirlenmekte SNP çipleri ile genotipleme yapılabilmekte Verimlerle ilgili genom bölgeleri belirlenebilmekte Akrabalık ilişkileri tanımlanabilmekte Fenotipe dayalı bilgilerin yanında genom bilgileri de kullanılarak daha isabetli damızlık değer tahmini yapılabilmektedir.

75

76 Gen İfadesi (Ekspresyon) Gen ifadesi veya gen ekspresyonu, genetik materyalde (DNA) şifrelenen bilginin ürüne dönüştürülmesini yani ilgili genin fonksiyonunu sergilemesidir. Transkripsiyon ve translasyon olaylarının toplamı olarak da tanımlanabilir. Transkripsiyon: DNA da saklanan genetik bilgilerin RNA molekülü (mrna, trna, rrna) sentezi ile kopyalanması veya yazılmasını ifade eder. Translasyon: Transkripsiyon ile RNA ya kopyalanan genetik bilginin bir polipeptit zincir (protein) haline dönüştürülmesini ifade eder.

77 Gen İfadesi DNA Transkripsiyon (Okuma) mrna rrna trna Ribozom Translasyon (Çeviri) PROTEİN

78 RNA (RiboNükleikAsit) Figure 6-4 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

79 RNA Polimeraz RNA DNA kalıbının ilgili bölgesinin kopya dizilimi yani mesajcı RNA (mrna) RNA Polimeraz enzimi aracılığıyla çıkartılır

80 Hücrede Protein Sentezi Protein = Polipeptit zincir Polipeptid büyüklüğü Ortalama aa En büyük polipeptid Titin kodon En küçük polipeptidler onlarca aa (küçük hormonlar) (aa: amino asit)

81 DNA dan Protein Sentezi Süreci

82 Figure 6-21 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

83 mrna sentezi mrna sentezi sırasında ilk elde edilen RNA molekülü splicing işlemi ile işlenerek olgun RNA molekülü elde edilir. Splicing işlemi sırasında intron bölgelerine ait bilgiler ayıklanır ve sadece exon bölgelerini içeren bilgiler kalır.

84 RNA Tipleri ve Görevleri mrna rrna trna snrna snorna scarna mirna sirna Haberci RNA, proteinleri kodlar ribozomal RNA, ribozomların yapısında yer alır ve protein sentezini katalize eder transfer RNA, aminoasitleri bağlayarak protein sentezinde rol oynar küçük nüklear RNA, pre-mrna kesilmesi ve diğer bazı nükleus içi süreçlerde rol oynar küçük nükleolar RNA, rrna modifikasyonunda rol oynar küçük kajel RNA, snorna ve snrna modifikasyonu mikro RNA, gen ekspresyonu regülasyonu küçük interferans RNA, gen ekspresyonu regülasyonu Diğer kodlama yapmayan RNA lar telomer sentezi, X-kromozom inaktivasyonu, proteinlerin ER a transferi gibi süreçlerde rol oynarlar

85 DNA kalıbı kullanılarak tamamlayıcı yani komplementer RNA molekülünün oluşturulmasına transkripsiyon, oluşan RNA molekülüne ise transkript denir.

86 Protein sentezinde görev alan 3 unsur: mrna trna ve ribozomlar

87 Genetik kod

88 Gen Ekspresyonu analizleri Gen ekspresyonu analizleri ile hangi dokularda hangi genlerin aktif olduğu belirlenebilmektedir. Analizler için önce ilgili dokulardan RNA ekstraksiyonu yapılmaktadır. RNA ekstraksiyonu sonrasında mrna dan revers transkriptaz enzimi kullanılarak tamamlayıcı yani komplementer (complementer) DNA (cdna) sentezi yapılmaktadır. Ardından istenirse cdna dizilimi (sekansı) çıkartılabilmekte veya bilinen DNA bölgelerinin var olup olmadığı problar aracılığıyla belirlenebilmektedir. Microarray çipler aracılığıyla aynı anda binlerce genin ekspresyon gösterip göstermediği belirlenebilmektedir.

89 Mikroarray çip ile gen ekspresyonu analizi

90 Mikroarray çiplerin yapıları

91 Çiftlik hayvanları bağlamında kantitatif teorileri temel alan fenotipik performans verilerine dayalı genotip tahminleri esas alınarak yürütülen klasik ıslah yöntemleri günümüzde de başvurulan en temel yöntemlerdendir. Kantitatif genetik teoride hayvanların damızlık değerleri fenotipik veriler kullanılarak tahmin edilmektedir Özellikle fertilite, ömür uzunluğu, yemden yararlanma yeteneği gibi karmaşık ve ölçülmesi zor özellikler söz konusu olduğunda klasik ıslah yöntemlerinin etkinliği azalmaktadır. Türlerin genetiğine yönelik bilgilerin artması ve DNA düzeyinde tanımlamalara ulaşılması, fenotipe göre işletilen seleksiyon programlarına, genotipe yönelik bilgilerin de eklenmesi ile genetik ilerleme daha üst seviyelere çıkartılabilmektedir

92 29 Bu teknikler ile ırklar içi ve arası genetik varyasyon tanımlanabilmekte, gen haritaları çıkarılabilmekte, pedigri kayıtlarının doğrulukları kontrol edilebilmekte ve genomik seleksiyon çalışmaları gerçekleştirilebilmektedir. Bu tekniklerin klasik ıslah yöntemleri ile birlikte kullanımı önemli bir bilgi birikimini birlikte getirecektir. Genetik işaretleyicilerin devreye girmesi daha erken yaşlarda bazı özellikler bakımından genetik yapının tam doğrulukla belirlenmesine ve erken yaşta damızlık seçimine olanak tanıyabilmektedir.

93 30 Ülkemizde mevcut yerli ırkların moleküler genetik düzeyde tanımlanması, ve elde edilen bilgilerin yürütülen / yürütülecek ıslah çalışmalarında kullanılması önemli kazanımlar sağlayacaktır. Yerli hayvanlarımıza ait DNA örneklerinin bir DNA bankasında depolanması sağlanmalıdır. Hayvancılık için çok önemli olan ve halen etkin olarak devrede olan klasik ıslah yöntemlerinin DNA belirteçleri ile beraber kullanımı seleksiyon programlarını daha da etkin kılacaktır.

94