Small RNA Dünyası.

Transkript

1 Small RNA Dünyası

2 Small RNA lar nedir? Small RNA lar gen sessizleşmesinde görev alan nükleotit uzunluğunda RNA lardır. Small RNA lar, mrna nın translasyonu veya kararlılığını etkileyerek posttranskripsiyonel gen sessizleşmesinde yardımcı olur. AAAAA Small RNA lar, kromatindeki epigenetik modifikasyonlar ile transkripsiyonel gen sessizleşmesine katkı sağlar. RNA Pol Histon modifikasyonu, DNA metilasyonu

3 RNA sessizleştirmesinin temeli Dicer lar ve Argonaute lar RNA sessizleştirmesi, çift iplikli RNA ların (dsrna), dicer ve homologları tarafından işlenip kısa RNA duplekslerine dönüştürülmesi reaksiyonlarını kullanır. Sonrasında bu küçük RNA lar ARGONAUTE protein ailesi ile etkileşir. AGO Sessizleşme

4 Dicer ve Dicer-like proteinler sirna ve mirna oluşumunda Dicer veya Dicer benzeri (DCL) proteinler, uzun dsrna yı keser ya da RNA yı ~21-25 nt lik fragmanlar olacak şekilde katlar (hairpin). Dicer ın yapısı kestiği RNA yı ölçebilmesini sağlar. Havuç kesen bir aşçı gibi, Dicer RNA yı eşit boyutlardaki parçalara ayırır. From MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.., Adams, P.D., and Doudna, J.A. (2006) Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311: Reprinted with permission from AAAS. Photo credit: Heidi

5 Argonaute proteinler ARGONAUTE proteinler small RNA lara ve bunların hedeflerine bağlanır. Arabidopsis ago1 mutantı ve ahtapot Argonauta argo ARGONAUTE proteinler Arabidopsis in argonaute1 mutantının adını almıştır. ago1 ince radyal yapraklara sahipti ve benzediği Argonauta ahtapotuna atfen bu adı almıştır. Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: EMBO J. Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., and Benning, C. (1998) AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J. 17: Copyright 1998; Reprinted from Song, J.-J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor, L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305: with permission of AAAS.

6 RNA sessizleşmesi Post-transkripsiyonel ve transkripsiyonel gen sessizleşmesi yoluyla sirnaaracılı sessizleşme AGO AGO RNA Pol mrna nın MicroRNA aracılı sessizleşmesi ve transkripsiyonel baskılama AGO AGO AAAn AGO AAAn mrna AAAn MIR geni RNA Pol RNA Pol

7 sirna lar Genomik Savunucular sirna lar genomu; Virüsleri baskılayarak, Aşırı anlatım yapan bölgeleri sessizleştirerek, Transpozonları ve tekrarlanan dizileri sessizleştirerek korur. sirna lar bazıgenlerin epigenetik olarak sessiz durumda kalmasını da sağlar. Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Nature. Lam, E., Kato, N., and Lawton, M. (2001) Programmed cell death, mitochondria and the plant hypersensitive response. Nature 411: Copyright 2001.

8 Viral olarak indüklenmiş gen sessizleşmesi Viral ssrna Virus tarafından kodlanan, RNA ya bağımlı RNA polimeraz Viral dsrna Çoğu bitki virüsleri, çift iplikli bir ara formla replike olan RNA virüsleridir. Çift iplikli RNA, DCL tarafından kesilir ve sirna lar oluşur. sirna lar AGO ile birleşerek virüs replikasyonunu ve anlatımını durdurur. AGO AGO

9 Bitkiler viral enfeksiyonu atlatır ve bağışıklık kazanır En genç En yaşlı Virüs tarafından enfekte edilmiş bir bitkide, daha genç yapraklar semptom göstermeyebilir. Böylece bitkinin enfeksiyondan kurtulduğu anlaşılır. Virüs bulaştırılmış

10 Bitkiler viral enfeksiyonu atlatır ve bağışıklık kazanır En yaşlı En genç Virüs tarafından indüklenmiş hücre ölümü Virüs bulaştırılmış yaprak Semptom yok: iyileşme Virüs bulaştırılmış yaprak Semptom yok: bağışıklık From Ratcliff, F., Henderson, B.D., and Baulcombe, D.C. (1997) A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science 276: Reprinted with permission from AAAS.

11 Bitkiler viral enfeksiyonu atlatır ve bağışıklık kazanır En genç En yaşlı Virüs bulaştırılmış Bu hücreler daha sonra aynı virüs tarafından enfeksiyona da direnç kazanmışlardır. Virüs bulaştırılmış

12 Viral direnç sirna aracılı sessizleşmeyi kapsar 22. GÜN Daha genç yaprağı su veya virüs ile inoküle et 32. GÜN 22. gün inoküle edilen yapraktan RNA izole et. Viral RNA miktarını ölç. 1. GÜN Yaprağı virüs veya su ile inoküle et

13 Viral direnç sirna aracılı sessizleşmeyi kapsar 22. GÜN Daha genç yaprağı su veya virüs ile inoküle et 32. GÜN 22. gün inoküle edilen yapraktan RNA izole et. Viral RNA miktarını ölç. 1. GÜN Yaprağı virüs veya su ile inoküle et 1. Gün 22. Gün 32. gün RNA Virüs Su Inokülüm Su Virüs Virüs Virüs Düşük RNA düzeyleri, ilk viral enfeksiyonun RNA sessizleşmesini indüklediğini göstermektedir. Böylece sonraki viral replikasyon önlenmiş olur From Ratcliff, F., Henderson, B.D., and Baulcombe, D.C. (1997) A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science 276: Reprinted with permission from AAAS.

