ADENOVIRUS R-gene REF REF B

Transkript

1 ADENOVIRUS R-gene REF REF B İnhibasyon kontrolü için yorum modifikasyonu (Bölüm 13.3 bakın) IVD BİLEŞİM REF DNA EXTRACTION KIT Ref. : Quantification and detection kit, ADENOVIRUS R-gene Ref. : B 1. Kit Tanımı 2 2. Kullanım amacı 2 3. Test Prensibi 3 4. Kit içeriği ve saklama koşulları 5 5. Kit içeriğinde bulunmayan fakat gerekli reaktif ve materyaller 6 6. Reaktiflerin rekonstitüsyonu 7 7. Uyarı ve Önlemler 7 8. İnternal kantifikasyon standartlar ve kontroller 8 9. Örneğin işlenmesi ve taşınması Ekstraksiyon protokolü Tespit ve Real Time PCR kantifikasyon protokol Data analizleri Sonuçların hesaplanması ve yorumlanması Arıza giderme Kılavuzu Test performansı Referanslar İlgili ürünler 30 Sayfa 1 / 30

2 1. Kit tanımı İnsan adenovirüsleri Mastadenovirüs cinsi Adenoviridae familyasındandır. Adenovirüsler ortaölçeklidir ve non-enveloped icosahedral virüslerden oluşan çift sarmallı DNA genomudur. 52 serotipde dahil olmak üzere en az yedi insan adenovirüs türleri (AG) tanımlanmıştır. Adenovirüsler esas olarak endemik veya epidemik salgınlar gibi çocuklar ve askerler arasında bulaşması ile görünen solunum, oküler veya gastrointestinal hastalığa neden olabilir. Adenovirus enfeksiyonları dünya çapında yaygın olarak görülür. Son birkaç yılda, adenovirüsler bağışıklık sistemi baskılanmış hastalar arasında yüksek hastalık oranı ve ölüm oranına sahip önemli viral patajonler olarak artarak tanımlanmıştır. İmmün sistemi baskılanmış hastalarda klinik belirtiler pnömoni, hepatit, hemorajik sistit, kolit, pankreatit, meningoensefalit ve yaygın hastalık içerir. Bu klinik belirtiler organ sistemi, hastanın yaşı ve virüsün serotipine bağlıdır. Adenovirus tarafından şüpheli bir enfeksiyon durumunda, kan örneklerinden alınan adenovirus DNA tespiti genellikle yayılan hastalık için önemli olduğu için kan örnekleri PCR ile test edilmelidir. Kan örneklerinde izleme şu anda hematopoietik kök hücre nakli (HKHT) alıcıları arasında özellikle pediatrik nüfusta yaygın olarak kullanılır. Virüs klinik belirtiler geliştirmeden önce 2-3 haftalık kanda tespit edilebilir. Hastalık takipi ve hastalığın seyri kantitatif PCR yöntemi ile daha güvenilir doğrulanabilir. Artan viral yük ölçümleri artan ölüm oranı riskine bağlıdır. Real Time PCR ile viral genomun tespiti ve amplifikasyonu oldukça yüksek duyarlılıktadır, ve özellikle bulaşıcı olmayan bir virüs durumunda uygulanabilir. Bu durumda viral yük hücre kültürü ile tespit edecekler için çok düşüktür ve sonuçlar hızlıca alınır. Her hasta için viral kinetikler analiz edilebilir. ADENOVIRUS R-gene kit viral DNA ekstraksiyon sonrası Real Time PCR ile Adenovirüslerin viral yükünü ölçmek için tasarlanmıştır. ADENOVIRUS R-gene kullanımı kolaydır ve komplet kittir ve bundan dolayı rütin teşhis için idealdir. ADENOVIRUS R-gene aşağıda listelenen ALL adenovirüsün kantifikasyonunu sağlar: o Adenovirus A : AdV 12, 18, 31. o Adenovirus B : AdV 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50. o Adenovirus C : AdV 1, 2, 5, 6. o Adenovirus D : AdV 8 to 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22 to 30, 32, 33, 36 to 39, 42 to 49, 51. o Adenovirus E : AdV 4. o Adenovirus F : AdV 40, 41. o Adenovirus G : AdV 52. Örneklerin birkaç tipi ve çok sayıda DNA saflaştırma sistemleri (otomatik ve manuel olarak) kit ile valide edilmiştir. Ekstre edilen DNA uygun platformlarda Real Time PCR ile amplifiye edildi ve tespit edildi. Ürünlerin R-gen aralığı içinde genel bir amplifikasyon programı sayesinde numune analizi aynı anda aşağıdaki diğer hedefler ile analiz edilebilir, bunlar: HSV1 HSV2 VZV R-gene kit (Ref: B) ile HSV1, HSV2, VZV, CMV R-gene kit (ref : B) ile CMV, CMV HHV6,7,8 R-gene kit (ref : B) ile CMV, HHV-6, HHV-7 ve HHV-8, ve EBV R-gene (ref : B) ile EBV. Sonuçlar farklı kontroller ve bir ekstraksiyon kontrolü de dahil olmak üzere kitte sağlananlar ile valide edilir. Sonuçlar hastanın tedavi durumuna göre erken yayılmış adenovirus infeksiyonların tanısı için geçerlidir. 2. Kullanım Amacı ADENOVIRUS R-gene kit tam kan, plazma, CSF, biyopsi, dışkı, bronkoalveoler lavaj (BAL) nazal aspirat ve swab örneklerinde tüm adenovirus serotiplerin genomunun kantifikasyonunu ve/veya tespitini sağlar. Viral yük kit ile sağlanan kantifikasyon aralığı kullanılarak ölçülebilir. Viral DNA, Real Time PCR ampifikasyonu öncesi ekstre edilmelidir. Sayfa 2 / 30

3 Biyolojik incelemenin diğer yöntemleri ile birlikte (tıbbi görüntüleme, biyokimyasal ve immünolojik analizi, vb ), ADENOVİRUS R-gene kit ile elde edilen sonuçlar adenovirüs ile erken bir enfeksiyon teşhisini ve tedavide bağışıklığı baskılanmış hastalarda izlemeyi sağlar. Solunum örneklerinde, birçok adenovirüs serotipleri immunfloresan teknikleri ile tespit edilemeyen duyarlılığın bir artış seviyesi ile tespit edilebilir. ADENOVIRUS R-gene kit ile adenovirüslerin tespiti EBV R-gene kit (Argene, ref.: ) kullanılarak EBV viral yük ölçümü ile, HSV1 HSV2 VZV R-gene kit (Argene, ref. : ) kullanılarak HSV-1, HSV-2, VZV viral yük ölçümü ile ve CMV HHV6,7,8 R-gene kit (Argene, ref. : ) kullanılarak CMV, HHV-6, HHV-7, HHV-8 viral yük ölçümü ile aynı anda gerçekleşebilir. Tüm Argene Real Time PCR kitler aynı amplifikasyon prosedürünü izler ve böylece aynı deneyde aynı anda kullanılabilir. 3. Test Prensibi 3.1 Numune tipi: Adenovirus R-gene kit kitte sağlanan kantifikasyon aralığı kullanılarak tam kan, CSF ve plazmada adenovirüs genomların tespitini sağlar. Solunum örneklerinde hücre miktarı yada dışkı örneklerinin tutarlılığı tamponda tekrar süspansiyon öncesi kurulmadığı için kalitatif bir yaklaşım dışkı, biyopsiler ve solunum örnekler için (nazal aspirat ve swablar, BAL) önerilir. Ayrıca, tampon miktarı genellikle standart değildir. Bu nedenle bir örnekten diğerine bir hastanın hastalık seyrini izlemek mümkün değildir. Ayrıca, yüksek viral yük aşırı DNA nedeniyle amplifikasyonun inhibisyonuna neden olan örneğin bu tiplerinde sıkça bulunur. Bu nedenle elde edilen değer ölçülebildiği halde, bir miktar tayini yapılmalıdır. Eğer ancak dışkı miktarı (dışkı) veya hücre miktarı (hacim ile ilgili hücre sayısı) standartsa ve kantifikasyon standart aralığı kullanılırsa, sonuçlar PCR başına kopya sayısı olarak rapor edilebilir. Aşırı bir malzeme nedeniyle yanlış negatif amplifikasyon sonuçlarından kaçınmak için örnek 1 / 100 (ekstraksiyon aşaması dahil ) oranında hem dilüe edilmiş hem de dilüe edilmemiş test sistamatik olarak önerilir. Örneğin hem pozitif hem de inhibe olma durumunda, ekstre DNA'nın bir ek bir dilüsyon ile yeni bir kalitatif test yapılmalıdır. Kantifikasyon sonuçlar örnek tiplerine göre kopya/ml yada kopya/pcr da bildirilir. Adenovirüs için kantifikasyon aralığı 10 kopya/pcr ile kopya/pcr gibi 500 kopya/ml ile 107 kopya/ml arasında lineerdir. Sonuçlar Adenovirus R-gene kit ile sağlanan negatif, pozitif kontrol, inhibasyon ve ekstraksiyon ile doğrulanmıştır DNA saflaştırma: Aşağıdaki DNA ekstraksiyon yöntemleri ADENOVIRUS R-gene kit, Ref.: B kiti ile doğrulanır: o NucliSENS easy MAG (Biomérieux Ref.: ) o MagNA Pure LC System Instrument (Roche Diagnostics Ref.: ) o MagNA Pure Compact Instrument (Roche Diagnostics Ref. : ) o BioRobot M48 (Qiagen) o m2000sp (Abbott, ref. 9K1401) o Versant kpcr Molecular System SP (SIEMENS réf ) o QIAcube (QIAGEN Ref.: / ) o Manual extraction Kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen Ref.: / 51106). o Manual extraction QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN Ref. : 51504). o Manual extraction Kit DNA EXTRACTION KIT (Argene Ref.: ) Numune ve ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü (IC2) içinde bulunan hedef DNA yukarıda ekstraksiyon yöntemlerinden biri kullanılarak ekstre edilir. Sayfa 3 / 30

