EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ (YÜKSEK L SANS) A LESEL AKDEN Z ATE L HASTALARDA MEFV GEN MUTASYONLARININ mrna EKSPRESYONU LE L K S

Transkript

1 1 EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ (YÜKSEK L SANS) A LESEL AKDEN Z ATE L HASTALARDA MEFV GEN MUTASYONLARININ mrna EKSPRESYONU LE L K S EBRU KOCADA KOCAZORBAZ Biyokimya Anabilim Dal Bilim Dal Kodu: Sunu Tarihi: Tez Dan manlar :Prof.Dr.Azmi TELEFONCU Prof.Dr. Afig BERDEL Bornova- ZM R

2 2 ÖZET A LESEL AKDEN Z ATE L HASTALARDA MEFV GEN MUTASYONLARININ mrna EKSPRESYONU LE L K S KOCAZORBAZ KOCADA, Ebru Yüksek Lisans Tezi, Biyokimya Anabilim Dal Tez Yöneticileri: Prof.Dr. Azmi Telefoncu Prof.Dr.Afig Berdeli Haziran 2008,81 sayfa Ailesel Akdeniz ate i (AAA), yayg n olarak Akdeniz toplumlar n etkileyen otozomal çekinik bir hastal kt r. Genelde kar nda görülen serozit ataklar ve buna e lik eden ate ve yükselmi akut-evre molekülleriyle karakterizedir. Bu çal mada fenotip ve genotip korelasyondaki moleküler temelin, de i en MEFV mrna ekspresyonu olup olmad ara tr ld. Fmf hastalar ndan ve sa l kl kontrol grubundan elde edilen periferik kan lökositlerindeki mefv transkriptinin rölatif miktar tespit edildi. Elde edilen veriler, Mefv mesaj düzeylerinin hem fenotipine hemde genotipine ba l oldu unu gösterdi. Sonuçlar, hastal n patofizyolojisinin, MEFV mrna ekspresyonunun kantitatif bir noksanl na dayand hipotezini destekleyici niteliktedir. Anahtar kelimeler: Ailesel Akdeniz Ate i (AAA); RNA izolasyonu; cdna; Real-Time PCR

3 3 ABSTRACT RELATED WITH mrna EXPRESSION OF MEFV GENE MUTATIONS IN PATIENTS WITH FAMILIAL MEDITERRANEAN FEVER KOCAZORBAZ KOCADA, Ebru Master of Science Thesis, Biochemistry Department Supervisors: Prof. Dr.Azmi Telefoncu Prof.Dr. Afig Berdeli June, 2008, 81 pages Familial Mediterranean Fever (FMF) is an autosomal recessive disease that commonly affects people of Mediterranean heritage. It is typically characterized by attacks of serositis observed in the abdomen and accompanied by fever and elevated acute-phase molecules. To address whether the molecular basis of the phenotype genotype correlation could be related to altered MEFV messenger RNA (mrna) expression, we quantified the relative abundance of MEFV transcripts in peripheral blood leukocytes from patients with FMF, healthy carriers of a single MEFV mutation, and healthy control subjects. Our results demonstrate that MEFV message levels are related to both the genotype and the phenotype, and suggest that the pathophysiology of FMF relies on a quantitative defect of MEFV mrna expression. Keywords: Familial Mediterranean Fever (fmf); RNA extraction; cdna; Real-Time PCR

4 4 IX TE EKKÜR Yüksek lisans çal mam boyunca sonsuz bilgi ve deneyimlerini benimle payla an say n Prof.Dr. Azmi Telefoncu ve say n Prof.Dr. Afig Berdeli ye te ekkür ederim. Çal malar m n her a amas nda büyük bir özveri ile bana yard mc ve destek olan Ara.Gör.Serap Evran a laboratuar çal malar mdaki yard mlar ndan dolay da Biyolog Kadriye Güler e, tüm Biyokimya bölümü çal anlar na ve beni daima destekleyen e ime ve aileme te ekkürü bir borç bilirim. Bu çal ma Ege Üniversitesi Ara t rma Fonu taraf ndan desteklenmi tir.

5 5 XI Ç NDEK LER Sayfa ÖZET....V ABSTRACT....VI TE EKKÜR.....IX EK LLER D Z N....XV Ç ZELGELER D Z N....XVII S MGELER VE KISALTMALAR D Z N. XIX 1.G R Ailesel Akdeniz Ate i (FMF) Tarihçe Epidemiyoloji Genetik..4

6 6 Ç NDEK LER (devam) Patojenez Pirin/Marenostrin Protein Klinik Özellikleri Laboratuvar Bulgular FMF de Klinik Tan ve Tan sal Kriterler Fenotip-Genotip Korelasyonu Tedavi Kol isinin Etki Mekanizmas Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Real-Time PCR Floresans Boyalar Tagman Prob Moleküler Boncuk Yöntemi Hibridizasyon Prob Yöntemi...43

7 7 Ç NDEK LER (devam) Sybr Green I Gerekli Donan m mrna Kantitasyonun Önemi RealTime PCR avantajlar Real-time PCR Uygulama Alanlar MATERYAL VE METOD Materyal Metod Kan örneklerinin toplanmas RNA izolasyonu cdna sentezi cdna PCR Agaroz Jel Elektroforez Çal malar MEFV -HPRT primer ve prob dizini.58

8 8 Ç NDEK LER (devam) Real-Time PCR De erlendirme SONUÇLAR VE TARTI MA RNA zolasyon Sonuçlar cdna Sentezi Ekspresyon Analizi Genel De erlendirme 68

9 9 EK LLER D Z N ekil Sayfa 1.1 FMF in co rafi da l m MEFV geni Pirin proteinin ematik görünümü MEFV mutasyon spektrumu Haploitlerin farkl adland r lmas FMF inflamasyonunun patofizyolojisi ve pirin Pirin domainleri ve fonksiyonlar FMF de gözlenen klinik belirtilerin spektrumu Ailesel Akdeniz Ate inde diz artritinin görünümü Ailesel Akdeniz Ate i nde erizipeli yans layan eritem ve vaskülitik döküntü Kol isinin kimyasal yap s PCR s cakl k döngüsü Taqman Probu Moleküler boncuk yöntemi..42

10 10 EK LLER D Z N (devam) 1.15 Hibridizasyon prob yöntemi SYBR Green I in kimyasal yap s SYBR Green I metodu Real-Time PCR donan m RNA n n jel görüntüsü cdna-gapdh PCR jel elektroforezi MEFV standart grafi i HPRT standart grafi i Kontrol grubu ve FMF mutasyonu ta yan hastalar aras ndaki MEFV mrna ekspresyon düzeyinin kar la t r lmas Kontrol grubuyla kar la t r lan FMF hastalar n MEFV mrna düzeyindeki de i im.67

11 11 Ç ZELGELER D Z N Çizelge Sayfa 1.1 Etnik kökenlere göre MEFV mutasyonlar n n da l m Etnik Gruplara göre klinik özellikleri Livneh ve Arkada lar n n FMF Tan Kriterleri cdna Reaksiyonun ilk basama cdna reaksiyonun ikinci basama S cakl k Döngüsü Program cdna PCR protokolü Mefv- Hprt primer ve prob dizini MEFV Real-Time PCR Reaksiyon Protokolü HPRT Real-Time PCR Reaksiyon Protokolü Real-Time PCR ko ullar.61

12 12 XVIII S MGELER VE KISALTMALAR K saltma cdna DNA dntp FRET LED RNA RT RT-PCR Taq Aç klama Komplementer Deoksiribonükleikasid Deoksiribonükleikasid Deoksinükleotidtrifosfat Floresans Resistant Enerji Transferi Light emitted diode Ribonükleikasid Reverse Trancriptase Real-Time Polimerase Chain Reaction Termo Stabil Polimeraz Enzimi TBE Tris Boric Asit EDTA FMF MEFV GAPDH EDTA Ailesel Akdeniz Ate i Mediterranean Fever (gene) Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenaz Ethylenediaminetetraacedic acid

13 13 1. G R 1.1 Ailesel Akdeniz Ate i (FMF) Ailesel Akdeniz Ate i (FMF); Akdeniz kökenli toplumlarda s k görülen otozomal resesif geçi li bir hastal kt r. Tekrarlayan ve kendi kendini s n rlayan ate ile birlikte kar n a r s, plevrit, artirit ve erizipel benzeri deri lezyonu ile Ailesel Akdeniz Ate i karakterize edilmi tir (Chetrit and Levy, 1998). Ayr ca kar n, eklem ve gö üste iddetli a r larda görülmektedir. Ataklar genellikle saat sürer ve ara s ra bir deri döküntüsünü içerebilir (Encyclopedia of Medicine, 2006). ltihapl ataklar n ortaya ç kmas na yol açt bilinen bir patojen ya da otoantikor veya antijene özgü T-hücre olmad için otoenflamatuar bir hastal k olarak tan mlanmaktad r (Kastner et al., 2005) Tarihçe Ailesel Akdeniz Ate i Türkler, Yahudiler, Araplar ve Ermenilerde s k olarak görülür (Schwabe et al., 1977). lk FMF olgular bu etnik gruplarda tan mlanm t r. Dünya literatüründe ilk kez 1908 y l nda Janeway ve Mosenthal tekrarlayan ate, abdominal a r ve lökositozu olan 16 ya nda Yahudi bir k z olgusu yay nlam lard r ( Janeway and Mosenthal, 1908). lk olgudan sonra 1945 y l nda Amerikal ara t rmac Siegal, Benign Paroksismal Peritonitis ad ile tekrarlayan ate ve kar n a r s ataklar ile seyreden bir klinik bulgu tan mlam t r (Siegal, 1945) y l nda Reiman periyodik hastal k tan mlanmas n kullanm t r (Reimam, 1948) y l nda ilk kez Catton ve Mamou hastal n n ailevi oldu una dikkat çekmi ler ve 1956 y l nda ayn yazarlar FMF li hastalarda amiloid geli ebilece ini bildirmi lerdir (Mamou, 1956). Heller

14 14 ve Sohar 1958 y l nda ilk kez Ailevi Akdeniz Ate i tan m n kullanm lar ve 1961 y l nda yine ayn yazarlar hastal n otozomal resesif karakterde oldu unu göstermi lerdir (Heler et al., 1958). Türkiye de ilk FMF hastas garip bir kar n a r s sendromu ad ile 1946 y l nda Abrevaya Marmaral taraf ndan bir eri kinde tan mlanm t r (Marmaral, 1946) y l nda FMF için etkili bir ilaç olan kol isin in ke fi büyük bir terapatik bulu tur (Medicine, 2005). FMF; Do u Akdeniz bölgesinde ya ayan insanlar aras nda oldukça s k görülmektedir. Bu hastal k özellikle Türkler, Yahudiler, Ermeniler ve Araplar da oldukça yayg n olup; Japon halk nda da FMF gözlenmi tir (Özen, 2003). Yahudi FMF hastalar n n %90 n ndan fazlas Sefardik veya Orta do u kökenlidir. Sefardik Yahudileri, 15. yüzy lda spanya dan sürgün edilen toplumun torunlar d r ve bu rk çe itli Kuzey Afrika ve Akdeniz ülkeleri aras ndan da lm t r. Orta Do u Yahudileri, Babil hükümeti taraf ndan Mezopotamya ya sürgün edilen Yahudilerin torunlar d r (Chetrit and Levy, 1998). Bu nedenle ailesel akdeniz ate i hastal n n Akdeniz le do rudan bir ba lant s olmay p, daha çok bu co rafi alandaki insanlar n geni kapsaml (tarihi) göç hareketleriyle oldu u dü ünülmektedir. ( ekil 1.1).

