T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ PANKREATİK BETA HÜCRELERİNDE ENDOPLAZMİK RETİKULUM STRES. Hazırlayan İbrahim AYDOĞDU

i T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ PANKREATİK BETA HÜCRELERİNDE ENDOPLAZMİK RETİKULUM STRES Hazırlayan İbrahim AYDOĞDU Danışman Yrd. Doç. Dr. Ahmet CUMAOĞLU Bitirme Ödevi Haziran 2014 KAYSERİ

i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. İbrahim AYDOĞDU

ii Pankreatik Beta Hücrelerinde Endoplazmik Retikulum Stres adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Biyokimya Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan İbrahim Aydoğdu Danışman Yrd. Doç. Dr. Ahmet CUMAOĞLU Biyokimya Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. İlhan DEMİRHAN ONAY: Bu bitirme ödevinin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın tarih ve. Sayılı kararı ile onaylanmıştır.../../. Prof. Dr. Müberra KOŞAR Dekan

iii TEŞEKKÜR Bu tez çalışmamda emeğini ve bilgilerini esirgemeyen saygıdeğer hocam Ahmet CUMAOĞLU NA 1988 yılında Hacettepe Üniversitesi Eczacıllık Fakültesinde başlayıp bugün Erciyes Üniversitesi Eczacılık fakültesinde devam eden öğrencilik hayatımda eczacılık mesleğini layıkiyle yerine getirebilmem adıına bu süre zarfında kıymetli bilgileri ile emeği geçen tüm akademisyen hocalarıma ve aileme teşekkür ederim. İbrahim AYDOĞDU, Haziran 2014, KAYSERİ

iv PANKREATİK BETA HÜCRELERİNDE ENDOPLAZMİK RETİKULUM STRES İbrahim AYDOĞDU Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Bitirme Ödevi, Haziran 2014 Danışmanı: Yrd. Doç. Dr. Ahmet CUMAOĞLU ÖZET Pankreatik hücrelerde salgı proteinleri için protein-katlama makinesi lokalize olduğu gibi 3 hücreler, endoplazmik retikulum (ER) insulin biyosentezinde çok önemli yerdedir. Insülin salgılanması için yüksek bir talep olarak (3-hücre, ER işlevine pertürbasyonlarının protein homeostazında dengesizliğe yol açabilir ve ER strese yol açabilir. Bu stres bir adaptif, hücresel yanıt, katlanmamış protein cevabı (EPD) tarafından hafifletilebilir. Bu hücreler çok salgı işlevi nedeniyle ER stres için en duyarlı dokuların, birini temsil olarak EPD aktivasyon, (3-hücrelerinin yaşaması için hayati önem taşımaktadır. Bununla birlikte, bazı durumlarda, bu yanıtı apoptosise götüren ve diyabet patojenezine katkıda stresi azaltmak için yeterli değildir. Son kanıtlar, ER stres, tip 1 ve tip 2 diyabetli hem de önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bu derlemede, biz ER stres aracılığıyla 3-hücre ölümünün mekanizmalarını özetlemekteyiz..

v ENDOPLASMIC RETICULUM STRESS IN PANCREATIC BETA CELLS İbrahim AYDOĞDU Erciyes University, Faculty of Pharmacy Graduation Project, June 2014 Advisor: Yrd. Doç. Dr. Ahmet CUMAOĞLU ABSTRACT In pancreatic (3-cells, the endoplasmic reticulum (ER) is the crucial site for insulin biosynthesis, as this is where the protein-folding machinery for secretory proteins is localized. Perturbations to ER function of the (3-cell, such as a high demand for insulin secretion, can lead to an imbalance in protein homeostasis and lead to ER stress. This stress can be mitigated by an adaptive, cellular response, the unfolded protein response (UPR). UPR activation is vital to the survival of (3-cells, as these cells represent one of the most susceptible tissues for ER stress, due to their highly secretory function. However, in some cases, this response is not sufficient to relieve stress, leading to apoptosis and contributing to the pathogenesis of diabetes. Recent evidence shows that ER stress plays a significant role in both type 1 and type 2 diabetes. In this review, we outline the mechanisms of ER stress-mediated (3-cell death.