14 Small RNA lar viral indüklenmiş gen sessizleşmesi ile ilişkilidir İnoküle yapraklarla sistemik yapraklarda, viral RNA ya homolog bir small RNA bulunmaktadır. Sistemik yaprak İnakülasyon sonrası günler İnoküle yaprak From Ratcliff, F., Henderson, B.D., and Baulcombe, D.C. (1997) A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science 276: Reprinted with permission from AAAS.

15 Virüs enfeksiyonu sistemik sirna birikimine neden olur Distal yaprak Inoküle yaprak

16 RNA sessizleşmesi nasıl sistematik olarak yayılır?? UV ışık altında, yabani tip yapraklar kloroplastlardaki klorofil tarafından emilen ışık yüzünden kırmızı ışık yayarlar. GFP GFP proteini anlatımı yapılan bitki UV ışık altında yeşil ışık yayar. Reprinted with permission from Kalantidis, K., Schumacher, H.T., Alexiadis, T., and Helm, J.M. (2008) RNA silencing movement in plants. Biol. Cell 100: 13 26; (c) the Biochemical Society.

17 RNA sessizleşmesinin yayılması GFP GFP Gen sessizleşmesini incelemek için GFP anlatımı yapan hücrelere GFP kodlayan DNA entegre edilmiştir. Reprinted with permission from Kalantidis, K., Schumacher, H.T., Alexiadis, T., and Helm, J.M. (2008) RNA silencing movement in plants. Biol. Cell 100: 13 26; (c) the Biochemical Society.

18 RNA sessizleşmesinin yayılması GFP GFP GFP sessizleştirildiği zaman, kırmızı klorofil ışıması görünür hale gelir. Reprinted with permission from Kalantidis, K., Schumacher, H.T., Alexiadis, T., and Helm, J.M. (2008) RNA silencing movement in plants. Biol. Cell 100: 13 26; (c) the Biochemical Society.

19 Sessizleşme lokal olarak yayılabilir Bazen sessizleşme, sinyalin plazmodezmatadan difüzyonu ile yaklaşık 15 hücreye kadar yayılabilir. Reprinted with permission from Kalantidis, K., Schumacher, H.T., Alexiadis, T., and Helm, J.M. (2008) RNA silencing movement in plants. Biol. Cell 100: 13 26; (c) the Biochemical Society.

20 Plazmodezmata, bitki hücreleri arasındaki düzenlenmiş bağlantılardır Bitki duvarı Reprinted from Zambryski, P. (2008) Plasmodesmata. Curr. Biol. 18: R with permission from Elsevier. TEM image credit BSA Photo by Katherine Esau;

21 Sessizleşme floem yoluyla sistematik olarak yayılabilir Sistematik sessizleşme İnoküle yaprak Sistemik sinyalin moleküler tanısı tam olarak yapılamamıştır ancak sirna olduğu düşünülmektedir. Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Nature Copyright Voinnet, O., and Baulcombe, D. (1997) Systemic silencing in gene silencing. Nature 389: 553.

22 Sistemik sessizleşme sinyal çoğaltımı ile arttırılır RdRP Birincil sirna Sessizleşme, RNA-bağımlı RNA polimeraz (RdRP) a ihtiyaç duyan ikincil sirna üretimi ile de yayılabilir, İkincil sirna

23 sirna üretimi mutantları viral hastalıklara daha yatkındır TRV ile inoküle edilmiş yabani tip Arabidopsis TRV ile inoküle edilmiş dcl2-dcl4 ikili mutantı Yabani tip Arabidopsis te Tobacco Rattle Virus (TRV) sessizleştirilmesi, hastalık semptomlarını önler. Dicer aktivitesinde bozukluk olan mutantlar, viral enfeksiyonu baskılayamaz. From Deleris, A., Gallego-Bartolome, J., Bao, J., Kasschau, K., Carrington, J.C., and Voinnet, O. (2006) Hierarchical action and inhibition of plant dicer-like proteins in antiviral defense. Science 313: Reprinted with permission from AAAS.

24 Virüsler RNA sessizleşmesine müdahale eden baskılayıcı proteinlere sahiptir RdRP RNA sessizleştirmesi ile müdahale ederek, viral baskılayıcı proteinler bitkinin viral savunma mekanizmasına karışabilir. Baskılayıcılar işlemin herhangi bir basamağında görev alabilirler.

25 Aktif bir viral baskılayıcı proteini Susturulmuş GUS genine sahip bitkilere işlev gören, mutant viral baskılayıcı protein kodlayan genler verilmiştir. Bitkiler GUS anlatımı yapan virüslerle inoküle edilmiştir. Mavi noktalar GUS anlatımınının olduğu yerleri göstermektedir. Viral baskılayıcı yok: GUS geni sessiz Mutant viral baskılayıcı: GUS geni sessiz İşlev gören viral baskılayıcı: GUS geni anlatımı var Viral baskılayıcı Bitkinin RNA sessizleştirmesi viral protein tarafından baskılanmıştır. sirna sirna sirna Transkripsiyon Anandalakshmi, R., Pruss, G.J., Ge, X., Marathe, R., Mallory, A.C., Smith, T.H., and Vance, V.B. (1998). A viral suppressor of gene silencing in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:

26 Small RNA lar bitkileri bakteriyel patojenlere karşı da korur Yabani tip (La-er) ve small RNA işlenmesi mutantları (dcl1-9 ve hen1-1), Pseudomonas bakterileri ile inoküle edilmiştir. Mutantlar daha çok hastalık semptomu göstermiş ve daha çok bakteriyel replikasyona izin vermiştir. Reprinted from Navarro, L., Jay, F., Nomura, K., He, S.Y., and Voinnet, O. (2008) Suppression of the microrna pathway by bacterial effector proteins. (2008) Science 321: Reprinted with permission from AAAS.