15 15 ekil 1.1 FMF in co rafi da l m (Chetrit and Levy, 1998) Epidemiyoloji AAA, hastal n s k görüldü ü co rafi bölgelerde 1-3/1000 s kl nda görülmektedir. Türkiye de de benzer s kl k söz konusudur. Ancak Türkiye nin belli bölgelerinden köken alan ki ilerde hastal a daha fazla rastlanmaktad r. smindeki Akdeniz tan mlamas n n aksine

16 16 AAA daha çok ç Anadolu (Sivas, Tokat, Kayseri), Bat Karadeniz (Kastamonu, Sinop), Do u Karadeniz iç kesimleri (Gümü hane, Bayburt), Do u (A r, Kars, Erzurum) ve Güneydo u Anadolu da (Malatya) görülmektedir. Akraba evlili inin daha fazla oldu u bölgelerde hastal n ortaya ç kma riski de artmaktad r. Otosomal resessif geçi li bir hastal k olan AAA da akraba evlili i s kl %30-40 civar ndad r. Hastal k %90, 20 ya ndan önce ba lar. Neredeyse yar s n n ba lang ç ya 10 un alt ndad r. Ya am n ilk y l nda dahi belirtiler ortaya ç kabilir. K rk ya ndan sonra ba lamas ise oldukça nadirdir. Erkeklerde biraz daha s kt r 1:1.5. Hastal a ba l geli en amiloidoza da erkeklerde belirgin olarak daha fazla rastlanmaktad r (Özdo an, 2003) Genetik Etkilenen ailelerin büyük bir ço unlu unda resesif geçi li olan; FMF hastal bir ku a n bireylerinde meydana gelmektedir. Bununla birlikte yüksek akrabal k oranlar birbirini izleyen iki veya daha fazla ku akta FMF in meydana gelmesine sebep olabilmektedir. Ta y c s kl kuzey Afrika Yahudilerinde 1/6 ve Ermenilerde 1/7 oldu u tahmin edilmi tir. Verilen populasyon da yüksek gen s kl bir tak m mekanizmalarla aç klanabilmi tir. Bu mekanizmalar genetik e ilimi ve heterozigot avantaj içerir. Heterozigot hastalarda infeksiyonlar n dü ük oranda ve ast m n hafif oldu u teyit edilmi tir (Chetrit and Levy, 1998). Hastal n otozomal resesif geçi li oldu u bildirildikten sonra 1992 y l nda hastal ktan sorumlu genin 16. kromozomun k sa kolunda oldu u gösterilmi tir (Pras et al., 1992) y l nda 16.kromozomun k sa kolunda (16p13.3) s ras yla telomer-d16s246-mefvd16s138- sentromer olarak belirlenmi olan

17 17 AAA geni (MEFV) 1997 y l nda iki ayr ara t rma grubu taraf ndan (Frans z AAA Konsorsiyumu ve Uluslarars AAA Konsorsiyumu) yürütülen çal malar sonucu pozisyonel olarak klonlanm t r. 15 kbl k bir bölgeyi kapsayan MEFV geni, 10 eksondan olu makta ve 781 aminoasitlik bir proteini kodlamaktad r. Ayn anda bulunan genin olu turdu u proteine Frans z grubu Marenostrin:Akdeniz ; di er grup ise Pyrin:Ate ismini vermi tir (Özlü, 2006). FMF geni, MEFV (mediterranean fever) geni olarak adland r lm t r nin bahar ay nda pozisyonel klonlama yapan grup birbirinden ba ms z olarak ayn zamanda FMF genini klonlam lard r (Centola et al., 1998). Bu gen daha çok monosit ve granülositlerde yüksek düzeyde eksprese edilen bir proteine dönü türülür (Özlü, 2006). MEFV (Mediterranean Fever) geni olarak adland r lan bu gen 16.kromozomun k sa kolunda (16p) 13.3 bölgesinde 10 eksonluk, 15 kilobazl k bir gendir ve 3505 nükleotitten olu maktad r (Tekin vd., 1999). MEFV geni 13.3 pozisyonda 16.kromozomun k sa koluna lokalize olmu tur ( ekil 1.2). MEFV geni 3,232,028 baz parças ndan 3,246,627 baz parças na kadar lokalize olmu tur (Pubmed, 2006).

18 18 ekil 1.2: MEFV geni (Pubmed, 2006) MEFV, 10 eksondan ve 781 aminoasitlik bir proteini kodlayan 3.7kb l k transkriptinden meydana gelmi tir ( ekil 1.3) (Schaner and Gumucio, 2005). Bu proteinin ürünü; FMF in ba l ca bulgusu olan ate le ili kisini belirtmek üzere pyrin olarak adland r lm t r (5makale afig hocadaki tez).

19 19 ekil 1.3. Pirin proteinin ematik görünümü (Stojanov and Kastner, 2005) FMF gen lokalizasyonun tam olarak belirlenmesi ve klonlanmas ndan beri; farkl etnik gruplarda 17 mutasyon saptanm t r. Bu mutasyonlar Tablo 1 de verilmi tir (Telatar and Grody, 2000). Daha sonralar yakla k 40 tane farkl FMF mutasyonu tan mlanm t r (Guillevin, 2004). FMF geni 1997 nin yaz nda birbirinden ba ms z iki grup taraf ndan pozisyonel klonlama ile tan mlanm t r. Pozisyonel klonlama özellikle birkaç nedenden dolay dolay güvenilir de ildir. Bu nedenler unlard r: (1) belirtilen haritada büyük skalada delesyonlar veya translokasyonlar yer almamaktad r, (2) FMF için aday olan gen bölgesi 16.kromozomun PKD1 ve RSTS bölgeleri aras nda yer almaktad r, suni maya kromozomlar nda de i kenli i ispatland, (3) MEFV geni bir gendir ki, eksprese edilen sekans tag (EST) databazlar n herhangi birisinde yer almamaktad r, (4) genin ekspresyonu di erlerine nazaran dokuya spesifiktir ve orijinal kay tlardaki mutasyonlar n dördü konservatif yanl anlaml mutasyonlard r. Hastal kla ili kili microsatelit haploitli 4 mutasyonun her birinin s k bir ili kisi vard r (Centola et al.,

20 ). 4 yanl anlaml mutasyon ( M694V, M694I,V726A ve M680I ) ekson 10 da yer almaktad r. Bunlar n ikisi ayn kodon da yer almaktad r. Bu mutasyonlar n her biri farkl haploitler ile ba lant l d r (Telatar, Grody 2000). Genin 10. ekzonu mutasyonlar için hassas bir bölgedir. 10. eksondaki M694V,M680I,M694I ve V726A mutasyonlar ta y c yada hasta kromozomlardaki AAA mutasyonlar n n %85 ini olu turur (Özlü, 2006). AAA da en s k görülen 4 mutasyon (missense mutasyon) pyrin proteininin karboksi terminal bölgesinde bulunmu tur. AAA vakalar n n büyük ço unlu undan, hangi etnik kökenden olursa olsun, bu mutasyonlar n sorumlu oldu u tespit edilmi tir (Özlü, 2006). AAA li hastalar genellikle homozigot veya karma heterozigot (2 allelde farkl 2 mutasyon ta yan) olarak görülmektedir. Baz AAA li hastalarda ayn kromozom üzerinde farkl iki mutasyon varl bildirilmi tir. Baz srailli AAA hastalar n n iki mutasyonu (V726 ile E148Q) birlikte ta d klar gözlenmi tir. Bu çift mutasyon Yahudi, Arap, Dürzilerde de gösterilmi tir. Bir Ürdün lü hastada ise V726A/E148Q mutasyonlar birlikte saptanm t r (Özlü, 2006). AAA li hastalarda yap lan bu genetik çal malar sonucunda; hastal n fenotipik varyasyonlar n n belirli mutasyonlar n varl na atfedilebilece i dü üncesi ortaya ç km t r. Akdeniz mutasyonu olarak da bilinen M694V mutasyonu Ashkenazi olmayan Yahudiler, Türkler, Ermeniler ve Araplar aras nda saptanm t r. Bu mutasyonu ta yan kromozomlar üzerinde yap lan haplotip analizleri göstermi tir ki bu mutasyon belirli bir rksal bölümde yakla k olarak belki de 2000 y ldan fazla zamandan beri mevcuttur (Cell, 1997). Bu mutasyonda valin 694. pozisyondaki metiyoninin yerine geçmi tir. Buda M694V mutasyon

21 21 olarak gösterilmektedir (Centola et al., 1998). M694V mutasyonu tek spesifik haploitli ba lant l farkl etnik kökenli (Irak, Yahudi, Ermeniler, Araplar, Güney Afrika Yahudileri ve Türkler) ailelerin ta c kromozomlar n n büyük bir yüzdesinde gözlenmektedir (Telatar and Grody, 2000). Amiloidozu olan hastalarda en fazla saptanan mutasyon bu oldu u için bu mutasyonu ta yan hastalarda amiloidoz geli me riskinin yüksek oldu u öne sürülmü tür. Bu bulgular n tersine olarak da V726A mutasyonu da bir ekilde farkl etnik gruplar aras nda saptand ; Askenezi Yahudileri, Dürziler, Irakl Yahudiler, Ermeniler gibi; ve bu grupta amiloidozun daha az oldu u gözlendi. Bu bulgu da V726A mutasyonunun amiloidozdan koruyucu olabilece ini dü ündürdü (Özlü, 2006). Bu mutasyon da kodon 726 da alanin valinin yerine geçmi tir. Bu mutasyonda V726A mutasyonu olarak adland r l r (Tablo 1). Bir tak m etnik kökenlerin ta y c kromozomlar nda gözlenmektedir (Centola et al., 1998). Fato Yalç nkaya ve arkada lar n n yurdumuzda yapm olduklar bir çal mada ise V726A mutasyonunun amiloidozdan korumad gösterilmi ; böylece bu mutasyonun sadece Yahudilerde amiloidozdan koruyucu olabilece i di er etnik gruplar için bunu öne sürmenin çok da do ru olmayaca belirtilmi tir (Aksentijevich et al., 1999). srail ve Kuzey Afrika da yap lan çal malarda, homozigot M694V mutasyonunun daha ciddi tablolar ile sonuçlanabilece i öne sürülmü tür. Ancak AAA li Türk hastalarda yap lan çal malar bu dü üncenin aksini ortaya koymaktad r. Bu bulgular, bilinmeyen çevresel etmenler ve/veya etnik kökene ba ml genetik de i imlerin de hastal n prognozunda rolü olabilece ini akla getirmektedir (Özlü, 2006).

22 22 Çizelge 1.1 Etnik kökenlere göre MEFV mutasyonlar n n da l m Di er ikisinden daha az rastlan lan mutasyonlar M680I ve M694I spesifik Ermeni ve Arap haploidlerin de bulunmu tur (Centola et al., 1998). Haploitleri ta yan kromozomlar 680. pozisyonunda ki metiyonin yerine izolösin kodlamaktayd (M680I). Bu haploit sadece Ermeni kromozomlar nda tespit edilmi tir. Frans zlar taraf ndan tan mlanan 4.cü mutasyon ise 694.cü pozisyonda bulunan metionin yerine izolösin in kodlanmas ile sonuçlanmaktad r (M694I). Bu mutasyon Araplara özel bir mutasyon olarak tespit edildi i için ARA2 olarak adland r lm t r. Bugüne kadar saptanan mutasyonlar n say s 30 civar ndad r. Bilinen 29 MEFV mutasyonun 26 s missense mutasyondur, bir tanesi yak n bir zaman önce tespit edilmi olan non-missense (anlams z) mutasyondur (Y688X) (Samuels et al., 1998) ve 2 tanesi de küçük mutasyonlard r (1692del, M694del) (Bernot et al., 1998; Notarnicola et al., 2001).

23 23 Bernot ve arkada lar ekson 2 de E148Q, E167D ve T267I, ekson 5de F479L ve ekson 10 da I162del, K695R, A744S ve R761H mutasyonlar n saptam lard r. E148Q ve K695R d nda tüm mutasyonlar bir tek kromozomda bulunur. E148Q mutasyonu tüm etnik gruplarda gözlenmi tir. ekil 1.4 de mutasyonlar verilmi tir (Bernot et al., 1998). Çok nadir görülen K695R ve A744S mutasyonlar tahmin edilenden daha hafif hastal a sebep olmaktad r ve pirinde konformasyonel de i iklik olmamaktad r (Goulielmos et al., 2006). ekil 1.4 MEFV mutasyon spektrumu (Touitou, 2001).

