in Vitro Diagnostic Kullanım için IVD REF Liste Numarası 2-8 C/ -20 C de saklayın Sadece Araştırma Kullanımı için RUO LOT Lot Numarası VER Versiyon

Transkript

1 REF TF1-100FRT VER IVD in Vitro Diagnostic Kullanım için RotorGene 3000/6000 (Corbett Research), SmartCycler (Cepheid), iq icycler ve iq5 (Biorad), Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR Systems (Applera), MX3000P ve MX3005P (Stratagene) ile kullanılan Candida albicans Real-TM Kullanılan Semboller REF Liste Numarası 2-8 C/ -20 C de saklayın RUO Sadece Araştırma Kullanımı için Dikkat! LOT Lot Numarası VER Versiyon Son Kullanma Tarihi Reaktif İçerir Kullanım Bilgileri Üretici İSİM Candida albicans Real-TM KULLANIM AMACI Kit Candida albicans Real-TM ürogenital swablar, idrar, prostat sıvı ve diğer biyolojik materyallerde Candida albicans in kalitatif tespiti için bir testtir. TEST PRENSİBİ Kit Candida albicans Real-TM iki temel aşamaya dayanır: örneklerden DNA izolasyonu ve Real-Time amplifikasyonu. Candida albicans DNA ve İnternal Kontrol için flüoresan reporter spesifik boya probları kullanarak tespit edilen ve Real Time PCR da amplife olan örneklerden Candida albicans DNA ekstre edilir. İnternal Kontrol (IC), olası reaksiyon inhibisyonlarının tespit edilmesini ve her bir örneğin bireysel amplifikasyon kontrolü yaparak çalışır. IC, Candida albicans DNA dışındaki kanallarda tespit edilir. KİT İÇERİĞİ Part N 1 DNA-Sorb-A : örnek hazırlama; Part N 2 Candida albicans Real-TM : Real Time amplifikasyon. Part N 1 DNA-sorb-A : Lizis Solüsyonu, 2x15 ml; Sorbent, 2x10 ml; Yıkama Solüsyonu, 2x50 ml; DNA-eluent, 2x5 ml; Transport ortam, 30 ml. 100 test için gerekli reaktif içerir. Part N 2 Candida albicans Real-TM : PCR-mix-1-FRT, 1,2 ml; PCR-buffer-FRT,2 x 0,35 ml; TaqF Polimeraz, 0,06 ml; Candida albicans C+, 0,2 ml;

2 Negatif Kontrol C-, 1,2 ml;* İnternal Kontrol IC, 1,0 ml,** DNA-buffer, 0,5 ml; 110 test için gerekli reaktif içerir. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Zone 1: örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj 60 C ± 2 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler (5-40 μl; μl; μl) 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Biyo tehlike atık konteynırı Buzdolabı Dondurucu Zone 2: RT and amplifikasyon: Real Time Thermalcycler Reaksiyon tüpleri Workstation Pipetler (ayarlanabilir) Filtreli steril pipet uçları 1,5/2,0 ml tüpler için rotorlu masa santrifüjü Vorteks karıştırıcı Dondurucu, buzdolabı UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Lizis Solusyonu, guanidine tiyosiyanat içerir. Guanidine tiyosiyanat solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysisi ve göz koruyucu kullanın. Çalışmalardan sonra ellerinizi yıkayın. 3. Ağızla pipetleme yapmayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 6. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 7. Örnekler potansiyel enfeksiyon faktörü olarak kabul edilmeli ve biyolojik kabinlerde Biyo güvenlik Seviye 2 ya da diğer uygun biyo güvenlik pratiklerine göre çalışılmalıdır. 8. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 10. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 11. Bu kiti ancak DNA amplifikasyon tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 14. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alanından başlayıp Amplifikasyon ve Belirleme alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI Candida albicans Real-TM +2-8 C de saklanmalıdır. TaqF Polymerase -20 C de saklanmalıdır. Candida albicans Real-TM kit 2-8 C de taşınabilir, 2-8 C ve -20 C de saklanmalıdır. KARARLILIK Candida albicans Real-TM test etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. Ürünün performansı etiket üzerinde yazılı kontrol tarihi ile sağlanacaktır. Işık, ısı ya da neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerin raf ömrünü etkileyebilir. Tekrarlanan çözdürme ve bu reaktiflerin dondurulması duyarlılığı azaltabildiği için bu durumdan kaçınılmalıdır. KALİTE KONTROL Komple kit bir RotorGene üzerinde test edilmiştir (Corbett Research). Analizlerin Sertifikaları info@sacace.com dan istenebilir. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT Candida albicans Real-TM aşağıdaki materyallerden ekstre edilmiş DNA ile analiz edilebilir: Servika, üretral, konjonktival swablar: swabı nukleaz-free 1,5 ml tüpe koyun ve 0,2 ml Transport medyum ekleyin saniye şiddetlice swabı sallayın. idrar sediment: steril konteynıra ml ilk akıntı idrarı toplayın. 3000g de 30 dakika santrifüj edin, dikkatlice supernatantı atın ve yaklaşık 200 μl solüsyon ayırın. Sedimenti tekrar süspanse edin. DNA ekstraksiyonu için süspansiyonu kullanın. prostatik sıvı Eppendorf tüpünde saklanan; seminal sıvı: sıvılaşma olana kadar karanlıkta 40 dakika semeni koruyun. 100 μl DNA ekstraksiyonu için kullanın.

