MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERDEN DİŞ ELDESİ

T.C. Ege Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Anabilim Dalı MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERDEN DİŞ ELDESİ BİTİRME TEZİ Stj. Dişhekimi Alime ERASLAN Danışman Öğretim Üyesi: Prof. Dr. Güray SAYDAM İZMİR-2013

İÇİNDEKİLER GİRİŞ... 1 1. Genel Bilgiler... 2 1.1. Kök Hücrenin Gelişim Tarihçesi... 3 1.2. Kök Hücre Nedir?... 3 1.3. Kök Hücre Kaynakları... 5 1.3.1. Embriyonik Kök hücreler (EKH)... 5 1.3.1.1. Embriyonik Germ Hücreleri... 5 1.3.1.2.EmbriyonelKarsinoma Hücreleri... 6 1.3.2. Embriyonik Olmayan Hücreler... 6 1.3.2.1. Erişkin Kök Hücreler... 6 1.3.2.2. Hematopoetik Kök Hücreler... 7 1.3.2.3. Kordon Kanı Hücreleri... 7 1.3.2.4. Mezenkimal Kök Hücreler... 8 1.3.3. Organlardaki Kök Hücreler... 8 1.3.3.1. Adiposit Kök Hücresi... 8 1.3.3.2. Kalp Kası Kök Hücresi... 8 1.3.3.3. Nöronal Kök Hücre... 8 1.3.3.4. Epidermal Kök Hücre... 9 1.3.3.5. Sindirim Sistemi Epitel Kök hücresi... 9 1.3.4. Diş Pulpası Kaynaklı Kök Hücreler... 9 1.4. Kök Hücre Nasıl Elde Edilir?... 11 1.5. Kök Hücre Kullanım Alanları Nelerdir?... 11 1.6. Diş Hekimliği Uygulama Alanları ve Gelecekten Beklentileri... 13 ÖZET... 16 KAYNAKLAR... 17 ÖZGEÇMİŞ... 19

GİRİŞ Hücresel ve moleküler biyoteknoloji alanındaki yeni bilimsel gelişmeler, hücre tedavisi, somatik hücre tedavisi ve doku mühendisliği alanları gibi ileri tedavilerin gelişmesini sağlamaktadır. Günümüzde yenileyici (rejeneratif) tıp; hastalıklar, travma, kanser ve doğumsal bozukluklar sonucu hasar gören doku ve organların işlevselliğinin onarılması ve iyileştirilmesi açısından önemli bir yere sahiptir. Yenileyici tıp, medikal tedavileri destekleyen, hücre kombinasyonları, mühendislik materyalleri ve uygun biyokimyasal faktörlerin kullanımı ile biyolojik fonksiyonların yerine getirilmesi ve tedavi edilmesini amaçlayan uygulamaları kapsamaktadır. ABD'de Birleşik Organ Paylaşım Ağı'nın (United Network for Organ Sharing, 2009) verilerine göre 102.500 ve Türkiye'de 2008 Ulusal Organ ve Doku Nakli Koordinasyon (Organ Nakli Koordinatörleri Derneği, 2009) verilerine göre48 bin organ nakli bekleyen hasta olduğu ve bu sayıya her yıl 4-5 bin hastanın eklendiği bilinmektedir. Kök hücre tedavileri, bu hastalar için oldukça umut vericidir. Kök hücreler, uzun zaman dilimleri boyunca bölünebilme, kendilerini yenileyebilme, özelleşmiş hücrelere kaynaklık etme (farklılaşma) ve hasar sinyallerini algılama özellikleriyle vücuttaki diğer vücut hücrelerinden farklı, özelleşmemiş hücrelerdir. Bu hücreler, embriyonik gelişimde ve organların oluşmasında (embriyonik ve fetal kök hücreler) ve hasarlı dokuların tamir edilmesinde (doku/organlarda var olan erişkin kök hücreler) önemli rol oynamaktadır (1). İn situbu özelliklerinin yanında son yıllarda bu hücrelerin kaynaklandıkları doku ve organların dışındaki hücrelere de farklılaşabilme yeteneklerinin (kök hücre plastisitesi) gösterilmiş olması, bu hücrelerin doku mühendisliği ve yenileyici tıp uygulamalarında önemli biyolojik aktörler olmalarını sağlamıştır.

1. GENEL BİLGİLER 1.1 KÖK HÜCRENİN GELİŞİM TARİHÇESİ Tarih boyunca transplantasyon düşüncesi hasara uğramış bir organın fonksiyonlarını restore etmenin, onun yerine yenisini koymaktan daha iyi bir yolu var mıdır? sorusu üzerinde yoğunlaşmış olup sfenksler, deniz kızları ve kantaronlar mitolojide birer zenotransplantasyon örneği olarak yerini almıştır. Mitolojide ateşi Olimpos Dağından, tanrılardan çalarak insanlığa hediye etmesi üzerine Zeus tarafından Kafkas (Kaf) dağında bir kayaya bağlanarak karaciğerinin her gün bir kartal tarafından yenmesi şeklinde bir cezaya çarptırılan Prometheus un karaciğeri her gün kendisini yenilemektedir. Bu, karaciğer hücresinin rejenerasyon yeteneği ve dolayısı ile kök hücre kavramını ortaya koyan ilk hikayedir (2). Bugünün kök hücre tedavisi üzerine dünyada belki de ilk çalışmaları yapan, insan ömrünü uzatmanın yolunun, doğum sonrası atılan plasentalarda, kordon hücrelerinde olduğunu söyleyen araştırmacı Prof. Dr. Süreyya Tahsin Aygün dür. 1950-1960 lı yıllarda kendisi hayvanlarda fetalgreftler ve kordon kanı greftler ile çeşitli hastalıkların tedavisinde araştırmalar yapmış ve almanca tıp dergilerinde yayınlamıştır. İlk olarak 1967 yılında tanımlanan embriyonel karsinoma hücrelerinin kültür ortamında çoğaltılması da bu alanda ileri doğru atılmış önemli bir adımdır ve o zamandan beri insan ve fare ter-atokarsinomlarından çok sayıda hücre serisi tanımlanmıştır. Bu hücrelerinin diferansiyasyonu embryoid cisimcikler olarak adlandırılan embriyo-benzeri oluşumların meydana gelmesiyle sonuçlanan hücre agregasyonu ile gelişir. Söz konusu embriyoid cisimcikler ilk olarak, embriyonal karsinomlu farelerin asit sıvılarında gözlenmiştir. Bu hücrelerin gelişimsel biyologlar için de önemli bir model oluşturdukları, çünkü in-vitrodiferansiyasyon paternlerinin, embriyogenezin çeşitli yönlerini açıkladığı ve üç germ tabakasının tümünü temsil edici hücrelerinin oluşumu ile sonuçlandığı görülmektedir (2). 2