24 24 Haplotip analizleri birtak m haplotiplerin belirlenmesini sa lar. Bunlar; haplotip S kuzey Afrika Yahudilerine, haplotip ARM1, ARM2 ve ARM3 ermenilere, haplotip T Türklere, haplotip ARA1 ve ARA2 Araplarda ve haplotip D Dürzilere verilmi tir. S, ARM1,T ve ARA1 ortak bir köken payla maktad rlar. Haplotip D ve ARM3 akrabal k ba oldu u gözlenmi tir Bu haplotipler uluslararas FMF birli i taraf ndan farkl isimlendirilmesi ( ekil 1.5)gösterilmi tir (Bernot et al., 1998).

25 ekil 1.5 Haplotiplerin farkl adland r lmas (Bernot et al., 1998). 25

26 Patojenez Hastal n etyopatogenezi kesin olarak ayd nlat lamamakla birlikte; immünolojik bir olay n rol oynad dü ünülmektedir. Ailesel Akdeniz Ate inde en belirgin patolojik özellik serozal yüzeylerdeki inflamasyondur. Bu bölgelerden al nan s v ve doku örneklerinde belirgin bir nötrofil birikimi gözlenir. Fakat nötrofillerin hangi mekanizma ile inflamasyon bölgesinde biriktikleri belli de ildir. Yap lan ilk çal malarda nötrofillerin normal fonksiyon ve morfoloji gösterdikleri saptanm t r. Ba ka bir çal mada ise bu nötrofillerin yüksek s da fazla lizozim salg lad klar saptanm t r. Ailesel Akdeniz Ate inde C-reaktif protein ve serum amiloid A n n ataklar s ras nda artt uzun süreden beri bilinmektedir. Bu sebeple AAA da akut faz yan t ndan sorumlu olan sitokinlerle ilgili çal malar yap lm t r. Ailesel Akdeniz Ate li hastalarda yap lan çal malarda atak s ras nda fitohemaglutinin ile indüklenmi mononükleer hücrelerden TNF ve IL-1 salg lanmas n n azald gösterilmi tir. Bu azalma; ataklar s ras nda, TNF ve IL-1 üretiminin doyuma ula t ve yeni bir uyar ya yan t veremedi i eklinde yorumlanm t r. nterlökin-1, IL-6 ve IL-8 in de ataktaki hastalarda, ataks z döneme göre artt gösterilmi tir. Yap lan ba ka bir çal mada ise ataktaki hastalarda TNF düzeyi kontrol grubuna göre artm olarak bulunmu tur. Tüm bu sitokinlerdeki de i ikliklerin AAA nin patolojisindeki esas bozukluklar olmaktan daha çok ikincil de i iklikler oldu u dü ünülmektedir. Bugün için bu patolojik de i iklikleri aç klayacak en önemli hipotez, ataklar n inflamatuar yan t n düzenlenmesindeki bir bozukluktan kaynakland d r. Normalde peritoneal ve sinovyal s v lar kompleman n C5a fragman n n kemotaktik aktivitesini engelleyen inhibitör bir protein ta rlar. Bu proteinin i levi, normal ko ullarda çe itli nedenlerle aktive olan C5a y nötralize etmek

27 27 ve inflamasyonu a r ya kaçmadan kontrol alt nda tutmakt r; eksikli inde seröz zarlarda inflamasyon ortaya ç kar. Yap lan çal malarda da hastalar n eklem ve s v örneklerinde C5a inhibitör aktivitesi saptanmam t r (Özlü, 2006). Bir ba ka çal mada ise ayn proteinin proinflamatuar bir sitokin olan IL-8 i de inhibe etti i gösterilmi tir (Birlik vd, 1998). IL-8 nötrofilleri uyararak adezyon moleküllerinin sunumunu böylece kemotaksisisi artt r r. Hastal kla ilgili MEFV geninin klonlanmas n dan sonra genin ürünü olan pyrin/marenostrinin inhibitör protein oldu u savunulmaktad r (Hatemi vd, 2004). Bu gen esas olarak nötrofillerde ekprese olmaktad r. Son zamanlarda nötrofillerden daha az olmak üzere sinovyal s v ve fibroblast kültürlerinde de eksprese oldu u gösterilmi tir (Chetrit and Levy, 1998). Bu gende olu an mutasyonlar, pyrin/marenostrin molekülünde yap sal de i iklikler olu turup bu proteinin inflamasyondaki bask lay c i levini ortadan kald rmaktad r. Hastal n ataklar halinde olmas n n sebebinin, mutasyona u ram bu molekülün normal ko ullarda i levini görmesi, fakat baz durumlarda (örne in stres) inflamasyonu engelleyememesinden kaynakland ileri sürülmektedir. As l olarak nötrofillerde ekprese olmu bir gen mutasyonunun hangi yolla serozal zarlarda inflamasyonu olu turdu u da iyi bilinmemektedir (Hatemi vd, 2004). Geçmi te FMF patogenezinde birçok hipotez öne sürülmü tür. Bunlar katekolamin metabolizma bozuklu u (Barakat et al., 1989), lipokortin eksikli i (Cook, 1986), lipid metabolizma bozuklu u (Garcia- Gonzalez and Weisman, 1992), immünolojik anormallikler (Anton et al., 1998) gibi hipotezler ileri sürülmü tür. Güncel hipotez ise; Pirinin, proinflamatuar molekülü bask lad yada antiinflamatuar proteini transkripsiyonel a amada artt rd dü ünülmektedir. Defekt pirin ise muhtemelen, inflamatuar olaylarda,

28 28 serozal alana artm lökosit migrasyonuna ve inflamutuar uyar ya uzam ve uygunsuz yan ta neden olur ( ekil 1.6) (Chetrit and Levry, 1998). ekil 1.6 FMF inflamasyonun patofizyolojisi ve pirin. Bu hipotez de pirinin normal fonksiyonunun granülosit arac l inflamasyonu downregüle etti i varsay l r. Bunu da ya mikrotübüller veya adezyon molekülü gibi down regüle eden inflamatuvar arac lar sayesinde veya C5a inhibitör veya lipokortin-1 gibi upregüle eden anti-inflamatuvar arac lar sayesinde yapmaktad r. Bu arac lar resimde gösterilmektedir ve pirinin faaliyeti için olas hedeflerin örnekleri için tasarlanm t r. (Samue et al., 1998.)

29 Pirin/Marenostrin Protein FMF e sebep olan gen pozisyonel klonlama ile 16.kromozomum k sa koluna 16p13.3 de saptanm t r. Protein MEFV geni taraf ndan kodlanmaktad r (Samuels et al., 1998) y l nda MEFV geninin ve ürünü olan proteinin ke finden sonra ortaya konulmu tur; MEFV taraf ndan kodlanan protein, uluslararas FMF grubu taraf ndan pirin, Frans z grubu taraf ndan da marenostrin olarak adland r lm t r (Cell, 1997). Pirin primer olarak nötrofillerde, eosinofillerde ve sitokinle aktive edilmi monositlerde eksprese edilmektedir (Centola et al., 2000). Epitopla i aretlenmi tam uzunluktaki pirin mikrotübüllerde ve aktin hücre iskeletinde kolokalize olmaktad r (Mansfield et al., 2001). Ekspre edilen ürün pirin veya marenostrin olarak adland r lan bir tak m nükleik asit ba lama faktörlerine homojili 781 aminoasitlik pozitif yüklü 86 kda a rl nda bir protein olarak bilinmektedir. Bu nükleik asit ba lama faktörlerine örnek verilirse; a-) 52 kda Ro/SS-A ribonükleoprotein, b-) interferon-indirgen transkripsiyonel regülatör staf 50 ve rpt-1, c-) IL-2 nin murine down regülatörüdür ( Chae et al., 2000). Pirin proteinin yap s nda ekzon 2den ekzon 10 a kadar uzanan bir tak m motifler içermektedir. Bu yer alan motifler : a- bzip transkripsiyon faktörü, ekson 2 ye lokalize olmu ana domain (Chae et.al., 2000). Amino asit (human mol.gen, 1998)

30 30 b- Ekson 3 de B-kutu çinko parmak (Chae et al., 2000). Bunun bir çe it protein-protein etkile im domain i oldu u dü ünülmektedir (Schultz et al., 1998). Amino asit (human mol.gen.1998). c- Ekson 3 ve 4 de 2 nükleer lokalizasyon sinyalleri, bu sinyallerden biri Robbins/Dingwall konsensusudur (Chae et al., 2000) Amino Asit ve (human mol.gen.1998). d- Bir -helikal bölge, ekson 3 ve 8 e kadar uzanan bu -helikal bölge bir coiled-coil konfigürasyonu olarak da kabul edilmektedir (Chae et al., 2000). Amino Asit (human mol.gen.1998). e- C terminal domain de yer alan ekson 10 u saran B30.2/SPRY /rfp domaini gibi çe itli adland rmalar almaktad r (Chae et al., 2000) Amino Asit (human mol.gen.1998). MEFV mutasyonlar n n büyük bir ço unlu u ekson 10 da yer almaktad r (Chae et al., 2000). Pirin proteinin ematize görünümü a a da verilmi tir.

31 31 NH 2 E148Q PYR N PROTE N M694I M694V K695R M680I V726A A744S R761H 774 COOH b-zip bölgesi B30.2 bölgesi B kutusu Alfa sarmal bölge Nükleer yer sinyali Fonksiyonlar DNA ile etkile im Protein-protein veya protein-dna etkile imi Nükleusa transport Bilinmiyor ekil 1.7 Pirin in domainleri ve fonksiyonlar (Centola et al., 1998). ekil 1.7 de görülen 8 mutasyonun 7 si B30.2 domain ine lokalize olmu tur (Centola et al., 1998). Pirin in C ucundaki rfp/b30.2/spry domaini ilginçtir. Çünkü FMF mutasyonlar n n en a r ekli bu domain de yer almaktad r (Schaner and Gumucio, 2005). B30.2 domaini nin varl pirinin potansiyel bir protein-protein etkile imini gerçekle tirebilir. Pirin ve rpt1 (regülatör protein T lenfosit 1) aras nda %23 kadar büyük bir homoloji bulunmu. rpt1 de gen ekspresyonunu gerçekle tiren interlökin-2 reseptörünün down regülatörüdür (Chetrit and Levy, 1998). B30.2 domain in de birtak m proteinler gözlenir ve

32 32 bunlar nükleus içersinde faaliyet gösteren pirini potansiyel bir proteinlerdir. Bunlar n aras nda interferon-inducible transkripsiyon regülatörü olan Staf 50, su keleri embriyosunda lampbrush kromozomlar n ba layan bir protein olan PwA33 ve Ksenopus embriyosunda bir nükleer fosfoprotein olan xnf7dir. MID1 bir transkripsiyon faktörü saptand. Bu proteinin mutasyonlar Opitz G/BBB sendromuna sebep olmaktad r. Ribonükleoprotein olan Ro52/SS-A sjören sendromu ve Sistemik Lupus Eritematozus (SLE) da otoantijeniktir (Samuel, 1998). Bunun birlikte B30.2 domainli di er proteinler nükleus içinde faaliyet göstermezler. Salg lanan bir molekül olan butirofilin gö üs epitel hücrelerinden d ar süt proteinlerinin ta n m n gerçekle tirmektedir. Ba ka bir B30.2 proteini stonustoksin in ve altbirimleri kayabal zehirinin öldürücü bir substitueenti olarak salg lanmaktad r. Homomultimerizasyon, nükleer translokasyon ve subnükleer hedef gibi 3 aktivite bu proteinlerin birkaç nda ortakt r. Coiled-coil domain protein dimerizasyonuna arac l k etmektedir. Pirin de bir bzip domain yer almaktad r. Bunun bir çe it protein-protein etkile im domain i oldu u dü ünülmektedir (Centola et al., 1998). MEFV geninin klonlan m oldu u s rada pirin in N-terminal k sm özgün bir yap gibi gözükmekteydi. Bu bölgeye homoloji gösteren karakteristik proteinler mevcut de ildi. Ancak yak n zamanlarda çe itli proteinlerin, pirin in N- terminal k sm na benzerlik gösteren bir sekans domain ini içerdikleri saptanm t r (Richards et al., 2001). Bu domain bir pirin doma i (PYD) (Bertin and Distefano, 2000), DAPIN domain i (Staub et al., 2001) yada PAAD domain i (Pawlowski et al., 2001) olarak adland r lm t r. Dolay s yla Pirin, PyD içeren proteinler ailesinin bir üyesi dir; ve bu proteinlerin apoptosis te, enflamasyonda ve do u tan immunitede i lev gösterdikleri dü ünülmü tür. Pirin N-terminal domain i arac l yla apoptosis le ili kili zerrecik benzeri bir protein (ASC) olan bir CARD proteiniyle etkile ime girmektedir (Richards et al., 2001). Bu protein,