vi İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK... i ONAY:... ii TEŞEKKÜR... iii ÖZET... iv ABSTRACT... v İÇİNDEKİLER... vi ŞEKİLLER LİSTESİ... viii KISALTMALAR... ix 1. GİRİŞ VE AMAÇ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 4 2.1. DİABETES MELLİTUS... 4 2.2. DİYABETES MELLİTUSUN İNSİDANSI VE EPÎDEMİYOLOJİSİ... 6 2.3. SINIFLANDIRILMA VE ETİOPATOGENEZ... 7 2.4. TİP 2 DİABETES MELLİTUS ETYOPATOGENEZ... 8 3. DİYABET VE PANKREATİK BETA HÜCRESİ... 16 3.1. Pankreatik Beta Hüclererinin Fizyolojisi... 16 3.1.1. Insulin Sentezi Salgılanması ve Fonksiyonu... 17 3.1.2. Diyabet ve Beta Hücre Apoptozisi... 19 3.2. Endoplazmik retikulum stres... 21 3.2.1. IRE1 sinyal yolu... 24 3.2.2. PERK sinyal yolu... 25 3.2.3. ATF6 sinyal yolu... 27 4. ENDOPLAZMIK RETIKULUM STRES VE APOPTOZIS... 29 4.1. PERK/eIF2/ATF4/CHOP apoptozis sinyal yolağı.... 30 4.2. IRE1/JNK apoptozis sinyal yolağı.... 30 4.3. Kaspaz 12 apoptozis sinyal yolu... 31

vii 4.4. ER stres ve pankreatik beta hücresi... 31 5. SONUÇ VE YORUM... 34 KAYNAKLAR... 34

viii ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 1: İnsan ve kemirgen pankreasının adacık hücreleri ve genel dağılımı... 7 Şekil 2: Endoplazmik stresi uyaranlar ve endoplazmik retikulumdaki etkisi... 22 Şekil 3: IRE1 sinyal yolu... 25 Şekil 4: PERK sinyal yolu... 27 Şekil 5: ATF6 sinyal yolu... 28 Şekil 6: ER stresin uyardığı apoptozis yolları... 30 Şekil 7: Pankreatik beta hücresi reaktif oksijen türleri ve ER stres... 33

ix KISALTMALAR ADH AKR : Aldehit dehidrogenaz : Aldoz redüktaz AP 1 : Aktivatör protein 1 APS : Amonyum persülfat ASK1 : Apoptozis sinyali düzenleyen kinaz 1 ATF3 : Aktive edici transkripsiyon faktörü 3 ATF4 : Aktive edici transkripsiyon faktörü 4 ATF6 : Aktive edici transkripsiyon faktörü 6 Bak Bax : Bcl-2 ilişkili antagonist/öldürücü protein : Bcl-2 ilişkili X proteini Bcl-2 : B hücresi lenfoma geni 2 CHOP EDEM1 EDEM2 EDEM3 EGFR eif2a ER ERAD Erk ½ :([C/EBP (CCAAT/enhancer-bağlanan protein)-homolog protein]) : Endoplazmik retikulum degradasyonu hızlandırıcı alfa mannozidaz benzeri 1 : Endoplazmik retikulum degradasyonu hızlandırıcı alfa mannozidaz benzeri 2 : Endoplazmik retikulum degradasyonu hızlandırıcı alfa mannozidaz benzeri 3 : Endotelyal büyüme faktör reseptörü : Ökaryotik translasyon başlama faktörü 2 α subünitesi : Endoplazmik retikulum : Endoplazmik retikulumla ilişkili protein degredasyonu :Hücre dışı sinyalle düzenlenen kinaz Ero1 : Endoplazmik retikulum oksidoredüktin 1 GLUT-2 : Tip 2 glukoz transport proteini