4 DNA EXTRACTION KIT (Ref.: ) ile kullanılan teknik, bir mikrosentrifujasyon hızı ile silika jellerin seçici bağlayıcı özellikleri ile ilişkilidir. Numune ve internal kontrol (IC2) membran üzerinde DNA bağlayıcı kapasitelerini optimize etmek için proteaz ile ilk kez parçalanır. Silika kolonunun kullanımı, DNA kaplama sonrası, kontaminasyonu elimine etmek için numunenin verimli yıkmasını sağlar. Elüsyon sonrası, DNA amplifikasyon tekniklerinde direk kullanılmak için uygundur Real time amplifikasyon ve kantifikasyon : Amplifikasyon, 5' nükleaz TaqMan teknolojisi (patent n : , ) kullanılarak yapılır. Kullanıma hazır amplifikasyon karışımı: primerler, dntps, amplifikasyon bufferı, Hot StarTaq Polimeraz (QIAGEN), tüm ekstraksiyon prosedürü (lizis dahil) yapılan internal kontrol (IC2) için spesifik primerler ve problar yanında spesifik Adenovirüs primerler ve prob içerir. Aşağıdaki Real Time PCR platformların aralığı ADENOVİRUS R-gene kit ref.: B ile doğrulanır: o Gamme LightCycler (LC480, System II dahil) o Gamme ABI (ABI StepOne ve ABI Fast dahil) o SmartCycler 2.0 o Rotor-Gene o Stratagene yada Versant kpcr Molecular System AD Ekstre edilen numuneler aynı zamanda amplifiye edilir ve tespit edilir. Amplifiye edilmiş parçanın büyüklüğü: 138 baz çiftidir ve adenovirus kapsid protein alt birimleri formu olan altıgen capsomeres için kodlama Hexon geninde bulunmaktadır. 4 kantifikasyon standardın aralığı ADENOVİRUS R-gene kit (QS1, QS2, QS3, QS4) sağlanmıştır. Kantifikasyon standartları PCR başına 50 kopya ile kopyaya uygun kopya /μl ile 5 kopya/ μl arasındadır. Kantifikasyon standartları termocylera sahip programda yeni bir standart eğrisi oluşturmak için kullanılır. Bilinmeyen örneklerde Adenovirus genomunun kantifikasyonu bu standart eğriden bulunur (gerekli hesaplama yazılımı PCR cihazı ile sağlanır). QS3, PCR başına 500 kopya standart DNA içeren bir kantifikasyon standardıdır. Bu standart, daha önce oluşturulan bir standart eğri vermek için kullanılabilir (bkz: 8.2 bölümü). SC, 10 kopya/pcr a karşılık gelen µl başına 1 kopya plazmit içeren duyarlılık kontrolüdür. Bu kontrol (SC) testin performansını doğrular ve bir çalışma-kontrolü olarak kabul edilmelidir. Bir ekstraksiyon ve inhibisyon kontrolü (IC2) eğer numune iyi ekstre edilmişse ve numunede amplifikasyon inhibitörlerinin varlığı doğrulanmışsa, lizis adımını kontrol etmek için ADENOVİRUS R- gene kitinde bulunur. UYARI: Kitin açıklanan performansları sadece önerilen ekstraksiyon sistemleri ve PCR cihazları için garanti edilebilir. Hasta takibi sırasında, aynı protokolü kullanmak ve aynı ekstraksiyon ve tam kan, CSF ve plazma örneği ile amplifikasyon cihazı kullanmak zorunludur. Dışkı örneğinin (ağır dışkı) veya hücre miktarı (örnek hacmi ile ilgili olarak) standart olmadığı için kalitatif bir yaklaşım dışkı örnekleri ve solunum örnekleri için önerilir. Kantitatif analiz için, aşırı bir malzeme nedeniyle yanlış negatif amplifikasyon sonuçlarından kaçınmak için örnek 1 / 100 (ekstraksiyon aşaması dahil ) oranında hem dilüe edilmiş hem de dilüe edilmemiş test sistamatik olarak önerilir. Örneğin hem pozitif hem de inhibe olma durumunda, ekstre DNA'nın ek bir dilüsyon ile yeni bir kalitatif test yapılmalıdır. Sayfa 4 / 30

5 4. Kit içeriği ve saklama koşulları 4.1. DNA Ekstraksiyon kit Kit başına ekstraksiyon sayısı: 50 A QIAamp Mini column... 5 x 10 B Collection tubes (2 ml)... 2 x 50 C AL buffer Xn - HARMFUL ml D AW1 buffer (concentrated) Xn - HARMFUL ml E AW2 buffer (concentrated) ml F AE buffer ml G QIAGEN protease Xn - HARMFUL mg H Protease solvent ml Bu kit kutu üzerinde yazılı son kullanım tarihine kadar +2 C/+8 C de açılmadan önce ve açıldıktan sonra saklanabilir. Yüksek sıcaklıkta saklamadan kaçının. Çözündürülmüş QIAGEN proteaz, tekrarlanan donma/çözündürmeyi önlemek için -18 C/-22 C 'de eşit miktarlarda saklanabilir Kantifikasyon Kit ADENOVIRUS R-gene B Test sayısı: 90 W0 Ekstraksiyon için su (Molecular grade)... 2 x 1.8 ml IC2 Internal Kontrol ml R0 Amplifikasyon için su (Molecular grade) µl QS kopya*/μl adenovirusde kantifikayson standard µl QS2 500 kopya*/μl adenovirusde kantifikayson standard µl QS3 50 kopya*/μl adenovirusde kantifikayson standard µl QS4 5 kopya*/μl adenovirüsde kantifikayson standard µl SC Duyarlılık kontrolü (1 kopya*/μl adenovirus) µl R10 Adenovirus ve IC2 Amplifikasyon premiks... 3 x 450 µl *adenovirüs için plazmit kopyasının miktarına karşılık gelir. Kiti (ref B), kutu üzerinde yazılı son kullanım tarihine kadar karanlıkta -18 C/-22 C de donmuş olarak açıldıktan sonra ve önce tutun. Kit (ref. : B), Internal kontrol 2 (IC2), reaktif (W0), kantifikasyon standartlar (QS1, QS2, QS3, QS4) ve duyarlılık kontrolü (SC) açıldıktan önce ve sonra -18 C/-22 C de ekstraksiyon odasında saklanmalıdır. Reaktifler R10 ve R0-18 C/-22 C de premiksin hazırlanması için ayrı odada saklanmalıdır. Sayfa 5 / 30