33 33 Pirin in N-terminal k sm n ve CARD n C(karboksi) terminal k s mlar n kapsayan 2 parçal bir proteindir (Masumoto et al., 1999). Bu ASC proteini tek ba na yada makromoleküler komplekslerde, birbirleriyle ili kili CARD-CARD etkile imleri arac l yla caspase-1 in (IL-1 converting enzimin) oligomerizasyonunu ve proenflamatuar otokatalizini indüklemektedir (Srinivasa et al., 2002). Pirin, bir fare makrofaj hücre kültüründe IL-1 beta aktivasyonunu inhibe etmekte ve tam uzunluktaki pirin de in vitro ko ullarda ASC ile caspase-1!in etkile imini inhibe etmektedir (Chae et al., 2003). Pirin transfekte edilmi hücrelerde ASC ye ba ml apoptosisi ve NF-kappa B aktivasyonunu engellemektedir (Masumoto et al., 1999). Üstelik pirin in dallanm bir formunu eksprese eden fareler, caspase-1 ve IL-1 beta aktivasyonu ve makrofaj apoptosis inin IL-1 den ba ms z bir ekilde bozulmas ile karakterize, artm bir enflamatuar yan t sergilemektedirler (Chae et al., 2003). Mutasyona u ram pirin in neden oldu u, bir taraftan bask lanamay p ortama ç kan proinflamatuar moleküller, di er taraftan inhibe edilmeyen lökosit apoptosis i, akut ataklar sorumlu tutulmaktad r (Tunca ve Özdo an, 2003). Ancak unu önemle belirtmek gerekir ki söz konusu denemelerde hastal kla ili kili olan ve hemen hemen tümü proteinin c-terminal k sm üzerinde yerle mi bulunan mutasyonlar, defekt proteinle elde edilen sonuçlar her zaman için modifiye etmemektedir ( Chae et al., 2003) Klinik Özellikleri Ailesel Akdeniz Ate i, esas olarak çocukluk ça hastal d r ve hastalar n %90 nda ikayetler 20 ya nda ba lar (Kastner, 1998). FMF semptomlar hastalar n yakla k %50 sinde ya am n ilk on y l nda ba larken sadece %5 inde 30 ya ndan sonra hastal k ortaya ç kmaktad r

34 34 (Chetrit and Levy, 1998). Hastal n semptomatik oldu u dönem atak olarak adland r l r (Örün ve Yalç nkaya, 2003). Ailesel Akdeniz Ate i (FMF) kar n, gö üs ve eklem a r s n n ve i li inin e lik etti i tekrarlayan ate nöbetleri ile karakterize bir genetik hastal kt r. FMF in yayg n belirtilerinin s kl klar ekil 1.8 de gösterilmi tir.

35 ekil 1.8 FMF de gözlenen klinik belirtilerin spektrumu (Schultz et al.,1998). 35

36 36 FMF in tipik ata 1-4 gün kadar süren ate ve serositi içerir. Hastalar atak aras nda kendilerini tamamen iyi hissederler ve bu özellik tan için önemlidir. Ataklar n s kl, haftada birden her 3-4 ayda bire de i ebilmektedir. Ataklar n iddeti ve s kl genellikle ya ilerledikçe azal r (Chetrit and Levy, 1998). Ate her akut ata n bir özelli idir (Chetrit and Levy, 1998). Ate atak s ras nda genellikle C olup 12 saat 3 gün sürer. Ate her FMF ata na e lik etmeyebilir. Hafif geçen ataklarda ve kol isin kullanan hastalarda ate fark edilmeyebilir (Örün ve Yalç nkaya, 2003). Kar n a r s olarak kar m za ç kan akut peritonit en s k görülen semptomlar dan biridir. Kar n a r s iddetlidir ve genellikle hastalar yata a hapsetmektedir. Hastalar kar n a r s boyunca ishal ve kab zl ktan ikayet edebilirler (Özen, 2003). Baz ataklar o kadar a r l olur ki hasta ya da ailesi tibbi yard m iste inde bulunur. Özellikle a r abdominal ataklar akut apendisit i taklit edilebilir ve bu nedenle baz hastalar gereksiz apendisit ameliyat geçirebilirler (Chetrit and Levy, 1998). Hastalar n %50 sinde artrit bulunmaktad r. Artrit genellikle monoartrit ve oligoartritdir. Artrit asimetriktir. Ayak bile i ve diz, artrit için en çok yayg n bölgelerdir ( Özen, 2003). FMF de artrit in 3 ekli vard r. -Asimetrik, zarar vermeyen artrit (%75), ataklar genellikle k sa sürelidir ve hastal k ortaya ç kmadan aniden ataklar ba lar. Bir veya iki eklem büyük efüzyom ile i meye ba lar (Chetrit and Levy, 1998). En çok etkilenen eklemler; diz, ayak bile i ve el bile idir. Tutulan eklem oldukca i ve k zar k görünümlüdür Bu durumlar hastal n karar verilmesinde yeterlidir (Kasapçopur ve Ar soy, 2006).

37 37 -Kronik zararl artrit, sakroilit içerir (%2-5), burada en çok etkilenen eklemler; kalça ve dizdir. Kal c hasarlar ya uzun sürmü olan ataklardan veya k sa süreli tekrar eden ataklardan meydana gelebilir. Sakroilit çok nadirdir. (Chetrit and Levy, 1998). - Seyyar poliartrit, akut römatik ate e benzer. Romatizmal ate ve FMF ayn ya grubunda ve ayn populasyon gruplar nda görüldükleri için, romatizmal ate olgular n n yanl l kla FMF tan s almas (ve tam tersi) mümkün gözükmektedir (Chetrit and Levy, 1998). ekil 1.9 Ailesel Akdeniz Ate i nde diz artritinin görünümü (kasapçopur ve ar soy, 2006). Ataklar esnas nda iddetli kas a r s genellikle kollarda ve bacaklarda gözlenmektedir. Nadir olarak da ayak taban nda da gözlenmektedir. Kas a r s ataklar 3 haftadan fazla sürebilir.

38 38 Ailesel Akdeniz ate inde plöreziye ba l olu an gö üs a r s s kl %25-80 olarak bildirilmektedir (Chetrit and Levy, 1998). Gö üs a r s genellikle tek tarafl d r. Yan a r s, s rt ya da gö üs a r s eklinde ortaya ç kar. A r n n iddetinde hasta yeterince derin nefes alamayabilir Baz hastalarda gö üs a r s ataklar na perikardit tablosu neden olabilir. Perikardit FMF li hastalar n %0,5 inde raporlanm t r (Knees et al., 1997). Ailesel Akdeniz ate inin en karakteristik cilt lezyonu erizipel benzeri eritemdir. S kl %3-46 olarak bildirilmektedir (Sohar et al., 1967). Lezyon genellikle baca n ön yüzünde, ayak bile inde veya ayak s rt nda pembe-mor renkli, ciltten hafif kabar k ekil 1.10 da görülen eritem eklindedir. Lezyonun bulundu u cilt bölgesi gergin ve ödemli olabilir, s art görülmeyebilir. Genellikle 2-3 gün içinde kendili inden geriler (Chetrit and Levy, 1998). ekil 1.10 Ailesel Akdeniz Ate i nde erizipeli yans layan eritem ve vaskülitik döküntü (Kasapçobur ve Ar soy, 2006)

39 39 Ailesel Akdeniz Ate i nin seyri s ras nda belirgin olarak artm s kl kta vaskülitlere rastland yap lan ara t rmalar ile gösterilmi tir. Ailesel Akdeniz Ate i nde en s k görülen vaskülit Henoch Schönlein purpuras d r (HSP). Buradaki ilginç olan noktalardan birisi HSP geçiren hastalar iyi sorguland klar nda birço unda AAA oldu u ortaya ç kmaktad r. Normal topluma göre AAA da artm s kl kta görülen di er bir vaskülit tablosu ise poliarteritis nodoza d r. Poliarteritis nodoza ço unlukla hastal n seyri s ras nda ortaya ç kmaktad r. Bu olgularda perirenal hematoma s k rastlanmaktad r. Çocukluk ve gençlik ça lar nda ortaya ç kan PAN da AAA mutlaka sorgulanmal d r (Özdo an vb, 1997). Ailesel Akdeniz Ate i nde saptanan bir di er vaskülitik tablo ise uzam febril miyaljidir (Langevitz et al., 1992). Avrupa ülkelerinde romatoid artrit reakif amiloidozlar n en s k nedeni olarak bildirilirken ülkemizde romatoid artritten çok Ailevi Akdeniz Ate i reaktif amiloidozun en s k nedeni olarak bildirilmektedir (Karakoç vb, 1999). Ailesel Akdeniz Ate i nin en önemli ve klinik gidi ini belirleyen komplikasyonu amiloidozdur. Ailesel Akdeniz Ate i nde olu an ikincil amiloidoz AA tipindedir. AA tipinde amiloidozun öncü proteini akut faz reaktanlar ndan serum amiloid A d r. Ailesel Akdeniz Ate i ne ikincil olarak olu an amiloidozun s kl ülkeden ülkeye farkl l k göstermektedir. Ülkemizde amiloidoz s kl eski yay nlarda % 60 lara varan oranlarda bildirilmi olmakla birlikte bunun gerçek s kl yans tmad, nefroloji kliniklerinin gözlemlerine dayand için yan lt c olarak yüksek bulundu u dü ünülmektedir. Bu oran n yeni serilerde, kol isin kullanmayanlarda %20-25 civar nda oldu u bildirilmektedir. Düzenli kol isin kullananlarda ise amiloidoz geli memektedir. Ailesel Akdeniz Ate i nde olu an amiloidozun nöbet say s, tipi ve iddeti ile

40 40 ili kisi bulunmamaktad r. Yap lan gen çal malar ile amiloidozun en s k homozigot M694V mutasyonunda ortaya ç kt gösterilmi tir (Kasapçopur ve Ar soy, 2006). Ailesel Akdeniz Ate i ne ikincil olarak görülen amiloidozda klinik tablonun iki farkl ekilde ortaya ç kt öne sürülmektedir. Fenotip I, bilinen ataklardan sonra amiloidozun ortaya ç kt tablodur. Varl tart lan Fenotip II ise, ailesinde AAA olan bireylerde tipik ataklar olmaks z n hastal n amiloidoz ile ba lad tablodur. Amiloidozda tan yöntemi olarak renal ya da rektal biyopsi kullan lmaktad r. Kol isin tedavisi alt nda amiloidozun geli medi i ve hatta geriledi i bildirilmektedir. Amiloidozlu hastalar n klini i, proteinürik, nefrotik ve üremik dönem olmak üzere üç bölümde ilerlemektedir. Amiloidozlu hastalara kronik böbrek yetersizli i döneminde tedavi amaçl böbrek aktar m yap labilmekte ve kol isin de i tirilmi böbre i ikincil amiloidozdan korumaktad r. Ailesel Akdeniz Ate i nin gidi i s ras nda nadir olarak glomerülonefrit gibi amiloidoz d böbrek patolojileri de görülebilmektedir (Medicine, 2005). Yap lan çal malarda hastal n klinik özelliklerinin farkl etnik gruplarda önemli farklar göstermedi ini belirlemi tir (Çizelge 1.2). Ancak Türklerde hastal n daha a r seyretti i ve amiloid geli me riskinin daha yüksek oldu u çe itli yay nlarda vurgulanm t r (Örün ve Yalç nkaya, 2003).

