SERVİKS BİOPSİLERİNDE p16 ve Ki67 EKSPRESYONUNUN AYIRICI TANIDAKİ YERİ

Transkript

1 TC Sağlık Bakanlığı Haseki Eğitim Hastanesi Patoloji Kliniği Şef: Doç Dr Fevziye Kabukçuoğlu SERVİKS BİOPSİLERİNDE p16 ve Ki67 EKSPRESYONUNUN AYIRICI TANIDAKİ YERİ (Uzmanlık Tezi) Dr. Gülbin ÖZUYAR ORAN İstanbul-2008

2 TEŞEKKÜR Patoloji eğitimim boyunca tecrübe ve bilgisiyle desteğini esirgemeyen klinik şefimiz Doç. Dr. Fevziye Kabukçuoğlu na; eğitimimiz için her türlü imkanı bize sağlayan şef muavini Dr. S. Gül Barut a; eğitimimde ve uzmanlık tezimin hazırlanmasında bilgi ve tecrübesiyle destek olan Başasistan Dr. R. Nilgün Demirbağ a; tezimin istatistiklerinde bana yardımcı olan arkadaşım Dr. Serap Konakçı ya; Uz. Dr. Şebnem Batur a; eğitimimde emeği geçen tüm başasistan ve uzmanlarımıza; birlikte çalışmaktan mutluluk duyduğum asistan arkadaşlarıma ve çalışma arkadaşlarıma çok teşekkür ederim. 1

3 İÇİNDEKİLER Giriş ve Amaç 1 Genel Bilgiler 2 Materyal ve Metod 26 Bulgular 29 Tartışma 39 Sonuçlar 46 Özet 47 Kaynaklar 49 2

4 GİRİŞ VE AMAÇ Serviksin skuamöz hücreli karsinomu, bazı ülkelerde, en sık görülen kadın genital sistem tümörlerinden biridir. Ancak smear ile tarama programlarının yaygınlaşması, doğurganlığın azalması ve yaşam koşullarının da değişmesi gibi faktörlerle, serviks kanseri sıklığında azalma görülmüş olup, prekanseröz lezyonlarda artış söz konusudur. Human papilloma virüsü (HPV) ve özellikle yüksek riskli tipleri, servikal karsinogenezde en önemli ajandır. HPV DNA sı hibridizasyon teknikleriyle servikal kanserlerin %95 inde gösterilmiştir. Değerlendirilen biopsilerde, lezyon varlığında bile, araştırmacılar arasında histolojik servikal intraepitelial neoplazi tanısının tutarlılığının olmaması ve diğer lezyonlarla karışması, spesifik belirleyicilerin önemini arttırmaktadır. Yüksek riskli HPV lerde, E7 onkogeninin, p16 nın aşırı ekspresyonuna neden olması ve p16 nın klasik morfoloji ile kolay uygulanışı nedeniyle kullanımı, ayırıcı tanıda önem kazanmaktadır. Ki67, proliferasyon belirleyicisidir ve displazide ekspresyonu artmaktadır. İmmunhistokimyasal incelemede p16 ve Ki67 oranlarının yüksek olması displazi ile uyumludur. Bu çalışmada, p16 ve Ki67 nin neoplazik ve nonneoplazik olgularda, morfolojik tanıya yardımcı rolü ve tanı güçlüğü yaratan lezyonlarda ayırıcı tanıdaki önemini araştırmak amaçlanmıştır. 3

5 GENEL BİLGİLER SERVİKS KANSERİ İnsidans ve Epidemiyoloji Serviksin invaziv skuamöz karsinomu, bazı ülkelerde hala en sık görülen kadın genital sistemi tümörlerinden biridir lı yıllarda ABD de kanserden ölümlerdeki önemli nedenlerden biriyken, sitolojik tarama yöntemlerinin yaygınlaşması ve risk faktörlerinin belirlenmesi nedeniyle, görülme sıklığı son yıllarda azalmakta ve erken kanser ve prekanseröz lezyonların görülme sıklığı artmaktadır. Serviks kanserinden her yıl yaklaşık 4500 ölüm olmakta ve ölüm sıklığı akciğer, meme, kolon, pankreas, over, lenf nodu ve hematolojik malignitelerden sonra gelmektedir. Her yıl yaklaşık yeni invaziv kanser vakası ve yaklaşık 1 milyon prekanseröz lezyon (skuamöz intraepitelial neoplazi) görülmektedir. Bu da, Papanicolaou smear taramasının tümörün henüz tedavi edilebilir dönemde yakalanmasına ve preinvaziv lezyonların eradikasyonuna yardım ettiğinin kanıtı olarak gösterilebilir (1). Serviks kanseri, 1990 da kadınlarda toplam 470,000 kanser vakasının yaklaşık %10 unu oluşturmaktaydı (2) de dünya üzerinde yaklaşık olarak 493,000 yeni servikal kanser vakasına tanı konulmuş, aynı yıl servikal kanserden kaynaklı 274,000 ölüm meydana gelmiştir (3,4). 4

6 Serviks kanserinin görülme sıklığı ülkelere göre değişmektedir. Irak ta 3,27/100,000; İsrail de 5,76/100,000 iken Zambia da 61,08/100,000 ; Svaziland da 52,16/100,000 gibi yüksek oranlar bildirilmiştir (3,5,6). Servikal kanser insidansı, tarama programlarının kullanılması nedeniyle gelişmekte olan ülkelerde son otuz-kırk yıldır azalma eğilimindedir. Ancak bu azalmanın tek nedeni tarama programları değil; doğurganlığın azalması ve yaşam koşullarının da değişmesidir (2,7). Birçok ülkede ise 45 yaş altı kadınlarda mortalite aynı ya da artmış olarak seyretmektedir. Latin Amerika ve Doğu Avrupa da, yüksek risk gruplarında yüksek mortalite eğilimi endişe vericidir (2,8,9). Türkiye ye ait geniş veri tabanı olmamasına rağmen, elde edilen verilere göre, serviks kanseri kadınlarda ölüme neden olan kanserler arasında 5. sırada yer almaktadır. Sekiz ilde yapılan geniş bir çalışmaya göre serviks kanseri görülme sıklığı 3,96/100,000 olarak bildirilmiştir (10). Türkiye de Sağlık Bakanlığının 1999 daki verilerine göre en sık görülen jinekolojik kanserin serviks kanseri olduğu bildirilmektedir (11). Aydın ve arkadaşlarının 2000 yılında yaptığı bir çalışmaya göre, serviks kanseri, ülkemizde, jinekolojik kanserler arasında ilk sırayı almaktadır (12). Risk faktörleri Human Papilloma Virüs (HPV): 1842 de İtalyan araştırmacılar, İtalyan kadınlarla karşılaştırıldığında, Katolik rahibelerde serviks kanserinin hiç görülmediğini ortaya çıkarmışlardır (3). O zamandan beri epidemiyologlar servikal kanserle cinsel davranışlar arasında 5

7 ilişki olduğunu bildirmişlerdir (13). Bu bulgular serviks kanseri gelişiminde çeşitli teoriler gelişmesine ve cinsel yolla bulaşan sifilis, gonore gibi bakteriel enfeksiyonlar ile Herpes simpleks virüs (HSV) ve HPV gibi virüslerin etken olduğu enfeksiyonların araştırılmasına olanak sağlamıştır (3). HPV üzerine çalışmalar 1970 li yıllarda başlamış olup, 1980 lerde Harald zur Hausen ve çalışma grubu ilk kez HPV-16 ve HPV-18 i servikal kanser dokusundan izole etmişlerdir (14,15) de Dünya Sağlık Örgütü (WHO) jürisi HPV-16 ve HPV-18 in serviks kanserinden sorumlu olduğu sonucuna varmışlardır (16). HPV, servikal onkogenezdeki en önemli ajandır. Seksüel geçişli vulvar kondiloma aküminatum ile vulvar ve vaginal skuamöz hücreli karsinomdan sorumlu tutulmaktadır. Ayrıca deri ve müköz membranların skuamöz tümörleri ya da proliferatif lezyonların gelişiminde de rol oynar (17). HPV DNA sı hibridizasyon teknikleriyle servikal kanserlerin %95 inde gösterilmiştir (18). Servikal kanserlerle birlikte olan (yüksek riskli) ve kondilomlarda görülen (düşük riskli) spesifik HPV tipleri vardır. Yüksek riskliler (HR-HPV) 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 ve 68; düşük riskliler (LR-HPV) 6, 11, 42, 44, 53, 54, 62 ve 66 dır (18). Deneysel çalışmalar, yüksek riskli HPV tiplerinin viral genlerinin çeşitli yollarla hücre siklusunda değişikliklere yol açtığını göstermiştir (19-22). HPV geni en az altı farklı erken (E) ve iki geç (L) proteini kodlar. Yüksek riskli HPV tipleri, büyümeyi stimüle edici ve transforme edici özelliklerine sahip en az üç protein kodlar (E5, E6, E7). E5 proteini enfeksiyonun başlangıç döneminde eksprese edilir. HPV ile enfekte lezyon ilerlerken E5 ve bazı proteinler kaybolur (23). 6