Aynı zamanda döneminde; in vitro fertilizasyon kliniklerinden alınan fazla embriyolar kullanılarak insan embriyonik kök hücrelerinin üretilmesine yönelik çalışmalar da başlamıştır. Bu çalışmalar başlangıçta başarısız olmuş ancak preimplantasyon blastosistlerinden izole edilen hücrelerde diferansiyasyonu incelemek için yapılan bir teşebbüste tavşan embiyo hücreleri kültür ortamına getirilebilmiştir. 1998 de ilk insan embriyonik kök hücreleri kültüre edilebilmiştir. Aynı zaman diliminde, insan primordial germ hücrelerinden embriyonik germ elde edilmiştir. Bu kök hücrelerinin gelecekte hastalık tedavisi için kullanılabilecek olması büyük bir heyecan oluştururken, henüz çözümlenmemiş etik sorunlar ciddi bir direnç oluşturmuştur. Bu hücrelere karşı gösterilen etik reaksiyonlar sonucu, erişkin kök hücreleri ile ilgili çalışmalar da yoğunlaşmış ve bu hücrelerin belirgin plastisiteleri kemik iliğinden kas, beynin kana çevrilmesi, kanın beyne çevrilmesi gibi başlıkların görülmesine neden olmuştur. Bu ilk çalışmalardan sonra erişkin ve embriyonik kök hücrelerle ilgili çok sayıda yayın ortaya çıkmıştır. Bunların hepsi aynı amacı taşımaktadır: kök hücre esaslı tedavi (2). 1.2 KÖK HÜCRE NEDİR? Kök hücreler, canlılarda "kendilerini yenileyebilme", "sürekli bölünebilme ve "farklılaşma (plastisite)" kabiliyetleri bulunan hücreler olarak tanımlanmaktadır (3). Bu hücreler, uygun sinyallerle karşılaşmadıkları sürece, dokulara özgü işlevsellik kazanmamış (özelleşmemiş) ve farklılaşmamış hücrelerdir. Kök hücreler, yenilenebilme yeteneklerini, organizmanın yaşamı boyunca sürdürebilmektedir. Kök hücreler, in vitro koşullarda çoğaltılabilmelerinin yanı sıra özel biyolojik sinyallerin etkisiyle, kaynaklandıkları öncül hücrelerden farklı özelleşmiş hücrelere de farklılaşabilmektedirler (4). Leipzig'de 2001 yılında toplanan Doku Kök Hücreleri Çalışma Grubu kök hücreleri "bir dokuya ait kök hücre, fonksiyonel olarak farklılaşmamış ve potansiyel olarak heterojen hücrelerdir" şeklinde tanımlamıştır. Bir hücreyi, kök hücre olarak tanımlamak için beş gerekli ölçüt vardır (5): 1. Kök hücreler, uzun zaman dilimleri boyunca bölünebilme ve kendilerini yenileyebilme yeteneğine sahiptirler. Hücrelerin bölünme yeteneklerini (yaşam sürelerini) belirleyen faktörlerden biri, doğrusal kromozomların ucunda yer 3

alanve " telomer " adı verilen DNA zincirleridir. Telomerler doğrusal kromozomların uçlarıdır ve binlerce kez tekrarlanan kısa DNA tekrar dizileri (insanda TTAGGG) içerirler. Telomerler, kromozom uçlarının parçalanmasını ve dağılmasını ya da diğer kromozomlarla kaynaşmasını engelleyerek, kromozomların yapısal bütünlüğünün korunmasını sağlamaktadır. ancak her çoğalmada hücre döngüsü esnasında ve oksidatif DNA hasarlanması nedeniyle kromozom kısalmaktadır. Normal bir hücrenin her bölünüşünde telomer uzunluğu 100 baz çifti kadar kısalmaktadır. Telomeraz enzimi, sayısız tekrar dizilerini kromozomun 3' ucuna takarak kromozomun kısalmasın engellemektedir. Somatik hücrelerde, birçok bölünmeden sonra telomerde ciddi aşınmalar meydana gelmekte ve hücreler bölünme hücrelerde belirlenen telomeraz aktivitesinin, bu hücrelerin sınırsız bir şekilde kendilerini yenileyebilme kapasitesinden sorumlu olduğu düşünülmektedir. Benzer şekilde mezenkimal kök hücrelerde de, telomerleri sabit bir uzunlukta tutmaya yetecek seviyelerde telomeraz üretimi gerçekleşmektedir. Kök hücreler, özelleşmemiş hücrelerdir. Bir kök hücrenin temel özelliklerinden biri de, bu hücrenin özelleşmiş işlevleri yerine getirebilecek herhangi bir dokuya özgün yapıya sahip olmayışıdır. Kök hücrelerin özelleşmiş hücrelere kaynaklık etme yetenekleri "plastisite (farklılaşma)" olarak adlandırılmaktadır. Kök hücreler, somatik üç germ yaprağına doğru gösterdikleri farklılaşma yetenekleri açısından "totipotent","pluripotent" ve "multipotent" olarak sınıflandırılmaktadır. 2. Totipotent hücreler, zigot evresindeki, 8 hücrelik blastomer evresindeki sınırsız farklılaşma yeteneğine sahip hücrelerdir. Totipotent özelliği bilinen tek kök hücre tipi, embriyonun gelişim sürecinde organizmayı oluşturan tüm doku ve hücre çeşitlerine farklılaşma kapasitesine sahip, fertilize yumurta hücresidir. Bu hücreler, embriyon ve embriyon dışı membran ve organların kaynağını oluşturmaktadır (5). Pluripotent hücreler, mezodermal (kemik, kas, kan, kıkırdak vb), ektodermal (nöron, deri, saç vb) ve endodermal (hepatositler, pankreatik beta hücreleri, sindirim sistemi hücreleri) hücrelere farklılaşma göstermekte buna karşılık multipotent kök hücreler tek bir germ yaprağına ait hücrelere farklılaşabilmektedir. Pluripotent kök hücrelerin vücuttaki farklılaşmış bütün hücretiplerini oluşturabilme potansiyeline sahip "gerçek kök hücreler" olduğu belirtilmektedir (6). Erişkin bireylerin dokularında varolan, multipotent kök hücreler ise, kültür koşullarında çok miktarda çoğaltılabilmekte ve organizmada, gerçekleşen doku ve organ hasarlarında, ilgili 4

