Sekansın Temelleri ve Sekans Bazlı Çalışma Doç. Dr. Fatih Özaltın Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Nefroloji Ünitesi Nefrogenetik Laboratuvarı TİGED-24 Nisan 2011 Dalaman

Çekirdekte DNA

kromatin kromozom p kolu sentromer q kolu kromatid

Watson ve Crick, Nature 1953 Baz (Adenin) Fosfat grupları DNA: Deoksiribonükleik Asit Deoksiriboz şeker ATCG.. 5 3

Pürin bazlar Pirimidin bazlar Timin Adenin Sitozin (C) Guanin

mrna

Santral Dogma (Ana Kural)

Polimeraz Zincir Reaksiyonu

DNA dizi analizi (Sekanslama) (Sanger s Dideoxy Method) DNA Sequencing (Sanger s Dideoxy Method) Example

elektroferogram

Nisan, 1953 Nisan, 2003

İnsan Genom Projesiyle -İnsan genomunda 3 milyar baz çifti olduğunu, -Bütün insanların genomunun %99.9 aynı olduğunu, -Insanlar arasındaki bütün farklılıkların %0.1lik kısımdan kaynaklandığını, -Genomun sadece %2lik kısmının gen içerdiğini, -Genomun 30,000 gen içerdiğini ve bu genlerin yarısından çoğunun fonksiyonunun bilinmediğini, -Insan proteinlerinin neredeyse yarısının diğer organizmalarla benzerlik taşıdığını, -30,000 genin 30,000 protein olmadığını, bir tek genin yaklaşık 1000 proteini kodladığını öğrendik. Ama hala bilinmeyen pek çok şey var..

Elde ettiğimiz bilgiyi nasıl kullanabiliriz?

Next Generation Sequencing Genetikte bir devrim niteliğindedir Her bir yürütmede 1.4 milyar baz Klonal olarak amplifiye edilip taneciklere bağlanan DNA fragmentlerinin, toplu ve paralel sekanslanması temeline dayanır -SAGE - Whole Transcriptome4 - Small RNA Analysis -Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-Seq) - Methylation - Whole Genome Resequencing - de novo Sequencing - Targeted Resequencing5 -Gene Expression Profiling

Leading Supplier in Genomic Sequencing CE (3500 Series Genetic Analyzer) Gold Standard in CE sequencing Enables path to translate discoveries from NGS platforms to Dx CE IVD Registered and targeting 510(k) clearance in 2011 SOLiD TM System 2 nd generation platform reduces cost of sequencing Industry leading accuracy Continued increases in throughput on current platform Single Molecule Sequencing Real time analysis on single molecule long reads Preview of technology at AGBT 2010 Early customer access in late 2010 Roche, Illumina, Applied Visigen ve Helicos

MHC bölgesi 6.kromozomun kısa kolunda İleri derecede polimorfizm ve linkage disequilibrium 4Mb, Yüzlerce gen (HLA en çok çalışılan) HLA genleri, hücre aracılı immun cevapta Ag sunumundan sorumlu hücre yüzey proteinlerini kodlar Kalıtımsal DNA dizi varyasyonları, otoimmun, infeksiyöz hastalıklar; ağır ilaç reaksiyonları ile ilişkili HLA dizi bilgisi transplantasyonda alıcı-verici uyumunda yaygın kullanılmakta (benzer allel düşük red riski)

MHC Bölgesi (Chr 6p)

İmmun sistemin hücrelerine Ag sunumundan sorumlu 2 HLA Sınıfı; Sınıf I (A, B, C) Sınıf II (DRB1, DRB3/4/5,DQA1, DQB1, DPA1 ve DPB1) Uygun antiserum olmadığından bütün HLA molekülleri serolojik olarak saptanamayabilir Daha yüksek rezolüsyonlu alternatif metodlar Restriction Fragment Length Polymorphism, (RFLP), Sequence Specific Oligonucleotides (SSO), Sequence Specific Primers (SSP), Reverse dot-blot, Reference Strand Conformation Analysis (RSCA) Sequencing (altın standart) (yeni alleller saptanabilir, korunmuşkorunmamış tüm pozisyonlar analiz edilebilir, yapması kolay)