8 HPV-16 ve HPV-18 in onkojenik potansiyeli, E6 ve E7 olarak adlandırılan iki erken viral gen ürünü ile ilgilidir. DNA virusunun replikasyonu, konak hücrelerindeki replikasyon sistemlerine bağlıdır. E6 ve E7, hücre siklusunun inhibisyonunda engelleyici rol oynar. E6, p53 e ; E7, RB e bağlanarak bu proteinlerin azalmasına yol açar. Ayrıca E7, p53 ün transkripsiyonel aktivitesini engeller ve p21 i de inaktive eder. Böylece E6 ve E7, p53 ve RB hücre siklusu supresyon yollarını bloke eder. Bu viral proteinlerin tümör baskılayıcı gen ürünlerine afinitesi, HPV nin onkojenik potansiyeline göre farklılıklar gösterir. E6 proteini, yüksek riskli HPV tiplerinden elde edilir ve p53 ün ubiquitin-bağımlı proteolizis yoluyla parçalanmasını arttırarak inaktive olmasına neden olur. Böylece E2F transkripsiyon faktörü açığa çıkar ve hücre siklusunun ilerlemesi aktive olur (17,23). E2F ayrıca, çok miktarda inaktif p16 ekspresyonu oluşturur. Siklin A ve siklin E salınımını arttırarak p16 ın siklusa girmesini engeller (23). Virusun fiziksel yapısı farklı durumlarda değişkenlik gösterir. Kanserde konak DNA sına integre olurken ve birçok prekanseröz lezyonda ve kondilomda serbest (episomal) halde viral DNA bulunur (23). 3p delesyonu ve 3q amplifikasyonu gibi kromozom anomalileri ve spesifik (HPV-16) papillomavirus içeren kanserler birlikte bulunabilir (22,24). HPV, genel olarak seksüel yolla bulaşmaktadır. Partner sayısı, ilk ilişki yaşı ve partnerin HPV pozitif olması önemli risk faktörlerindendir. Virigolarda yapılan çalışmalarda çok düşük oranlarda HPV pozitifliği gösterilmiştir(25). Kjaer ve arkadaşlarının (26) yaptığı bir çalışmada virigolarda ve monogamik çiftlerde servikal lezyon gelişiminin ilişki başladıktan sonra ortaya çıktığı ve partner sayısı arttıkça da riskin arttığı saptanmıştır. 7

9 Sünnet olmuş erkeklerde HPV pozitifliğinin diğerlerine göre 3 kat az olduğu saptanmış ve bu kişilerin partnerlerinde de HPV pozitifliği ve serviks kanseri gelişme riski daha az bulunmuştur (27). HPV, serviks kanseri gelişiminde tek etken değildir. Genç kadınlar üreme çağı boyunca yüksek oranda HPV nin bir ya da daha fazla tipiyle enfekte olurlar ancak sadece az bir kısmında kanser gelişir (17). Üreme ile ilgili faktörler: Doğurganlığın serviks kanseri riskini arttırıcı etkisi ilk olarak tanımlanan risk faktörlerinden biridir. International Collaboration of Epidemiological Studies of Cervical Cancer grubu tarafından reprodüktif değişkenlerin serviks kanserine etkileri incelenmiştir. Bu çalışmada 16,563 invaziv ve preinvaziv kanserli olgu ile 33,542 kontrol grubu karşılaştırılmıştır. Term gebelik oranları arttıkça riskin de buna paralel arttığı saptanmıştır(28). İlk ilişki yaşı ve partner sayısına göre veriler standardize edildiğinde bile 7 ve üzeri term gebelik için riskin 2,39 olduğu saptanmıştır (25,28). İlk gebelik yaşına bakıldığında 25 yaş altında riskin arttığı, özellikle yaşlarında çok daha belirgin olduğu görülmüştür. Son gebelikten sonra geçen zaman ile serviks kanseri arasında anlamlı bir ilişki bulunamamıştır (25). Term gebelik sayısı ile oral kontraseptif kullanımı birlikte değerlendirildiğinde, 5 yılın üzerindeki kullanımda doğum sayısı arttıkça risk de artmakta, 5 in üzerindeki gebelik sayısında 5 yıldan fazla oral kontraseptif kullanımında risk 11 kat artmaktadır (25,29). 8

10 Sigara ve katran: Katran ilk defa kanserle ilişkisi gösterilen kimyasal maddedir yılında Londra daki baca temizleyicilerinde artmış skrotal kanserin nedeninin katran olduğu bildirilmiştir (27,29,30). Daha sonra birçok kanserle ilişkisi ortaya konmuştur (31-33) li yıllardan itibaren başlayarak çeşitli yayınlarda katran içeren vajinal duş maddelerinin servikal kansere neden olduğu rapor edilmiştir (34-37). Sigara kullanımı da katran içeren kimyasal maddelere bir diğer maruziyet nedeni olarak kabul edilmektedir (34,38). Trimble ve arkadaşları pasif içiciliğin bile önemli olduğunu rapor etmişlerdir. Yaklaşık 25,000 hastalık bir analizde pasif içicilik ile riskin 2,1 kat arttığını saptamışlardır (39). International Agency for Research on Cancer (IARC) çalışmalarında herhangi bir zamanda sigara içmiş olmanın riski 2 kat arttırdığı belirtilmiştir. İçilme oranı ile risk artmaktadır. HPV pozitif hastalarda yüksek dereceli lezyon saptanma oranları 1,9-2,3 kat fazla bulunmuş ve sigara içiminin özellikle persistans yönünden önemli bir faktör olduğu düşünülmüştür (40). Sigara içmeye bağlı asıl nedenin ne olduğu konusu henüz kesinlik kazanmamıştır. Çeşitli metabolitler, immunsupresyon ya da antioksidanların az tüketimi gibi faktörler de ileri sürülmektedir. Sigara içimi ile birçoğu kanserojen olan yaklaşık 4000 çeşit kimyasal madde vücuda girmiş olur. Bunlar arasında en çok bilinenler benzil prenler, polisiklik aromatik maddeler ve tütüne özel nitrozaminlerdir. Sigara içenlerin servikal mukusunda, normal populasyona göre, bunlara daha çok rastlanmaktadır (41). 9

11 Hormonal kontrasepsiyon Oral kontraseptif kullanımı ile serviks kanseri gelişme riski arasındaki ilişkiyi göstermek amacıyla yapılan çalışmalarda farklı sonuçlar saptanmıştır. Bazı çalışmalarda risk bulunurken bazılarında anlamlı fark olmadığı belirtilmiştir. Smith ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada 12,531 servikal kanser olgusu değerlendirilmiş; 5 yıl, 5-9 yıl, 10 yıl ya da üzeri kullanımda riskin sırasıyla 1,1, 1,6 ve 2,2 kat arttığı bulunmuştur (42). HIV HIV pozitif hastalarda, AIDS tanısı için, servikal kanser bir parametre olarak kullanılmaktadır. Hastaların sağkalım süresi kısa olduğundan sonuçlar çelişkilidir. Ancak genel olarak immun yetmezlik, karsinojenik süreci hızlandırmaktadır (43). Cinsel yolla bulaşan hastalıklar Bu grup hastalıkları değerlendirmede bir takım zorluklar vardır. Bu enfeksiyonların çok görülmesi ve tespitinin zor olması başta gelen nedenlerdendir. IARC çalışmalarında chalamydia trachomatis ya da HSV-2 ye karşı antikorlar varsa serviks kanseri riskinin 2,1 kat arttığı bildirilmiştir (40). Madeleine ve arkadaşlarının (44) yaptığı bir çalışmada chalamydia trachomatis saptanan hastalarda skuamöz hücreli kanser için riskin 1,6 kat arttığı gösterilmiş; ancak adenokarsinom ile anlamlı bir ilişkinin olmadığı belirtilmiştir. 10