3 Toplamadan hemen sonra örneklerin çalışılması önerilir. 24 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri 2 8 C de ya da daha uzun saklamak için 20/80 C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik ajanların transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solüsyonu ve Yıkama Solüsyonu (diğerleri +2-8 C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar C ye kadar ısıtılır. Bir tüpte Ekstraksiyonun Negatif Kontrolü olacak şekilde gerekli miktarda 1,5 ml polipropilen tüpler hazırlayın. 2. Herbir tüpe 10 μl Internal Kontrol ve 300 μl Lizis Solüsyonu ekleyin. 3. Uygun tüplere 100 μl Örneklerden ekleyin. 4. Aşağıdaki gibi Kontrolleri ekleyin: Cneg tüpüne 100 μl C Negatif Kontrol (amplifikasyon kiti ile sağlanır) ekleyin. 5. Tüpleri vorteksleyin ve 65 C de 5 dakika inkübe edin. 5-7 saniye santrifüj edin. Eğer örnek tamamen çözülmemişse, maksimum hızda ( ) 5 dakika yeniden santrifüj etmenizi ve supernatantı DNA ekstraksiyonu için yeni bir tüpe aktarmanızı öneririz. 6. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve herbir tüpe 25 μl ekleyin saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 3 dakika inkübe edin. Bu aşamayı tekrar edin. 8. Tüm tüpleri 5000g de 30 saniye santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden herbir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 9. Her bir tüpe 500 μl Yıkama Solüsyonu ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 30 saniye vorteksleyin. Herbir tüpten supernatantı atın. 10. Aşama 9 u tekrar edin ve tüm tüpleri kapakları açık şekilde 65 C de 5-10 dakika inkübe edin. 11. Pelleti 100 μl DNA-eluent içinde yeniden süspense edin. 65 C de 5 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. 12. Tüpleri 12000g de 1 dakika santrifüj edin. 13. Supernatant amplifikasyon için hazır DNA içerir. Eğer amplifikasyon, ekstraksiyon ile aynı günde yapılmayacaksa hazırlanan örnekler maksimum 5 gün için 2-8 C de saklanabilir ya da 20 /-80 C de dondurulabilir. PROTOKOL: 1. Örnekler (N) ve kontroller (N+2) için yeterli miktarda reaksiyon tüpü hazırlayın. 2. Yeni bir steril tüpte her bir örnek için 10*N µl PCR-mix-1-FRT, 5*N µl PCR-Buffer-FRT ve 0,5*N µl TaqF DNA Polymerase hazırlayın. Vorteksleyin ve kısaca santrifüjleyin. 3. Her bir tüpe 15 μl Reaction Mix ve 10 μl ekstrakte DNA ekleyin. Pipetleyerek karıştırın. 4. Her bir panel için 2 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Negatif Kontrol işaretli tüpe 10 μl DNA-buffer ekleyin; Amplifikasyon Pozitif Kontrol işaretli tüpe 10 μl Positive Control C+ ekleyin; 5. Tüpleri thermalcyclera yerleştirin. Sonuçlar, threshold (eşik) çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada varlığı ile yorumlanır. Candida albicans, FAM (Green) kanalda ve IC DNA, JOE (Yellow)/HEX/Cy3 kanalda tespit edilir. SmartCycler (Cepheid) ile Real Time Amplifikasyonu Aşağıdaki gibi SmartCycler programlayın: 1. Minisantrifüj ve santrifüjün (5-7 sec) rotoru içine SmartCycler tüplerini transfer edin. 2. Ana menüde Define Protocols (Protokoller tanımla) seçin ve sol alt köşedeki New Protocol (Yeni protokol) seçeneğini seçin. Protokol için bir isim belirleyin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: 3. Save Protocol (Protokol kaydet) seçin. 