27 Viral indüklenmiş gen sessizleşmesi RNA-aracılı gen sessizleştirmesi bitkilerde patojenlere karşı savunmada önemli bir araçtır. sirna lar viral replikasyona müdahale eder. sirna lar bitki iyileşmesi ve bağışıklığında sistemik olarak yardımcı olur. Çoğu virüs, bitkinin sirna savunma yolunu hedefleyen RNA sessizleştirici baskılayıcı protein üretir. Bu proteinler, RNA sessizleştirmesi yolunun anlaşılmasında önemlidir.

28 Transgenlerin sessizleştirilmesi Bitkilere aktarılan transgenler sıklıkla sirna yolu ile sessizleştirilir. Sessizleşme: Yüksek ekspresyon düzeyleri Transgenden türevlenen dsrna Transgen tarafından kodlanan anormal RNA ile tetiklenebilir. Transgenler post-transkripsiyonel ve transkripsiyonel olarak sessizleştirilir.

29 Transgen indüklenmiş gen sessizleşmesi 1980 lerde, bilim insanları Agrobacterium tumefaciens bakterisi ile genlerin bitki genomuna aktarılması yöntemleri geliştirdi. Aktarılmış genlere transgen denilmektedir. Nükleus Bitki hücresi DNA Bitki hücresi yüzeyinde Agrobacterium tumefaciens Photo credits: Martha Hawes, University of Arizona.

30 Transgen indüklenmiş posttranskripsiyonel sessizleşme Petunyada çiçek rengini değiştirme deneyleri, RNA sessizleştirilmesinin ilk kanıtlarını vermiştir.

31 Pigmentasyon değişimi için chalcone synthase anlatımının değiştirilmesi Chalcone Synthase (CHS) Mor antosiyanin pigmentleri üreten yabani tip petunya Chalcone synthase (CHS) antosiyanin sentezinin ilk basamaklarındaki enzimdir Antosiyaninler Photo credit Richard Jorgensen; Aksamit-Stachurska et al. BMC Biotechnology :25 doi: /

32 Sense RNA üretiminin pigmentasyonu arttırması.. beklentisi Endojen gen PRO ORF mrna Protein üretimi mrna Transgen Sense yapı: PRO ORF Sense RNA Fazladan protein üretimi mrna mrna

33 ..ve antisense RNA üretiminin pigmentasyonu bloke etmesi Endojen gen PRO ORF mrna Protein üretimi mrna Transgen Sense yapı: PRO ORF Transgen Antisense yapı: PRO ORF Sense RNA Antisense RNA Fazladan protein üretimi mrna mrna Sense-antisense dupleks oluşumu ve translasyonun engellenmesi

34 Beklenmedik şekilde hem antisense hem sense gen yapıları pigment üretimini engeller CHS transgeni taşıyan bitkiler CaMV 35S pro : CHS veya CaMV 35S pro : Sense Antisense CHS Photo credit Richard Jorgensen

35 Sessizleşmiş dokular endojen veya eklenmiş CHS anlatımı yapmazlar Mor çiçekler Beyaz çiçekler Hem sonradan eklenmiş hem de endojen genin sessizleşmesi olayı kobaskılama olarak adlandırılır. Transgen RNA Endojen gen RNA Napoli, C., Lemieux, C., and Jorgensen, R. (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2:

36 Ko-baskılama, sirna üretiminin bir sonucudur Yabani tip PRO ORF Endojen gen mrna Protein sentezlenir mrna Ko-baskılanmış transgenik PRO ORF Sense yapı PRO ORF Endojen gen Sense RNA mrna sirna üretilir Ko-baskılama De Paoli, E., Dorantes-Acosta, A., Zhai, J., Accerbi, M., Jeong, D.-H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and Green, P.J. (2009). Distinct extremely abundant sirnas associated with cosuppression in petunia. RNA 15:

37 C. elegans çalışmaları ile, gen sessizleşmesinin en güçlü tetikleyicisinin çift iplikli RNA olduğu anlaşılmıştır unc-22 genine homolog sense, antisense veya çift iplikli RNA lar bu solucanlara verilince unc-22 nin sessizleşmesi kas kontrolünün azalmasına neden olmuştur. unc = uncoordinated Sense RNA Anti-sense RNA Çift iplikli RNA Etki yok Etki yok Koordine olmamış çekme Derived The Nobel Committee based on Fire, A. et al., (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391:

38 Transkripsiyonel gen sessizleşmesi Small RNA lar gen sessizleştirmesini DNA veya bağlantılı histon proteinlerinde kovalent modifikasyonlar ile başlatabilir. Histon proteinleri Transkripsiyon DNA Sessizleşme Bu sessizleşme formu sentromer ve transpozonlar gibi kararlı olarak susturulmuş DNA ile ilgilidir, ancak genlerde de gerçekleşebilir.

39 Transkripsiyonel gen sessizleşmesi CaMV 35S pro : KAN Kanamisine direnç sağlayan genin anlatımı Transkripsiyonel gen sessizleşmesi, genetik çaprazlamalarla bitkiye birden fazla transgen aktarımı çalışmaları ile aydınlatılmıştır. CaMV 35S pro : HYG Higromisine direnç sağlayan genin anlatımı Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed plants. EMBO J. 8:

40 Transkripsiyonel gen sessizleşmesi x CaMV 35S pro : KAN CaMV 35S pro : HYG Beklenen sonuçlar: Kanamisin seçimi: 50% KanR Higromisin seçimi: 50% HygR Kan + Hyg seçimi: 25% KanR ve HygR Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed plants. EMBO J. 8:

41 Transkripsiyonel gen sessizleşmesi CaMV 35S pro : KAN Bazen transgenlerden biri, iki geni de taşıyan nesilde sessizleştirilir. CaMV 35S pro : HYG Gözlenen sonuçlar: Kanamisin seçimi: 50% KanR Higromisin seçimi: 0% HygR Kan + Hyg seçimi: 0% KanR ve HygR Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed plants. EMBO J. 8:

42 Transkripsiyonel gen sessizleşmesi CaMV 35S pro : KAN Bazen transgenlerden biri, iki geni de taşıyan nesilde sessizleştirilir. CaMV 35S pro :: HYG DNA metilasyonu CaMV 35S pro : HYG Sessizleşmiş genin promotörü metillenmiş haldedir. Bu da transkripsiyonu engeller. Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed plants. EMBO J. 8:

43 sirna lar, sitozin metilasyonu veya histon modifiye edici enzimler ile sessizleşme için DNA yı hedef alabilir O N NH2 N ~ sitozin O N NH2 N ~ 5-metilsitozin CH3 sirna nın sessizleştirme için DNA yı hedef almasının mekanizması tam olarak bilinmemektedir; ancak bitkiye özgü iki RNA polimeraz kompleksini içerir: RNA Polimeraz IV (Pol IV) ve RNA Polimeraz V (Pol V). DNA, metiltransferazların gerçekleştirdiği sitozin metilasyonu ile kovalent olarak modifiye edilebilir. DNA metiltransferaz Histon modifikasyonu DNA metilasyonu

44 Bitkilerin sessizleşmeyle ilgili fazladan RNA polimeraz kompleksleri vardır RNA DNA RNA Polimeraz Kompleks Dağılım İşlev RNA Polimeraz I Bütün ökaryotlar rrna üretimi RNA Polimeraz II Bütün ökaryotlar mrna, microrna üretimi RNA Polimeraz III Bütün ökaryotlar trna, 5S rrna üretimi RNA Polimeraz IV Kara bitkileri sirna üretimi RNA Polimeraz V Anjiyospermler AGO nun DNA da toplanması ve birikimi

45 RNA Pol IV geni işlev kaybı sessizleşmeyi engeller Sessizleşmiş GFP genine sahip Arabidopsis bitkisi nrpd1a-1 işlev kaybı mutantı. NRPD1A, RNA Polimeraz IV ün bir alt birimini kodlar. Yeşil bölgelerde GFP anlatımı yapılmaktadır. Pol IV ün gen sessizleştirilmesi için gerekliği olduğu gösterilmiştir. From Herr, A.J., Jensen, M.B., Dalmay, T., and Baulcombe, D.C. (2005) RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA. Science 308: Reprinted with permission from AAAS.

46 RNA Pol IV ve V transkripsiyonel sessizleşme için gereklidir Histon modifikasyonu DNA metilasyonu RNA Pol IV, sirna üretimine katkıda bulunur. RNA Pol V tarafından üretilen kodlama yapmayan RNA lar, sessizleşme mekanizmasına dahil olan molekülleri hedef bölgelere yönlendirir.

47 Çoğu sirna lar transpozonlar ve tekrarlanan DNA dan türevlenir Kromozom Sentromer small RNA miktarı transpozon/ retrotranspozon miktarı Arabidopsis te, kromozomların perisentromerik bölgelerinde bu tekrarların yoğun olarak bulunduğu yukarıda gösterilmiştir. Kasschau, K.D., Fahlgren, N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., and Carrington, J.C. (2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis sirnas. PLoS Biol 5(3): e57.

48 sirna lar sirna; yabancı DNA, transpozonlar ve tekrarlanan dizileri sessizleştirir. Bitkilerde sirna lar, dsrna nın Dicer-benzeri proteinler tarafından 24 nt lik uzunlukta kesilmesi ile oluşur. sirna lar AGO proteinleri ile birleşerek susturucu kompleksleri meydana getirir. Susturucu kompleksler RNA hedefleri üzerinde posttranskripsiyonel olarak çalışır: onları keser veya translasyona müdahale eder. Bu kompleksler kromatin üzerinde de DNA metilasyonu veya histon modifikasyonları ile sessizleşme sağlar.

49 microrna lar mirna lar mirna ların sirna lardan oluştuğu düşünülmektedir ve benzer şekilde üretilip işlem görür. Bitkilerde oldukça korunmuş az sayıda mirna ve korunmamış çok sayıda mirna vardır. mirna lar, spesifik MIR genleri tarafından kodlanır ancak trans-acting düzenleyici proteinler oldukları için başka genlerle çalışır. mirna lar bitkilerde gelişimsel ve fizyolojik olayları düzenler.

50 microrna lar mirna lar microrna lar mrna ları keser ya da translasyonlarına müdahale eder. MIR geni Translasyonel müdahale AGO AAAn RNA Pol II mrna kesimi AGO AGO AAAn mrna AAAn RNA Pol II

51 mirna lar ve sirna lar, birbiriyle ilişkili ancak farklı DCL proteinleri tarafından işlenir AtDCL1, mirna üretir AtDCL2 ve 4 sirna üretir Bitkilerde 4 veya daha fazla DCL proteini vardır, diğer organizmalarda bulunandan fazla sayıya sahiptir. DCL proteinlerinin, bitkilere patojen savunma cevabında yardım ettiği düşünülmektedir. Reprinted from Margis, R., Fusaro, A.F., Smith, N.A., Curtin, S.J., Watson, J.M., Finnegan, E.J., and Waterhouse, P.M. (2006) The evolution and diversification of Dicers in plants FEBS Lett. 580: with permission from Elsevier.

52 mirna ve sirna lar çeşitli AGO proteinleri ile bağlantılıdır AGO1 AGO1 hedeflerini seçici olarak keser ve mirna lara, bazen de sirna lara bağlar AGO4 AGO4 seçici olarak sirna ya tutunur ve kaynak DNA nın metilasyonununa aracılık yapar Arabidopsis, 10 AGO proteinine sahiptir. Hepsi tam olarak karakterize edilememiştir. Reprinted from Vaucheret, H. (2008) Plant ARGONAUTES. Trends Plant Sci. 13: with permission from Elsevier.