dokuların hücrelerine farklılaşarak tamirin gerçekleşmesini sağlamaktadır. Mulipotent kök hücreler, EKH'lerle karşılaştırıldığında sınırlı bir farklılaşma yeteneğine sahiptirler (5). 3. Kök hücreler, hasarlı organların tedavisi amacıyla gerçekleştirilen nakillerde, kaynak dokunun işlevsel olarak tekrar çoğaltabilmesine olanak sağlamaktadır. 4. Kök hücreler, in vivo koşullarda doku hasarının gerçekleşmediği durumlarda bile farklılaşmış diğer hücrelere katkı sağlamaktadır. (5). 1.3. KÖK HÜCRE KAYNAKLARI 1.3.1. Embriyonik kök hücreler (EKH) Blastosist evresindeki embriyonun iç hücre kitlesinden elde edilen pluripotent hücrelerdir. Vücuttaki herhangi bir farklılaşmış hücreyi oluşturma yeteneğindedirler. EKH'ler, çekirdeği çıkartılmış bir ovumla kaynaştırılarak elde edilmiş olan (klonlanmış) bir embriyodan da elde edilebilir. Embriyonik kök hücreden elde edilen hücre kümeleri embriyoid cisimcikler olarak adlandırılmaktadır. Bunlar plasenta dışında, ektoderm, mezoderm ve endoderm tabakalarından köken alan çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilir. Embriyonik kök hücreler, hücre yüzey belirteçleri olarak Oct- 4, SSEA-1, TRA1-60, TRA1-81eksprese ederler. İnsan embriyonik kök hücreleri, fare embriyonik Fibroblast hücreleri ve "Leukemia Inhibitory Factor"-LIF varlığında bu özelliklerini korumaktadır. EKH'lerin farklılaşmadan kendini yenileyebilmesi için birçok faktörün dengede olması gerekmektedir. EKH farklılaşmasının yönlendirilmesi amacıyla, kültür ortamına çeşitli büyüme faktörleri ve sitokinler eklenerek, farklı destek hücreleri kullanılarak ve gen aktarımı ile çalışmalar yapılmaktadır. Sox-2, Oct-4 ve Nano pluripotent embriyonik kök hücre fenotipini devamlılığının sağlanmasında önemli transkripsiyon faktörleridir. EKH'lerin tedavide kullanımında en önemli faktör farklılaşmanın istenilen yönde kontrol edilmesidir, ancak etik sorunlar nedeniyle EKH kullanımı yasaklanmıştır (7). 1.3.1.1.Embriyonik germ hücreleri (EGH) :Primordiyalgerm hücrelerinden köken alan pluripotent kök hücrelerdir. 5-9 haftalık fetusun gonadal kıvrım ve mezenter bölgesindeki primordiyal germ hücrelerinin kültürü ile elde edilmişlerdir. 5

Primordiyal germ hücreleri, geç embriyonik ile erken fetal gelişim sırasında somatik seriden ayrılan erişkin gametlerin öncü hücreleridir. İlk olarak farede gözlenen embriyonik germ hücreleri, insanlarda da gösterilmiştir. Pluripotent kök hücreler olarak, uzun süre farklılaşmadan kendini yenileyebilir ve invitro her üç germ tabakasındaki hücreler ve daha az farklanmış progenitör ve öncü hücreler içeren embriyoid cisimleri oluşturabilir. İnvivo deneysel olarak transplantasyonu takiben teratokarsinoma oluşumunu tetiklemektedir. Germ hücrelerinin diabetes, ürolojik ve nörolojik sorunlarda tıbbi tedavide kullanılması için çalışmalar yapılmaktadır (7). 1.3.1.2.Embriyonal Karsinoma Hücreleri: Embriyonal karsinoma hücreleri, teratokarsinom olarak adlandırılan germ hücre tümörlerinde bulunan kök hücrelerdir. Teratokarsinomların, öncü germ hücrelerin malign transformasyonundan kaynaklandığı düşünülmektedir. Embriyonik kök ve embriyonal karsinoma hücreleri transkripsiyon faktörleri Sox2 ve Oct-3/4 ile ilişkilidir. Sox2:Oct-3/4 hedef geni oranındaki küçük değişiklikler kök hücrelerin farklılaşmasını değiştirebilmektedir. 17 İnsanda daha sık olarak testis tümörlerinde rastlanmaktadır (7). 1.3.2.Embriyonik Olmayan Hücreler 1.3.2.1.Erişkin kök hücreler: Embriyonik kök hücrelere göre gelişmenin daha sonraki basamaklarında görülen bu hücreler, organizmanın yaşamı boyunca daha sınırlı olmakla birlikte kendilerini yenileyebilme özelliğini korurlar. Erişkin dokulardaki öncü ve özelleşmiş hücrelere farklılaşma yeteneğindedirler. Daha çok elde edildikleri dokuya dönüşme potansiyelleri vardır ve multipotent kök hücrelerdir. Bu hücrelerin, vücut dışında embriyonik kök hücreler kadar uzun süre özelliklerini koruyarak çoğalma yetenekleri yoktur. Kişinin immun sistemine uyum gösterirler, ancak tüm hücre tiplerine dönüşemedikleri için kullanımları sınırlıdır, teratokarsinoma oluşturmazlar. Günümüzde, erişkin kök hücrelerin diğer organ ve dokulara farklılaşması yönünde çalışmalar yapılmaktadır. Organizmada ancak belirli birkaç hücre türüne dönüşebilen erişkin kök hücreleri, laboratuvar koşullarında gerekli ortam ve sinyaller sağlandığında birçok farklı hücre türüne dönüşebilmektedirler. 6