4. Ana menüden Create Run (Çalışma Oluştur) seçeneğini seçin ve Run Name (Çalışma ismi) penceresinde deney için bir isim girin. 5. Dye Set (Boya Ayarı) düğmesini tıklayın ve FCTC25 seçin. 6. Add/Remove Sites (Ekle/Çıkar Site) seçin ve analiz için yeni bir pencerede Protokol ve Sites seçin. OK tıklayın. 7. SmartCycler içine reaksiyon tüplerini koyun ve Start Run (Çalışmayı başlat) düğmesine basarak deneyi başlatın. 8. View Results (Sonuçları gör) menüsünde Results Table (Sonuç tablosu) basın ve Sample ID (örnek ID) kolonuna örnek isimlerini ekleyin. SONUÇ ANALİZİ 1. Analysis settings (Analiz ayarları) basın ve Manual Thresh Fluor Units kolonunda Fam ve Cy3 kanalları için 30 a threshold (eşik) çizgisinin değerini ayarlayın. Update Analysis ( Analiz güncelleme) tıklayın.

4 2. Results Table (Sonuç Tablosu) menüsünde Save Run (Çalışmayı Kaydet) tıklayın. 3. Eğer FAM Std/Res kolonunda sonuçlar POZ (FAM Ct değeri sıfırdan farklıdır) olarak görünürse, örnek Pozitif olarak düşünülür. Eğer IC in Ct değeri 40 dan yüksekse, numunenin tekrar test edilmesi gerekir. 4. Eğer FAM Std/Res kolonundaki sonuçlar NEG (FAM Ct in değeri=sıfır ) olarak ve СY3 Std/Res kolonundaki sonuçlar POZ olarak görünürse, örnek Negatif olarak düşünülür. Cy3 kanalda negatif örnek Ct değeri döngü aralığında verimsiz bir DNA ekstraksiyonunu gösterir. (Eğer Ct > 40 se, örnek yeniden test edilmelidir). 5. Eğer FAM Std/Res kolonunda ve СY3 Std/Res kolondaki sonuçlar NEG (Ct = 0) olarak görünürse, sonuçlar geçersizdir. Örnek hazırlama ve amplifikasyona sahip test girişini tekrar edin. 6. Amplifikasyonun Pozitif ve Negatif Kontrolleri ve DNA izolasyonunun geçersiz olduğunda, sonuç kabul edilir. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol için aşama Ct kanal Fam Ct kanal Cy3 Yorumlama NCS DNA izolasyonu NEG POZ Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon NEG NEG Geçerli sonuç C+ Amplifikasyon POZ NEG Geçerli sonuç Örnek: FAM Kanal Candida albicans DNA tespiti (Pozitif örnek): Cy3 Kanal İnternal Kontrol DNA tespiti: Rotor-Gene 3000/6000 ile Real Time Amplifikasyonu 1. Advanced sistemini programlayıp New Run penceresinde etkinleştirerek Urogenital Assays için bir şablon oluşturun. Dual Labeled Probe/Hydrolysis probes seçin ve New düğmesini tıklayın. 2. Yeni bir pencerede karusel tipi 36-Well Rotor ya da 72-Well Rotor ve Reaction Volume (μl) 25 seçin. 3. Edit Profile penceresinde program STD RG-TaqF ayarlayın (bu program bütün Sacace Urogenital testleri için evrenseldir): 1. Hold: 95 С - 15 dak. 2. Döngü: 95 С - 20 sn. 65 С - 20 sn. 72 С - 20 sn. Döngü tekrarı 10 kez 3.Döngü 2: 95 С - 20 sn. 60 С -30 sn.-fam (Yeşil), Joe (Sarı) da tespit* 72 С - 20 sn. Döngü tekrarı 35 kez 4. Floresan kanal duyarlılık düzenlemesi yapın: Channel Setup (Kanal Kurulum) Calibrate (Kalibrasyon) (RG6000 için optimizasyon sağlayın) Auto Gain Calibration (Otomatik Kalibrasyon Ayarı) (Optimizasyon) Setup (Kurulum) Calibrate Acquiring (Kalibrasyon Elde edilmesi) (Optimizasyon Elde edilmesi) ve Perform Calibration (Perform Kalibrasyon) (Optimizasyon) 1. devralmadan önce seçin. Fam/Sybr (Yeşil) kanal için Min Okuma 5, Max Okuma 10 ve Joe (Sarı) kanalı için Min Okuma 4, Max Okuma 8 görünür. Tüp pozisyon kolonunda Rotor-Gene 2000/3000/6000 karuselinde