53 MIR genleri, mirna lara dönüştürülecek uzun RNA ları mirna lar MIR genleri tarafından şifrelenir transkribe eder MIR geni primer mirna (pri-mirna) transkriptleri DCL1 tarafından işlenen çift iplikli bir yapı haline katlanır 5' pri-mirna 3' 5' mirna mirna* ipliği degrede olur 3' mirna* mirna Hedef mrna

54 Bazı mirna lar oldukça korunmuştur ve önemli gen düzenleyicilerdir Factors faktörleri Korunmuş mirna ların hedeflerinin neredeyse yarısı transkripsiyon faktörleridir Fahlgren, N., Howell, M.D., Kasschau, K.D., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., Law, T.F., Grant, S.R., Dangl, J.L., and Carrington, J.C. (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis micrornas: Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes. PLoS ONE. 2007; 2(2): e219.

55 Bazı mirna lar oldukça korunmuştur ve önemli gen düzenleyicilerdir Korunmuş mirna ların hedeflerinin neredeyse yarısı transkripsiyon faktörleridir faktörleri Korunmamış MIRNA aileleri genellikle tek gen olarak bulunur. Korunmuş olanlar çoğunlukla daha büyük gen ailelerine duplike olmuşlardır. Fahlgren, N., Howell, M.D., Kasschau, K.D., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., Law, T.F., Grant, S.R., Dangl, J.L., and Carrington, J.C. (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis micrornas: Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes. PLoS ONE. 2007; 2(2): e219.

56 MIR156 gen ailesi oldukça korunmuştur mir156 bitki aleminde yüksek seviyede korunmuştur mir156, angiospermlerde ve su yosunlarında da bulunur mir156, Arabidopsis te 6 veya daha fazla gen tarafından kodlanır mir156, gelişimsel evre değişimlerini kontrol eden transkripsiyon faktörlerini hedefler Reprinted from Reinhart, B.J., Weinstein, E.G., Rhoades, M.W., Bartel, B., and Bartel, D.P. (2002) MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16:

57 Bazı korunmuş mirna ların hedefleri mirna gen ailesi Hedef gen ailesi İşlev 156 SPL transkripsiyon faktörleri Gelişimsel zamanlama 160 ARF transkripsiyon faktörleri Oksin cevabı, gelişim 165 HD-ZIPIII transkripsiyon faktörleri Gelişim, polarite 172 AP2 transkripsiyon faktörleri Gelişimsel zamanlama, çiçeksel organ tayini 390 ARF transkripsiyon faktörleri üzerinde çalışan TAS3 (tasirna) Oksin cevabı, gelişim 395 Sülfat taşıyıcı Sülfat alımı 399 Protein ubikitinasyonu Fosfat alımı Adapted from Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Conservation and evolution of mirna regulatory programs in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10:

58 Bitki mirna larının hedefleri ile uzaktan ilişkili olduğu düşünülmektedir Gen duplikasyonu Bitki mirna larının, hedef dizilerinden gen duplikasyonu, tersine duplikasyon ve ayrılma ile türevlendiği düşünülmektedir. Sadece bazı mirna lar seçici üstünlük gösterir ve yeniden duplike edilirler. Reprinted from Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Conservation and evolution of mirna regulatory programs in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10: with permission from Elsevier.

59 mirna lar ve vejetatif faz değişimi Vejetatif faz değişimi genç bitkiden olgun bitkiye geçiştir. Çimlenme Vejetatif faz değişimi zigot EMBRİYONİ K FAZ GENÇ EVRE OLGUN EVRE ÜRETKEN EVRE

60 Vejetatif faz değişimi, morfoloji ve üreme kapasitesini etkiler Olgun Bazı kaktüsler çok farklı genç ve olgun büyüme patternleri gösterir. Genç O G Photos courtesy of James Mauseth

61 Faz değişimi, yaprak şekli, filotaksi ve tüy motiflerini etkileyebilir Olgun yapraklar: Uzamış, asimetrik, değişen filotaksi Genç yapraklar: yuvarlak, simetrik, ters filotaksi Ökaliptus yaprakları, çobanpüskülü ve sarmaşık yaprakları gibi dimorfiktir. Arabidopsis ve mısır gibi diğer bitkilerde değişim daha hafiftir. Eucalyptus globulus

62 Arabidopsis te faz değişimi, yaprak şekli ve tüy motiflerini etkiler Genç yapraklar daha yuvarlak, daha az oyukludur ve sadece üst yüzeylerinde tüy vardır; olgun yaprakların alt yüzeylerinde de tüy bulunur. Reprinted from Poethig, R.S. (2009) Small RNAs and developmental timing in plants. Curr. Opin. Genet. Devel. 19: , with permission from Elsevier.

63 Faz değişimi mirna lar tarafından belirlenir hasty Daha kısa genç faza sahip HASTY, mirna nın nükleustan sitoplazmaya taşınması için gereken proteini kodlar. Yabani tip Reprinted with permission from Bollman, K.M. Aukerman, M.J., Park, M.-Y., Hunter, C., Berardini, T.Z., and Poethig, R.S. (2003) HASTY, the Arabidopsis ortholog of exportin 5/MSN5, regulates phase change and morphogenesis. Development 130:

64 Faz değişimi mirna lar tarafından belirlenir zippy Yabani tip İşlev kaybına sahip zippy mutantları genç evredeyken olgun vejetatif özellikleri gösterir. ZIPPY bir ARGONAUTE protein olan AGO7 yi kodlar Reprinted from Hunter, C., Sun, H., and Poethig, R.S. (2003) The Arabidopsis heterochronic gene ZIPPY is an ARGONAUTE family member. Curr. Biol. 13: , with permission from Elsevier.