1.3.2.2.Hematopoetik kök hücreler (HKH): Üzerinde en çok çalışılan ve tedavide yaygın olarak kullanılan erişkin kök hücrelerdir. 1 Kendi kendine yenileyebilme ve bütün matür kan hücrelerine farklılaşabilme özellikleri vardır. Kemik iliği, periferik kan, kordon kanı ve fetal karaciğerden elde edilebilirler. Yüzey belirteçleri başlıca, CD34, CD14, CD45 ve CD133'dür. İntrensek ve ekstrensek sinyaller ile farklılaşmaları düzenlenmektedir. HKH mikro çevresi (niche) tanımlanması ile gelişmenin kök hücre ile çevresi arasındaki etkileşim ile dengede olduğu belirlenmiştir. Son yapılan çalışmalar ile Wnt, Notch, kemik morfojenik protein (BMP), sonichedgehog ve Fibroblast büyüme faktörü'nün HKH hücre farklılaşmasını kontrol ettiği gösterilmiştir. Osteoblastik ve damarsal mikro çevre, HKH'nin çoğalma, farklılaşma, mobilizasyon ve homing gibi davranışlarının düzenlenmesinde önemli rol oynamaktadır. 1.3.2.3.Kordon kanı kök hücreleri: Bebeğin doğumunun ilk yarım saati içerisinde alınan plasenta ve göbek kordon kanı erişkin kök hücreler için önemli bir kaynaktır. Kordon kanı kök hücrelerinin avantajları: genç hücreler olmaları; yaşayabilme yeteneklerinin yüksek olması; fazla sayıda elde edilebilir olmaları ve alıcıya kolay uyum sağlamalarıdır. Göbek kordon kanı, kök hücre kaynağı olarak 1988 yılından beri çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Mobilizasyon ve homing gibi davranışlarının düzenlenmesinde önemli rol oynamaktadır. Dolaşımdaki kök hücreler kemik iliği mikro çevresi ile temasa geçerek, endotel ve adezyon moleküleri aracılığı ile buraya yerleşirler. Kök hücre faktörü kemik iliğinde stromal hücreler tarafından salınır ve HKH üzerindeki c-kit antijenine bağlanır. Kök hücre faktörünün, Interlökin-1(IL-1) IL-3 veya IL-6 ile kombinasyonları HKH'lerin eritroid ve myeloid yönde çoğalmalarını sağlar. Sessiz fazdan çoğalma fazına geçmesi için uyarılar gereklidir. Kültür ortamına eritropoetin, G-CSF, GM-CSF veya M-CSF eklenmesi HKH'lerin myeloid öncü hücrelere farklanmasını sağlar. Normal fizyolojik durumda, HKH ve erişkin kök hücreler, sessiz dönemde uzun süre kalabilirler. Hücre siklus regülatorlerinden, p21 CIP1 ve p18 INK4C'in HKH'lerin sessiz kalmalarını düzenledikleri gösterilmiştir. Sessiz dönemlerinden ayrıldıklarında, kök hücreler intrensek ve ekstrensek uyarıcı sinyallerin etkisine bağlı olarak kendini yeniler ya da progenitör hücreye farklanırlar. Bu sinyaller pozitif ve negatif regülatorler arasındaki "Yin&Yang" balansını oluşturur. 7

1.3.2.4.Mezenkimal kök hücreler (MKH) : Kemik iliğinin stroması içinde yer alan uzantılı fibroblast-benzeri multipotent hücrelerdir. CD73, CD54 (ICAM-1), CD105, CD39, CD49e (a5- integrin) gibi belirteçleri eksprese ederler. Uygun koşullarda, osteojenik, kondrojenik, adipojenik yönde farklılaşabilmektedirler. 20,21 Aynı zamanda fibroblast, iskelet kası hücreleri gibi mezodermal hücreler ile, mezodermal kökenli olmayan endotel, nöroektoderm de dahil olmak üzere çok çeşitli hücresine farklılaştıkları gösterilmiştir. 1.3.3.Organlardaki Kök Hücreler 1.3.3.1.Adiposit kök hücresi: Yağ dokusundan elde edilen pluripotent kök hücrelerin, kemik iliğinden elde edilen kök hücreler kadar farklılaşma yeteneğine sahip olduğu bildirilmektedir. Uygun koşullarda elde edilen adiposit kök hücresi invitro koşullarda adipojenik, kondrojenik, myojenik, ve osteojenik hücreler gibi birçok değişik hücre tiplerine dönüşebileceği gösterilmiştir. Mezenkimal kök hücrelere alternatif olarak, doku mühendisliğinde farklı biyo-materyaller üzerinde farklılaştırılarak çeşitli rejeneratif tedavide kullanımları üzerinde çalışılmaktadır. 1.3.3.2.Kalp kası (kardiyomyosit) kök hücresi: Hasarlı myokardiyumun rejenerasyonunda önemli olan kardiak progenitor hücreler bulunduğu gösterilmiştir. Mezenkimal ve hematopoetik kök hücrelerin ve kahverengi yağ dokusundaki CD133+, c-kit- ve Sca-1-, hücrelerin kardiyomyositlere farklılaştığı bildirilmiştir. 1.3.3.3.Nöronal kök hücre (NKH): Nöralhücreler farklılaşmamış hücreler olarak, sinir sisteminin en az bulunan ve en primordial hücreleridir. Nöronal kök hücrelerin taşıması gereken özellikler şu şekilde belirlenmiştir: (1) Multipotent hücreler olmalı ve sinir sistemi hücrelerinden nöron, astrosit ve oligo dendrositlerin bütün alt tiplerine farklılaşabilmelidir. (2) Sinir sistemi hücre tiplerine farklılaşabilme ve sinir sisteminin dejenere veya hasarlanmış bölgelerinde yeniden çoğalabilme yeteneğinde olmalıdır. (3) Seri olarak transplante edilebilir olmalıdır. (4) Kendi kendini yenileyebilir olmalı, aynı potansiyel ve özellikleri taşıyan yeni hücreler üretebilme yeteneğinde olmalıdır. 8