5 tüp pozisyonunu programlayın (1ci pozisyon reaktifli reaksiyon tüpü içerir) Auto Gain Calibration Setup (Otomatik Kalibrasyon Ayarı Kurulumu) penceresini kapatın. 5. Program dosyaları / RotorGene 6 / Şablonları (RG6000 Program dosyası / RotorGene 6000 Software / Şablonlar için ) klosör içine kaydedin ve New Run Wizard penceresini kapatın. Yeni şablon New Run penceresinde şablon listesinde görünür ve tüm Sacace Real-TM Urogenital Testleri için kullanılabilir. AMPLİFİKASYON VE TESPİTE BAŞLAMA 1. New Run penceresinde Quick Start (Advanced Start for RG6000) seçin ve STD RG-TaqF şablonlarından seçin. 2. Karusel tip seçin ve 36-Well Rotor için No Domed 0,2 Tüpler ya da 72-Well Rotor için Locking Ring Attached işaretleyin. Next tıklayın. 3. Sample Setup penceresinde tüplerin pozisyonlarını programlayın. 4. Deneye başlamak için Next ve Start Run tıklayın. ANALİZ SONUÇLARI: 1. Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada Rotor-Gene 3000/6000 software ile yorumlanır. Candida albicans, FAM (Yeşil) kanalında, İnternal Kontrol, JOE (Sarı) kanalında tespit edilir. 2. Analysis bastıktan sonra Quantitation (Kantitasyon) düğmesini seçin. Fam(yeşil) kanalı (Cycling A FAM or Cycling A. Green for RG6000) için ve sonra JOE (Sarı) kanalı (Cycling A JOE or Cycling A. Yellow) için işlemi gerçekleştirin. 3. Fam(Yeşil) kanalı (Candida albicans) için Dynamic Tube, More Setting (Outlier Removal for RG6000) 0%, and Threshold: 0,05 seçin. 4. JOE (Sarı) kanalı (IC) için Dynamic Tube, More Setting (Outlier Removal for RG6000) 5%, Threshold: 0,1 seçin. 5. Fam (Yeşil) kanalında (Quant. Resultes Cycling A. FAM/Green) Ct < 33 değerli örnekler pozitif olarak yorumlanır. 6. JOE (Sarı) kanalında (Quant. Resultes Cycling A.JOE/Yellow) Ct < 30 değerli örnekler ve Fam (Yeşil) kanalında flüoresan sinyal yoksa negatif olarak yorumlanır. 7. FAM (Yeşil) ve JOE (Sarı) (ya da Ct > 30) de sinyal bulunmayan örnekler geçersiz olarak yorumlanır. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam(Yeşil) Ct kanal Joe(Sarı) Yorumlama NCS DNA izolasyonu Sinyal yok < 30 Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon Sinyal yok Sinyal yok Geçerli sonuç C+ Amplifikasyon < 30 Yok Geçerli sonuç Örnek 20f, 21f, 22f, 23F negatif örnek 24f, 28f, pozitif örnek Chl+ : Pozitif Kontrol Chl- : DNA-buffer iq icycler ve iq5 (Bio-Rad) ile Real Time Amplifikasyonu 1. Edit Plate Setup of Workshop modül penceresinde Fam ve Hex kanallarında bütün tüplerdeki flüoresans sinyal tespitini ve tüp pozisyonlarını programlayın. Run with selected protocol (Seçilmiş protokol ile çalışma) düğmesini etkinleştirerek bu şemayı kullanın ve kaydedin. iq5 cihazı için Whole Plate loading (Tüm plakaları yükleme) sisteminde şemayı düzenleyin. Sample Volume 25: μl, Seal Type: Domed Cap, Vessel Type: Tubes seçin. Save &Exit Plate Editing (Kayıt ve çıkış plaka düzenleme) düğmesini tıklayın. 2. iqicycler ya da iq5 da program STD iq-taqf başlatın, View Protocols (protokol görüntüleme) modülünde programı seçin veya oluşturun ve Run with selected plate setup (Seçilen plaka ayarı ile çalıştırma)düğmesini etkinleştirerek başlatın. 95 C 13 dakika 30 sn.