6 5. Kit içeriğinde bulunmayan fakat gerekli materyal ve reaktifler 5.1 Numune ekstraksiyonu için: With «DNA EXTRACTION KIT» Ref.: , QIAamp DNA Blood Minikit Ref: or ve QIAamp DNA Stool Mini kit Ref: Etanol %. - Santrifüj (6 000xg xg). -Vorteks. -Test tüpleri (1.5 ml, 2 ml) C su banyosu. -Aerosol filtreli steril mikropipet uçları. -Tek kullanımlık lateks veya benzeri eldivenler. ADENOVIRUS R-gene Ref. : B ile doğrulanan diğer ekstraksiyon yöntemleri Kitler QIAamp DNA Blood Mini kit Ref.: / QIAamp DNA Stool Mini kit Ref.: / MagNA Pure DNA Isolation Kit I (Ref ) 192 isolations MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I Ref.: NucliSENS easymag Magnetic extraction reagents Mag Attract DNA Mini M48 Kit (192) (Ref.: ) Sample Preparation System DNA PROMEGA (Ref.: 06K12.24) (4x24 preps) Versant Sample Preparation 1.0 Reagents Ref.: Ref.: EKSTRAKSİYON CİHAZLARI QIAcube Üreticinin talimatlarını izleyin. MagNA Pure LC System Üreticinin talimatlarını izleyin. MagNA Pure Compact Üreticinin talimatlarını izleyin. NucliSENS easymag Üreticinin talimatlarını izleyin. BioRobot M48 Üreticinin talimatlarını izleyin. m2000sp Üreticinin talimatlarını izleyin. Versant kpcr Molecular System SP Üreticinin talimatlarını izleyin ADENOVIRUS R-gene kit için, ref.: B Aerosol filtreli steril mikropipet uçları. Real Time PCR thermocycler: LightCycler, ABI, SmartCycler, Rotor-Gene yada Stratagene, Versant kpcr Molecular System AD, Chromo4. LightCycler için LC Karusel Santrifüj veya 2mL reaksiyon tüplerine uygun tezgâh üstü mikrosantrifüj veya ABI ve Stratagene, Versant kpcr Molecular System AD için plaka santrifüj. Tek kullanımlık lateks veya benzeri eldivenler. ADENOVİRUS R-gene için doğrulanan real time PCR platformlar için kapileriler, tüpler ve mikroplakalar. Tercih edilen termocyler için uygun soğutma bloğu. U.V Light. Örnekler ve premiks dağıtımı için workstation veya pleksiglas ekran. LightCycler 2.0 sonuç yorumu için renk kompansasyon r-gene (Argene Ref.: ). LightCycler 1.0 de bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrol elde etmek için DICO Extra r-gene (Argene ref. : ) in DP2 premiksi Sayfa 6 / 30

7 6. Reaktiflerin çözündürülmesi DNA Extraction kit (ref.: ) ile sağlanan reaktifleri SADECE çözündürün. 6.1 Proteaz stok solüsyon hazırlama 24 mg liyofilize proteaz (G) e 1.2 ml proteaz çözücü (H) ekleyin. -18 C/-22 C de aynı hacimlerde saklayın (tekrar çözündürme ve dondurmadan kaçının) AL tampon (C) hazırlama Kullanım öncesi çalkalayarak AL tampon (C) iyice karıştırın. AL tampon (C) karışımlı proteazı saklamayın. Eğer çökelti AL tamponunda (C) görünürse, çökelti çözünene kadar +70 C de ısıtın. AL tampon (C) +2 C / +8 C de saklandığında stabildir AW1 tampon (D) hazırlama AW1 tampon (D) konsantre olarak bulunur. +2 C/+8 C de saklayın. AW1 tampon (D) bir konsantre olarak verildi. İlk kullanım öncesi, 19 ml konsantre edilmiş tampona 25 ml etanol (96-100%) ekleyin AW2 tampon (E) hazırlama AW2 tampon (E) konsantre olarak bulunur. +2 C / +8 C de saklayın. AW2 tampon (E) bir konsantre olarak verildi. İlk kullanım öncesi, 13 ml konsantre edilmiş tampona 30 ml etanol (96-100%) ekleyin. 7. Uyarılar ve Önlemler 7.1 Moleküler biyoloji işlemleri için uyarılar ve önlemler Amplifikasyon prosedürlerinde numunenin kontaminasyon riskini önlemek için aşağıdaki talimatlar izlenmelidir: Numune hazırlama ve amplifikasyon reaksiyonu için ayrı çalışma alanları kullanın. Laboratuvarda hareket reaktif hazırlık alanından amplifikasyon alanı yönünde olmalıdır. Her alan için pipetler ve laboratuar ekipmanlarını hazırlayın. Reaktif yada numune hazırlama alanında amplifiye bir ürünü asla başlatmayın. Kullanılan örnekler sadece bu analiz için ayrılmalıdır. Numuneler biyolojik güvenlik kabini altında hazırlanmalıdır. Farklı örnek tüpleri aynı zamanda asla açılmalıdır. Örnekleri çalışmak için kullanılacak pipetler sadece bu amaç için ayrılmalıdır. Bu pipetler filtre uçlu pozitif boşluklu pipetler veya hazırlanmış pipetler olmalıdır. Kullanılan uçların farklı türleri steril olmalıdır. Eşit miktarlardaki reaktifler için kullanılan pipetler sadece bu amaç için ayrılmalıdır. Amplifikasyon için gerekli reaktifler tek bir deney sırasında kullanılmak üzere eşit miktarlarda ayrılmıştır. 7.2 Genel uyarılar ve önlemler Bulaşıcı olan tüm örnekler ve malzemeleri çalışmayın yada atmayın. Kullandıktan sonra: malzemeler, reaktifler ve atığın bulaşıcı olarak ele alınması gerekir. Bu testi gerçekleştirmeden önce tüm talimatları okuyun. Son kullanım tarihinden sonra reaktifleri kullanmayın (etiket basılmış). Yalnızca kitte bulunan reaktifleri kullanın. Sayfa 7 / 30