12 Beslenme ve diyet alışkanlıkları Bu konudaki en ayrıntılı analiz Garcia-Cloas ve arkadaşları (45) tarafından yapılmıştır yılları arasındaki gözlemsel çalışmalarla arasındaki randomize çalışmalar değerlendirilmiştir. Risk değerlendirilmesi yapıldığında çok az çalışmada folik asit, retinol, vitamin E, vitamin C, betakaroten, B12 ve likopen gibi maddelerin koruyucu etkileri olduğu bulunmuştur. Bugüne kadar yapılan çalışmalarda istatistiki olarak güçlü bir verinin olmadığı ve iyi planlanmış geniş katılımlı çalışmaların yapılması gerektiği vurgulanmıştır. NORMAL HÜCRE SİKLUSU Moleküler olayların etkili olduğu hücre proliferasyonunda bilgiler son yıllarda çok büyük artış göstermiştir. Protoonkogen ve tümör supresör genler olarak adlandırılan hücresel genlerin bulunmasıyla bunların normal hücre proliferasyonuna etkileri ortaya çıkarılmıştır. Bu genlerdeki defektler, kanser gelişiminde etkili olmaktadır. Sinyal transdüksiyonu yolundaki değişiklikler, birçok hastalıkta anormal hücresel yanıttan sorumludur. Hücrelerin replikasyonu genellikle büyüme faktörleriyle ya da ekstrasellüler matriks (ECM) komponentlerinin integrinleri uyarmasıyla stimüle olur. DNA replikasyonunun oluşması ve bölünme için hücre, hücre siklusu olarak bilinen yüksek kontrollü döngüye gider (46,47). Hücre siklusu boyunca ilerleme özellikle G1/S geçişi siklin denen proteinler ve siklin bağımlı kinazlar (SBK) denen enzimlerle beraber sıkı bir şekilde düzenlenir. SBK lar, hücre siklusunu, kritik hedef proteinlerle sürdürür ve bu da hücrenin bir sonraki faza ilerlemesini sağlar. SBK lar inaktif formdadır. Ancak 11

13 hücre siklusu boyunca eksprese olup siklinler denen protein ailesine bağlandıktan sonra fosforilasyonla aktive olurlar(46). Siklinler ise hücre siklusunun spesifik fazları boyunca sentezlenir ve fonksiyonları SBK larla aktive olur (Şekil 1). 15 den fazla tanımlanmış siklin vardır. Siklin D, E, A ve B hücre siklusunda ardı ardınadır ve bir veya daha fazla SBK a bağlanır(48). Şekil 1: Siklin, Siklin Bağımlı Kinaz (SBK) ve Siklin Bağımlı Kinaz İnhibitörlerinin G1/S hücre siklusu geçişinde düzenleyici rollerini gösteren şema. 12

14 Siklin D ve Retinoblastom Yatkınlık Proteini(RB) Fosforilasyonu: Siklin D hücre siklusunda ilk artan siklindir. G1 ortalarında görülür ; S fazından sonra uzun süre görülmez. D1, D2, D3 olarak 3 formu bulunur. Siklin D, diğer siklinler gibi kararsız olup ubiqitin-proteozom yolu boyunca azalır. Hücre siklusunun G1 fazı boyunca siklin D, SBK4 e bağlanır ve aktive olarak siklin D-SBK4 kompleksi oluşur. Bu kompleks, retinoblastom yatkınlık proteininin (RB) fosforilasyonunda kritik role sahiptir. RB nin fosforilasyonu hücre siklusunda çok önemli role sahip olup moleküler değişimi sağlar. Hipofosforile olduğu durumda, RB, hücre çoğalmasını baskılar. E2F transkripsiyon faktörü ile inaktif kompleks halindedir. RB nin fosforilasyonuyla bu kompleks çözülür. E2F transkripsiyon aktivitesinin inhibisyonu ortadan kalkar. Böylece RB fosforilasyonu hücre siklusunun ilerlemesinin ana engelini durdurur ve hücre çoğalmasını destekler(48). Hipofosforile RB, dinlenmedeki hücrelerde (G0 ya da erken G1) bulunur ve E2F ve DP1 altgrup içeren protein kompleksine bağlıdır (E2F/DP1/RB kompleksi). Bu kompleks E2F-duyarlı gen promotoruna bağlıdır. Bağlı E2F/DP1/RB kompleksi inaktiftir. Dinlenmedeki hücreler büyüme faktörleri ile uyarıldıklarında siklin D ve E artar. G1/S kontrol noktasında siklin D-SBK4 ve siklin E-SBK2 aktivasyonu olur ve RB fosforilasyonu gerçekleşir. RB nin hiperfosforile olup kompleksten ayrılması, S fazına ilerleme için gerekli olan E2F hedef genlerinin transkripsiyonunu aktive eder. M fazında fosfat grupları sellüler fosfatazlarla RB den ayrılır ve RB hipofosforile hale döner(48). Hücre siklusunun G1/S kontrol noktası boyunca ilerlemesi: Siklusun S fazı boyunca ilerlemesi ve DNA replikasyonunun başlamasında, siklin E ve SBK2 nin aktif kompleks oluşturması rol oynar. DNA replikasyonu 13

15 için, aktive E2F artışıyla siklin E nin transkripsiyonu ve polimerazlar gereklidir. Hücre siklusunda bir sonraki karar noktası G2/M geçişidir. Bu geçiş, siklin A nın E2F aracılı transkripsiyonuyla başlar. Siklin A-SBK2 kompleksi mitotik profazda düzenleyicidir. Hücrenin profaza ilerlemesindeki ana mediatör siklin B-SBK1 kompleksidir. Bu kompleks protein fosfatazı aktive eder ve erken profazda nukleusda birikmeye başlar. Siklin B-SBK1 aktivasyonu nükleer membranda bozulmaya neden olur ve mitozu başlatır. Siklin A ve B ile birlikte SBK kompleksleri G2/M geçişinde mikrotubul stabilitesinde azalma, sentrozomda ayrışma, kromozom kondansasyonu gibi bazı önemli olayları düzenler. Mitozdan çıkış için siklin B-SBK1 in inaktivasyonu gerekir.yeni bölünmüş hücreler G1 e geri dönebilir ve yeni bir replikatif siklus başlar ya da hücreler dinlenmeye çekilir. Son bilgiler göstermiştir ki prolifere hücrelerde siklin E-SBK2 bazı fonksiyonlar için birbirinin yerini alabilir. Ancak siklin E nin her iki izoformunun da olmaması stabil hücreleri hücre siklusuna girmekten korur(48,49). Hücre siklus inhibitörleri: Siklin-SBK kompleksi, SBK inhibitörleri ile düzenlenir. İki ana sınıf SBK inhibitörü vardır: Cip/Kip ve INK-4/ARF aileleri. Bu inhibitörler tümör baskılayıcı gibi fonksiyon görür ve sıklıkla tümörlerde değişirler. Cip/Kip ailesi p21, p27ve p57 olmak üzere 3 komponentten oluşur. Bunlar siklin ve SBK kompleksine bağlanır ve inaktive eder. p21 in transkripsiyonel aktivasyonu, mutasyonu insan kanserlerinde çok görülen tümör supresör gen p53 ün kontrolü altındadır. p53 ün hücre siklusundaki temel rolü; izlemek, hasarlı hücrelerde kontrol noktalarında ilerlemeyi yavaşlatmak ya da durdurmak ve DNA tamiri gerçekleşmezse apoptoza neden olmaktır. İnsan INK4a/ARF lokusu, p16ink4a ve p14arf olmak üzere iki proteinle kodlanır. Bunlar tümör supresör gen gibi davranarak hücre siklusunu bloke eder. p16ink4a, CDK4 e 14