6 10 Döngü: 95 C 10 sn, 65 C 20 sn, 72 C 20 sn 35 Döngü: 95 C 10 sn, 60 C 30 sn, 72 C 20 sn 2ci adımda (60 C) Fam ve HEX kanallarında flüoresans tespiti 3. Dynamicwf için aşağıdaki iq icycler ayarlarının seçili olduğundan emin olun: 4. Önceden oluşturulmuş modele göre termalcycler içine tüpleri transfer edin. 5. Select well factor source çizgisi altında Experimental Plate seçin ve reaksiyon hacmini 25 µl olarak tercih edin (iq icycler için) 6. Run düğmesine basın. ANALİZ VERİLERİ Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada iq icycler ya da iq5 software ile yorumlanır. Candida albicans, FAM kanalında ve IC DNA, HEX kanalında tespit edilir. Fam ve Hex kanalları için Log View düğmesi etkinleşir. Flüoresans eğrisinin doğrusal olduğu düzeylerde eşik çizgisine (farenin sol tuşu ile) yerleştirin. Fam (Select a Reporter penceresinde FAM-490 ) kanalında Ct değeri (Ct < 33) sıfırdan farklı ise, örnekler Borrelia burgdorferi için pozitif olarak yorumlanır. HEX (Select a Reporter penceresinde HEX-530 ) kanalında Ct 33 ise ve FAM kanalında flüoresans sinyali yoksa örnekler negatif olarak yorumlanır. FAM ve HEX kanalında örneklerin Ct değeri yoksa ya da > 33 ise geçersiz olarak yorumlanır. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam Ct kanal HEX Yorumlama NCS DNA izolasyonu Sinyal yok 33 Geçerli sonuç (negatif) DNA-buffer Amplifikasyon Sinyal yok Sinyal yok Geçerli sonuç (negatif) C+ Amplifikasyon 33 Yok Geçerli sonuç (pozitif) FAM Kanal Candida albicans DNA tespiti (iq5) HEX Kanal İnternal kontrol DNA tespiti (iq5) Bilinmeyen-1, 2, 3, 4, 5, 6 = Pozitif örnek; К+ = Pozitif Kontrol; Bilinmeyen-7, 8, 9 = Negatif örnek ; Bilinmeyen-11 = Negatif Kontrol

7 Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR System Programı aşağıdaki gibidir: 1. Ana menü seçeneğinde New (Yeni) seçeneğini seçin ve yeni belgenin verilerini ayarlayın: Assay (Test) penceresinde Absolute Quantitation (Mutlak kantitasyonu) seçeneğini, Template (Kalıp) penceresinde Blank Document (Boş Belge) seçeneğini seçin. OK tuşuna basın. 2. Tools (Araçlar) menüsündeki yeni pencerede Detector Manager( Dedektör Yöneticisi) düğmesini tıklayın. 