Multipotentnöronal kök hücreler, santral sinir sisteminin gelişimi boyunca bulunan hücreler olmakla birlikte, erişkinlerde, belirli bölgelerde bulunabilirler. Bir HMG box transkripsiyon faktörü olan, SOX2, farelerde in vivo ve in vitronöral kök/progenitor hücrelerde gösterilmiştir. 1.3.3.4.Epidermal kök hücre: Erişkin derisinde herbir kıl follikülü, kök hücreler içermektedir. Bu hücreler her kıl siklusunda, follikül rejenerasyonunda ve yara iyileşmesi sırasında re-epitelizasyonda önemlidirler. Kendini yenileyen ve multipotent olan kök hücrelerin bir kısmı bazal lamina ile temasını devam ettirirken, diğerleri suprabazal yerleşimlidir. Bu hücreler, kolay elde edilebilmeleri açısından önemli bir kök hücre kaynağı olarak değerlendirilmektedir. Follikülerepitel Sonichedgehog eksprese eden epidermal plakod hücrelerinden köken almaktadır. 1.3.3.5.Sindirim sistemi epitel kök hücresi: Organizmanın yaşamı boyunca kök hücrelerden köken alan farklılaşmamış epitel hücreleri sindirim sisteminde hızlı hücre yenilenmesini sağlarlar. Epitel hücre yenilenmesi; epitel ve bağ dokusu arasındaki hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matriks etkileşiminin sıkı bir kontrolü altındadır. 31 Özellikle kök hücre etrafındaki mikro çevre "niche" bu kontrolde çok önemlidir ve sindirim sisteminde görülen birçok hastalık ve kanser gelişiminde önemli rol oynamaktadır. Sindirim sistemi epitelinin yenilenmesinde rol oynayan önemli faktörler: Wnt/T-hücre faktörü-katenin (TCF/beta-catenin), Notch, Sonichedgehog (Shh)/kemik morfogenik protein (bone morphogenetic protein-bmp) sinyal yolaklarıdır (7). 1.3.4.Diş Pulpası Kaynaklı Kök Hücreler (DP-KH) Embriyonik dönemde, diş tabakasının gelişimi ektodermden kaynaklanmaktadır. Ektodermal yapı diş germlerini oluştururken, nöral kabartı hücreleri diş organı, diş papillası ve diş folikülüne farklılaşmaktadır. Bu nedenle, diş pulpası ektodermal kaynaklı nöral kabartı hücrelerini de kapsayan mezenkimal bileşenler içermektedir (8). Diş pulpasının damarları çevresindeki (perivasküler) yatakta yeralan ve "diş pulpası kök hücreleri (DP-KH)" olarak adlandırılan hücre populasyonunun MKH 9

oldukları düşünülmektedir. Bu hücreler, yüksek proliferasyon gösterebilen, klonlanabilen ve yüksek plastisite yeneteneğine sahip multipotent hücrelerdir. 90'lı yılların ortalarında, diş pulpasından öncül hücrelerin elde edildiği bildirilmiştir. Daha sonra, diş MKH'lerinin, gömük yirmi yaş diş pulpasından da elde edildiği belirtilmiştir. DP-KH'lerin izolasyonu ve tanımlanması, ilk olarak 2000 yılında Gronthos ve ekibi tarafından gerçekleştirilmiş ve aynı ekip tarafından, bu hücrelerin odontoblastik, adipojenik ve nöral hücre tiplerine farklılaşması gösterilmiştir. Pulpa dokusundan kök hücrelerin izolasyonu oldukça etkili şekilde gerçekleştirilebilmektedir. DP-KH'lerin kemik iliği kökenli kök hücrelerden, hücre döngüsü ile ilişkili genleri eksprese etmeleri nedeni ile ayırt edilebildiği belirtilmektedir. Bu sonuçlar, DP-KH'lerin MKH'ler ile karşılaştırıldığında yüksek proliferasyon hızına sahip olduğuna ilişkin bulgular ile uyumluluk göstermektedir. DP-KH'lerin kolay izole edilebilmesi ve daha yüksek bir proliferasyon hızı göstermeleri, bu hücreleri Kİ-MKH'lerden üstün kılmaktadır. Diş kök hücreleri, damarların çevresinde lokalize olmaktadır ve kök hücre belirteci Stro-1'i eksprese etmektedir (9). DP-KH'lerin başlıca farklılaşma potansiyeli dentin ya da diş kökünü saran bağ doku ile ilişkili hücrelerin oluşumunda etkili olmaktadır. Bu kök hücreler pulpa, dişi çevreleyen bağ dokusu ya da diş folikülünden köken almaktadır. Diş dokularındaki kök hücrelerin farklı kaynaklardan elde edilebilmesi mümkündür; diş epiteli, diş çıkıntısı (papilla), dişi çevreleyen bağ doku, diş folikülü. Diş epitelinden elde edilen kök hücreler (ektodermal kök hücreler) dışındaki, diş kök hücrelerinin tümü, nöralkabartı kaynaklı ektomezenkimal hücrelerdir. Bu kök hücreler, dentin ve diş dokularının gelişiminde gelişim ve hücresel farklılaşma süreçlerine katılmaktadır. (10). DP-KH'lerin gen ekspresyonlarının belirlenmesi ve bu genlerin fonksiyonel sınıflandırılmasının gerçekleştirilmesi ile bu hücrelerin alkalin fosfataz, dentin matriks proteini-1, dentin siyalo fosfoprotein ekspresyonları gösterilmiştir. Gen ekspresyon analizleri, eksprese edilen genlerin çoğunun ekstrasellüle rmatriks bileşenleri, büyüme faktörleri ve hücre adezyon moleküllerini kodladığını ortaya koymuştur. Gen ekspresyon düzeyleri, hücre sinyalleri, hücresel etkileşimler ve hücre metabolizmasını düzenleyici etki göstermektedir. 10