41 41 Çizelge 1.2 Etnik Gruplara göre klinik özellikleri (Örün ve Yalç nkaya, 2003) Laboratuvar Bulgular Hastal n tan koydurtucu ve özgün olan bir laboratuar verisi bulunmamaktad r. Atak s ras nda akut faz proteinlerinde belirgin yükselme olmakta ve ataks z dönemde ya normale dönmekte ya da ataklar n üçte ikisinde normale dönmese de anlaml dü ü görülmektedir. C reaktif protein atak döneminde hastalar n tümünde yükselmekte, çökme h z %90' nda, fibrinojen %60' nda artmakta ve lökositoz ise hastalar n %50'sinde ortaya ç kmaktad r. Ataklarda trombositoz görülmemekte ve ferritin düzeyleri artmamaktad r. Atak s ras nda geçici albüminüri ve hematürilere rastlanabilmektedir (Özdo an, 2003).

42 FMF de Klinik Tan ve Tan sal Kriterler Bugün için, FMF tan s esas itibariyle klini e dayan r. Vakalar n ço unda klinik tablo tipiktir ve tan kolayd r. FMF de tan kriterleri baz hastalarda tan y kolayla t rabilir. Y llar boyunca ki isel veya kurumsal tecrübeye dayanan bir çok kriter setleri geli tirilmi tir. Fakat bunlar vaka-kontrol de erlendirmelerine veya istatistik metodlar na dayanmaz. Livneh ve arkada lar geli tirdikleri kriterlerin %99 sensitivite %99 spesifitesi oldu unu, ba ka baz setlerin sensitivitesinin %60 kadar dü ük oldu unu iddia etmektedirler (Çizelge 1.3) (Livneh et al., 2000). Çizelge 1.3 Livneh ve Arkada lar n n FMF Tan Kriterleri (Livneh et al., 2000).

43 Fenotip-Genotip Korelasyonu FMF (Ailesel Akdeniz Ate i) in iddeti de i ik derecelerde gözlenebilmektedir. Hastalar n bir k sm ayda birkaç kez atak geçirirken, baz hastalar ise sadece y lda birkaç kez atak geçirirler. Ayr ca, de i ik zamanlarda FMF hastalar ve ayn hastalar içinde bile klinik özelliklerinde farkl l klar olabilir. Y llar önce, amilodozisin oran ve hastal n iddetinin boyutunda çe itli etnik gruplar aras nda farkl l klar gözlenmi tir. Kuzey Afrika kökenli Yahudiler, Irak kökenli Yahudilerde daha iddetli FMF hastal na sahiptirler. MEFV genin izolasyonu ve FMF hastal na sebep olan mutasyonlar n saptanmas fenotip-genotip korelasyonun ara t r lmas için bir yol aç lm t r. Gerçekten, Kuzey Afrika kökenli FMF hastalar n n ço u M694V mutasyonu ta yorken, Irak kökenli Yahudiler daha çok V726A ve di er mutasyonlar ta maktad r. Bu sonuçlar, M694V mutasyonun yer almas amiloidozisin iddetli olmas ve mutasyonun hastal n iddetiyle ba lant s n n olup olmad n ara t rmaya yöneltmi tir (Ben-Chetrit and Levy, 2001). Her iki konsorsiyum da M694V homozigot mutasyonlu FMF hastalar, V726A mutasyonunu ta yan FMF hastalar ndan daha a r bir hastal k gösterirler ve M694V homozigot mutasyonlu hastalar amiloidozisin geli imine e ilimlidir. V726A mutasyonlu hastalarda önceki çal malarda amilodoizis gerçekle memekte oldu u belirtilirken, di er taraftan V726A mutasyonu amilodoizise kar koruyucu bir etki ile hafif hastal a sebep olan bir dizi de i ikli i olarak gözlenir ( Ben-Chetrit, 2001). E148Q mutasyonu hafif bir hastal k olarak nitelendirilir.

44 44 lk iki geni kapsaml Türk çal mas nda M694V homozigot mutasyonu ve amiloidozis aras nda bir ba lant olmad ispatlanm t. Halbu ki son zamanlardaki çal malarda FMF li Türk hastalar aras nda bir amiloidozis ile bir ba lant oldu u gösterilmi. FMF li hastalar n fenotipik özellikleri sadece MEFV mutasyonlar taraf ndan saptamada gözlenmemi tir. Cinsiyet ve serum amiloid A1 in (SAA) genotipi / geni amiloidoizisin geli imi için di er bir risk faktörü olarak dü ünülmektedir.(önen, 2006). Amilodoizisin serum amiloid A1 in (SAA) / genotipinin bulunmas durumunda di er SAA genotipli hastalarla kar la t r lan FMF hastalar nda böbrek amiloidozisin riski yedikat art rmaktad r. Bu ili ki M694V homozigot mutasyonlu hastalarda son derece belirgindir. Üstelik erkek hastalarda geli en amiloidozis kad n hastalardan dört kat daha yüksek riske sahiptirler. Bu ili ki M694V homozigot mutasyon olmayan hastalarda yag nd r ve SAA1 allel varyasyonlar ndan ba ms zd r. Amilodoizosin duyarl l genetik kökenli olan cinsiyet ve SAA geninden etkilenmektedir. Bu genetik kökenli SAA gen ve cinsiyet birbirlerinden ba ms zd rlar. Baz ara t rmac lar amiloidozisin geli iminde çevresel faktörlerinde rol oynayabildi ini ileri sürmü lerdir. Yap lan çal mada M694V homozigot mutasyonlu hastalarda yer alan A9 Major histokimyasal kompleks s n f I zincir ba lant l gen A di er a r hastal klarla da ba lant s vard r. Di er bir ifadeyle; MICA A4 ün bulunmas, ayn genotipli hastalarda FMF ataklar n n daha az s kl kta görülmesine neden olmu tur. MICA ilk çal malarda yeni genetik modifiye edici olarak tan mlanm t r ve benzer mutasyon ta yan FMF hastalar n n klinik özelliklerindeki de i imi k smi olarak ayd nlatabilir (Ben-Chetrit, 2001).

45 Tedavi Hastal n tek bir tedavisi vard r: ömür boyu proflaktik olarak kullan lmas gereken KOL S N. Kol isin oldukça zehirli bir alkoloiddir. Kol isin çi dem bitkisinden elde edilmektedir.kol isinin moleküler formülü C 22 H 25 NO 6 d r. Kimyasal ad N-[(7S)-5,6,7,9-tetrahydro- 1,2,3,10-tetramethoxy-9-oxobenzo[a]heptalen-7-yl)acetamide] dir (Budavari, 1989). ekil 1.11 Kol isinin kimyasal yap s (Budavari, 1989) y l nda e zamanl olarak S.E. Goldfinger ve E. Özkan, farkl dergilerde kol isinin sürekli kullan lmas halinde AAA ataklar n ortadan kald rd n bildirmi lerdir. Daha sonra yap lan çal malarla da amiloidoz geli mesini engelledi i gösterilmi tir. Çocuklarda 1 mg/gün, eri kinlerde ise mg/gün dozlar nda kullan lmaktad r. Hastalar n yar s nda ataklar tamamen ortadan

46 46 kalkarken, %40-45 kadar nda atak say s ve iddeti anlaml olarak azal r. Hastaya ve aileye ilac n, yak nma olsun olmas n sürekli olarak kullan lmas n n ne kadar ya amsal oldu u mutlaka anlat lmal d r (Özdo an, 2003). Kol isin tedavisinin FMF hastalar için güvenli ve uygun bir tedavi oldu u bilinmektedir. Kol isinin bebek üzerinde zararl bir etkisi gösterilmemi olmakla birlikte, hamile FMF hastalar na amniyosentez yap lmas (bebe in içinde bulundu u su kesesinden örnek al nmas ) ve fetüsün genetik incelemesinin yap lmas önerilmektedir. lac n en s k görülen yan etkisi ishaldir. Bazen tedaviye ara vermeyi gerektirecek kadar fazla olabilir. O zaman ufak doz ile ba lay p yava yava artt rmak gerekir. Ayr ca bulant, kusma, nadiren lökopeni ve trombopeni yapabilir. Atak ba lad ktan sonra verilen hiçbir a r kesicinin yarar olmamaktad r. Ayr ca atak s ras nda kol isin dozunun artt r lmas da atak süresini k saltmamaktad r. Temel amaç ataklar n gelmesini engellemektir. Y lda 2-3 kez tam kan say m ve idrar tahlili ile hasta izlenmelidir. Erken tan ve do ru tedavi ile bu hastalar tamamen normal bir ya am sürebilirler (Özkaya ve Yalç nkaya, 2003) Kol isinin Etki Mekanizmas Kol isinin sa lad yarar, hastal n gidi inde ortaya ç kan inflamatuar sürecin basamaklar üzerine olan etkisinden kaynaklanmaktad r. Pirin in hemen hemen sadece nötrofillerde eksprese edildi inin ke fi, kol isinin esas olarak nötrofillerde konsantre olmas ara t rmac lar kol isin in nötrofil fonksiyonlar üzerine olan etkilerini ara t rmaya itmi tir. Yap lan çal malarda kol isin, makrofajlar n TNFalfa üretmesini inhibe etti i gibi, makrofajlar n ve endotel hücrelerinin

47 47 TNF-alfa reseptör ekspresyonunu da bozdu u gösterilmi tir. Ayr ca, LTB4 olu umunu engelleyerek inflamasyon alan na lökosit migrasyonunu engelledi i, COX-2 ve prostonoid sentezini de bloke ederek, inflamasyonun ilerlemesini azaltt, nötrofilin vasküler endotele yap mas n engelledi i gösterilmi tir. Koli isin in nötrofil fonksiyonlar n etkilemek için gerekli dozundan 1000 kez dü ük bir dozu nötrofilin endotele yap mas engelleyebilir. Daha yükesek dozlar nda, kol isin lökositlerin yüzey ekspresyonunu veya lökositlerdeki L- selektin i etkileyerek, nötrofil yöneli ini, vasküler geçi e izin vermeyecek engeller. Tedavi dozu ile ula labilecek daha yüksek dozlar nda kol isin ba ka antienflamatuar etkiler de gösterebilmektedir. (fozfolipaz A2 inhibisyonu, lökosit lizozomal enzim salg lar n azaltmave fagozitozu ask lama gibi). Mikrotubuller sistem, inflamasyonun çok erken faz nda, i lev üstlenmektedir. Ata n ilerledi i ve geli ti i evrelerde önemi azalmaktad r. Kol isin in mikrotubuller proteinleri (tubulin ve P-Glikoprotein) ile olan il kisinin anla lmas, farmakolojik ve farmokinetik etkilerini ö renmemize yard mc olmu tur. Tubulin, mikrotubuller sistemin temel proteini olup, hücre transportunda ve bölünmesinde ba rolü üstlenir. Kol isin, mikrotubul sisteminin çal ma h z n etkilemez, ancak beta tubulini ba lay p, tubulin-kol isin kompleksi yaratarak etkisini gösterir ( Yair Molad, 2002). Kol isin in farmakolojik etkisi, tubuline birebir moleküler ba lant yaparak onun polimerizasyonunu inhibe etmesine dayan r. Bu ba lanma ile olu an kompleksin saat gibi çok uzun bir yar ömrü oldu u saptanm t r. Kol isin serum albumine %40 l k doymam bir ba lanma gösterirken di er proteinlere ihmal edilebilir düzeyde bir ba lanma % si vard r. FMF hastalar üzerine yap lan çal malar total kol isin in %36-56 kadar n n serbest kald n ortaya koymu tur. Eritrositlerin kol isini depolama özelli i bulunur. Buna kar l k lökositlerin ilac yakalam oran dü üktür. Lökositler için vücudun derin bir kol isn mikro deposudur tan m