16 bağlanmak için siklin D ile yarışır ve siklin D-CDK4 kompleksinin inhibisyonunu sağlayarak RB nin fosforilasyonunu engeller. Bu da hücre siklusunu geç G1 fazında durdurur. p16ink4a, insan kanserlerinde sıklıkla mutasyona uğramıştır ya da hipermetilasyonla inaktive edilir (50). Hem p16ink4a, hem de p14arf hücre siklusunu bloke eder ancak hedefleri farklıdır. p16ink4a, siklin D-SBK4 de rol alır, p14arf ise p53 ün feedback döngüsünü inhibe ederek p53 ü azalmaktan korur (48). Hücre siklusu kontrol noktaları: Hücre siklusu, kontrol noktası denen kendi internal kontrol noktasına sahiptir. İki temel kontrol noktası vardır. Biri G1/S geçişi, diğeri G2/M geçişidir(51,52). S fazı hücre siklusunda geri dönüşü olmayan noktadır. Hücre replikasyona girmeden önce G1/S kontrol noktasında DNA hasarı için kontrol edilir. Eğer DNA hasarı varsa DNA tamir mekanizmaları çalışır ve siklus durur. Siklus ilerlemesinde ertelenme tamir için gerekli zamanı sağlar. Eğer hasar tamir edilemezse apoptotik yolla hücre öldürülür. Böylece G1/S kontrol noktası DNA defektli hücreyi replikasyondan korur. DNA hasarı replikasyondan sonra da kromatidlerin ayrılmamasıyla hala tamir edilebilir. G2/M kontrol noktası DNA replikasyonu bitiminde izlenir ve mitozun düzenli başlamasını kontrol eder ve kardeş kromatidleri ayırır. Bu kontrol noktası özellikle hücreler iyonize radyasyona maruz kalırsa önemlidir. Hücreler iyonize radyasyonla hasarlanırsa G2/M kontrol noktası aktive olur ve G2 de durur, kontrol noktasındaki defekt kromozomal anomalilere neden olur. Uygun fonksiyon için hücre siklusunun kontrol noktaları DNA hasarı için algılayıcılara, sinyal ileticilerine, efektör moleküllere ihtiyaç duyar. DNA hasarı algılayıcıları ve ileticileri G1/S ve G2/M kontrol noktalarına benzer görünümdedir. Hücre siklusunda G2/M kontrol noktası aracılığıyla durma hem p53 e bağımlı hem de bağımsız mekanizmalarla 15

17 olur. Hücre siklusu kontrol noktasında defekt, kanser hücrelerindeki genetik instabilitenin en büyük nedenidir (48). G1/S kontrol noktasında hücre siklusunda durma p53 aracılıdır, bunu da hücre siklusu inhibitörü p21 indükler (48,51,52). p16, SBK-4 inhibitörüdür. Spesifik olarak siklin D-SBK4/6 kompleksine bağlanarak hücre siklusunu G1/S interfazında RB aracılı olarak kontrol eder. RB nin HPV E7 ile fonksiyonel inaktivasyonu, p16 nın resiprokal aşırı ekspresyonu ile sonuçlanır. Bu yüzden p16 pozitifliğinin, yüksek riskli HPV enfeksiyonunu belirlemede önemli bir belirleyici olduğu düşünülmektedir (53,54). p16: Hücre siklusunun kontrol mekanizmasında çok çeşitli proteinler yer alır. Özellikle G1 progresyonunun kontrolünde etkili proteinlerle oluşan değişiklikler, pek çok kanserin gelişimine neden olur. Bu proteinlerin en önemlileri G1 siklin bağımlı kinaz aktivitesini kontrol eden p16 ve normalde G1 siklin bağımlı kinazlar tarafından düzenlenen RB dir (55,56). p16, SBK-4 ve SBK-6 ı inaktive eden bir tümör supresör gendir. 9. kromozomda lokalizedir (56,57). Normalde displazi içermeyen hücrelerde p16 proteini oldukça düşük seviyededir ve immunhistokimyasal olarak tespit edilemez (58). Yetişkinlerde normal proliferatif endometriumda, meme duktal epitelinde, serviksin tubal metaplazik epitelinde, özofageal skuamöz epitelde, tükrük bezinde ve antral gastrik bezlerde ekspresyonu vardır. Ayrıca pankreasın Langerhans hücreleri, testisin Leydig ve Sertoli hücrelerinde de eksprese edilebilir. İnfantlarda timik Hassal korpuskullerinde sınırlıdır; nadiren pankreas epitel hücrelerinde görülür (57,59). 16

18 p16, Siklin D-SBK 4/6 kompleksine bağlanarak hücre siklusunu G1-S interfazında, RB aracılı kontrol eder (56,60,61,62). Preneoplastik ve neoplastik servikal lezyonlar, yüksek riskli HPV tipleri ile birliktedir. Bu durumda RB, HPV E7 proteini ile fonksiyonel inaktive olur. Bunun sonucunda p16 proteini birikir. Çünkü normalde RB, p16 transkripsiyonunu inhibe eder. p16 ve RB ekspresyonu arasında resiprokal ilişki vardır. p16 seviyesi ve RB, negatif feedback ile kontrol edilir. p16 birçok kanserde, mutasyon, delesyon, promotorunun hipermetilasyonuyla inaktivedir (56,62). Tüm yüksek riskli HPV tiplerindeki E7 onkogeninin transforme edici aktivitesi nedeniyle, p16, displastik servikal hücrelerde güçlü overekspresyon gösterir ve immunhistokimyasal olarak kolayca gösterilebilir. Bu yüzden p16, displastik servikal hücrelerde, yüksek riskli HPV tiplerinin onkogen ekspresyonunu göstermek için kullanışlı bir belirleyicidir (58). Reaktif durumlar ile düşük dereceli intraepitelial lezyon ve düşük dereceli intraepitelial lezyon ile yüksek dereceli intraepitelial lezyon ayırımı bazen güçlük yaratabilir. Farklı patologlar arasında da farklı tanılar alabilecek bu lezyonların ayrımında, proliferasyon belirteçleri ve onkogen ekspresyonu gibi parametrelere ihtiyaç duyulur. p16 ve Ki67, bu noktada displazinin tanısı ve diğer lezyonların ayrımını kolaylaştırarak, değerlendiren kişiler arasındaki farklılıkları ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir (63). Ki67: Hücre proliferasyonu, mitoz sayımı, flow sitometri, timidin labelling indeks veya immunohistokimyasal olarak, hücre siklusu içerisinde yapılan proteinlerin (Ki67, PCNA, siklinler vb.) tayini ile ölçülebilir. Yüksek proliferasyon hızına sahip tümörlerin prognozu daha kötüdür (64). 17

19 Ki67, ilk defa 1983 de Gerdes ve arkadaşları (65) tarafından tanımlanmış, tonsil germinal merkez hücreleri, epitelyum bazal hücreleri ve intestinal epitelin kript hücreleri gibi prolifere hücrelerde gösterilmiştir. Ki67, hücre siklusunun Go fazı dışında tüm fazlarında bulunan nonhiston nükleer proteindir. 345 ve 395 kd ağırlığındaki iki molekülden oluşur ve geni 10. kromozom üzerinde yer alır (56,66). İmmunhistokimya ile Ki67 için pozitif nükleer boyanma gösteren hücre yüzdesi, proliferatif fraksiyonu gösterir. Agresif tümörlerde bu oran yüksektir (67). Birçok sistem tümörlerinde (meme, akciğer, özofagus, böbrek ve prostat kanseri, malign melanom, nonhodgkin lenfoma, glial tümörler) yüksek Ki67 oranı, kötü prognostik faktör olarak gösterilmiştir (68-73). Servikal displazilerin değerlendirilmesinde de, birçok çalışmada, Ki67 ve p16 nın displazinin şiddetiyle ilişkisi araştırılmış ve Ki67 nin sensitif bir belirleyici olabileceği belirtilmiştir (56,63,74,75,76). Ki67, yüksek dereceli servikal intraepitelial lezyonlar (HSIL) ile bunlarla karışabilen atrofik skuamöz epitel, transizyonel metaplazi ve immatür skuamöz metaplazi gibi durumlarda değerlidir. Ki67 ayrıca loop marjinindeki koterize epitelin değerlendirilmesinde de yardımcıdır (56). SERVİKAL İNTRAEPİTELİAL NEOPLAZİ Servikal intraepitelial neoplazi (CIN), servikal skuamöz hücreli karsinomun prekürsör lezyonudur. CIN çok sayıda seksüel partner ve bir çok HPV tipinden özellikle HPV-16 ile yakından ilişkilidir. Hayatın erken üreme çağında daha sık görülür (77). 18