8 Diğer üreticilerin yada farklı lot numaralı kitlerin reaktiflerini değiştirmeyin. Ağız ile asla pipetlemeyin. Özel çalışma alanlarında sigara veya içecek içmeyin, yemek yemeyin 7.3 Spesifik reaktifler için uyarılar ve önlemler AL (C) tampon ve AW1 tampon (D) guanidinyum klorür içerir (kaotropik tuz) R22: Yutulursa zararlıdır. R36/38: Göz ve cilt için zararlıdır. S13: Hayvan yemi, yiyecek ve içeceklerden uzak tutun. S26: Göz ile temas halinde, derhal bol su ile yıkayınız ve tıbbi yardım isteyiniz. S36: Uygun koruyucu önlük giyin. S46: Yutulduğunda derhal tıbbi yardım alınız ve bu konteynırı veya etiketi gösterin. Bu bileşen çamaşır suyu içeren dezenfeksiyon ajanlar ile kullanılmamalıdır. AW2 tampon (E) ve proteaz çözücü (H) koruyucu olarak % 0.04 Sodyum Azide içerir. Proteaz (G) subtilisin içerir. R37/38: Deri ve solunum sistemini tahriş edicidir. R41: Göze ciddi hasar riski. R42: Solunduğunda hassasiyete neden olabilir. S22: Tozlarını solumayın. S24: Cilt ile temasından sakının. S26: Göz ile temasında derhal bol su ile yıkayın ve doktora başvurun S36/37/39: Çalışırken uygun koruyucu giysi, koruyucu eldiven, koruyucu gözlük / maske kullanın. S46: Yutulması halinde hemen bir doktora başvurun, kabı veya etiketi gösterin. Reaktiflerin cilde temasından kaçının. Eğer temas olursa bol miktarda su ile hemen yıkayın. Reaktifler kullanıldığında eldiven giyin. 8. Internal kantifikasyon standartlar ve kontroller Not 1 : 530 nm = ABI, Smartcycler 2.0, Stratagene ve Versant kpcr Moleküler Sistemi AD platformları üzerindeki "FAM" okuma kanalına karşılık gelir, fakat Rotor-Gene e "Yeşil" karşılık gelir. Şu andan itibaren sadece terim 530 nm kullanılacaktır. 560 nm = ABI platformların VIC okuma kanalına, Smartcycler Cy3 okuma kanalına, Rotor- Gene Yellow okuma kanalına, Stratagene ve Versant kpcr Moleküler Sistemi AD platformları «Hex» okuma kanalına karşılık gelir. Şu andan itibaren sadece terim 560 nm kullanılacaktır. Not 2 : CT = ABI, Rotor-Gen ve SmartCycler, Stratagene ve Versant kpcr Moleküler Sistemi AD platformlar için Crossing Threshold. Bu terim LightCycler platformları için CP (Crossing Point) e karşılık gelir. Şu andan itibaren sadece terim CT veri sayfası ile kullanılacaktır. UYARI: Numuneler ve kontrolleri eklemek için sıra takip edilmelidir (konu 11.2 bakın). 8.1 İnternal kantifikasyon standartları (QS1, QS2, QS3, QS4) İnternal kantifikasyon standart aralığının kullanımı numune kantifikasyonu için zorunludur. Kantifikasyon standartlar termocylerın sahip olduğu program standart bir eğri oluşturmak için kullanılır. Kantifikasyon standartları kopya/μl (QS1) ile 5 kopya/μl (QS4) aralığındadır. Kantifikasyon standartları standart olarak belirlenmiştir ve değerleri numuneler analiz program tablosunda tanımlandığında girilmelidir. Sayfa 8 / 30

9 8.2 Kantifikasyon standart (QS3) Kantifikasyon standart QS3 ilk çalışmada oluşturulan standart eğrinin alımını sağlar. Standart eğrisinin alımı AYNI lotlu reaktifler ile çalışmadan çalışmaya kullanılacak bir kantifikasyon yöntemidir. Dört kantifikasyon standartına sahip standart eğride tanımlanan çalışmalar arasındaki periyod ve alınan standart eğri kullanılarak yapılan çalışma 3 aydan fazla olmamalıdır. ABI, Stratagene ve Versant kpcr Moleküler Sistemi AD real time PCR cihazları standart eğrisinin alımına izin vermez. 8.3 Hassasiyet kontrolü (SC) Hassasiyet kontrolü (SC) testin performansını doğrular ve bir çalışma-kontrolü olarak kabul edilmelidir. Hassasiyet kontrolü (SC) R10 amplifikasyon premiks ile amplifiye edilir. Hassasiyet kontrol çok zayıf bir pozitif örnek gösterdiği için zaman zaman negatif sonuçlar verebilir. Bu kontrol tespit sınırına sahiptir. 8.4 Ekstraksiyon+inhibisyon kontrol Numune ekstraksiyon+inhibisyon kontrol (IC2numune) Bir internal kontrol (IC2) den oluşan bu kontrol ekstraksiyon öncesi örneğe eklenmelidir ve hem ekstraksiyonun etkinliğini hem de olası inhibitörlerin varlığının tespit edilmesini kontrol eder. 560 nm de sinyal okunur Referans ekstraksiyon+inhibisyon kontrol (IC2W0) İnternal kontrolden (IC2) oluşan bu kontrole ekstraksiyon öncesi negatif ekstraksiyon kontrolü (W0) eklenmelidir ve bir referans (IC2W0) elde etmek için hasta örnekleri ile aynı zamanda amplifiye edilmelidir. Sonuçlar hasta numunelerinin (IC2sample) ekstraksiyon+inhibisyon kontrolü ile karşılaştırılmalıdır. 560 nm de sinyal okunur. 560 nm de hem IC2W0 hem de IC2 numune kontrollerin CT (Crossing Eşiği) değerlerinin karşılaştırılması ekstraksiyon etkinliğini değerlendirmek için ve olası bir inhibitörlerinin varlığını tespit etmek için kullanılır. 8.5 Negatif kontroller Negatif ekstrasksiyon+ amplifikasyon kontrol (IC2W0) Bu kontrol de açıklandığı gibi tam olarak aynı tüptedir (referans ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü). Ancak, 530 nm de analiz edildiğinde bu kontrol ekstraksiyon ve amplifikasyon sırasında kontaminasyonun yokluğunu gösterir. Negatif ekstraksiyon+amplifikasyon numunenin sinyal okuması 530 nm dir Negatif amplifikasyon kontrolü Negatif amplifikasyon kontrol amplifikasyon premiksde (R10) amplifiye edilmiş reaktifden (R0) oluşur. Bu kontrol amplifikasyon sırasında olası bir kontaminasyonu gösterir. Bu kontrol opsiyoneldir. Negatif amplifikasyon kontrol R0 ve IC2W0 in 530 nm de CT (Crossing Eşiği) değeri karşılaştırması bir olası kontaminasyonu belirler. Sayfa 9 / 30

10 9. Numune toplama, çalışma ve taşıma Örnekler laboratuar talimatları izlenerek toplanmalı ve taşınmalıdır. 9.1 Numune taşıma Taşınacak numunelerde zararlı ve bulaşıcı malzemenin taşınması için yerel mevzuatı kontrol edin. Örnekler sevk edilmeli ve olası en kısa sürede (tercihen 24 saat içinde) laboratuarda çalışılmalıdır Numune hazırlama Kan numuneler UYARI : Heparize tüplerin kullanımı genik amplifikasyon analize uygun değildir. Kan toplama tüpleri amplifiye ürünlerin tespiti sırasında azalan sinyallerden sorumlu olan sitrit içerir. Kan EDTA içinde toplanmalıdır. Ekstraksiyon adımı öncesi, otomatik çalkalayıcı ile 10 dakika örnek tüplerini ters düz ederek kan örneğini homojen hale getirin. Biyolojik güvenlik kabini altında küçük hacimlerde her bir kan örneğini eşit olarak ayırın. Örnekler alındıktan sonra en kısa sürede (tercihen 24 saat içinde) laboratuara aktarılmalıdır. Kan örnekleri oda sıcaklığında laboratuara gönderilmelidir (+18 C/+25 C) Serum ve plazma Kan bir kuru tüpte yada EDTA içeren bir tüpte toplanmalıdır. 20 C de 10 dakika 1200xg de tüpleri santrifüjleyin. Maksimum 2 ml (200 µl minimum) serum ve plazma biyolojik güvenlik kabini altında cryotüplerde boşaltılır. Serum ve plazma tercihen oda sıcaklığında (+18 C/25 C) yada +2 C/+8 C de laboratuara gönderilmelidir. Serum ve plazma hemen alınıp çalışışmazsa +2 C/+8 C de bir hafta saklanmalıdır. Bu gecikme bir haftayı aşarsa, serum ve plazma -18 C/-22 C saklayın. Eğer serum ve plazma kuru buz üzerinde laboratuara gönderilirse, -18 C/-22 C de yada tercihen - 78 C/-82 C de saklanmalıdır Dışkı solüsyonu a) NucliSENS easymag ile bir otomatik ekstraksiyon için: o 800 μl NucliSENS lizis pad dışkının büyük bir lensini ekleyin. o İyice vorteksleyin. o Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin(+18/+25 C). o 30 dakika 3000xg de santrifüj edin. İlgili easymag yükleyicinin kontrol kuyusu içine supernatant transfer edin. b) Diğer ekstraksiyon için: Aşağıdaki yolla 1 ml steril PBS içinde 10 ile 50% dışkı süspansiyonu hazırlayın: o o 1 ml steril suyu 2 ml işaretli santrifüj tüpüne pipetleyin. 1.1 ml (10% de dışkı süspansiyonu) den 1.5 ml (50% de dışkı süspansiyonu) e değişik hacimlerde toplam süspansiyon elde etmek için dışkı örneği ekleyin. İyice karıştırın. 2 ml Örnek: 40% lık dışkı süspansiyonu 1.4 ml 1 ml PBS dışkı Sayfa 10 / 30

