Bakterilerin Üretilmesi. Dr. Banu SANCAK

Transkript

1 Bakterilerin Üretilmesi Dr. Banu SANCAK

2 Mikrobiyal Üreme Üreme = Hücrelerin sayısında artma

3 Bakteri üremesi icin gerekli olan faktörler nelerdir?

4 BAKTERİ ÜREMESİ İCİN GEREKLİ A.Fiziksel faktörler: OLAN FAKTÖRLER 1. Sıcaklık 2. ph 3.Ozmotik basınç B. Kimyasal faktörler 1. Karbon 2. Nitrojen, sülfür, fosfor 3. Oksijen 4. Mineraller: K, Mg, Ca 5. Büyüme fakterleri: vitaminler, a.a.ler, pürin, pirimidin

5 Bakterileri laboratuvar koşullarında üretebiliyor muyuz? Neden?

6 1. Canlı Ortamlar 1) Deney hayvanları: Kobay, fare, sıçan, hamster, tavşan ve maymun. 2) Embryonlu yumurta: Sarı kese, amniyotik zar, allantoik boşluk, embryo. 3) Hücre kültürleri: Hep-2, HeLa, Vero

7 2. Cansız Ortamlar Besiyerleri

8 Fiziksel özelliklerine göre Besiyerleri Katı besiyerleri Yarıkatı besiyerleri Sıvı besiyerleri

9 Agar ROBERT KOCH Experimented with medium to grow bacteria on. He tried gelatin, but it did not work. Wife of colleague recommended agar (a gelatinlike product derived from seaweed). Didn t melt, and bacteria couldn t digest it. He could also add various nutrients necessary to grow certain organisms. Koch (pronounced Coke) originated use of a two part dish for growing bacteria ( named after Julius Petri, a German bacteriologist), and a technique for isolating pure bacterial colonies.

10 Agar Kompleks polisakkarit 100 C :sıvı, ~40 C katılaşır Katı (%2-3 agar) Yarıkatı (% agar)

11 Fiziksel özelliklerine göre Besiyerleri Katı (%2-3 agar) : Koloni oluşumu Yarıkatı (% agar): Hareket Sıvı:Tortu, zar oluşması, bulanıklık

12 Besiyerleri

13 Kolonilerin değerlendirilmesi Katı besiyeri

14 Yarı-katı besiyeri Hareket özelliği Non motile bacteria will only be found at the site of inoculation Motile bacteria swim around go everywhere

15 Sıvı Besiyeri It is used as enrichment media biochemical testing media Blood culture media

16 Amaçlarına göre besiyerleri 1. Temel (basit) 2. Zenginleştirici 3. Seçici 5. Ayırt edici 6. Transport 7. Saklama

17 1. Temel/Basit besiyeri Buyyon (nutrient broth) Pepton %1, et suyu %1, NaCl %0.05 Adi agar (nutrient agar) %2-3 agar eklenmiş buyyon

18 2. Seçici besiyeri İstenmeyen bakterilerin inhibisyonu Antibiyotik, safra tuzu, boya Salmonella-Shigella agar Mc Conkey agar, EMB agar, Endo agar

19 2. Seçici besiyeri Salmonella-Shigella agar

20 gr/l Sığır eti özütü: 5 Pepton:. 5 Laktoz:. 10 Safra tuzları. 8.5 Sodyum sitrat. 8.5 Sodyum tiyosülfat 8.5 Ferrik sitrat:. 1 Nötral kırmızısı: Brillant yeşili: mg Agar 13.5 Lactose Lactose fermenter Acid Neutral red Pink colonies H2S + Ferric ammonium citrate Ferrous sulfide Black precipitate

21 2. Seçici besiyeri EMB (Eosin Methylene Blue) dyes inhibit Gram (+) bacteria selects for Gram (-) bacteria G.I. Tract infections caused by Gram (-) bacteria Gram negatif bakterileri üretir

22 3. Ayırt edici besiyeri Belli özelliklere göre bakterilerin birbirinden ayırt edilmesini sağlar

23 gr/l Pepton: 10 Laktoz:. 10 K 2 HPO 4 :. 2 Eozin Y: 0.4 Metilen mavisi: 0.06 Agar: 15 ph:6.8