20 Preinvaziv servikal skuamöz lezyonları tariflemek için çeşitli sınıflama sistemleri kullanılmıştır. CIN sınıflamasında hafif displaziye CIN I ; ağır dereceli displazi ve karsinoma in situ ya da CIN III denmiştir. Bu sistemde başlıca ayrım CIN II ve CIN III arasında yapılmalıdır. Başka bir sistem de düşük dereceli skuamöz intraepitelial lezyon (LSIL) ve yüksek dereceli skuamöz intraepitelial lezyon (HSIL)dir. Bütün bu sınıflamaların yapılmasının nedeni saptandıklarında uygulanan farklı tedavi seçenekleridir. Günümüzde, bazı birimlerde, LSIL yalnızca takip edilirken, HSIL e (CIN II ya da CIN III) loop eksizyonu uygulanmaktadır (78). Etyoloji Pubertede, skuamöz hücrelerle döşeli serviksin alt bölgesinde anatomik değişiklik olur. Buna kolumnar epitelin eversiyonu denir. Bu histolojik değişiklikler tamamen fizyolojiktir. Ancak bu transformasyon zonu onkojenik stimuluslara duyarlıdır (2). Son 25 yıl içinde, serviksin flat ve eksofitik kondilomu ve CIN, HPV ile ilişkili bulunmuştur. Bazı HPV tipleri serviks kanseri ile ilişkili; bazıları ise değildir (77). Histopatoloji Servikal intraepitelial neoplazi, klasik olarak 3 dereceye ayrılır: CIN I; II ve III (2). Bu tümör öncülü lezyonlar, düşük ve yüksek dereceli skuamöz intraepitelial lezyon olarak da derecelendirilebilirler (2,79). CIN lezyonunu derecelemek, düşük dereceli (CIN I) ve yüksek dereceli (CIN II-III) lezyonun gerileme, devam etme ve ilerleme oranını anlayabilmek ve tedavi ve klinik izlem algoritmasını değerlendirebilmek için gereklidir (79). 19

21 Servikal İntraepitelial Neoplazi I: Epitelin üst 2/3 ünde maturasyon mevcuttur. Superfisyal hücrelerde çeşitli derecede ancak genellikle hafif atipi vardır. Koilositoz, diskeratozis gibi viral sitopatik etkilerle birlikte binukleasyon, multinükleasyon, nukleusda kıvrımlaşma, nükleer hiperkromazi ve düzensiz nükleer konturlar da bulunabilir. Perinükleer halo çeşitli şekillerde olabilir ve koilositte, nukleus çevresinde farklı, berrak bir alan ve halonun etrafında yoğun görünümlü sitoplazma şeklinde görülür. Bu hücresel değişikliklerin, hücre içindeki virüs replikasyonunu ve viral proteinlerle hücre siklusunun uyarılması nedeniyle oluştuğu düşünülmektedir Nükleer anormallikler epitelin alt yarısında ve genellikle hafiftir (2,78,79). Mitotik figürler basal alt 1/3 de bulunabilir ancak çok değildir. Anormal mitoz görülmez (2,78,79). Yoğun glikojenize skuamöz epitel ve inflamasyona reaktif epitel, gerçek koilositozla karışabilir. Koilositoz ile birlikte düzensiz nükleer konturlar, binükleasyon/multinükleasyon, hiperkromazi ve/veya sellüler pleomorfizm düşük dereceli displazi tanısı koymada yardımcı olur (2,80). Servikal İntraepitelial Neoplazi II: Maturasyon epitelin üst yarısında mevcuttur. Nukleus/sitoplazma oranında artış, düzensiz nükleer konturlar, kromatinde kabalaşma gibi sitonükleer anormallikler hem alt hem de üst epitel tabakasında dikkat çeker. Mitotik figürler genellikle epitelin bazal 2/3 üne sınırlıdır. Anormal mitoz görülebilir (2,80). 20

22 Servikal İntraepitelial Neoplazi III: Maturasyon yoktur ya da epitelin üst 1/3 ünde sınırlıdır. Sitonükleer anormallikler daha uniform yapıda ve belirgin, epitelin tamama yakını ya da tam katı boyunca görülür. Mitotik figürler epitelin tüm seviyelerinde görülebilir. Anormal mitoz sıktır (2,80). Yüksek dereceli skuamöz intraepitelial lezyonun (HSIL) morfoloiik temelinin, replikatif (ölümsüz) hücre populasyonu ya da bir grup hücre biyolojisindeki, viral onkogenlein yaptığı değişiklikler nedeniyle olduğu öngörülüyor. Bu değişiklikler epitel tabakasının hem üst hem de alt kısmında görülür. Bu immatür hücreler sitolojik olarak HSIL tanısının temelini oluşturur ; ancak HSIL tanısı sadece sitolojik bulgularla konulmayıp histopatolojik olarak da kesinleştirilmelidir (78). HSIL de lezyonun bir bölgesinde epitelin tüm tabakasında nükleer atipi bulunur. Koilositik atipili ya da maturasyonun korunduğu lezyonlar CIN II ; maturasyonun seçilemediği lezyonlar CIN III kategorisine girer. Koilositler, flat kondilomdakine benzer ancak daha küçük, daha konsantrik halo ve nükleer hiperkromazi ve /veya pleomorfizm görülür. CIN II ve CIN III ün epitelial yüzeyi anormal nukleuslu horizontal yerleşimli parakeratotik hücreler içerir (78). HSIL in varyantları: Keratinize ya da koilositik HSIL: Atipiye ek olarak yüzeyde belirgin keratinizasyon bulunur. Keratinize hücreler benign durumlarda da ; ASCUS, HSIL, LSIL ve invaziv skuamöz hücreli karsinomda da görülebilir. Keratinize HSIL deki hücrelerin konturlarında düzensizlik görülür. Kromatin yoğun veya kabadır. Sitoplazma genellikle eosinofiliktir. Ayırıcı tanı keratinize karsinomla yapılmalıdır. Keratinize HSIL de 21

23 matür ya da hücreler içinde belirgin yüzeyel nükleer atipi görülür. Parabazal atipi çeşitli derecelerdedir (78). HSIL ve immatür metaplastik diferansiasyon: İmmatür metaplazinin kesin özelliklerini koruyan, kötü sınırlı lezyon spektrumundan oluşan lezyondur. Yuvarlak ya da dalgalı epitelial-stromal geçiş, uniform görünümlü immatür hücrelerle birlikte sitoplazmik differansiasyon ve sıklıkla alttaki kolumnar hücrelerde süreklilik görülür. Klasik metaplazinin tersine bu tip HSIL de yüzeydeki hücresel maturasyon gerilemiştir (78). Stratifiye, müsin üreten varyant: Bu az görülen varyant, yalnız ya da adenokarsinoma in situ ile eş zamanlı görülebilir. Bu lezyon morfolojik olarak belirgin müsin damlaları dışında immatür metaplastik HSIL e benzer. Müsin damlaları epitelde uniform dağılım gösterir. Bu hücrelerde çok katlı dizilim adenoskuamöz karsinoma in situyu düşündürür ; ancak skuamöz diferansiasyon belirleyicisi p63 ile zayıf boyanma vardır ya da boyanma görülmez (78). AYIRICI TANI: DÜŞÜK DERECELİ SIL AYIRICI TANISI : Tipik olarak LSIL tanısı için nükleer atipi gereklidir. Atipi ve papillomavirus nükleik asitinin varlığını destekleyen verilerin birlikteliği LSIL tanısını koymaya yardım eder. Ancak bunların nonspesifik hücresel değişikliklerden nasıl ayırt edileceği önemlidir. LSIL tanısına yaklaşım için bazı kriterlere başvurulabilir : 22