48 48 yap lm t r. Otopsi çal malar nda doku yo unlu u aç s ndan ilac n, kalp, Karaci er, böbrek, beyin ve dalakta daha yo un depoland, ya dokusunda saptanamad bildirilmi tir. Gebelerde yap lan nadir çal malarda, plasentay geçebildi i, yenido an kordon kan nda saptanabildi i yaz lm t r. lac n metabolizmas nda karaci er enzimlerinin ön planda bulundu u ve safra yolu ile ekstrekte edildi i bilgisi mevcuttur. lac n %74 nün karaci er yolu ile at ld bildirilmi tir (Chappey, 1995). 1.2 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); uzun çift iplikli bir DNA molekülü içinden 100 ile 600 baz içeren k sa DNA dizisinin logaritmik amplifikasyonuna izin veren bir tekniktir. Bu yöntem; Kaliforniya da Dr. Kary Banks Mullis taraf ndan 1980 lerde ke fedildi. Kary Banks Mullis PCR n ke fi ile kimyan n Nobel ödülünü alm t r (McPherson, M.J 2000). Bu yöntemde ço alt lmas (replikasyon) istenen DNA örne i, replikasyon için gereken maddelerle birlikte bir tüpe konarak, üç de i ik s da bir döngü (siklus) içerisinde tutulur. lk basamak DNA n n denatürasyonudur C'ye s t lan DNA' n n iki zinciri birbirinden ayr l r (denatürasyon). kinci basamak ba lanmad r (yap ma = annealing). Ortama konmu ve sadece ço alt lmak istenen DNA bölgesine özgül iki primer, s cakl n (50-70 C' ye) dü ürülmesiyle, ilk basamakta ayr lm olan kal p DNA n n özgül olduklar bölgelerine ba lan rlar. Üçüncü basamak primerlerin uzamas d r (sentez = extension). Ortama konmu ve optimum sentez s cakl C olan Thermus aquaticus (Taq) polimeraz (ya da s ya dayan kl ba ka polimerazlar) bu s da hedef DNA ya yap m primerlerin 3 ucundan ba layarak istenen DNA bölgesinin sentezini yapar. Bu tekrarlan nda

49 49 iki primer aras nda kalan üç basamak bir döngüyü olu turur ve her özgül DNA parças ço alt larak iki kat na ç kar lm olur. Yeni sentezlenen DNA da bir sonraki döngüde kal p olarak kullan l r ve bu DNA parçalar geometrik olarak artar. Teoride özgül DNA parças ; siklus say s (n) ve ba lang çtaki hedef say s na (t) ba l olarak yakla k tx2 n say s nan ula r. Hedef say s, enzim, dntp, primer konsantrasyonu ve ço alt lan bölgenin birikmesi gibi nedenlerle ürün miktar formüldeki say ya ula maz. Fakat yinede milyonlarca kopyal k çok yüksek yo unlu a ula an hedef DNA molekülünün PCR sonras agaroz jel elektroforezi gibi bir yöntemle gösterilmesi oldukça kolayd r ( ekil 1.12) (Mikael, 2006). ekil 1.12 PCR s cakl k döngüsü:(1) Çift iplikli DNA n n ayr lmas için s cakl k yakla k olarak 95 0 C ye yükseltilmi tir,(2) Primerin ba lanmas na izin verilmesi için s cakl k dü ürülmü tür,(3) s cakl k 72 0 C ye ayarlanarak polimeraz primerin uzamas sa lar (Mikael, 2006).

50 Real-Time PCR Real-time PCR DNA n n ço alt m n ve ürünlerini tek bir tüpte belirlemeyi mümkün k lan çok yak n bir zamanda uygulamaya konulan popüler bir metotdur (Gibson et al., 1996). Gen anlat m n n analizini de istiren bu metot ile geleneksel PCR yöntemi ve gen analizi birlestirilmistir. PCR ço alt m n görünür hale getiren ve monitorize edebilen floresan isaretli prob ve boyalar n kullan ld, floresan n olusan DNA ile do ru orant l olarak artt bir ço altma yöntemidir. Birçok isimlendirilme yap lan bu teknoloji yabanc yay nlarda kinetik PCR, homojen PCR, kantitatif Real-time PCR gibi çesitli adlarla da isimlendirilmektedir (Bustin, 2000). Biyolojik örneklerden elde edilen DNA n n kopya say s n say sal de erlere dönüstürme ve mrna n n düzeyini say sal olarak belirleyebilme en çok kullan lan alanlar n olusturmaktad r. Bu amaçlarla kullan m n n yan s ra tek nokta mutasyonlar n belirleme, patojen belirleme, DNA hasar belirleme, metilasyon tespiti, SNP analizi, kromozom bozukluklar n n tespiti gibi çal smalarda da kullan m alanlar mevcuttur (Kubista et al., 2006). Bugün birçok arast rma ve tan laboratuarlar nda kullan lan real-time PCR cihazlar mevcuttur.bu cihazlar birbirlerinden reaksiyon say s kapasiteleri, eksitasyon-emisyon dalga boylar ndaki farkl l klar, h zlar ve kanal say lar ile ayr l rlar. Ticari olarak sat lanlar; Stratagene M x 3000p, M x 3005p ve M x 4000, Applied Biosystems 7300 ve 7500, Chromo4, Smart Cycler, Rotor- Gene, LightCycler en fazla kullan lanlard r (Kubista et al., 2001).

51 Floresans Boyalar Nükleik asit amplifikasyonu ile e zamanl olarak art gösteren floresans sinyalin ölçülmesiyle k sa sürede kantitatif sonuç verebilen PCR yöntemidir (Nordgard et al., 2006). Bunu spesifik kimyasallar ve enstrümentalleri sayesinde ba armaktad r. Genellikle, kimyasallar PCR da yeralan özel floresans problar bulunur. EtBr veya SYBR green I gibi DNA ba layan boyalar, hidroliz proplar ( 5 nükleaz problar ), hibridizasyon problar, moleküler i aretleyiciler, peptid nükleik asit (PNA) ayd nlatma problar n içeren problar n birtak m tipleri mevcuttur (Valesek and Repa, 2005) Tagman Prob TagMan prob yöntemi Double-Dye Oligonucleotide, dual labeled prob veya 5' nuclease prob olarak da adland r lmaktad r. TagMan prob yöntemi ço alt lmak istenilen DNA ya komplementer olan ve floresan isaretlenmis tek zincirli bir prob içerir. Floresan isaretli probun 5' ucunda fluorophore (6-karboksifloresin= 6-FAM) ve 3 ucunda quencher (6- karboksitetrametil-rodamin= TAMRA). 3 uçtaki bas lay c TAMRA boyas 5' uçtaki FAM boyas boyas n n sinyal olusturmas n engellemektedir. Prob hedef DNA ya ba lanma durumunda bile floresan sinyal ölçümü düsüktür. Ço alt lma s ras nda hedef nükleik asit dizisi üzerinde primerler ba lanma bölgeleri aras nda Taq Man problar ba lan rlar. Primerlerin ba lanmas n n ard ndan yeni zincir olusmaya baslar. Probun ba l oldu u bölgeye gelindi inde Taq DNA polimeraz enzimi 5' 3 nükleaz aktivitesi ile FAM probdan ay r r. Serbest hale geçen FAM sinyal olusturur. DNA zincir sentezi uzamaya devam eder. Her bir döngüde ürün ço al m artt kça floresanda

52 52 ona ba l olarak artmaya devam eder (Sekil 1.13) (Cacherill and Uhl, 2001). TagMan prob yönteminde mutasyon tespiti ile birlikte say sal de erlere de ulas labildi indenarast r c lar için avantaj sa lar. Bu yöntem standart bir protokolü ve kolay bir dizayn ve çok az bir optimizasyonla gerçeklesti i için hem allelik diskriminasyon hem de ekspresyon profilinin ç kart lmas nda kolayl kla kullan l r (Gut et al.,1999). ekil 1.13 Taqman Probu (Bustin and Mueller, 2005).

53 Moleküler Boncuk Yöntemi Moleküler boncuk yöntemi hem yap s hem de çal ma prensibi ile TagMan prob ve SYBR Green I yönteminden çok farkl d r. Saç tokas eklindeki yap n n yuvarlak uç k sm ço alt lacak DNA ile komplementer tek zincirli DNA dizisini içerir. Bu yap n n düz olan uç k s mlar nda 2 adet florokrom boya içermektedir. Bunlardan bask lay c florofor di er boyan n floresans n engeller. Moleküler boncuk probu solüsyon içerisinde serbest halde iken ma yapmaz. Ço alt lmak istenilen DNA bölgesi PCR ile ço almaya ba lad nda prob hedef DNA dizisine göre dizayn edildi inden birbirleri ile kar la t klar nda konformasyonu de i ir ve düz, çift zincirli hale geçer. Çünkü bu yap termodinamik olarak saç tokas eklinden daha kararl d r. Moleküler boncuk hedef nükleik asit dizisi ile hibridize olur olmaz boncuk molekülünün yap s de i ti inden ve boyalarda birbirlerinden uzakla t ndan floresan miktar artar. Bu teknikte olusan floresan n ölçümüne dayanmaktad r ( ekil 1.14) (Tyogi and Kramer, 1996).

54 54 ekil 1.14 Moleküler boncuk yöntemi (Tyogi and Kramer, 1996). Moleküler boncuk yönteminin en fazla kullan ld alanlar; genetik tarama, SNP çal malar, farmakogenetik çal malard r. Bu yöntemde prob dizayn çok önemlidir ve optimal artlar sa lanmad nda özellikle uygun s cakl k bulunamam sa probun saç tokas eklindeki yap s de i meyece inden ortamda hedef DNA dizisi bulunsa bile floresan ma elde edilemeyebilir (Tyogi and Kramer, 1996).

55 Hibridizasyon Prob Yöntemi Bu yöntem Roche taraf ndan LightCycler PCR cihaz nda kullan lmak üzere geli tirilmi tir (Wittwer et al., 1997). ki farkl prob dizayn edilmi tir. 3 ucunda floresans i aretli boya (donor), 5' ucunda al c boya (acceptor) bulunmaktad r. PCR reaksiyonu s ras nda bu iki prob hedef nükleik asit dizisine ba lan p birbirine yakla t nda bir enerji yay l m olur (FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer). Enerji donor boyadan acceptor boyaya transfer olur. Bu enerji transferi sonucunda olu an floresans miktar PCR süresince olusan ürün miktar ile do ru olarak artar (Sekil1.15) (Chaplin et al., 1999). ekil 1.15 Hibridizasyon prob yöntemi

56 Sybr Green I Spesifik olmayan çift zincirli DNA n n ço alt m nda SYBR Green I yöntemi kullan l r. Bu yöntemde kullan lan floresan boya sadece çift zincirli DNA ya ba land ndan ço alan DNA miktar ndaki art a paralel olarak real-time PCR cihaz nda okunan floresan n miktar da e zamanl olarak artar. SYBR Green I en fazla kullan lan boya çe itidir ve 497 nm dalga boyunda yükseltgenir ve 520 nm dalga boyunda indirgenir. Çift sarmal DNA n n küçük olu una ba lanan boya 30 amplifikasyon döngüsü sonras yaln zca aktivitesinin % 6 s n kaybeder ( ekil 1.16 ) (Kubista et al., 2006) Sekil 1.16 SYBR Green I in kimyasal yap s (Kubista et al., 2006).