11 o o o 30 dakika 6000xg de santrifüj edin. Süpernatantı toplayın. 15 dakika 12000xg de santrifüj edin. Süpernatantı toplayın. Süpernatant -78/-82 C de saklanmalıdır Solunum örnekleri hazırlama: Solunum örnekleri (katı yada swab örnekler) normal tuz solüsyonunun az miktarında eğer gerekirse, tekrar suspense edilmelidir ve test gerçekleştirmeden önce 6 dakika rpm de santrifüjleyin. NucliSENS easymag otomatik sistem kullanılarak ekstraksiyon durumunda, numune + Proteinase K li IC2 işlem öncesi gereklidir. Bu durumda, 20 mg/ml a 10 µl Proteinaz K ekleyin ve 15 dakika 56 C de inkübe edin. 10. Numune ekstraksiyon protokolü UYARI: Ekstraksiyon prosedürüne başlamadan önce, numune ve reaktiflerin IC2 homojen olduğundan emin olun. Enfeksiyondan sorumlu adenovirüs alt grupların tanımlanması ADENOVIRUS CONSENSUS kit (Argene, ref: ) ile yapılır. Dışkı örneğinin (ağır dışkı) veya hücre miktarı (örnek hacmi ile ilgili olarak) standart olmadığı için kalitatif bir yaklaşım dışkı örnekleri ve solunum örnekleri için önerilir. Kantitatif analiz için, aşırı bir malzeme nedeniyle yanlış negatif amplifikasyon sonuçlarından kaçınmak için örnek 1 / 100 (ekstraksiyon aşaması dahil ) oranında hem dilüe edilmiş hem de dilüe edilmemiş test sistamatik olarak önerilir. Örneğin hem pozitif hem de inhibe olma durumunda, ekstre DNA'nın ek bir dilüsyon ile yeni bir kalitatif test yapılmalıdır. Örnek ekstraksiyonu için ayrılmış odada 10.1 «DNA EXTRACTION KIT» ile (Ref. : IC2+ W0) +18 C/+25 C oda sıcaklığına IC2 ve W0 örnekleri dengeleyin. +18 C/+25 C oda sıcaklığına AVE buffer (F) dengeleyin. AL (C), AW1 (D), AW2 (F) ve taşıyıcı RNA (G) "Reaktifleri rekonstitüsyon bölümünde verilen talimatlara göre hazırlanıp hazırlanmadığını kontrol edin. Çalışma başına bir ayrılmış numene kullanın. Gerekirse +70 C 'de ısıtarak AL tampon (C) daki çökeltiyi tekrar çözün ve kullanmadan önce oda sıcaklığında soğutun. Tüm santrifüj adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir Lizis +18 C/+25 C oda sıcaklığına IC2 ve W0 örnekleri dengeleyin. Analiz edilecek numune için 1,5 ml microcentrifuge tüplerinden eşit sayıda belirleyin (kapakta) ve hazırlayın. Ekstre edilecek (W0+IC2) karışımı BİR tüpe ekleyin. +56 C ye termocylere ya da su banyosunu ısıtın. 1.5 ml bir mikrosantrifüj tüp içine 200 µl AL buffer (C) pipetleyin. 20 μl proteaz pipetleyin. 10µL internal kontrolü (IC2) ekleyin. Sayfa 11 / 30

12 W0+IC2 karışım için belirlenen tüp içine 200 µl W0 ekleyin. Numune ekstraksiyonu için belirlenen tüp içine 200 μl numune ekleyin. Numune hacmi 200 μl den az ise, PBS numuneye ekleyin. Elde edilen sonuçlar bu durumda sadece kalitatif olacaktır. 15 dakika boyunca pulse-vorteksleyerek karıştırın. Verimli lizis sağlamak için, örnek homojen bir solüsyon verene kadar iyice karıştırılır. +56 C de 10 dakika boyunca inkübasyon edin. Lizisin 10 dakika sonra inkübasyonu tamamlanır. Uzun inkübasyon süresinin saflaştırılmış DNA nın kalitesi veya verimi üzerinde etkisi yoktur. Potansiyel olarak bulaşıcı ajanlar lizis adımdan sonra numune 95 C'de 15 dakika inkübe edilerek inaktive olabilir. Ancak uzayan bu inkübasyon DNA nın bozulmasına neden olur. Kapağın içindeki damlaları uzaklaştırmak için 1,5 ml mikrosantrifüj tüpünü kısa süre santrifüjleyin Yükleme adımı Numuneye 200 μl % lik etanol ekleyin ve 15 dakika boyunca pulse-vorteksleyerek karıştırın. Kısa süre santrifüjleyin. Test edilecek örnekler ile spin kolonu aynı sayıda belirleyin ve hazırlayın. Kenarlarını ıslatmadan spin kolonuna (2 ml toplama tüpünde) yukarıdaki karışımı dikkatle uygulayın. 6000xg de 1 dakika santrifüjleme ve santrifüj sırasında aerosol oluşumunu önlemek için her spin kolonunu kapatın. Eğer lizisat santrifüj sonrası kolon üzerinden tamamen geçerse, spin kolonu boşalana kadar daha yüksek hızda tekrar santrifüjleyin. Temiz bir 2 ml toplama tüp içine spin kolonu yerleştirin ve süzüntü içeren tüpü alın Yıkama Spin kolonunu dikkatlice açın ve kenarlarını ıslatmadan 500 μl AW1 tampon (D) ekleyin. Kapağı kapatın ve 6000xg de 1 dakika santrifüjleyin. Temiz bir 2 ml toplama tüp içine spin kolonu yerleştirin ve süzüntü içeren tüpü alın. Spin kolonunu dikkatlice açın ve kenarlarını ıslatmadan 500 μl AW2 tampon (E) ekleyin. Kapağı kapatın ve full hızda (12000xg) 3 dakika santrifüjleyin. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine spin kolonu yerleştirin, süzüntülü eski toplama tüpünü alın. Elüsyon öncesi full hızda (12000xg) 3 dakika santrifüjleyin. Bu adım AW2 tampon (E) etkisini ortadan kaldırır Elüsyon Spin kolonunu dikkatlice açın. UYARI: Elüsyon hacmi numunenin türüne bağlıdır: - Tam kan örneği, solunum örnekleri yada dışkı için, oda sıcaklığında 100 µl dengelenmiş elusion tampon AE (F) ekleyin. - Plazma örneği için, oda sıcaklığında 50 µl dengelenmiş elusion tampon AE (F) ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. 6000xg de 1 dakika santrifüjleyin. Ekstre edilen DNA -18 C/-22 C de saklandığında bir yıla kadar stabildir. Sayfa 12 / 30