24 Eosin Methylene Blue (EMB) Agar E. coli E. labmanua/lab3/embeacolony.html aerogenes ASİT oluşumu: pembe koloni (Enterobacter aerogenes) ASİT: metalik refle (E. coli) Laktoz fermentasyonu (-): renksiz (S. typhimurium) S. Typhimurium P. aeruginosa

25 MacConkey's (MAC) MacConkey s media is both selective & differential. 1. Selective because it only grows Gram-negative bacteria. Inhibits the growth of Gram-positive bacteria. 2. Differential because neutral red (ph-sensitive dye) and lactose (type of sugar) have been added to media. - Bacteria that use lactose for food (lactose fermenters), produce acidic metabolites that trigger the ph sensitive dye to turn pink. - So lactose fermenting bacteria will grow in bright pink colonies while non-lactose fermenters will be colorless and clear. Enteric bacteria are the most frequently encountered bacteria isolated from many types of clinical specimens. They are most commonly lactose fermenters.

26 3. Ayırt edici besiyeri EMB, Endo by: Laktoz (+) ve (-) bakterilerin ayrımı

27 3. Ayırt edici besiyeri Kanlı agar: Hemoliz özelliği kullanılarak beta ve alfa hemolitik Streptokokların ayrımı 27

28 Blood agar (BAP) Most specimens received in a clinical microbiology lab are plated onto Blood Agar. It is an enriched medium that will grow even fastidious bacteria. Also contains 5% sheep blood. This media is not selective. It is enriched and differential: Certain bacteria produce enzymes called that act on red cells to produce either: * hemolysis: Enzymes lyse the blood cells completely, producing a clear area around the colony. * hemolysis: Incomplete hemolysis produces a greenish discoloration around the colony. * hemolysis: No effect on the red cells. Blood agar is usually inoculated from a patient s throat swab. Microbiologist are trying to detect Group A beta hemolytic Streptococcus pyogenes (a Gram-positive cocci-shaped bacteria that causes Beta hemolysis on blood agar.)

29 selective & differential media 29

30 4. Zenginleştirici besiyeri Üreyebilmek için kan, serum gibi maddelere ihtiyaç gösteren Özellikle nazlı bakteriler için Kanlı agar Çikolata agar: Haemophilus influenzae, Neisseria spp Selenit F besiyeri Çikolata agar Kanlı agar (%5 kan) 30

31 5. Transport besiyeri Amies besiyeri Stuart besiyeri Cary- Blair besiyeri

32 gr/l Sodyum tiyoglikolat 1.5 Sodyum Klorür. 5 Disodyum Fosfat Agar 5 Amies Stuart ph: 8.5 V.cholerae transportunda kullanılabilir

33 gr/l Pepton 10 Sodyum Klorür.. 10 ph: 8.5 Kültür gecikecekse (> 6 saat) Cary Blair tercih edilmeli

34 6. Saklama besiyerleri Gliserollü triptik soy buyyon Gliserollü beyin kalp infüzyon buyyon

35 Major Contribution to Culture Media

36 Besiyerlerine ekim yöntemleri nelerdir?

37 Ekim Yöntemleri Plak üzerine tek koloni ekim yöntemi Tüpte sıvı besiyerine ekim yöntemi Tüpte yarıkatı besiyerine ekim yöntemi Tüpte katı besiyerine ekim yöntemi

38 Öze İnokulasyonda kullanılan araçlar Yuvarlak (Katı besiyerine ekim) İğne (tüpte sıvı ve katı besiyerlerine ekim) Çengel (küf cinsi mantar ekimi) Eküvyon

39 Streak Plate

40 Tek koloni ekim yöntemi

41 Tek koloni ekim yöntemi

42 Tek koloni ekim yöntemi

43 1. Aerop ve fakültatif anaerop kültür yöntemleri Etüv (normal atmosfer) Karbondioksitli etüv (%5-10CO 2 ) Mumlu kavanoz (%5-10 CO 2 ) saat, 37 C de

44 2. Mikroaerofilik bakterilerin üretilmesi Mumlu kavanoz %1-4 O 2 %5-10 CO 2 (KAPNOFİLİK) Mikroaerofiller Brucella abortus Campylobacter jejuni Grow best under reduced O 2 levels and increased CO 2 levels Normal Atmosphere:21 % O 2, 0.3 to.03 % CO 2