3. Pencerenin sol alt köşesindeki File (Dosya) tıklayın ve New (yeni) seçin. New detector (Yeni dedektör) penceresinde probların özelliklerini ayarlayın: POZ tespit: Name (isim) ve Description (açıklama) çizgileri POZ gösterir; Reporter Dye Fam ve Quencher Dye None çizgisinde. Color (renk) (örneğin kırmızı) seçin. Create Another (Başka oluşturma) düğmesini tıklayın. New detector (Yeni dedektör) penceresine karşı açıldı. İnternal Kontrol için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Name (isim) ve Description (açıklama) çizgileri IC gösterir; Reporter Dye Joe ve Quencher Dye None çizgisinde. Color (renk) (örneğin mavi) seçin. 4. Prob bilgileri ile Detector manager (Dedektör yöneticisi) penceresini kapatın. 5. Instrument (Cihaz) penceresini seçin. 6. Thermal profile (Termal profil) aktif edin ve aşağıdaki amplifikasyon programını ayarlayın: Aşama Profile Replikasyon 1 95 C 15: C 0:20 65 C 0:20 72 C 0:20 95 C 0:25 60 C 0:50* 72 C 0: *Fam, Joe kanalında flüoresans belirlenir. 7. Reaksiyon hacmini 25 μl olarak seçin Emulation seçin. 8. Oluşturulmuş dokümanı kaydedin: File menüsünde Save as... seçin, File type çizgisinde SDS Templates (*.sdt) seçin ve Save tıklayın. 9. Pencerenin sağ üst köşesinde Set up (Kur) seçin. Açılan Plate penceresinde planlanmış amplifikasyon hücreleri mouse ile seçin. View (Görüntüle) menüsünde Well inspector (Kuyu kontrolör) düğmesini tıklayın. 10. Add Detector (Dedektör ekle) düğmesini tıklayın ve Detector manager penceresinden POS ve IC probları seçin. Bunu yapmak için, mouse ile çizgileri seçin ve Add to Plate Document (Plaka dokümanı ekle) ve Done (Bitti) düğmesini tıklayın. 11. Well inspector (Kuyu kontrolör) penceresinin kullanılan sütununda POS ve IC probları seçin. 12. Passive Reference (Pasif Referans) çizgisinde pencerenin sağ alt köşesinde none (hiçbiri) ayarlayın. 13. Sample Name (Örnek ismi) alanına örneklerin isimlerini ekleyin. ANALİZ SONUÇLARI 1. Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR Systems software ile yorumlanır. Poz sonuç, FAM kanalında ve İnternal Kontrol, JOE kanalında tespit edilir. a. Fam kanalında CT değeri Ct < 40 ise örnekler, Joe (IC) kanal sonuçlarına bakmaksızın Pozitif olarak yorumlanır. b. Fam kanalında Ct ( Undet. ) yoksa ve Joe kanalında Ct < 40 ise örnekler Negatif olarak yorumlanır. c. Eğer Fam kolonunda ve Joe kolonunda sonuçlar Undet. ya da Ct >40 olarak görünürse, sonuçlar geçersizdir. Örnek hazırlama ve amplifikasyonu içeren test girişini tekrarlayın. 2. Amplifikasyonun Pozitif ve Negatif Kontrolleri ve DNA izolasyonu geçerli olduğunda sonuçlar sadece önemli olarak kabul edilir.