13 10.2 ADENOVIRUS R-gene ile doğrulanan kitler ya/yada ekstraksiyon cihazları ile Bu ekstraksiyon cihazları nitelikli ve eğitimli personel tarafından üreticisinin önerdiği şekilde düzenli olarak çalışılmalıdır. CİHAZLAR : QIAcube MagNA Pure Compact MagNA Pure LC System NucliSENS easymag BioRobot M48 m2000sp Versant kpcr Molecular System SP Kit QIAamp DNA Blood Mini kit Ref: / QIAamp DNA Stool Mini kit Ref: QIAamp DNA Blood Mini kit Ref: / QIAamp DNA Stool Mini kit Ref: MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I Ref isolations MagNA Pure DNA Isolation Kit I Ref isolations NucliSens magnetic extraction reagents Mag Attract DNA Mini M48 Kit (192) Ref Sample Preparation System DNA PROMEGA (4x24 preps) Ref : 06K12.24 Versant Sample Preparation 1.0 Reagents Örnek+ IC2 Hacimler 200 µl örnek + 10 µl IC2 800 µl örnek + 10 µl IC2* (extraction 300 µl) 400 µl örnek + 10 µl IC2** (extraction 250 µl) Örnek tipi: Tam kan Solunum örnekleri Protokol Elüsyon miktarı 100 µl Plazma 50 µl Dışkı 100 µl Dışkı 100 µl Tam kan Solunum 100 µl örnekleri Kan ve vucut sıvı spin protokol V3 Plazma 50 µl Dışkı 100 µl Dışkı Plasma Solunum örnekleri Tam kan Plasma Solunum örnekleri Tam kan Solunum örnekleri Tam kan Dışkı Solunum örnekleri Tam kan Solunum örnekleri Plazma CSF Isolation of DNA from stool for pathogen detection V1 100 µl Total_NA_Plasma_100_ µl DNA_Blood_100_ µl Total NA Variable_elution_volume DNA I Blood_Cell High Performance 50 µl 100 µl Generic 50 µl Specific B µl silica + 2 ml lysis buffer Specific A µl silica 50 µl 50 µl Bacteria DNA 100 µl Combined Open Mode 0.3ML DNA Blood CMV ASR Örnek Hazırlama protokolü µl 65 µl (eluat 50 µl) * 800μL den daha yüksek başlangıç miktar örneklerini ekstre etmek için, IC2 reaktife aşağıdaki miktarları ekleyin: 1 başlangıç örnek miktarı için, IC2 reaktiften 1/80 th oranında ekleyin (örneğin: 1mL numune ekstre etmek için, 12.5µL IC2 reaktif ekleyin). ** 400μL den daha yüksek başlangıç miktar örneklerini ekstre etmek için, IC2 reaktife aşağıdaki miktarları ekleyin: 1 başlangıç örnek miktarı için, IC2 reaktiften 1/40 th oranında ekleyin (örneğin: 600µL numune ekstre etmek için, 15µL IC2 reaktif ekleyin). Sayfa 13 / 30

14 11. Tespit ve Real-Time Kantifikasyon protokolü Not: Talimatları basitleştirmek için, amplifikasyon reaksiyon karışımı veren cihaz bir "tüp" olarak adlandırılır. UYARI : Hasta takibi sırasında, aynı protokolü ve aynı ekstraksiyon ve amplifikasyon cihazı kullanmak zorunludur. Tüp sayılarını belirlemek için, eğer deney standart eğrinin oluşumu gerektirirse kontrol edin (bölüm 8.2 bakın). Plan: - Test edilen numune başına 1 tüp; - Adenovirus kantifikasyon standart eğri oluşturmak için 1 yada 4 tüp; - Adenovirus duyarlılık kontrol (SC) için 1 tüp, - Referans ekstraksiyon+inhibasyon kontrol (IC2W0) için 1 tüp ekstraksiyon ve amplifikasyon için negatif kontrol olarak da kullanılır; LightCycler 1.0 için NOT: LightCycler 1.0 aynı kapilleride 2 farklı dalga boyunda tespit mümkün değildir. Bu nedenle, inhibisyon kontrol ölçümünü etkinleştirmek için, ek bir kapiller her bir örnek ile kullanılmalıdır. Bu ek kapiller aşağıdaki reaktifleri içermelidir: 10 µl ekstre edilen numune + IC2, 15µL DP2 premiks (DICO Extra r- gene kit, Argene, ref.: de bulunan) ve 0.1µL Taq polimeraz (sağlanmayan) Program : Real time PCR platformu kullanılır yada kullanılmazsa, amplifikasyon programı aynı kalır. Amplifikasyon programı aşağıdaki tabloda açıklanmıştır. Adımlar Zaman Sıcaklık Döngü LC1 LC2, LC480 Fluorescence acquisition: ABI Rotor-Gene SC2 Stratagene Versant kpcr Molecular System AD Hot Start Taq Polymerase Activation 15 dk. 95 C Denaturasyon 10 sn. 95 C Amplifikasyon 530 FAM Green FAM Hibridizasyon sn. 60 C 560 VIC Yellow Cy3 Annealing End of the elongation FAM HEX Not 1: Sıcaklık geçiş oranı/eğimi 20 C/sn yada 100% kadar önceden tanımlanmıştır. Not 2 : LightCycler üzerinde, PCR ın sonunda soğutma adımı: 30 sn / 40 C / 1 cycle ekleyin. Not 3: LightCycler üzerinde, programlamada 60 C a seek temperature parameter ayarlayın. Not 4: LightCycler 2 üzerinde, bir renk kompensasyon dosyasının kullanımı sonuçlarını yorumlamak için ŞART tır. Bu Colour Compensation kit r-gene (Argene ref.: ) kullanılarak LightCycler 2.0 için yönetim programında oluşturuldu ve kaydedildi. Not 5: LightCycler 480 üzerinde, iki optikal sistem vardır: sadece "Sistemi II" ADENOVİRUS R-gene kite uyumludur. "Sistemi II" yazılımda otomatik renk kompensasyon içerir. Not 6: ABI üzerinde, passive reference içinde none seçin. Not 7: Rotor-Gene üzerinde, "gain optimisation" tıklayarak sinyal kalibre edin. Not 8: Stratagene ya da Versant kpcr Molecular System AD de "referans Dye içinde "none" seçin. Sayfa 14 / 30

15 Her real time PCR platformu için programlama ayrıntıları mevcuttur Amplifikasyon hazırlama Amplifikasyon odası Deneye başlamadan önce: o o o UYARI: Vorteksleyerek veya pipetleyerek çözündürülmüş reaktifleri homojenize edin, sonra kısa bir süre santrifüjleyin. Soğutma bloğu 30 dakika U.V. light altında dekontamine edildiğinden emin olun. Soğutma bloğu +2/ +8 C de önceden soğutulduğundan emin olun. Mümkün olduğunca kontaminasyonu önlemek için dağıtım tamamlandığında tüpleri kapatın. -18 C/-22 C'de kullanımdan sonra hemen amplifikasyon premiksi (R10) değiştirin. Tüm tüplere aynı hacimde dağıtmak için pipet ile hafifçe homojenizasyon yaparak 15 μl amplifikasyon premiks toplayın. UYARI: Örnekler/ reaktifler eklemek için aşağıda gösterilen sıraya uyulmalıdır. İlgili tüpte ekstre edilen numunenin 10 μl sini ekleyin. İlgili tüplerde duyarlılık kontrolünün (SC) 10 μl sini ekleyin (bölüm 8 bakın). İlgili tüplerde her standardın (QS4 den QS1 e) 10 μl sini ekleyin (bölüm 8 bakın). İlgili tüplerde ekstre edilmiş miks IC2+W0 in 10 μl sini ekleyin. Bu kontrol IC2W0 kontroldür (bölüm 8 bakın). İlgili cihazla tüpleri santrifüj edin ve sonra tüpleri termocyclera aktarın. LightCycler 1.0 için NOT: LightCycler 1,0 kullanarak yapılan bir deney için, ayrıca eklenecekler: - Numunenin(IC2sample) ekstraksiyon+inhibisyon kontrolünü oluşturmak için DICO Extra r-gene (DP2) premiksini içeren 1 tüp içine her numunenin 10 µl si eklenecek. - Referans ekstraksiyon+inhibisyon kontrolü oluşturmak için DICO Extra r-gene (DP2) premiksini içeren 1 tüp içine 10 µl (IC2W0) ekleyin ADENOVIRUS R-gene programı çalıştırma: Amplifikasyon programını çalıştırın (bölüm 11.1 de açıklanan talimatlara göre saklandı). Aşağıdaki tabloya göre kontroller ve numuneler belirlenmiştir: Thermocycler LightCycler SmartCycler ABI Rotor- Gene Stratagene Versant kpcr Molecular System AD Samples Bilinmeyen Bilinmeyen Bilinmeyen Bilinmeyen STANDARD Standards STANDARD STD STD STANDARD Bilinmeyen IC2W0 at 560 nm Bilinmeyen Bilinmeyen Bilinmeyen Bilinmeyen Bilinmeyen IC2W0 at 530 nm Bilinmeyen Bilinmeyen NTC Bilinmeyen Bilinmeyen Sensitivity Bilinmeyen Bilinmeyen Bilinmeyen Bilinmeyen control (SC) NTC Sayfa 15 / 30