45 3. Anaerobik Kültür Metodları 1.Redükleyici madde (Tiyoglikolatlı besiyeri) 2. Anaerobik kavanoz 3. Anaerobik kabin

46 3. Anaerobik Kültür Metodları Tiyoglikolatlı besiyeri O 2 girişini önlemek için redükleyici ajanlar içerir Tiyoglikolik asit, sistein, Birçok mikroorg.nın üremesi için zengin besiyeri O 2 tüpün 1/3 üst kısmına kadar penetre olmaktadır Tiyoglikolik asit (TGA): organik bir bileşik: HSCH 2 CO 2 H. thiol (mercaptan) + carboxylic acid den mg. HAVA VARLIĞINDA okside olur:[sch 2 CO 2 H] 2.

47 3. Anaerobik Kültür Metodları Anaerobik kabin

48 3. Anaerobik Kültür Metodları Anaerobik kavanoz

49 Üreme Özellikleri

50 Sıvı besiyerinde üreme özellikleri 1. Yüzeyde halka ya da zar (ring or pellicle) oluşumu 2. Flokülent (küçük parçalar) 3. Bulanıklık 4. Sediment

51 Katı besiyerinde üreme özellikleri nedir?

52 Koloni Özellikleri Koloni büyüklüğü Koloni biçimi Koloni yapısı Koloni rengi Koloni kokusu Hemolitik aktivitesi

53 FYI

54 Colonial Morphology Shape Edge Elevation Size Chromogenesis Opacity Surface Consistency Emulsifiability Odor 54

55 55 Shape Edge Elevation

56 Koloni Tipleri S (Smooth) düzgün koloni Düzgün kenarlı, yuvarlak, homojen görünümlü, hafif kabarık koloniler. Örnek: Staphylococcus aureus

57 Koloni Tipleri R (Rough) kaba koloni Düzgün olmayan, kenarları girintili, yüzeyi buruşuk veya granüllü koloniler Örnek: Mycobacterium tuberculosis

58 M (Mucoid) koloni Koloni Tipleri Düzgün,yapışkan, parlak koloniler Örnek: Klebsiella pneumoniae

59 Bacillus subtilis Colony shape and size: irregular Margin (edge): undulate (wavy) Elevation: umbonate Color: white, dull Texture: dry (or rough). Staphylococcus aureus Colony shape and size: circular Margin (edge): entire Elevation: corvex Color: yellow Texture: butyrous (buttery) 59

60 Bakterilerin hemoliz özelliği Alfa hemoliz Koloni çevresinde yeşilimsi renk değişikliği Beta hemoliz Koloni çevresinde şeffaf renk değişikliği

61 Bakterilerin hemoliz özelliği Gama hemoliz Koloni çevresinde renk değişikliği görülmemesi

62

63 The Gram Stain Crystal violet Gram's iodine Decolorise with acetone Counterstain with e.g. methyl red Gram-positives appear purple Gram-negatives appear pink

64 Gram boyama Preparat hazırlama Kristal viyole ile boyama Tüm hücreler boyayı alırlar Lugol ile boyama Tüm hücreler mavi-siyah boyanır Etil alkol ile dekolorizasyon Karşıt boya ile boyama- Sulu fuksin

65

66 Gram pozitif Gram negatif

67 Gram Staining Steps 1. Crystal violet acts as the primary stain. Crystal violet may also be used as a simple stain because it dyes the cell wall of any bacteria. 2. Gram s iodine acts as a mordant (Helps to fix the primary dye to the cell wall). 3. Decolorizer is used next to remove the primary stain (crystal violet) from Gram Negative bacteria (those with LPS imbedded in their cell walls). Decolorizer is composed of an organic solvent, such as, acetone or ethanol or a combination of both.) 4. Finally, a counter stain (Safranin), is applied to stain those cells (Gram Negative) that have lost the primary stain as a result of decolorization Dr.T.V.Rao MD 67

68 Gram staining Named after Hans Christian Gram, differentiates between Grampositive purple and Gram-negative pink stains and is used to identify Dr.T.V.Rao MD 68 certain pathogens.

69 Staining cationic dyes - basic, with positive charges on the chromophore anionic dyes - acidic, with negative charges on the chromophore surfaces of microbes are negatively charged and attract basic dyes positive staining. negative staining microbe repels dye & it stains the background 69