Ekim 2007 itibariyle 2941 allel (2009 klas I, 932 klas II, 97 diğer loküsler) 617 HLA-A, 960 HLA-B, 335 HLA-C, 9 HLA- E, 21 HLA-F, 28 HLA-G. Bunlardan başka 61 MICA ve 30 MICB alleli tanımlanmış Null allel HLA A (43), HLA B (32), HLA C (7), HLA G (1), DRB1 (8), DQA1 (1), DQB1 (1), DPB1 (2), DOA (1). Bu allellerde wild-type ile karşılaştırıldığında yüksek oranda sekans homolojisi var ancak nükleotid dizilerindeki mutasyonlar nedeniyle ya hücre yüzeyinde eksprese edilmezler (null allel) ya da serolojik metodlarla saptanamayacak düzeylerde eksprese edilirler Teorik olrak farklı loküslerdeki alleller 11 milyonun üzerinde HLA haplotipi ile milyarlarca olası diploid kombinasyonu oluşturabilir

HLA Allelleri Şimdiye dek HLA veritabanında 4 haneli 2048 klas 1 ve 751 klas 2 HLA alleli tanımlanmıştır (sequence specific oligonucleotide (SSO) ve Sanger yöntemleriyle) SSO hibridizasyon, belli bir polimorfizmin varlığını ya da yokluğunu saptayan prob lar kullanır Sanger metodu ile dizileme (sekans) yapılır (dezavantajı iki ayrı haploid sekans oluşturamaz 6.kromozom çift olduğu diploid hücrede bireysel HLA haplotip sekanslarını çözmede yetersiz)

Allele-Level Matching Alıcı ve vericinin HLA A, B, C ve DR allel seviyesinde uyumu başarılı bir nakil için gereklidir. Bazı çalışmalarda HLA-DQB1 ve DPB1 için uyumun da transplant sonucuna etkili olduğu gösterilmiştir A*2403 alleli taşıyan hastada patient A*2402 antikoru rejeksiyon ile ilişkili A*2403 166.Glutamik asit 167.triptofan A*2402 de aspartat ve glisin Pancoska C, Breed R, Harris P, Sonuga B, Venzon l. Emergent PRA technologies may detect unexpected antibodies in the sera of solid organ transplant recipients. One Lambda Advanced LABMAS Workshop,Los Angeles, August 14-17th; 2007 Seçilmiş alıcı/vericilerde yüksek rezolüsyonlu HLA tiplendirme rejeksiyon sıklığının azaltılmasında gerekli

Allele-Level Matching Canlıdan transplantasyonda düşünülebilir Kadavradan transplantasyonda zaman yok Strateji; böbrek hastalarının solid faz taramaları allel spesifik antikor varlığını gösterdiğinde bu antikorların hedefleri olan geniş serolojik tiplerden kaçınılmalı Örneğin verici HLA allel bilgisi yoksa alıcıdaki A*2402 antikorlarının varlığı tüm A24 vericilerini potansiyel donör olarak ekarte eder

21.yy da Böbrek Nakli İçin HLA Uyumunda Yeni Yaklaşım Alıcı/verici uyumunda kullanılan metod son 30 yılda hemen hemen değişmemiştir HLA A, B ve DR kullanılarak uyan Ag sayısına dayanan basit metod başarılı ancak HLA polimorfizmine dayanan diğer yaklaşımlar da göz önünde bulundurulmalı HLA klas 1 ve 2 genlerinin tam sekansı transplantasyona yanıt olarak yapılan HLA antikorlarının hedefi olan epitopların saptanmasına olanak vermiştir Yüksek oranda sensitize hastalarda uygun donörün bulunmasında yararlı