24 1-Küçük büyütmede epitelial organizasyon: Birçok olguda çevredeki epitelden farklı durumları da görebilmek açısından, küçük büyütme, LSIL den kuşkulanmak için uygundur. Bu değişiklikler, epitelde kalınlaşma, metaplazik değişikliklerin olmaması, üst tabakada belirgin hiperkromazi, hücresel yerleşim veya üst epiteldeki halodur (78). 2-Major histolojik kriterler: Bir sonraki adım, epitelin büyük büyütme ile incelenmesi ve nükleer atipinin derecesini belirlemektir. Herhangi bir SIL formunun nonspesifik prosesden ayrımında intermediate ve süperfisyal hücrelerin boyut ve boyanmasındaki farklılıklar temel alınır (78). 3-Minör histolojik kriterler: Bazı durumlarda LSIL lerin yaklaşık %90 ında binükleasyon görülmesi gibi tanıyı doğrulayan kriterler vardır. Küçük, hiperkeratotik binükleer hücreler SIL tanısını destekler ve bu atipik parakeratotik hücreler smearde de görülebilir. Düzensiz sınırlı sitoplazmik halo da tanıya yardımcıdır ancak daha az spesifiktir (78). Koilositoza benzeyen epitelial değişiklikler: 1- Vajinal papillomatozis: Histolojik olarak parakeratoz ve sitoplazmik halo görülebilir ancak belirgin akantoz, nükleer atipi ve atipik parakeratoz görülmez. Bu tip biopsilerde uygun tanı akantozis, papillomatozis, vb., nonspesifik olmalıdır. Buradaki nonspesifik terimi bu değişikliklerin HPV etkisiyle olmadığını belirtir (78). 2-Reaktif epitelial değişiklikler (nonspesifik): Belirgin sitoplazmik halo glikojenize epitelde görülebilir ve subepitelial ya da intraepitelial inflamasyon varsa hafif nükleer atipi de görülebilir. Sıklıkla reperatif ya da reaktif epitelial değişiklikler nükleer hiperkromazi ve sitoplazmik halonun olduğu inkomplet maturasyona gider. Bu tip olgularda en önemli ayırt edici özellik hücre boyutu ya 23

25 da boyanma yoğunluğunda farklılıklar olmamasıdır. Bazen reaktif epitelde semimatür metaplazi ve belirgin binükleasyon görülebilir. Bu olgular kondilomla karıştırılmamalıdır. Binükleer hücreler genellikle büyümemiştir ve zeminde metaplazi vardır (78). 3- Postmenopozal skuamöz atipi: LSIL, bu yaş grubunda da görülmekle birlikte, menopozal ya da postmenopozal kadınlarda parsiyelden komplete giden bir spektrum içinde atrofik hücresel değişiklikler görülür. Bu spektrum içinde psödokoilosit, transizyonel metaplazi ve klasik atrofik değişiklikler bulunur. Bazen aynı biopside bu üç değişiklik birden görülür. Psödokoilosit, epitelial maturasyon, sitoplazmik halo, genellikle hafif nükleer boyut ya da boyanma ile karakterlidir. LSIL i reaktif değişikliklerden ayırma çabası, genellikle papillomavirus DNA analizi merkezlidir. Son zamanlarda, başlangıç çalışmalarında, HPV ile enfekte epitelde p16 gibi hücre siklusu proteinlerini kullanmayı önermektedir (78). YÜKSEK DERECELİ SIL AYIRICI TANISI Yüksek dereceli SIL in temel ayırıcı tanısı reaktif/inflamatuar değişiklikler, bazal hücre hiperplazisi, immatür skuamöz metaplazi, skuamöz atrofi ve düşük dereceli SIL ile yapılmalıdır. Bazal hücre hiperplazisi : Bazal hücre hiperplazisi, bazal ve parabazal tabakada kalınlaşmayla birlikte nükleer büyüme ve sitoplazmik bazofiliyle karakterlidir. Bu kalınlaşmış hücre 24

26 tabakasının üzerindeki skuamöz epitelde maturasyon ve polarite mevcut olup normal glikojenize skuamöz epitel devam etmektedir. Ancak bazal tabaka hücrelerindeki çit dizilimi görünümü kaybolmuştur. Hücreler oval şekillidir ve nükleer pleomorfizm ve hiperkromazi görülmez (79). İmmatür skuamöz metaplazi : Skuamöz metaplazi servikal biopsi ve loop eksizyonlarında sıklıkla görülen normal fizyolojik bir durumdur. İmmatür skuamöz metaplaziyi yüksek dereceli SIL den ayırt etmek güçtür. Nukleus/sitoplazma oranında artış ve maturasyonun nispeten yokluğu her iki lezyonda da bulunur. Metaplastik hücreler genellikle uniform; oval ya da yuvarlak ve tek nukleolusludur. Nükleer konturlar düzenlidir. Belirgin hücresel kalabalıklaşma, nükleer atipi ve epitelin üst yarısında artmış mitoz daha çok, yüksek dereceli SIL tanısını destekler. CIN de, endoservikal kriptlerin tutulumu ve nükleer pleomorfizm görülebilir (79). Reaktif atipi : Reaktif ve reperatif epitel değişiklikleri servikal biopsilerde sık görülür ve büyümüş, veziküler nukleus ve belirgin nukleolusla karakterlidir. Akut ya da kronik olsun inflamasyonla birlikte mitotik aktivitede artış sık görülür. Güçlük, bu reaktif değişiklikler, CIN ile superimpoze olursa ortaya çıkar. Kaba, kümeleşmiş nükleer kromatin ve nükleer konturlarda düzensizlik, altta yatan displaziyi düşündürür. Reaktif durumlardaki atipi genellikle epitelin bazal yarısında sınırlıdır ve yüzeydeki skuamöz epitel maturasyonunu korur. Bu yüzden reaktif tipteki değişikliklerin belirgin sitonükleer atipiyle kombine olduğu durumlarda p16 kullanımı önerilmektedir (79). 25

27 Skuamöz atrofi : Skuamöz atrofi, hücresel diferansiasyon bulgusu olmadan servikal skuamöz epitelde incelmeyle karakterlidir. Atrofi, menapozda ya da oral kontraseptif kullanımında olduğu gibi düşük östrojen seviyelerinde görülür. Skuamöz atrofi daha çok parabazal tiptedir ; uniform hiperkromatik ve monomorfik görünümdedir. Skuamöz atrofideki nukleus/sitoplazma oranında artış ve normal maturasyonun olmaması yüksek dereceli SIL ile karışmasına neden olur. Ancak atrofide mitoz nadirdir ya da görülmez (79). Düşük dereceli SIL : Düşük dereceli ve yüksek dereceli SIL arasındaki morfolojik ayrım; eğer sitonükleer anormallikler tüm katlarda görülüyorsa ve mitotik aktivite epitelial yüzeyin yarısı ya da 1/3 ünde görülüyorsa oldukça güç olabilir. Düşük dereceli SIL deki histolojik değişiklikler genellikle epitelin alt 1/3 ünde görülür. Küçük büyütmede lezyondaki sellülariteye; büyük büyütmede ise mitoza bakmak gerekir. Mitotik figürler epitelin bazal 1/3 ünden yukarıda görülüyorsa yüksek dereceli SIL düşünülmelidir. Düşük dereceli SIL de de epitelin yüzeyine yayılan sitonükleer anormallikler görülse de nukleus/sitoplazma oranı, yüksek dereceli SIL deki kadar belirgin değildir (79). Ayırıcı tanıda ortaya çıkan güçlükler ve biopsileri değerlendiren kişiler arası farklılıklar, araştırmacıları, objektif kriterler kullanmaya yönlendirmiştir. p16, yüksek riskli HPV tiplerini gösteren moleküler analizlerin yerine geçebilecek değerli bir belirleyicidir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda servikal intraepitelial neoplazilerde p16 ile ekspresyonda artış görülmüş ve servikal neoplazinin derecesi ve yüksek riskli HPV enfeksiyonu arasında da pozitif korelasyon saptanmıştır (57,60,79, 81-84). 26

28 CIN I ve CIN II arasında kalınmış bir lezyona Ki-67 uygulandığında, epitelin üst 1/3 ünde nükleer boyanma ; p16 ile 2/3 ya da tam kat nükleer boyanma görülüyorsa, yüksek dereceli SIL olarak tanı konur (79). p16 yüksek riskli HPV tipleri ile oluşan enfeksiyonları belirlemenin yanında, viral onkojenik aktiviteyi göstermesiyle, rekürrensi belirleyici rolü nedeniyle de önem kazanmaktadır (53, 79,85). 27