65 mir156 aşırı anlatımı Arabidopsis te genç fazı uzatır Reprinted from Poethig, R.S. (2009) Small RNAs and developmental timing in plants. Curr. Opin. Genet. Devel. 19: , with permission from Elsevier.

66 mir156, faz değişim promotörleri olan SPL genlerini hedefler SPL genleri, mir156 nın hedefleri olan transkripsiyon faktörleri ailesidir. SPL3 Promoter ORF 3 UTR mir156 bağlanma bölgesi Yabani tip bitkilerde, mir156 anlatımı bitkinin yaşlanmasıyla azalır ve SPL nin birikmesine izin vererek faz değişimini başlatır. mir156 SPL

67 mir156-dirençli SPL, erken faz değimini başlatır SPL3 SPL3Δ SPL3m Promoter Promoter Promoter ORF ORF ORF 3 UTR 3 UTR mir156 bağlanma bölgesi Yabani tip mir156 SPL mir156- dirençli mir156 SPL Reproduced with permission from Wu, G., and Poethig, R.S. (2006) Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by mir156 and its target SPL3. Development 133:

68 mir156 işlev kaybı, erken faz değişimini başlatır mir156 OX Yabani tip mir156 SPL mir156 işlev kaybı SPL Reprinted from Poethig, R.S. (2009) Small RNAs and developmental timing in plants. Curr. Opin. Genet. Devel. 19: , with permission from Elsevier.

69 Gelişimsel değişimi başlatmak işlevi mir156 da korunmuştur Yabani tip MIR156B/C Promoter zma-mir156b zma-mir156c mir156 Corngrass1 mutant allel Promoter Transpozon zma-mir156b zma-mir156c mir156 Zea mays Corngrass1 mutantında (Cg1), MIR156B/C lokusunun upstream kısmına giren bir transpozon, transkripsiyon düzeyini arttırır ve daha fazla mir156 nın birikmesine neden olur. Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Copyright Chuck, G., Cigan, A.M., Saeteurn, K., and Hake, S. (2007) The heterochronic maize mutant Corngrass1 results from overexpression of a tandem microrna. Nat. Genet. 39:

70 Cg1 de arttırılmış mir156 anlatımı genç fazı uzatır Cg1 WT Cg1 WT Cg1 WT Olgun Corngrass1 bitkileri yaprak aksillerinde (kırmızı) ve köklerde (sarı) genç bitkilere ait özellikleri gösterir. Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Copyright Chuck, G., Cigan, A.M., Saeteurn, K., and Hake, S. (2007) The heterochronic maize mutant Corngrass1 results from overexpression of a tandem microrna. Nat. Genet. 39:

71 Leaf 4 Mısırda, AP2-benzeri gen GLOSSY15 in artmış anlatımı faz Yabani tip değişimini erteler Gl15-TG7 GLOSSY15, mir172 hedef bölgesine sahip, mir172 tarafından düzenleniyor olabilen bir AP2-benzeri transkripsiyon faktörü kodlar Leaf 8 Ault Leaf 12 Genç yapraklar pembe, olgun yapraklar mor boyanır. Lauter, N., Kampani, A., Carlson, S., Goebel, M., and Moose, S.P. (2005) microrna172 downregulates glossy15 to promote vegetative phase change in maize PNAS 102:

72 mir172, Arabidopsis te AP2-benzeri transkripsiyon faktörlerini hedefleyerek çiçeklenmeyi başlatır Yabani tip mir172-ox mir172 nin aşırı anlatımı sonucu Arabidopsis bitkileri erken çiçeklenir. mir172 homolojisi Aukerman, M.J., and Sakai, H. (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microrna and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15:

73 mir172 anlatımı geçici olarak AP2- benzeri proteinleri düzenler Çiçeklenme başlangıcının, AP2-benzeri floral inhibitörler belirli bir seviyenin altına indiği zaman olduğu düşünülmektedir. Aukerman, M.J., and Sakai, H. (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microrna and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15:

74 Faz değişimi, mirna ve transkripsiyon faktörlerinin geçici yolağını kapsıyor olabilir Arabidopsis te, SPL9 doğrudan MIR172b transkripsiyonunu aktive eder mir156 SPL mir172 AP2-benzeri

75 mirna lar diğer organizmalarda gelişimsel zamanlamayı düzenler mirna lar, nematod C. elegans ın gelişimi araştırılırken keşfedilmiştir. lin-4 tarafından kodlanan bir mirna normal larva gelişimi için gereklidir. lin-14 geni lin-4 bağlanma bölgesi 3 UTR lin-14 mrna lin-4 mirna Lee, R.C., Feinbaum, R.L., and Ambrose, V. (1993). The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75: Wightman, B., Ha, I., and Ruvkun, G. (1993) Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell 75:

76 lin-14 ün lin-4 tarafından downregülasyonu normal gelişim için gereklidir Yabani tip C. elegans lin-4 işlev kaybı lin-14 anlatımı Yabani tip solucanlarda, lin-14 erken aşamalarda anlatım yapar, sonra susturulur. lin-4 işlev kaybı, lin-14 anlatımının yüksek seviyede kalmasına neden olur. lin-4, lin-14 ün negatif düzenleyicisidir. Lee, R.C., Feinbaum, R.L., and Ambrose, V. (1993). The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75: Wightman, B., Ha, I., and Ruvkun, G. (1993) Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell 75:

77 mirna lar ve faz değişimi Vejetatif faz değişimleri, morfoloji ve üremeyi etkiler. mirna lar gen anlatımının ve faz değişiminin zamansal kontrolüne yardımcı olur: mir156, SPL geni birikimini önleyerek genç fazı devam ettirir. SPL genleri, faz değişimini ve çiçeklenmeyi uyarır. Arabidopsis te, bir SPL proteini mir172 transkripsiyonunu uyarır. Mir172, GLOSSY15 anlatımına müdahale ederek faz değişimini tetikler Nematod C. elegans ta, lin-14 ün lin-4 tarafından sessizleştirilmesi gelişim için gereklidir.