DP-KH ve Kİ-MKH'lerin gen ekspresyonları karşılaştırıldığında, çok az farklılık gözlenmektedir. DP-KH'lerde, hücre siklusu aktivatörüsiklin-bağımlı kinaz- 6 yüksek oranda eksprese edilmektedir. Bu yüksek ekspresyon DP-KH'lerin neden daha yüksek bir proliferasyona sahip olduklarını açıklamaktadır (11). 1.4.KÖK HÜCRE NASIL ELDE EDİLİR? MKH insanda genellikle süperior iliak kanattan alınan kemik iliği aspiratından elde edilir.ancak femoral ve tibial medullar kısımlarından ve toraksik ve lombervertebralardan da elde edilebilirler. Büyük hayvanlarda benzer bölgelerden alınırken kemirgenlerde daha çok tibia ve femurmid-diafizinden alınır. Kemik iliğinden alde edilen çekirdekli hücrelerin genç erişkin dönemde 1/10,000,erişkinde 1/250,000 i ve 80 yaşından sonrada 1/2000,000 i ancak MKH dir. Heperinize edilmiş enjektöre alınan kemik iliği aspiratı serum fizyolojik ya da PBS (phosphatebufferedsaline)ile seyreltilerek fikoldan sitegradiyent yöntemi ile mononüklear hücre ayrımı yapılır. Fikolsüpernatantından ayrılan hücre çökeltisi %20-30 FBS (FetalBovine Serum) içeren DMEM (dulbecco s Modified Eagle s Medium) besiyerinde süspanse edilir. Hücre kültür flasklarından 48-72 saat 37 C sıcaklıkta, %5 CO2 içeren humidifiyein kübitörlerde inkübe edilir. Bu süre sonunda süpernatant ve plastiğe yapışmayan hücreler aspire edilerek uzaklaştırılır. Geriye kalan plastiğe yapışmış hücreler kültüre edilmeye devam edilir. Hücreler flask tabanının %75'ini kaplayınca tripsinasyon işlemi yapılarak yapışan hücrelerin tabandan ayrılması sağlanır. Daha sonra hücreler bölünerek taze besiyerlerine ekilir. Ortalama 2-6 pasaj sonra yeterli sayıda hücre elde edilmiş olur. Kullanıma hazır hale gelen hücreler daha sonra çalışılmak üzere dondurularak -80 C ile -196 C de saklanır. 1.5.KÖK HÜCRE KULLANIM ALANLARI NELERDİR? KH araştırmaları, temel ve klinik bilimler çatısı altında yer alan birçok alanda yürütülmektedir. Bilim adamlarının KH'lere ilgi duymalarının başlıca nedenlerinden biri, totipotentlik ve plastisite niteliklerini açıklayarak embriyonik gelişim dönemine ışık tutmaktır. Bu niteliklerin düzenlenmesinde görevli genlerin ve hücre 11

farklılaşmasını öncüleyen yönlendirmenin moleküler düzeneklerinin belirlenmesi, KH araştırmalarından temel biyolojik bilimlere sağlanacak yararlar arasında başlıcalarıdır. Farklılaşma sürecindeki hataların, doğumsal kusurlar ve ilerleyen dönemde kanser gibi ciddi hastalıkların gelişiminde belirleyici olduğu bilinmektedir. Bunu etkileyen moleküler düzeneklerin açıklanması, yeni sağaltım seçeneklerini de ortaya koyabilecektir. KH'lerden hayvanlarda insana özgü hastalıkların modellerinin oluşturulmasında yararlanmak, hedef kullanım alanlarından biridir. Embriyonik hücre çalışmalarına ilişkin sonuçların çoğunun elde edildiği fare embriyonik KH'lerinde, mutasyon taşıyan insan genlerinin ifade edilmesi sağlanabilirse, gen aktarımı yapılmış fare soylarının oluşturulması mümkün olacaktır. Bu tip çalışmalar, özellikle sinir sistemi hastalıklarının modellenmesi için kullanılmaktadır. KH çalışmalarının klinik bilimler açısından en fazla ilgi uyandıran alanı, hiç şüphesiz, bu hücrelerin ve uyarılmış farklılaşmayla elde edilecek pluripotent/multipotent KH'lerin hastalıklı ya da hasarlı dokuların yedeklenmesinde kullanılmasını kapsayan hücre tedavileridir. Günümüzde bu işlevi, bağışlanan organ ve dokular görmektedir; ancak nakil bekleyen hasta sayısı nakledilebilecek organ sayısının çok üzerindedir. Araştırmacılar, yıllardır KH'leri, hasar gören ya da hastalıklı hücre ve dokuları yedekleyebilmek amacıyla kullanmanın yollarını aramaktadırlar. Bu hastalıkların önemli bir kısmı için gen tedavisi deneyleri de uygulanmaktadır. Burada amaç, genetik bir bozukluğun, etkilenen genin normal bir kopyası kullanılarak yedeklenmesidir. Teorik olarak çok güçlü olan bu tedavi şekli, işlevsel genin aktarımında yaşanabilecek sorunlardan kaynaklanacak başarısızlıklara ve risklere açıktır. KH tedavisi de gen tedavisi gibi gelişiminin erken dönemlerindedir. Hücrelerin ayrıştırılması, kültürde çoğaltılırken hedeflenen dokuya farklılaştırılması ve hastaya verilmesi aşamaları, bu tedavinin iş yoğunluğunu oluşturmaktadır. Gen tedavisinde olduğu gibi, KH tedavisinde de immunred reaksiyonu önemli bir sorundur. Eğer tedavide kullanılan hücreler hasta dışında bir bireyden alınmışsa (allojenik nakil), 12