57 57 Ço alt m n ba nda reaksiyon kar m nda çift zincirli DNA molekülü, primerler ve SYBR Green I boyas bulunmaktad r. Ba l olmayan serbest DNA molekülü çok az bir floresan ma yapar. Primerler ba lan p uzama ba lad nda boya molekülü çift zincirli DNA n n aras na girer ve floresan yay l m ba lar. Baslang çtaki döngü boyunca sinyal zay ft r; ürün miktar artt kça floresan miktar h zla artar ve bu art real-time cihaz n n monitöründen izlenebilir (Kubista et al., 2006). Bu yöntem optimize edilmi PCR artlar nda ve dizayn iyi yap lm primerler ile çok fazla say da hedef genin ço alt lmas na olanak verir. Floresan i aretli problara ihtiyaç göstermedi i için maliyeti ucuzdur. Bunun yan s ra yöntemin dezavantajlar da vard r. stenmeyen PCR ürünlerin ço almas ile yine floresan aç a ç kaca ndan her zaman istedi imiz DNA n n ço ald n i aret etmez yanl pozitif sonuç almak mümkündür. Ortamda hedef DNA dizisi olmad nda primerlerin birbiri ile ba lanmalar sonucunda primer dimer leri olarak adland r lan ve çift zincirli DNA bölgelerinin olusumu ile floresan ma gözlenebilir. Ço alt lan DNA n n istenilen hedef bölge olup olmad n anlayabilmek için DNA lar n erime e risi analizleri ( melting curve, dissociation ) yap lmas gerekmektedir. Erime e risi analizi yap lmak istendi inde cihaz PCR tüplerini yava ça s tmaya ba lar. Çift zincirli DNA birbirinden ayr lmaya ba lad nda (melting temperature= Tm) floresan boya serbest kal r ve okunan floresan miktar da dü er. Her bir DNA n n belirli bir erime s cakl (Tm) derecesi vard r. Bu erime s cakl ço alan DNA parçalar n n uzunlu una ve içerdi i GC/AT oran na ba l d r. Spesifik olmayan ürünlerin ço almas nda (primer dimer lerinde) arad m z DNA parças n n Tm derecesi aras nda farkl l k olacakt r. Tm derecesinin farkl olmas her ürünün kendine özgü uzunlu u ve gen dizisi içermesindendir. Bu yüzden Tm s cakl her ürün için özeldir. Ço unlukla bu yöntemle bilinmeyen iki DNA dizisi kars last r lmak

58 58 istendi inde yöntem güvenilir bir ekilde kullan labilir (Sekil1.17) (van der Velden et al., 2003). ekil 1.17 SYBR Green I metodu

59 Gerekli Donan m RT-PCR n gerçekle tirilmesi ve sonras ndaki analizler için u araçlara ihtiyaç duyulmaktad r. Bunlar, veri eldesi ve analizi için sofware; floresans eksitasyon ve emisyon koleksiyonu için optik; bir bilgisayar ve termal döngü yü sa layan bir donan m olarak özetlenebilir. Çe itli firmalardan temin edilen bu makineler birbirinden farkl d rlar. Örne in; baz firmalar n cihazlar 96 platelik standart format nda iken, baz lar nda daha az örnek içeren plateler bulunur. Yada cam kapiller tüplere gereksinim duymaktad rlar. Ayr ca baz lar lazer kullan rken baz lar da ayarlanabilen filtreli geni spektrum k kayna kullanmaktad rlar (Hongbao et al., 2006 ). ekil 1.18 Real-Time PCR donan m. Örnekler, pcr n her döngüsünde gerekli s cakl kontrol eden termocycler a yerle tirilir. Bu örneklereksitasyon enerjisine maruz b rak l r ve meydana gelen floresans fotodedektör ile ölçülmektedir (Valasek and Repa, 2005).

60 mrna Kantitasyonun Önemi Hayatta kalma, büyüme ve farkl la ma ile ilgili olan hücresel kararlar, gen ekspresyonu ve transkripsiyon seviyelerindeki (de i ik durumlar ) de i imleri yans t r ki; gen ekspresyonu ve transkripsiyon seviyesinin belirlenmesi gen fonksiyonu ile ilgili olan çal malarda her zaman temel olu tururlar (Zamorano et. al 1996). Son zamanlarda moleküler t ptaki gereksinimler, klinik tan larda RNA seviyelerinin kantitatif olarak ölçülebildi i tekniklerin kullan mlar n artt rm t r. Bu tür uygulamalar n tümör hücrelerinde ilaç markerlar n n ekspresyonu ve regülasyonun belirlenmesi (Ramachandran and Melnick 1999), kemoterapiye olan cevab n izlenmesi (Desjardin et al., 1999), teropötikleri ifreleyen genlerin transkripsiyonunun ve biyoda l m n n ölçülmesi (fairman et al., 1999), tümör a amas n n moleküler olarak de erlendirilmesi (bustin and dorudi, 1998), kanser hastalar nda tümör hücrelerinin sirkülasyonunun belirlenmesi (Ghossein and Rosai, 1996), bakteriyel (Hill, 1996) ve viral patojenlerin saptanmas gibi oldukça geni kullan m alanlar vard r (Holodniy, 1994). Transkripsiyonun kantitikasyonu için 4 temel metod vard r. 1-Northern Blotting 2- n Situ Hibridizasyon 3- RNAase Protection Assay 4-RT-PCR Be inci bir metod da cdna array leridir. Fakat bu yöntem pahal olmas nedeniyle kullan mlar hala s n rl d r. Northern analizi; sadece mrna n n büyüklü ü (boyutu), alternatif splicing ve RNA örneklerinin

61 61 bütünlü ü hakk nda bilgi verebilen yöntemdir. RNAase protection Assay; transkriptin ba lama ve sonlanma bölgelerinin ekson-intron s n rlar n n haritalanmas, benzer büyüklü e sahip olan ve bu nedenle northern blot yönteminde ayn bölgelere göç edecek olan mrna örneklerinin ayr m n n yap lmas için kullan lan en faydal yöntemdir. n Situ Hibridizasyon; bütün yöntemlerin içinde en kompleks olan d r fakat doku içindeki spesifik hücrelerde transkriptin lokalizasyonunun belirlenmesine olanak sa layan tek yöntemdir. Bu üç yöntemin temel k s tlamas ise bunlar n nispeten dü ük duyarl l a sahip olmamalar d r. RT-PCR; belirli bir RNA dizisinin in vitro ko ullarda, enzimatik olarak amplifikasyonuna dayanan ve ayn deneyde çok küçük örnek miktarlar yla bir hücredeki farkl örneklerin analizine olanak sa layan bir yöntemdir. Bu yöntem dü ük duyarl, oldukça esnek ve en kullan l kantifikasyon yöntemidir ve farkl örnek populasyonlar nda mrna seviyelerinin kar la t r lmas, mrna ekspresyon örneklerinin karakterize edilmesi, birbirleri ile yak ndan ili kili (benzer) olan mrna lar n ayr mlar n n yap lmas ve RNA yap s n n analizinde kullan labilir. RT-PCR ayr ca, zaman alan, teknik olarak i gücü gerektiren yöntemlerde maksimum duyarl l k üzerine odakland r lmas daha kompleks prosedürlerin geli tirilmesinde olanak sa lam t r. Semi nested, nested ve 3 a amal nested RT_PCR teknikleri duyarl l artt rm lard r fakat reaksiyonun spesifitesini tehlikeye sokmaktad r. Bu yöntemler, kontaminasyon ve yanl pozitif sonuçlar n elde edilmesi olas l n art rd klar gibi gerçek, uygun olmayan, dü ük seviyedeki transkripsiyonun ay rt edilmesine imkan vermemektedirler (Bustin, 2000).

62 Real-Time PCR avantajlar RT-PCR kompleks bir yöntemdir ve reaksiyona kat lan bütün fiziksel ve kimyasal bile enler birbirleriyle etkile im içindedirler. Bunlar; reaksiyonun spesifitesi, duyarl l, ço alt labilirli i veya do rulu u optimize edilirken göz önünde bulundurulmas ve dikkatli olunmas gerekmektedir. RT-PCR n ba ar l bir performans göstermesi denemenin temel amac n n iyi bir ekilde anla lmas na ba l d r. Klinik tan uygulamalar nda; spesifite, duyarl l k ve ço alabilirlik (üretilebilirlik) en önemli kantitatif karakteristikleridir. Buna kar l k e er çal man n amac mutasyon analizi, klonlama veya ekspresyon ise do ruluk önemli bir kriter olacakt r. RNA, PCR için bir kal p görevi görmez bu nedenle RT-PCR denemelerinde birinci a ama RNA kal b n n reverse transkripsiyon ile cdna ya dönü türülmesidir. Daha sonra bu cdna, PCR ile amplifiye edilir. Bu yöntemde genellikle RNA ve DNA ba ml DNA polimerazlar kullan l r, reaksiyonlar ayr ayr (2 enzim/2 tüp) veya tek (2 enzim/1 tüp) olacak ekilde haz rlanabilir. RT ve PCR a amalar n n ayr olarak yap lmas elde edilen kararl cdna n n uzun süre saklanabilmesi bak m ndan avantaj sa lar. Alternatif olarak, hem RNA hem de DNA ba ml DNA polimeraz gibi fonksiyon gösterebilen tek bir polimeraz kullan larak 1 enzim/1 tüp eklinde reaksiyon gerçekle tirilebilir ve böylece zaman problemi ve kontaminasyon riski minimalize edilebilir. (Bustin, 2000).

63 Real-time PCR Uygulama Alanlar Klasik PCR yöntemlerinin uygulanabildi i her durumda Real-Time PCR uygulanabilir. A a daki uygulamalar örnektir: Quantitative Gen ekspresyonu çal malar (mrna sentezi) (qpcr) Viral DNA ve genomic DNA da DNA kopya say lar n n ölçümü. Alleleri ay rma ve SNP genotiplenmesi laç dizayn DNA hasar ölçümleri DNA hasar n n belirlenmesi Mycobacterium tuberculosis ve dirençli türleri Sularda mikrobiyal patojen ara t mas (Honbao et al., 2006).

64 64 2. MATERYAL VE METOD 2.1 Materyal RNA izolasyonu için gerekli kan örnekleri Ege üniversitesi T p fakültesi Çoçuk sa l ve Hastal klar Anabilim Dal Moleküler T p Laboratuar ndan sa land. Kandan RNA izolasyonu için QIAamp RNA Blood Mini Kit, cdna sentezi için Quantitect Reverse Transcription Kit, Real-Time PCR da kullan lmak üzere Quantitec Probe RT-PCR kit QIAGEN GmbH, Germany firmas ndan temin edildi. RT-PCR reaksiyonlar ABI 7700 thermal cycler da gerçekle tirildi. Di er tüm kimyasallar analitik safl kta olup de i ik kaynaklardan sa lanm t r. 2.2 Metod Kan örneklerinin toplanmas Ara t rmam z y llar aras nda gerçekle tirildi. Ege Üniversitesi T p Fakültesi Çocuk Sa l ve Hastal klar Anabilim Dal Moleküler T p Laboratuar na ba vuran 30 hastadan toplanan kan örne inden mutasyon analizi yap ld. Sa l kl, semptomu yada FMF li akrabas olmayan 7 ki i kontrol grubu olarak çal maya al nd. Çal ma

65 65 grubunu olu turan olgulardan EDTA içeren tüpler içerisine 2cc kan örne i al nd. Taze kan örneklerinden RNA izolasyonu yap ld RNA izolasyonu Q agen RNA izolasyon kitinde önerilen i lem ad mlar a a daki s raya göre uyguland. Santrifüj tübüne al nan 1ml tam kan örne i üzerine 5ml EL tamponu eklendi. Buz üzerinde dakika bekletildi ve eritrosit lizizi sa land. 4 0 C 10 dakika 400g de santrifüjlendi ve süpernatant uzakla t r ld. Pellet 2ml EL tamponunda süspanse edildi ve buz üzerinde 5-10 dakika bekletildi. 4 0 C 10 dakika 400g de santrifüjlendi ve süpernatant uzakla t r ld. Pelleti olu turan lökositlerin üzerine 600µl RLT tamponu (1ml sine 10µl -merkaptoetanol eklenerek haz rlanan ) eklendi. Lökosit lizat QIAshredder kolonuna (homojenizasyon kolonu)uyguland ve 4 0 C de 2 dakika rpm de santrifüjlendi. Kolon uzakla t r ld.