78 mirna lar ve besin sinyali Besin alımı Besin nakli Bitkiler besinleri topraktan alır. Sürgünler, besin ihtiyaçlarını bildirmek için köklere sinyal gönderir. mirna lar sürgünlerden köklere floem aracılığı ile taşınır ve besin alımını düzenler. Heidi Natura of the Conservation Research Institute.

79 mir399, fosfat açlığına bağlı olarak indüklenir mir399 kodlayan genler fosfat açlığı ile spefisik olarak uyarılır. mir399 aşırı anlatımı yapılan bitkilerde aşırı fosfat birikimi olur Bari, R., Pant, B.D., Stitt, M. and Scheible, W.-R. (2006) PHO2, microrna399, and PHR1 define a phosphate-signaling pathway in plants. Plant Physiol. 141: ; Chiou, T.J., Aung, K., Lin, S.I., Wu, C.C., Chiang, S.F. and Su, C.L. (2006) Regulation of phosphate homeostasis by microrna in Arabidopsis. Plant Cell 18:

80 Bir ubikitin bağlayıcı olan E2, mir399 hedefidir E2 gen yapısı Olası mir399 bağlanma bölgesi mir399 arttığı zaman, E2 anlatımı azalır E2 işlev kaybı (pho2) (solda) fosfatın aşırı birikimine neden olur. mir399 E2 Fosfat birikimi Chiou, T.J., Aung, K., Lin, S.I., Wu, C.C., Chiang, S.F. and Su, C.L. (2006) Regulation of phosphate homeostasis by microrna in Arabidopsis. Plant Cell 18:

81 E2, ubikitin proteoliz yolundaki bir bileşendir Hedef Ubikitin F-box SKP1 CUL1 E2 SCF E3 kompleksi 26S proteozom Ubikitin yolu, proteinlerin proteozomlar tarafından yok edilmesini sağlar. Adapted from Vierstra, R.D. (2009) The ubiquitin 26S proteasome system at the nexus of plant biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10:

82 E2 konjugaz sürgünde değil kökte görev yapar Genotip Shoot Root pho2 ve yabani tip filiz ve köklerin mikrograftı ile köklerdeki PHO2 işlevinin, normal fosfat alımı için yeterli olduğu gösterilmiştir. Fosfatın aşırı birikimi sadece mutant köklü bitkilerde olur. Bari, R., Pant, B.D., Stitt, M. and Scheible, W.-R. (2006) PHO2, microrna399, and PHR1 define a phosphate-signaling pathway in plants. Plant Physiol. 141:

83 Tam tersi olarak, mir399 un sürgün ya da kökteki aşırı anlatımı fosfat birikiminin artmasına neden olur mir399 un filizde aşırı anlatımı, kökteki E2 aktivitesini nasıl etkileyebilir?? Sadece filiz Filiz ve kökte mir399 un aşırı anlatımı Sadece kök Pant, B.D., Buhtz, A., Kehr, J., Scheible, W.-R. (2008) MicroRNA399 is a long-distance signal for the regulation of plant phosphate homeostasis. Plant J. 53:

84 mir399, sürgünlerden köklere taşınır ama köklerden sürgünlere taşınmaz Filizdeki mir399 düzeyi Kökteki mir399 düzeyi mir399 un kökte aşırı anlatımı yapıldığı zaman, filizdeki düzeyinde bir artış olmaz. mir399 un filizde aşırı anlatımı yapıldığı zaman, kökteki düzeyi artar. Pant, B.D., Buhtz, A., Kehr, J., Scheible, W.-R. (2008) MicroRNA399 is a long-distance signal for the regulation of plant phosphate homeostasis. Plant J. 53:

85 mir399, floemde taşınabilir bir sistemik sinyaldir Yeterli fosfat Sınırlı fosfat mir399 Tanımlanamayan hedeflerin proteolizi Daha fazlası var... Fosfat alımı arttırılır E2 düzeyi azalır, proteoliz azalır, olası hedefler birikir

86 mir399 aktivitesi target mimic tarafından düzenlenir mir399 mir399 GUCCCGUUUAGAGGAAACCGU PHO2 UUGGGCAAAUCUCCUUUGGCA PHO2 mir399, hedefi PHO2 ye yüksek düzeyde tamamlayıcıdır.

87 mir399 aktivitesi target mimic tarafından düzenlenir mir399 mir399 GUCCCGUUUAGAGGAAACCGU PHO2 UUGGGCAAAUCUCCUUUGGCA IPS1, mir399 a bağlanır ama kesim yerinde fazladan nükleotidlere sahip olduğu için kesilmez PHO2 mir399, hedefi PHO2 ye yüksek düzeyde tamamlayıcıdır. mir399 IPS1 mir399 GUCCCGUUGAGAGGAAACCGU 5 IPS1 UUGGGCAACUUUCCUUUGGCA CUA Redrawn from Franco-Zorrilla, J. M., Valli, A., Todesco, M., Mateos, I., Puga, M.I., Rubio-Somoza, I., Leyva, A., Weigel, D., García, J.A., and Paz-Ares, J. (2007) Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microrna activity. Nat. Genet. 39:

88 mir399 aktivitesi IPS1 varken azalır IPS1 yok IPS1 var mir399 PHO2 mir399 PHO2 mir399, PHO2 ye bağlanır ve keser. PHO2 yapılmaz, fosfat alınımı olmaz. mir399 tutulur. PHO2 translasyona uğrar, fosfat alınır.