29 MATERYAL VE METOD Çalışmamızda Ocak 2005 Aralık 2006 tarihleri arasında Haseki Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Patoloji kliniğinde smear sonrası biopsi alınan ve farklı histopatolojik tanılar alan 147 olgu gözden geçirildi. Olgulara ait tüm preparatlar yeniden gözden geçirilerek değerlendirildi. İmmunhistokimyasal inceleme için yeterli doku örneği içeren 95 olgu ve bunlara ait en uygun bloklar seçildi. Hasta yaşı arşiv kayıtlarından elde edildi. Her olguda aşağıdaki faktörlere bakıldı: a) Histopatolojik tanı: Olguların tümü yeniden değerlendirilerek nonneoplazik ve neoplazik lezyonlar gruplandı. b) Histolojik grade: Displazik olgularda nükleer atipinin derecesi, hücrelerin boyutu ve boyanmasındaki farklılıklar, nukleus/sitoplazma oranı ve epitel tabakasında displazik hücrelerin kapladığı yer dikkate alınarak LSIL ve HSIL olarak derecelendirildi. 28

30 İMMUNHİSTOKİMYA Biopsi materyallerinin 2 µm lik parafin kesitleri, önceden Histogrip le (Zymed) muamele edilmiş lamlara alınarak bir gece etüvde 37ºC de bekletildi. Kesitler ksilende berraklaştırılıp alkol içinde rehidrate edildi. Antijeni açığa çıkarmak için, kesitler 10mM sitratlı tampon (ph 6) içinde mikrodalga fırında 4x5 dakika ısıtıldı. Aynı tampon içinde dakika oda ısısında soğumaya bırakıldı. Dokulardaki endojen peroksidaz aktivitesini ortadan kaldırmak için, kesitlere %3 lük hidrojen peroksidaz çözeltisi damlatılıp 10 dakika beklendi. Daha sonra sırasıyla, protein blok solüsyonu (TA-125-UB, Lab Vision Corp. Fremont, CA, USA, 10 dak.), primer antikor, sekonder antikor (TA-125-BN, Lab Vision Corp. Fremont, CA, USA, 10 dak.) ve streptavidin-hrp ile işlemden geçirildi (TA-125-HR, Lab Vision Corp. Fremont, CA, USA, 10 dak.). Kromojen olarak aminoethyl carbazole (TA-125-HA, Lab Vision Corp. Fremont, CA, USA, 20 dak.) kullanıldı. Her işlemden sonra kesitler TBS ile çalkalandı. Son olarak Mayer hematoksilen ile zıt boyama yapılıp kapatıldı. İmmunhistokimyada şu antikorlar kullanıldı: p (Klon 6H12, Mause Monoclonal Antibody, Novocastra Laboratories Ltd., Bailliol Business Park West, Benton Lane, Newcastle Upon Tyene, NE12 8EW, UK, 45 dak. ), Ki67 (Rabbit Polyclonal Antibody, ScyTek Laboratoires Logan, Utah, USA, 45 dak.). Negatif kontroller, primer antikor basamağının atlanması ile yapıldı. Pozitif kontroller; p16 için proliferatif endometriuma ait kesitler kullanılarak; Kİ67 için, epitelin bazal tabakası ile internal olarak yapıldı. İmmunhistokiyasal boyamanın değerlendirilmesi İmmunohistokimyasal incelemede p16 pozitifliği nükleer ve sitoplazmik boyanma olarak izlendi. İstatiksel analizi kolay anlaşılabilir hale getirebilmek ve tekrarlanabilirliğini değerlendirebilmek için p16 için immunreaktivite var (pozitif) 29

31 ve immunreaktivite yok (negatif) şeklinde 2 dereceli sistem kullanıldı. Bazal ve parabazal seviyede diffüz boyanma pozitif boyanma olarak değerlendirildi. Tek hücre boyanmaları ve boyanmanın görülmemesi, negatif boyanma olarak değerlendirildi. (85). İmmunohistokimyasal incelemede Ki67 pozitifliği, nükleer boyanma olarak izlendi. Bazal tabaka hücrelerinde izlenen boyanma negatif, üst 2/3 de izlenen boyanma pozitif olarak değerlendirildi (89). Değerlendirmeler Olympus Cx31 ışık mikroskobunda, 400x (40x objektif lens, 10x okuler lens, 0,151 mm²) büyütmede yapıldı. İstatiksel analiz Verilerin istatiki analizi için SPSS 10.0 programında korelasyon katsayılarının hesaplanmasında parametrik analiz koşulları karşılanmadığı için Spearman Sıra Korelasyonu Analizi kullanılmıştır. rho değeri için güçlü, çok güçlü olarak kabul edilmiştir. Tutarlılığın değerlendirilmesinde kappa değeri hesaplanmış, kappa için orta derece, >0.75 mükemmel kabul edilmiştir. 30

32 BULGULAR Çalışmamıza 95 hasta alınmıştır. Yaş: Olgular yaşları arasında olup ortalama yaş 42 dir. Nonneoplazik lezyon tanısı alan 35 kadının yaş ortalaması 41.94±9.39 (en düşük 24, en yüksek 61) dir. CIN I tanısı alan 37 kadının yaş ortalaması 41.32±8.73 (en düşük 24, en yüksek 61) dir. CIN II tanısı alan 12 kadının yaş ortalaması 44.42±10.92 (en düşük 28, en yüksek 66) dir. CIN III tanısı alan 11 kadının yaş ortalaması ±8.82 (en düşük 32, en yüksek 55) dir. Histolojik grade: Biopsilerin 37 si (%38,9) LSIL; 23 ü (%24,2) HSIL; 35 i (%36,8) nonneoplazik olarak değerlendirilmiştir. 31

33 p16: İmmunhistokimya ile pozitif reaksiyon intrasitoplazmik ve intranükleer boyanma şeklinde görülmüştür. 53 (%55,8) olguda boyanma izlenmezken 25 (%26,3) olguda zayıf boyanma, 17 (%17,9) olguda kuvvetli ve tam kat boyanma izlenmiştir. Nonneoplazik biopsilerin tamamında p16 ile boyanma görülmezken displazi bulunan biopsilerin %43,1 inde p16 ile boyanma izlenmiştir. p16 ile boyanma izlenen 42 adet vakanın %50 si HSIL; %50 si LSIL olarak değerlendirilmiş vakalardır (Resim 1, Resim 2 ve Resim 3). Resim 1: HSIL de p16 ile tam kat boyanma (x40). 32

34 Resim 2: LSIL de p16 ile pozitif boyanma (x100). Resim 3: LSIL de p16 ile pozitif boyanma (x100). 33

35 HSIL tanısı almış olguların %91,3 ünde p16 ile pozitif boyanma izlenmişken, 2 olgu (%8,7) p16 ile negatiftir. Buna göre lezyonun derecesi arttıkça p16 ekspresyonunun görülme sıklığı anlamlı olarak artmaktadır (χ 2 eğimde=49.146, p<0.001, Tablo 1, Grafik 1). Tablo 1: Olguların p16 ile boyanma oranları (Çapraz Tablolama). p16 TANI nonneoplazik Sayı negatif pozitif Total % 100,0% 100,0% Düşük dereceli skuamöz intraepitelial lezyon Sayı % ,2% 56,8% 100,0% Yüksek dereceli skuamöz intraepitelial lezyon Sayı % ,7% 91,3% 100,0% Total Sayı % 55,8% 44,2% 100,0% Grafik 1: p16 ile neoplazik (düşük ve yüksek dereceli skuamöz intraepitelial neplazi)- nonneoplazik lezyon ilişkisi. 34

36 p16 nın displazik skuamöz epitelde duyarlığı %70,0 oranında, seçiciliği %100 oranında, olumlu öngörü değeri %100 oranında bulunmuştur (Tablo 2). Tablo 2: p16 ile neoplazik-nonneoplazik olguların karşılaştırılması. Patolojik tanı toplam P16 Neoplazik (+) Nonneoplazik (-) toplam Duyarlık(sensitivity)= %70.0 Seçicilik (specificity)=%100.0 Olumlu öngörü değeri (+predictivitiy)=%100.0 κ=(p gt P bt ) / (1 - P bt ) =0.632 p16 nın yüksek dereceli displazik skuamöz epitelde duyarlığı %91,3 oranında, seçiciliği %100 oranında, olumlu öngörü değeri %100 oranında bulundu (Tablo 3). Tablo 3: p16 ile Yüksek dereceli skuamöz intraepitelial lezyon ve nonneoplazik olguların karşılaştırılması. Patolojik tanı toplam Yüksek dereceli nonneoplazik (-) skuamöz intraepitelial P16 lezyon toplam Duyarlık(sensitivity)= %91,3 Seçicilik (specificity)=%100.0 Olumlu öngörü değeri (+predictivitiy)=%