66 66 Homojenize edilen lizat n üzerine %70 lik(w/v) etanolden 600µl eklendi ve pellet olu umu gözlendi. Yeni QIAamp spin kolonuna örnek dikkatlice pipetlendi ve 4 0 C de 15 saniye rpm de santrifüjlendi. QIAamp spin kolonu yeni bir 2ml toplama tüpüne al nd ve 700 µl RW1 tamponu eklendi ve 4 0 C de 15 saniye rpm de santrifüjlendi. QIAamp spin kolonu yeni bir 2ml toplama tüpüne al nd ve 500µl RPE tamponu (% etanolle 5 kat seyreltilmi ) eklendi ve 4 0 C de 15 saniye rpm de santrifüjlendi. Ayn kolona 500µl RPE tamponu eklendi ve 4 0 C de rpm de 3 dakika santrifüjlendi. Etanolü uzakla t rmak amac yla kolon 4 0 C de rpm de 1 dakika santrifüjlendi. QIAamp spin kolon steril 1.5ml lik mikrosantrifüj tüplerine aktar ld. 40 µl RNaz içermeyen su QIAamp membran n direk üzerine pipetlendi ve 24 0 C de rpm de 2 dakika santrifüjlendi. zole edilen RNA n n konsantrasyonu nanodrop cihaz kullan larak belirlendi ve izolasyonun hemen ard ndan cdna sentezi gerçekle tirildi. RNA n n geriye kalan k sm C de sakland.

67 cdna sentezi Quantitect Reverse Transcription kiti, izole edilen RNA dan cdna sentezinde kullan ld. Quantitect Reverse Transcription kitinde belirtilen reaksiyon kar m haz rland (Çizelge 2.1 ). Çizelge 2.1: cdna Reaksiyonun ilk basama. B LE ENLER M KTAR gdna8 Wipeout Buffer 7x 2µl Kal p RNA 10µl RNaz içermeyen su 2µl Toplam 14µl Çizelge 2.1 e göre genomik DNA uzakla t r lmas için gerekli kar mlar buz üzerinde haz rland. Ard ndan da 42 C de 2 dakika thermal cycler da 1döngü sürecek ekilde inkübe edildi. Hemen program sonlan r sonlanmaz reaksiyon kar m buz üzerine al nd.

68 68 Çizelge 2.2: cdna reaksiyonun ikinci basama B LE ENLER M KTAR Reverse transkripsiyon Master Mix Quantiscript Reverse Transcriptase 1µl Quantiscript RT Buffer,5x 4µl RT primer mix 1µl cdna reaksiyonun ilk ad m ndan 14µl Toplam 20µl cdna eldesi için gerekli olan bile enleri içeren kar m çizelge2.2 ye göre haz rland. Vortekste hafifçe çalkaland ve spin santrifüj edildi. Reverse transkripsiyon master mix kar m ndan her 0.2 ml PCR tüpüne 6 µl pipetlendi. Daha sonra üzerine cdna reaksiyonun birinci ad m ndaki 14 µl lik reaksiyon kar m pipetlendi ve pipet ucu at lmadan 3-4 kez pipet ile bu cdna kari imi ve RNA kar t r ld. A a da belirtilen programda thermal cycler da cdna reaksiyonu gerçekle tirildi (Çizelge 2.3). Çizelge2.3 : S cakl k Döngüsü Program. SICAKLIK SÜRE DÖNGÜ SAYISI 42 C 30 dakika 1 95 C 3dakika 1

69 cdna PCR Qiagen QuantiTect Reverse Transkripsiyon kitiyle RNA dan cdna sentezi gerçekle tirildi. Daha sonra bu sentezin gerçekle ip gerçekle medi ini ve ortamda herhangi bir genomik DNA n n kal p kalmad n kontrol etmek için a a daki çizelge 2.4 e göre bir PCR reaksiyon kar m haz rland. Çizelge 2.4: cdna PCR protokolü Bile enler Miktar cdna(50ng) 5µl 10x PCR Buffer buffer 2,5µl Gold MgCl 2 (25mM MgCl2) 2,5µl dntp GAPDH Forwar (10µM) 5 GCCTCCTGCACCACCAACTG3 GAPDH Reverse (10µM) 5 CGACGCCTGCTTCACCACCTTCT3 Amplitaq gold(5 U/µl) 0,5µl 2µl 2µl 0,3µl DNAaz-RNAz free su 10.2µl Toplam 25µl

70 Agaroz Jel Elektroforez Çal malar cdna GAPDH primeri kullan larak PCR ile ço alt ld ve PCR ürünleri %2 lik (w/v) agaroz jelde (Sigma Co., S.Louis. MA, USA) elektroforeze tabi tutuldu. Elekroforez i lemi için agarozdan 2gr tart larak 100µl 1xTBE tamponundan (10xTBE Sigma Co., Blue View Nucleic Acid Stain) manyetik kar t r c da boncuklar kullan larak kar t r ld. Bu kar m mikrodalga f r n kullan larak eritildi. Manyetik kari t c üzerinde kar t r larak 60 C ye kadar so utuldu ve üzerine 10µg/ml konsantrasyounda etidyum bromür çözeltisinden (Sigma Co., S.Louis. MA, USA) solüsyonundan 7µl ilave edildi. Bu agaroz solüsyonu önceden haz rlanm elektroforez tank n n (Owl Inc, Heidelberg,Germany) taraklar yerle tirilmi kameras na döküldü ve sertle inceye kadar beklendi. Üzerine 1xTBE tamponu eklendikten sonra taraklar ç kar ld. 2µl cdna, 1µl 1x6 yükleme solüsyonu ve 3µl su ile kar t r larak jele yüklendi. Elektroforez EC 105 cihaz nda (EC Apparatus Co, USA), güç kayna 100Mv-80Ma ko ullar na ayarlanarak dakika süreyle uyguland. Jeldeki cdna, ultraviole transiluminatöründe(vilber Inc, Lourmat France) baz say s bilinen standart DNA mark r (Hae III, Fermentas) ile kar l kl olarak yüklenip, syngene In geneus jel kamera sistemi kullan larak görüntülendi MEFV -HPRT primer ve prob dizini Real-time pcr da kullan lan MEFV - HPRT primer ve prob dizini çizelge 2.5 de verilmi tir.

71 71 Çizelge 2.5: Mefv- Hprt primer ve prob dizini Primer\Prob MEFV-F MEFV-R MEFV-Prob HPRT-F HPRT-R HPRT-Prob Dizi 5 -TTTCTTTGTGGCCTCACTGGAGGA-3 5 -TAGCCCTGTGCAAGATGTCTCCAA-3 5 FAMTGCCAGTCAGAATGGGAACTTCTGCA-3 TAMRA 5 -ATGGACAGGACTGAACGTCTTGCT-3 5 -TTGAGCACACAGAGGGCTACAATG-3 5 FAMATGTGATGAAGGAGATGGGAGGCCAT-3 TAMRA Real-Time PCR Real-Time PCR, FMF li hasta grubu ve sa l kl kontrol olarak ifade edilen gruplar aras ndaki hedef genin (MEFV) mrna miktar ndaki de i imi gözlemek için gerçekle tirildi. Real-Time PCR reaksiyonu için Qiagen firmas ndan temin edilen Quantitect Prob RT-PCR kiti kullan ld ve reaksiyonlar ABI PRISM 7700 cihaz nda gerçekle tirldi. PCR reaksiyonu s ras nda amplifikasyon i lemi gerçekle tikçe TaqMan probdan sal narak serbest kalan FAM boyas n n verdi i floresans Real- Time PCR cihazi tarafindan kaydedilerek her örne in ba lang ç konsantrasyonuna göre vermi oldu u Ct de erleri yine cihaz tarafindan otomatik olarak hesapland. Amplifikasyon ABI PRISM 7700 cihaz n n bilgisayar ndan on-line olarak da izlendi.

72 72 Çizelge 2.6 : MEFV Real-Time PCR Reaksiyon Protokolü Kar m M KTAR Son konsantrasyon 2xQuantiTect Probe RT- PCR Master Mix Forward Primer (10 M) Reverse Primer (10 M) 25µl 1x 1µl 200nM 1µl 200nM Prob (10 M) 1µl 200nM RNase-free water 12µl cdna (10 ng) 10µl 2ng Toplam 50µl Çizelge 2.7: HPRT Real-Time PCR Reaksiyon Protokolü Kar m M KTAR Son konsantrasyon 2xQuantiTect Probe RT- PCR Master Mix Forward Primer (10 M) Reverse Primer (10 M) 25µl 1x 1µl 200nM 1µl 200nM Prob (10 M) 1µl 200nM RNase-free water 12µl cdna (10 ng) 10µl 2ng Toplam 50µl

73 73 Reaksiyon kar mlar n n haz rlanmas nda Çizelge 2.6 ve 2.7 den yararlan ld. Ayn cdna örne i için Çizelge 2.6 ya ve Çizelge 2.7 e göre iki farkl reaksiyon kar m (s ras yla I. ve II.) haz rland. Çizelge 2.6, ekspresyon düzeyi incelenecek olan MEFV geninin; Çizelge 2.7 ise reaksiyonda kontrol amaçl olarak kullan lacak HPRT geninin Real-time PCR da ço alt lmas na ili kin reaksiyon kar mlar n belirtmektedir. I.reaksiyon kar m için MEFV prob seti, II. reaksiyon kar m için HPRT prob seti kullan ld. Her iki kar mda haz r oldu unda. I.kar m (MEFV) 1-30 numaral optik kapakl pcr tüplerinin içerisine 40µl pipetlendi. II. kari im (HPRT) numaral optik kapakl pcr tüplerinin içerisine 40µl pipetlendi nolu optik kapakl pcr tüplerine örnek 1den 30 a kadar 10µl cdna s ras yla pipetlendi nolu optik kapakl pcr tüplerine örnek 1den 30 a kadar 10µl cdna s ras yla pipetlendi. ABI PRISM 7700 e yerle tirildi. A a daki programa göre Real-Time PCR i lemi gerçekle tirildi (Çizelge 2.8). Çizelge 2.8: Real-Time PCR ko ullar

74 De erlendirme Sonuçlar Comperative Ct yöntemi ile hesapland (Yalç n, 2004). Bu yöntemde önce hasta ve kontrol grubu örneklerinin ortalama Ct de erleri hem HPRT hem de MEFV için ayr ayr hesapland. Daha sonra MEFV ortalama de erinden HPRT ortalama de eri ç kar larak ayr ayr hasta ve kontrol gruplar n n Ct (Delta Ct) de erleri hesapland. Daha sonra kontrol grubu Ct de eri hasta grubu Ct de erinden ç kar larak Ct de eri bulundu. Bu de er 2 - Ct formülüne uygulanarak (Yalç n, 2004) hasta grubunun MEFV ekspresyonun kontrol grubuna göre kaç kez artm yada azalm oldu u HPRT gen ekspresyonu internal kontrol olarak kullan larak relatif olarak belirlendi.

75 75 3. SONUÇLAR VE TARTI MA 3.1 RNA zolasyon Sonuçlar Çal mam zda tüm kan örnekleri için Qiagen RNA kan izolasyon metodu kullan ld. RNA konsantrasyonlar Nanodrop spektrofotometri ND 1000 cihaz nda ölçüldü. Elde edilen RNA konsantrasyonlar ng/µl ve A260/A280 oran ise 1,8-2.0 aras nda bulundu ( ekil 1.19). 28S, 18S ve 5S bantlar n n belirgin bir ekilde görülmesi, RNA n n izolasyon s ras nda degradasyona u ramad n göstermektedir S 18S 5S eki1 3.1: RNA n n jel görüntüsü

76 cdna Sentezi Real-time PCR da kal p olarak cdna kullan laca ndan, elde edilen RNA örnekleri cdna sentez kiti (Qiagen, Germany) kullan larak cdna ya dönü türüldü. Bu reaksiyonda RNA, revers transkriptaz enzimi kullan larak komplementer DNA ya çevrildi. PCR ürünleri agaroz jel elektroforezinde görüntülendi. ekil 1.20 de, elektroforez sonucu ilerlemeden kuyucuklarda kalan genomik DNA n n olmamas izolasyonun ba ar s n ve cdna dan hedef bölgenin ço alt lmas da cdna sentezinin gerçekle ti ini göstermektedir ( eki1 3.2) cdna PCR ürünü ekil 1.20: cdna-gapdh pcr jel elektroforezi. 1-8 kuyucukta 328 bp cdna örne i, 9. kuyucukta 100bp DNA ladder, kuyucukta 328 bp cdna örne i, 16 kuyucuk kontrol, 17.kuyucukta 100bp DNA ladder.