16 Adenovirus kantifikasyon için, aşağıdaki değerleri kantifikasyon standartları için girin (kopya/ml): Extraction 200µL Elution in 50 µl (copies/ml) Kantifikasyon (tam kan, plazma, CSF, dışkı, solunum örnekleri) Versant kpcr m2000sp Extraction Molecular Extraction 200µL System SP 300 µl Elution in 100 Extraction 250 Elution in 150 µl µl µl (copies/ml) Elution in 65 µl (copies/ml) (copies/ml) Results in copies/pcr QS QS QS QS Data Analizleri Not 1: Cihazların türleri ile sonuçların kullanımına ilişkin istenen detaylar mevcuttur. Not 2 : 530 nm = ABI, Smartcycler, Stratagene ve Versant kpcr Moleküler Sistemi AD platformları üzerindeki "FAM" okuma kanalına karşılık gelir, fakat Rotor-Gene e "Yeşil" karşılık gelir. Şu andan itibaren sadece terim 530 nm kullanılacaktır. 560 nm = ABI platformların VIC okuma kanalına, Smartcycler Cy3 okuma kanalına, Rotor- Gene Yellow okuma kanalına, Stratagene ve Versant kpcr Moleküler Sistemi AD platformları «Hex» okuma kanalına karşılık gelir. Şu andan itibaren sadece terim 560 nm kullanılacaktır LIGHTCYCLER 1.0 İLE 2 ölçüm noktasında Arithmetic modda Fit Points yöntemini kullanın. Threshold line (kırmızı) taşıyın, böylece arka plan gürültüsünün yukarısında bulunan lineer parçasında her floresan eğrisi çaprazlanır. NOT: Eğer bir düz çizgi aynı anda, kendi doğrusal kısmında bütün eğrileri çaprazlamazsa, her numune için bir CP elde etmek için gerektiği kadar çalışmayı tekrar edin. Her bir örnek için, bir CP Crossing Point 530 nm de hesaplanır. Örnekleri ölçmek için, Arithmetic modda "Second Derivative maximum" yöntemini kullanın. Adenovirus için hesaplanan konsantrasyonu Calculated sütununda görünür (kopya/ml) LIGHTCYCLER 2.0 İLE Viral hedef analizi Absolute Quantification modunda 530 nm de yapılmalıdır. Ekstraksiyon + inhibisyon testi Absolute Quantification modunda 560 nm de aktivasyon (Colour Compensation tab) sonunda analiz edilmelidir sonra renk kompensasyonu dosyası ile önceden oluşturulmuş uygun dosyayı seçin (Argene Colour Compensation r-gene ref: ). Fit Points yöntemini kullanın. Threshold line taşıyın, böylece arka plan gürültüsünün yukarısında bulunan lineer parçasında her floresan eğrisi çaprazlanır. NOT: Eğer bir düz çizgi aynı anda, kendi doğrusal kısmında bütün eğrileri çaprazlamazsa, her numune için bir CP elde etmek için gerektiği kadar operasyonu tekrar edin. Her bir örnek için, bir CP Crossing Point 530 nm de hesaplanır. Örnekleri ölçmek için, Automated F max modu seçin (ikinci derivatif yöntem). Sayfa 16 / 30

17 Adenovirus için hesaplanan konsantrasyonu Conc sütununda görünür (kopya/ml). Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) CP değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü (IC2sample) için hesaplanan CP değeri karşılaştırılarak analiz edilir LIGHTCYCLER 480 (System II) İLE LC480 (System II) FAM - HEX otomotik kompensasyonu açın. Viral hedef 530 nm (FAM) de Absolute Quantification modunda analiz edildi. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm (HEX) de Absolute Quantification modunda analiz edildi. Her pozitif numune için, bir Crossing Point (CP) 530 nm de hesaplandı. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CP değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CP değeri karşılaştırılarak analiz edilir SMARTCYCLER 2.0 İLE Viral hedef 530 nm de FAM modunda analiz edildi. Ekstraksiyon + inhibisyon test 560 nm de Cy3 modunda analiz edildi. Her pozitif numune için, bir Crossing threshold (CT) 530 nm de hesaplandı(fam Ct). Hesaplanan konsantrasyon FAM Std/Res Green kolonunda görünür. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CT değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CT değeri karşılaştırılarak analiz edilir ABI (including ABI StepOne ve ABI Fast) İLE None, Passive reference alanında seçildiğine emin olun çünkü R10 premiks herhangi bir pasif referans florokrom içermez. Örnek Detector/target alanında FAM R-gene detektör seçildikten sonra aynı yolla analiz edilir. Kendi lineer bölgesinde tüm örneklerin floresans eğrilerini çaprazlayan bir konum için manuel olarak Manual Baseline ayarlanır. Bu adım hesaplanan CT değerine karşılık gelen pozitif örnekleri tespit etmek için yapılır. Negatif örnek SDS programı tarafından CT kolonunda görüntülenen Undetermined olarak tanımlanır. İnhibisyon kontroller (IC2sample ve IC2W0) Detector/target alanında VIC R-gene seçildikten sonra aynı yolla analiz edilir. Örnekleri ölçmek için, lineer moda dönün. Adenovirus için hesaplanan konsantrasyon her deneyin sonunda rapor basılmış ve hazırlanmış olarak görünür. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CT değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CT değeri karşılaştırılarak analiz edilir ROTOR-GENE İLE Viral hedef 530 nm de Cycling A Green modunda analiz edildi. Ekstraksiyon + inhibisyon test 560 nm de Cycling A Yellow modunda analiz edildi. Threshold line (eşik çizgisi), Dynamic tubes ve Slope Correct seçildikten sonra Linear Scale modunda ayarlanmalıdır. Sayfa 17 / 30

18 Hesaplanan konsantrasyon Quant. Results Cycling A Green penceresinde Calc Conc kolonunda (copies/ml) görünür. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CT değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CT değeri karşılaştırılarak analiz edilir STRATAGENE, Mx3000PVersant kpcr Molecular System AD İLE None, Dye reference alanında seçildiğine emin olun çünkü ADENOVİRUS R-gene R10 kit kit premiks herhangi bir pasif referans florokrom içermez. Viral hedef, Hex butonu seçilmeyerek analiz edildi. Ekstraksiyon + inhibisyon kontrol Fam butonu seçilmeyerek analiz edildi. Threshold line (eşik çizgisi) Linear scale moda ayarlanmalıdır. Hesaplanan konsantrasyon Quant özet tablo penceresinde Quantity kolonunda (copies) görünür. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CT değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CT değeri karşılaştırılarak analiz edilir. 13. Sonuçların yorumlanması ve validasyonu Not : Örneği pozitif olarak analiz etmek için, adenovirus altgrupların daha fazla tespiti ADENOVIRUS CONSENSUS kit (Argene, ref.: ) ile gerçekleşir. Bu durumda, uygun örneklerin belli miktarlarını ayırın Test validasyonu: UYARI: Eğer aşağıdaki koşulların hepsi yerine getirilirse, test geçerlidir. Eğer durum böyle değilse, tüm numuneler ve kontroller tekrar test edilmelidir. 1 st ŞART : IC2W0 530 nm de tespit edilebilir sinyal vermez. 2 nd ŞART : IC2W0 560 nm de 36 döngüden daha az yada eşit olmalıdır. 3 d ŞART : QS3 CT standart aralığı 29 ve 33 döngü arasında olmalıdır. 4 th ŞART: Standart aralığı için gerekli eğim ya/yada etki aşağıda listelenen değerler arasında olmalıdır: Cihazlar LightCycler 1.0 LightCycler 2.0 / LightCycler 480 KANTİFİKASYON Tam kan, plazma, CSF (Dışkı, BAL ve nazal örnekler) Standart eğrisi her bir deney için tüm 4 kantifikasyon standartları ile oluşturulur. Değerlendirme Eğim/ Verim Standart eğrisi sonraki deneyler için tüm 4 kantifikasyon standartları ile oluşturulur < Eğim< < Eğim < < Verim< < Verim < 2.05 KALITATIF TESPİT Dışkı, BAL, nazal örnekler, biopsies Uygulanamaz Sayfa 18 / 30