KH'ler alıcının bağışıklık sistemi tarafından parçalanabilir. Bu noktada, somatik hücre çekirdek nakliyle elde edilecek KH'lerin kullanımı önemli bir avantaj sağlayacaktır. Yeni ilaç üretimi çalışmalarına, ilaçların olası etkilerinin belirli özelleşmiş hücrelerde ortaya konması da hücre farklılaşmasının aydınlatılması ve denenmek istenen hücrelerin pluripotent hücrelerin farklılaştırılması sonucunda elde edilmesiyle mümkün olabilecektir. 1.6. DİŞ HEKİMLİĞİ UYGULAMA ALANLARI VE GELECEKTEN BEKLENTİLERİ Erişkin insan diş pulpası dokusundan izole edilen mezenkimal kök hücrelerin karakterizasyon çalışmaları gerçekleştirilip in vitroepitelyal ve fibroblastik farklılaşma potansiyelleri araştırılmıştır. Elde edilen bu hücrelerin literatürde tanımlanmış özellikleriyle karşılaştırıldığında büyük oranda Kİ-MKH'ler ile benzer ortak immunofenotipik özellikler gösterdikleri görülmüştür. Farklılaşmayı uyaran büyüme faktörleri (KGF, HGF, EGF, IGF-2) varlığında, epitel-benzeri hücreler gözlenmiş ve bfgf+tgfp, EGF+TGF pkombinasyonları idp-mkh'lerin fibroblastbenzeri morfolojik ve immuno histokimyasal değişim gösterdikleri tespit edilmiştir. Ancak, kesin bir sonuca varılabilmesi için, elde edilen verilerin mrna düzeyinde gerçekleştirilecek çalışmalarla da desteklenmesi gerekmektedir. Fibroblastik ve epitelyal farklılaşma yeteneklerinin belirlenmesi ile idp-mkh'ler, deri başta olmak üzere diğer organ kavitelerinde (mide iç yüzeyi, ürogenital sistem ve göğüs kanalları) gerçekleşen epitel hücre kayıplarının klinik tedavileri, bağ doku ve ekstrasellüler matriksin yeniden yapılandırılmasına yönelik klinik uygulamalar ve doku mühendisliği çalışmalarında kullanılabilecek önemli bir alternatif kaynağı olacaktır. 13

Tablo 1: DP-MKH ve Kİ MKH'lerin hücre yüzey protein ekspresyonlarının karşılaştırılması Yüzey Antijeni DP-KH SHED KI-KH CD14 - - - CD34 - - - CD44 ++ ++ ++ CD45 - - - CD106 + +/- ++ CD146 ++/+/- ++/+/- ++/+/- Stro-1 ++/+/- ++/+/- ++/+/- Tip I kollajen ++ ++ ++ Tip III kollajen ++/+ ++/+/- ++/+ Osteokalsin ++/+ ++/+/- +/- Osteonektin ++/+ ++/+ ++/+ Osteopontin +/- +/- +/- DP-KH; Diş pulpası kök hücresi, SHED: süt dişi kök hücresi, KI-MKH: kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre (11). Diş pulpası kök hücreleri, tedavi amaçlı uygulamalar için gerekli bütün özellikleri taşımaktadır; 1) bu hücrelerin elde edilmesi oldukça kolaydır, 2) pulpa dokusundan elde edilen kök hücre ekstraksiyonu daha yüksek etkinlik göstermektedir, 3) yüksek farklılaşma yeteneğine sahiptirler, 4) biyomateryallerle birlikte gerçekleştirilen uygulamalarda dokuların yeniden yapılandırılması için etkin olarak kullanımları mümkündür, 5) yaşam süreleri uzundur, 6) güvenli olarak kriyo prezervasyonları mümkündür (11). Sağlıklı insan dişinden elde edilen DP-KH'lerin dondurularak saklandıktan sonra çözdürülmesiyle elde edilen yüksek hücre canlılık oranları bu hücrelerin 14