8 MX3000P and MX3005P (Stratagene) programı aşağıdaki gibidir: 1. Programı açın, Quantitative PCR (Multiple Standarts) seçin ve OK tıklayın. 2. Pencerenin üst kısmındaki Plate Setup seçin. 3. Well type penceresinde örnekler için Unknown ayarlayın. 4. Pencerede Collect fluorescence data Fam ve Joe kanalında tüm örnekler için seçin. 5. Pencerenin sağ üst kısmındaki Thermal Profile Setup büğmesini seçin. 6. Amplifikasyonun aşağıdaki parametrelerini ayarlayın: Hold 95 C 15 dk Döngü 1 95 C 20 sn 65 C 30 sn 72 C 20 sn Döngü Tekrarı 10 kez Döngü 2 95 C 25 sn 65 C 50 sn* 72 C 20 sn Döngü Tekrarı 35 kez *Flüoresans 2ci döngüde 65 C de ölçülür. 7. Run düğmesini tıklayın, deney için bir isim girin ve kaydedin. ANALİZ SONUÇLARI 1. Ampifikasyon bittikten sonra, pencerenin sol üst kısmındaki Analysis düğmesini seçin. 2. Results düğmesini seçin. 3. Area to analyze penceresinin sağ açı kısmında Amplification plots seçin. 4. Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada cihazın software ile yorumlanır. Candida albicans, FAM kanalında ve Internal Control, JOE kanalında tespit edilir. 5. IC inhibisyonu, Candida albicans ilk yüksek konsantrasyonlu örneklerde oluşabilir. 6. Fam kanalında Ct < 40 değerli örnekler, Joe (IC) kanal sonuçlarına bakmaksızın Candida albicans için pozitif olarak yorumlanır. 7. Fam kanalında Ct değerli örnekler yoksa veya Ct < 40 değerli örnekler Candida albicans için negatif olarak yorumlanır. 8. FAM ve JOE kanallarda sinyal veren örnek yoksa geçersiz olarak yorumlanır. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam Ct kanal Joe Yorumlama NCS DNA izolasyonu NEG POZ Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon NEG NEG Geçerli sonuç C+ Amplifikasyon POZ NEG Geçerli sonuç SORUN GİDERME 1. Ekstraksiyonun Negatif Kontrolu için IC (Joe/Hex/Cy3 kanal) sinyal vermez ya da zayıf verir. PCR inhibe olur. Size önerilen DNA ekstraksiyon yöntemini kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olun. Ekstre edilmiş DNA pipetlenmeden önce maksimum hızda ( g) 2 dakika boyunca bütün tüpleri tekrar santrifüj edin ve dikkatlice süpernatantı alın. Reaksiyonda inhibe olan sorbent pellete dokunmayın. Reaktif saklama koşulları talimatlara uygun değildir. Saklama koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değildir.

9 PCR şartlarını ve protokolde rapor edilmiş flüoresans kanalını IC tespit için seçin. Reaktifleri pipetleme işlemi sırasında örneğe IC eklenmedi. DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında dikkat edin. 2. Pozitif control sinyal vermez ya da zayıf verir. PCR koşulları talimatlara uygun değildi. Amplifikasyon protokolunu kontrol edin ve manuel de rapor edilmiş fluoresans kanalını seçin. 3. Negatif Kontrol ekstraksiyonu ile Fam sinyal verir. DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Ekstraksiyon prosedürü sırasında sadece filtre uçları kullanın. Tüpler arası geçişte uçları değiştirin. Reaktiflerin yeni bir seti ile DNA ekstraksiyonunu tekrar edin. 4. PCR Negatif Kontrolu (DNA-buffer) ile herhangi bir sinyal verir. PCR hazırlık işlemi sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Sonunda Pozitif kontrolü pipetleyin. Reaktiflerin yeni bir seti ile PCR hazırlanmasını tekrar edin. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Analitik özgüllük Primerler ve probların analitik özgüllüğünü negatif numuneler ile doğrulanmıştır. Bu numuneler spesifik Candida albicans primerler ve problar ile sinyal vermezler. Kit Candida albicans Real-TM özgüllüğü 100% dir. Kit Candida albicans Real-TM ın potansiyel çapraz-reaktivitesi kontrol grubuna karşı test edilmiştir. Diğer patojenler ile herhangi bir çapraz-reaktivite gözlenmedi. Analitik hassasiyet Kit Candida albicans Real-TM, 2500 kopya/ ml den az olmayan bir % 100 duyarlılıkla testlerin Candida albicans DNA tespitini sağlar. Tespit, negatif numuneler ile kontrol standardını ve dilüsyonlarını gerçekleştirir. Hedef bölge: kriptik plazmid *icycler and iq5 are trademarks of Bio-Rad Laboratories * Rotor-Gene Technology is a registered trademark of Corbett Research *MX3000P and MX3005P are trademarks of Stratagene *Applied Biosystems is trademarks of Applera Corporation * SmartCycler is a registered trademark of Cepheid Sacace Biotechnologies Srl 18 San Carlo str., Caserta, Italy *PCR: The Polymerase Chain Reaction (PCR) process is covered by patents owned by Hoffmann-La Roche and applicable in certain countries. Sacace does not encourage or support the unauthorized or unlicensed use of the PCR process. Use of this kit is recommended for persons that either have a license to perform PCR or are not required to obtain a license