89 IPS1, mir399 işlevini değiştirebilir IPS1? Fosfat yokluğunda, mir399 indüklenir ve PHO2 üretimini inhibe eder. Birkaç gün sonra, ISP1 anlatımı indüklenir, mir399 tutulur ve PHO2 anlatımına izin verilir. Reprinted by permission of Macmillan Publishers, Inc. Chitwood, D.H., and Timmermans, M.C.P. (2007) Nat. Genet. 39: Copyright 2007.

90 mirna lar ve besin alınımı Köklerde besin alımı derecesi, sürgünlerden gelen sinyallerle düzenlenir. PHO2, ubikitinle birleşen E2 kodlar, bunun da yönlendirilmiş proteolize yardımcı olduğu düşünülmektedir. PHO2 düzeyleri, fosfat açlığında biriken mir399 ile düzenlenir. Açlıkla indüklenmiş mir399, sürgünden köklere hareket eder ve PHO2 ile fosfat alımını düzenler. PHO2 anlatımı, mir399 un hedef taklidi olan IPS1 tarafından da kontrol edilir.

91 tasirna lar tasirna lar trans-acting sirna lar TAS genleri tarafından kodlanır Primer transkript işlenmesi mirna tarafından başlatılır TAS geni RNA Pol II tasirna lar, RNA Pol II tarafından transkribe edilen TAS genlerince şifrelenir. AGO Transkript bir mirna tarafından hedeflenir ve kesilir. RDR6 Kesilmiş transkript, RNA-bağımlı RNA polimeraz RDR6 tarafından dsrna ya kopyalanır.

92 tasirna biyogenezi dsrna, DCL4 tarafından daha kısa dsrna lara kesilir, TAS geninden birçok tasirna açığa çıkar. Arabidopsis 4 TAS geni ailesine sahiptir: TAS1 ve TAS2 tasirna lar pentatrikopeptid tekrar genlerini hedefler. TAS3 tasirna lar ARF transkripsiyon faktörlerini hedefler. TAS4 tasirna lar MYB transkripsiyon faktörlerini hedefler.

93 Her TAS geninden birkaç evreli tasirna lar türevlenir Primer transkriptin mirna kesim bölgesi tasirna lar her iki iplikten de üretilebilir. DCL4, dsrna boyunca hareket ederken, ölçüp kesim yapar. Reprinted from Allen, E., Xie, Z., Gustafson, A M., and Carrington, J.C. (2005) microrna-directed phasing during trans-acting sirna biogenesis in plants. Cell 121: , with permission from Elsevier.

94 tasirna üretimini etkileyen mutasyonlar faz değişimini etkiler rdr6-15 mutasyonu tasirna üretimini ortadan kaldırır zip-1, TAS3 tasirna üretimini ortadan kaldırır Reprinted from Fahlgren, N., Montgomery, T.A., Howell, M.D., Allen, E., Dvorak, S.K., Alexander, A.L., and Carrington, J.C. (2006) Regulation of AUXIN RESPONSE FACTOR3 by TAS3 ta-sirna affects developmental timing and patterning in Arabidopsis. Curr. Biol. 16: with permission from Elsevier.

95 Mutations that affect tasirna production affect phase change rdr6-15 mutasyonu tasirna üretimini ortadan kaldırır zip-1, TAS3 tasirna üretimini ortadan kaldırır Her iki mutasyon da dcl4 ve tas3 gibi faz değişimini hızlandırır. Reprinted from Fahlgren, N., Montgomery, T.A., Howell, M.D., Allen, E., Dvorak, S.K., Alexander, A.L., and Carrington, J.C. (2006) Regulation of AUXIN RESPONSE FACTOR3 by TAS3 ta-sirna affects developmental timing and patterning in Arabidopsis. Curr. Biol. 16: with permission from Elsevier.

96 nat-sirna lar Nat-siRNA lar Natural cis-acting sirna lar Örtüşen transkriptlerden türevlenirler Abiyotik ve biyotik stresle ilgidirler Örtüşen genler Tamamlayıcı transkriptler dsrna meydana getirir Sessizleşme AGO AGO Redrawn from Katiyar-Agarwal, S., Morgan, R., Dahlbeck, D., Borsani, O., Villegas Jr. A., Zhu, J.-K., Staskawicz, B.J., and Jin, H. (2006) A pathogen-inducible endogenous sirna in plant immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:

97 small RNA teknolojileri uygulamaları Bitkilerde sirna veya mirna oluşturan DNA, bir veya birden fazla genin sessizleştirilmesi için kararlı bir şekilde genoma entegre edilebilir. Gen sessizleştirilmesi, fıstıktaki allerjenleri durdurabilir. Gen sessizleştirilmesi, pamuk tohumlarındaki zehirli bileşenleri uzaklaştırarak, besin kaynağı olarak kullanılmasını sağlayabilir Parazitik nematod tarafından enfekte edilen kontrol Haşere kontrolü Böcek veya nematod genlerine karşı dsrna anlatımı yapan bitkiler, haşerelere karşı direnç kazanmışlardır! RNAi-indüklenmiş enfeksiyon yok Huang, G., Allen, R., Davis, E.L., Baum, T.J., and Hussey, R.S. (2006) Engineering broad root-knot resistance in transgenic plants by RNAi silencing of a conserved and essential root-knot nematode parasitism gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:

98 Sonuç Small RNA lar genomun düzenlenme ve savunmasına katkı sağlar ve baz çifti eşleşmesi ile sessizleşme özgünlüğünü düzenler. sirna hedefleri; çok tekrarlara sahip heterokromatin, transpozonlar, virüsler veya diğer patojenleri kapsar. mirna ve sirna hedefleri;gelişimsel zamanlama veya motifi etkileyen düzenleyici genler, besin dengesi ve stres cevabını içerir.