gerektiğinde kullanılmak üzere, örnek saklama bankalarında da saklanabileceğini ortaya koymuştur (D'aquino et al., 2008). DP-MKH'ler, anti-inflamatuar ve immundüzenleyici özelliktedir. Bu hücreler, pulpa kaynaklı ve diş destekdokularının enfeksiyonlarında, bağışıklık yanıtının oluşumunda proinflamatuar transkripsiyon faktörü NF-B aracılığıyla rol oynamaktadırlar. Allojenik dokulara transplante edildiklerinde ise immunolojik tolerans gelişimini uyarmaktadırlar. DP-MKH'ler, bağışıklık sistemini baskılayıcı etkilerini T lenfositlerin proliferasyonunu inhibe ederek göstermektedirler (12). Üçüncü molar dişlerden elde edilen idp-mkh'lerindentin-yapıcı odontoblastlar, osteoblastlar, yağ hücreleri, iskelet/düz kas hücreleri, endotel hücreleri, kıkırdak hücreleri ve sinir hücrelerine farklılaşabildiği gösterilmiştir. Aynı zamanda bu hücreler, osteoblastlara özgü karakteristik özellikler de göstermiştir. Bu çalışmalar, diş pulpası kök hücrelerinin mezenkimal ve mezenkimal olmayan dokuların hücrelerine farklılaşabildiğini göstermektedir. Yapılan son çalışmalar ise bu hücrelerin multipotentnöral kabartı kök hücreleri olabileceğine dair kanıtlar içermektedir. Ayrıca, bağışıklık sistemi baskılanmış sıçanlarda gerçekleştirilen çalışmalar, DP-MKH'lerin kafatasında gerçekleşen büyük defektlerin onarılmasında kullanılabilecek önemli bir hücre kaynağı olduğunu göstermiştir (13). DP-MKH'ler, bu özellikleriyle dentin, periodontal doku ve kemiksi kıkırdak dokusuların onarılmasında ve bağışıklık sistemi ve kas hastalıkları ve bağdoku hasarlarının tedavisine yönelik klinik uygulamalarda önemli bir kullanım potansiyeline sahiptir. 15

ÖZET Günümüzde embriyonik ya da erişkin dokulardan elde edilen kök hücrelerin, uygun ortam ve koşullar oluşturularak birçok hücre tipine in-vitro koşullarda farklılaştırmaları sağlanmıştır. Ancak farklılaştırılan hücrelerin, in-vivo tedavide kullanımları için hücrelerin çoğalma kontrol mekanizmalarının ve genetik yapılarının çok iyi bilinmesi gerekmektedir. Elde edilecek bu hücrelerden oluşturulacak hücre-doku ya da organların hasarlı olan bölgeye aktarılması yerine koyma (reperatif) ve tamir etme (rejeneratif) tedavilerini yolunu açacaktır. Bu konuda çalışmalar kök hücrelerden in-vitro koşullarda belirli şartlar ve ortamlar yaratılarak farklılaştırılış hücrelerin in-vivo ortamdaki davranışlarının araştırılmasını gerektirmektedir. Farklılaşan hücrelerin de-diferansiyasyon ve re-diferansiyasyon potansiyelleri, çoğalma ve göçlerinin kontrolü değerlendirilmektedir. Bu konunun aydınlatılması için daha birçok çalışmaya gereksinim olduğu görülmektedir. Kök hücrelerin, kalp kasının yenilenmesinde, dejeneratif ve inflamatuvar kıkırdak ve kemik hastalıklarında, diyabet tedavisinde, atherosklerozis nedeniyle işlevini yitiren kan damarlarının yenilenmesinde, Parkinson ve Alzheimer gibi santral sinir sistemi hastalıklarında, omurilik yaralanmalarında, karaciğer hasarlarında ve çeşitli kanserler dahil olmak üzere birçok hastalık gruplarında kullanılabilmeleri için çalışmalar hızla devam etmektedir. Klinik olarak, ortopedik kusurlar, impotans gibi bazı ürolojik rahatsızlıklar ve bazı deri hastalıklarında kök hücre tedavisi ile ilgili çalışmalar ilerlemiş durumdadır. Ancak, kök hücre tedavisi omurilik yaralanmaları ve dilate kardiyomyopatileri de içermek üzere henüz in vivo, pratiğe yansıyan çok az deneme ve yüz güldürücü gelişme vardır. 16

KAYNAKLAR 1- Peterson B.E.,Bowen, W.C., Patrene, K.D., Mars, W.M., Sullivan, A.K., Bone Marrow as a Potential Source of Hepatics Oval Cells 1999. 2- Şahin F, Saydam G, Omay SB, Kök Hücre Plastisitesi ve Kök Hücre Tedavisi,2005. 3- Kömürcü, m., Özkan, H., Mezenkimal Kök Hücre ve Ortopedide Kullanımı,Türk Ortopedi ve Travmatoloji Birliği Derneği DERGİSİ 2006, 5:3-4. 4- American Association for the Advancement of Science, 1999. 5- Bayık, M., Kök Hücre: Yaşamın Kaynağı, I. Ulusal Klinik Pratikte Kök Hücre ve Gen Tedavisi Kongre Kitabı, 2004 s13-23. 6- Karaöz, E., Ovalı, E., Kök Hücreler, Ati Teknoloji Yayınları, 2004. 7- İnan S. Özbilgin K., Kök Hücre Biyolojisi, Sağlıkta Birikim,Cilt:1 sayı:5. 8- Mauth, C., Huwig, A., Graf-Hausner, U., Roulet, J.F., Restorative Applications for Dental Pulp Therapy, Topics in Tissue Engineering, 2007. 9- Krebsbach, P.H., Robey, P.G., Dentaland Skeletal Stem Cells: Potential Cellular Regeneration, Journal Of Dental Education, 2002, 66:6. 10- Ministry of Research Scienceand Technology, Stem Cell Research in New Zealand; Challenges and Opportunities for the Research Sector, New Zealand 2006, p13-16. 17

11- Todorovic, V., Markovic, D., Milosevic-Jovcic, N., Petakov, M., Balint, B., Colic, M., Milenkovic, A., Colak, I., Jokanovic, V., Nikolic, N., Dental Pulp Stem Cells - Potential Significance In Regenerative Medicine, 2008. 12- Graziano, A., d'aquino, R., Laino, G., Papaccio, G., Dental Pulp Stem Cells: A Promising Tool For Bone Regeneration, Stem Cell Rev, 2008. 13- Morsczeck, C., Reichert, T.E., Völlner, F., Gerlach, T., Driemel, O., The State Of The Art In Human Dental Stem Cell Research, Mund Kiefer Gesichtschir, 2007. 18