37 Ki67: İmmunhistokimya ile pozitif reaksiyon intranükleer boyanma şeklinde görülmüştür. 55 olguda (%48) sadece bazal tabakada boyanma izlenirken 20 olguda (%21) epitelin 2/3 ünde boyanma, 20 olguda (%21) tam kat boyanma izlenmiştir (Resim 4, 5 ve 6). Resim 4: HSIL de Ki67 ile tam kat boyanma (x100). Resim 5: Ki67 ile nonneoplazik olguda bazal tabakada boyanma (x40). 36

38 Resim 6: LSIL de Ki67 ile bazal tabakayı aşan pozitif boyanma (x40). Nonneoplazik biopsilerin tamamında Ki67 ile sadece bazalde boyanma görülürken, displazisi bulunan biopsilerin %66,6 sında Ki67 ile yüksek boyanma izlenmiştir. Ki67 ile yüksek boyanma izlenen vakaların %57,5 i HSIL, %42,5 i LSIL olarak değerlendirilmiş vakalardır. Buna göre, lezyonun derecesi arttıkça, Ki67 ile boyanma oranı artmaktadır (χ 2 eğimde=45.103, p<0.001, Tablo 4, Grafik 2). Tablo 4: Olguların Ki67 ile boyanma oranları (Çapraz tablolama). TANI Total nonneoplazik Düşük dereceli skuamöz intraepitelial lezyon Yüksek dereceli skuamöz intraepitelial lezyon Sayı % Sayı % Sayı % Sayı % KI67 negatif pozitif Total ,0% 100,0% ,9% 54,1% 100,0% ,0% 87,0% 100,0% ,9% 42,1% 100,0% 37

39 Grafik 2: Ki67 ile neoplazik(yüksek ve düşük dereceli intraepitelial neoplazi)- nonneoplazik lezyon ilişkisi. 38

40 Çalışmamızda, Ki67 nin displazik skuamöz epitelde duyarlığı %66,7 oranında, seçiciliği %100 oranında, olumlu öngörü değeri %100 oranında bulunmuştur (Tablo 5). Tablo 5: Ki67 ile neoplazik-nonneoplazik olguların karşılaştırılması. Patolojik tanı toplam Ki67 Neoplazik (+) Nonneoplazik (-) toplam Duyarlık(sensitivity)= %66.7 Seçicilik (specificity)=%100.0 Olumlu öngörü değeri (+predictivitiy)=%100.0 κ=(p gt P bt ) / (1 - P bt ) =0.596 Çalışmamızda Ki67 nin yüksek dereceli displazik skuamöz epitelde duyarlığı %86,9 oranında, seçiciliği %100 oranında, olumlu öngörü değeri %100 oranında bulunmuştur (Tablo 6). Tablo 6: Ki67 ile Yüksek dereceli skuamöz intraepitelial lezyon ve nonneoplazik olguların karşılaştırılması. Patolojik tanı toplam Ki67 Yüksek dereceli skuamöz intraepitelial lezyon nonneoplazik (-) toplam Duyarlık(sensitivity)= %86,9 Seçicilik (specificity)=%100.0 Olumlu öngörü değeri (+predictivitiy)=%

41 Çalışmamızda p16 ve Ki67 arasında da güçlü bir ilişki olduğu saptanmıştır (rho değeri >0.75, Tablo 7, Grafik 3). İki yöntem arasındaki tutarlılık kappa olarak 0,786 dır ve güçlü düzeydedir. Tablo 7: Olgularda p16-ki67 oranlarının karşılaştırılması (Çapraz tablolama). Ki67-p16 Çapraz Tablolama P16 KI67 negatif Sayı negatif pozitif Total Totaldeki % 51,6% 6,3% 57,9% pozitif Sayı Totaldeki % 4,2% 37,9% 42,1% Total Sayı Totaldeki % 55,8% 44,2% 100,0% Grafik 3: Ki67 ile p16 arasındaki ilişki. 40

42 TARTIŞMA Serviks kanseri, bazı ülkelerde hala en sık görülen kadın genital sistemi tümörlerinden biridir. Yılda hasta yeni tanı almakta ve serviks kanseri nedeniyle hasta hayatını kaybetmektedir (25, 86). HPV, servikal onkogenezdeki en önemli ajandır. HPV DNA sı hibridizasyon teknikleriyle servikal kanserlerin %95 inde gösterilmiştir. Onkojenik tip HPV nin konak genomuna integrasyonu skuamöz hücreli serviks karsinomu gelişiminde önemli rol oynamaktadır. Onkojenik HPV nin hemen hemen tüm preneoplastik ve neoplastik servikal lezyonlarda bulunması karsinom gelişiminde önemli bir faktördür (2). HPV, çift sarmallı bir DNA virusu olup bugüne kadar 120 kadar HPV tipi tanımlanmıştır. Bunların 30 tanesi anogenital infeksiyonlarla ilişkilidir. 15 tanesi ise yüksek onkojenik riske sahiptir ve bunlar hemen hemen tüm servikal kanserlerde tanımlanmışlardır. HPV-16 ve HPV-18 en sık görülenlerdir. Yapılan çalışmalarda HPV-16 hastalığın progresyonunu etkileyen en önemli faktör olarak gösterilmektedir (2,25). Servikal kanserlerle birlikte olan (yüksek riskli) ve kondilomlarda görülen (düşük riskli) spesifik HPV tipleri vardır. Yüksek riskliler (HR-HPV) 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 ve 68; düşük riskliler (LR-HPV) 6, 11, 42, 44, 53, 54, 62 ve 66 dır (18). 41

43 Deneysel çalışmalar, yüksek riskli HPV tiplerinin viral genlerinin çeşitli yollarla hücre siklusunda değişikliklere yol açtığını göstermiştir (19-22). HPV-16 ve HPV-18 in onkojenik potansiyeli, E6 ve E7 olarak adlandırılan iki erken viral gen ürünü ile ilgilidir. DNA virusunun replikasyonu, konak hücrelerindeki replikasyon sistemlerine bağlıdır. Bu viral proteinlerin tümör baskılayıcı gen ürünlerine afinitesi, HPV nin onkojenik potansiyeline göre farklılıklar gösterir (23). ABD de 20. yüzyılda servikal kanserden ölüm oranı önemli ölçüde azalmıştır. Bunun nedeni de Papanicolaou (Pap) smear testidir larda smear ile tarama uygulanmadan önce serviks kanseri ABD de kanser ölümlerinin en sık görülen nedenlerinden biriyken bugün ilk 10 da bile değildir (87). Gelişmekte olan ülkelerde kadınların %5 den azına Pap testi uygulanmaktayken ABD de son üç yılda kadınların %89 una Pap testi yapılmıştır (87). Pap testi şimdiye kadar bulunmuş en ucuz ve etkili kanser tarama programıdır. Bunda en önemli pay, Dr. George N. Papanicolaou nundur de Dr. Papanicolaou vaginal smearde serviks kaynaklı olabilecek malign hücreleri bildirmiştir. Daha sonra Jinekolog Dr. Herbert Traut ile birlikte çok sayıda klinik örnekle çalışarak, smearlerde preinvaziv lezyonları tarifleyerek çalışmalarını sonuçlandırmışlardır (87). Pap testinin başarısı yine de duyarlılık ve seçiciliği nedeniyle sınırlıdır. Servikal premalign lezyonlar ve servikal kanserde yanlış negatiflik oranı, %15- %50 arasındadır. Yanlış pozitiflik oranı ise yaklaşık %30 olarak bildirilmiştir. Bu yetersizlik, sitolojik tanının subjektivitesi ve değerlendirenler arası uyuşmazlık nedeniyle olabilir (86). 42