19 SmartCycler < Eğim< < Eğim* < < Eğim < < Eğim* < Rotor-Gene 0.8 < Verim < < Verim < 1.05 ABI, Uygulanamaz ABI StepOne, ABI Fast < Eğim < Stratagene Versant kpcr Molecular System AD 0.8 < Verim < 1.1 Uygulanamaz * SmartCycler ile, regresyon hattı Ct = f(log (Concentration) in eğimi "Transpose X ve Y axes" seçerek ve grafikte sağa tıklayarak elde edilir. => Eğer TÜM bu koşullar yerine getirilirse, sonuçlar analiz edilecek numune ile elde edilebilir Örnek okuma: Her bir örnek tek tek analiz edilmelidir. Pozitif bir örnek bir 530 nm CT değerini gösterir. 530 nm de bir CT değeri yokluğu örnek negatif veya ekstre örneğe uygundur. Ancak, her durumda, inhibisyon olmadığından ve 560 nm'de ekstraksiyon aşamasında aşağıda açıklanan faktörlere göre doğru şekilde yapıldığından emin olun Sonuçların yorumlanması: Tam kan, CSF ve plazma örneği (kopya/ml) ve dışkı örnekleri ve solunum örneklerinde(kopya/pcr) kantitatif tespit: 560 nm: EKSTRAKSİYON VE INHİBİSYON kontrol Eğer: CT [IC2sample] CT [IC2W0] + 3 döngü, sonra, NON INHIBITED ÖRNEK ve doğru ekstraksiyon Eğer : CT [IC2sample] > CT [IC2W0] + 3 döngü, sonra, INHIBITED ÖRNEK ve/veya kötü ekstraksiyon 530 nm: Viral hedef yorumu POZİTİF örnek KANTİFİKASYON Valide edilen NEGATIF olarak valide edilen örnek POZİTİF örnek (dilüsyon olmayan yada dilüsyon olan) Tekrar kantifikasyon yeni ekstrede yada dilüe örneği kontrol edin Valide edilmeyen NEGATIF örnek, tekrar ekstre edilmeli Sayfa 19 / 30

20 Solunum, dışkı örneklerinde ve biyopsilerde kantitatif tespit : 560 nm: EKSTRAKSİYON VE INHİBİSYON kontrol Eğer: CT [IC2sample] CT [IC2W0] + 3 cycles, sonra, NON INHIBITED ÖRNEK ve doğru ekstraksiyon Eğer : CT [IC2sample] > CT [IC2W0] + 3 cycles, sonra, INHIBITED ÖRNEK ve/veya kötü ekstraksiyon 530 nm: Viral hedef yorumu Valide edilen POZİTİF örnek NEGATIF olarak valide edilen örnek Valide edilen POZİTİF örnek Valide edilmeyen NEGATIF örnek, tekrar ekstre edilmeli İstisnai durumlar: UYARI: Negatif bir numune durumunda: Eğer eğrinin eğimi son floresans IC2W0 kıyasla son flüoresansın ( % 50) bir düşüşüne neden olursa, zayıf bir inhibisyon mümkündür. Örneğin tekrar test edilmesi ve ekstre edilmesi önerilir. IC2W0 IC2Sample ÖNEMLİ NOTLAR: log 10 raporlama biçiminin kullanılması önerilir. İki kantifikasyon sonucu eğer her iki değer arasındaki fark en az 0.5 log 10 den daha yüksekse faklı olarak kabul edilir ve bu sonuçlar ekstraksiyon ve amplifikasyon için aynı cihaz ve aynı ekstraksiyon kullanılarak elde edilir. Hastanın viral durumunu tanımlamak için teşhis inceleme yöntemlerinden başka ADENOVİRUS R-gene kiti ile elde edilen sonuçları karşılaştırmak için gereklidir. Bu ürünün satın alınması sadece insan in vitro teşhis hizmetleri sağlamak için kullanılacak belli roche patenti altında alıcı hakları vermektedir. Alıcının kullanımının bu özel hakları dışında diğer lisans veya genel patent Argene tarafından verilmez. Sayfa 20 / 30

21 14. Arıza Giderme 14.1 Pozitif örneklerde sinyalin olmaması veya az olması OLASI NEDENLER Laboratuarda yanlış numune toplama, taşıma ve saklama Taşıma ve saklama koşulları karşılanamadı. ÖNERİLER Taşıma ve saklama için opsiyonel koşulları (sıcaklık, zamanı) belirleyen konu 9 a bakın. Örnek toplama ve analizi arasındaki gecikmeyi kontrol edin. EDTA tüplerine kanı toplayın. 18 C/-22 C 'de ve tercihen karanlıkta ADENOVİRUS R-gene kitin saklanması ile ilgili bölüm 4 deki talimatları izleyin. Ekstraksiyon adımında problem Pipetleme hatası Programlama hatası Amplifikasyon adımında sorun Data analizinde hata Sonuçları yorumlamada hata Ekstraksiyon yapmadan önce numuneleri dikkatlice homojenize etmişseniz, kontrol edin. Tüm yıkama adımlarını gerçekleştirin ve DNA Ekstraksiyon kit (ref ) kullanıldığında inkübasyon zamanına uyun. Bölüm 10.1 bakın. Eğer ADENOVİRUS R-gene kit B ile analiz etmek için önerilen protokol (bölüm 10 Bkz) ve materyale karşılık gelen ekstre numune kullanılırsa, kontrol edin. Kitin performansı sadece DNA/RNA Ekstraksiyon kit ve bölüm 10.2 de açıklanan otomatik sistem kullanılarak ekstraksiyon için doğrulanmıştır. Üreticinin önerileri doğrultusunda otomatik ekstraksiyon ve santrifüj sistemleri için workstations koruyucu bakımını her zaman gerçekleştirin. Pipetlerin kalibrasyonunu kontrol edin. Numune ve reaktiflerin dağıtılmış miktarını kontrol edin. Amplifikasyon tüplerindeki dağıtım öncesi reaktif ve numuneleri dikkatle homojen edin. Bütün program verilerini kontrol edin (tespit kanalı, modu, döngü sayısı, sıcaklık ve zaman). Örneklerin giriş ile ilgili tüm adımları kontrol edin. Saklanmış standartların konsantrasyonlarını kontrol edin. Üretici tarafından önerilen real time PCR platformların performanslarını kontrol edin. Üreticinin önerileri doğrultusunda real time PCR platform ve santrifüjün önleyici bakımını her zaman gerçekleştirin. Rotor-Gene karüselin kilitleme halka ekini kontrol edin. Sınır çizgisi ayarını kontrol edin. Deneylerde elde edilen sonuçların doğruluğunu kontrol edin (İlgili bölümde açıklanan bütün doğrulama koşullarını kontrol edin). LightCycler 2.0 ile: renk kompansasyon dosyası Colour Compensation r-gene (Argene ref.: ) dan oluşturduğunu ve LightCycler 2.0 software de saklandığını kontrol edin. ABI ile: None, passive reference field seçilmezse, kontrol edin. Sayfa 21 / 30