x Grb2 : Büyüme faktör reseptöre bağlanan protein 2 GRP78 : Glukozla düzenlenen protein 78 GRP94 : Glukozla düzenlenen protein 94 GST HNE : Glutatyon-S-transferaz : 4-hidroksinonenal HRD1 : Hipoksi sorumlu domain 1 Hsp70 : Isı şok protein 70 IFN-γ IL-1β : interferon-gama : interlökin-1β IP10 : İnterferon gama ile uyarılan protein 10 IRE1 : inositol-gerektiren enzyme 1 Ire1p/Ern1p : ER transmembran protein kinaz/endoribonükleaz IRS-1 : İnsulin reseptör substrat 1 JNK MAP : JUN N-terminal kinaz : Mitojenle aktive olan protein MCP-1 : Monosit kemoatraktan protein 1 mrna : Haberci RNA MRP2 : Çoklu ilaç direnci ile ilişkili protein 2 MTT nnos PC1 PC2 PCH PERK :(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide : nöronal Nitrik Oksit Sentaz : Prohormon konvertaz-1 : Prohormon konvertaz-2 : Karboksipeptidaz H : Çift zincirli RNA bağımlı protein kinaz benzeri-er kinaz PP1 : Protein fosfataz 1 PPAR : Peroksizom prolifere edici aktif reseptör Prx6 : Peroksiredoksin 6 SDS : Sodyum dedosilsülfat

xi SRP TEMED TNF-α : Signal recognition particle : Tetrametiletilendiamid : Tümor nekrozis faktör-α TRAF2 : Tümör nekrozis faktör reseptörü ile ilişkili faktör 2 XBP-1 : X-kutusuna bağlanan protein 1

1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Diabetes Mellitus iskelet kası, karaciger ve yağ dokusu gibi periferal dokularda insulin direncinin artması ve insilin salıvermesinden sorumlu pankreatik beta hücrelerinin fonksiyon bozukluğu ile karakterize endoprin ve metabolik bir hastalıktır. Pankreatik beta hücrelerinde fonksiyon bozukluğuna bağlı insulin salıverilmesinde ki azalma, hiperglisemiyi artırarak diyabetin retinopati, nöropati, nefropati, kardiyomiyopati gibi sekonder komplikasyonlarının gelişimine neden olmaktadır. Kronik hiperglisemi birçok dokuda ve pankreatik beta hücrelerinde serbest radikal üretimini artırarak oksidatif stresi tetiklemektedir. Serbest radikaller lipitler, proteinler ve nükleik asitler gibi biyomoleküllerin oksidasyonuna neden olmaktadır. Detoksifikasyonda görevli enzimlerde fonksiyon bozuklukları özellikle proteinlerde hatalı katlanmaya neden olur. Hatalı katlanmış proteinler stoplazmada birikerek endoplazmik retikulumda (ER) hatalı katlanmış proteinlere duyarlı stres sensör proteinlerinin uyarılmasını sağlar. Böylece hasarın şiddetine bağlı olarak ya hücre hatalı proteinleri proteozomlarda ortadan kaldırma yoluna gider veya endoplazmik retikulum aracılı sinyal kaskadını başlatarak hücrenin apoptozise yönelmesini sağlar. Hatalı katlanmış proteinlerin artan hücre içi konsatrasyonları endoplazmik retikulum aracılı stresi uyararak, endoplazmik retikulum memranında bulunan stres cevap proteinlerinin aktivasyonuna neden olur. ATF6 (Aktive edici transkripsiyon faktörü 6), IRE1 (inositol-gerektiren enzyme 1) ve PERK (Çift zincirli RNA bağımlı protein kinaz benzeri-er kinaz) başlıca endoplazmik retikulum stres cevap proteinleridir. Tip 2 transmembran proteini olarak bilinen ATF6 nın aktivasyonu bu proteinin endoplazmik retikulum membranından koparak nükleusa transferini sağlar. Böylece ATF6, aktif bir transkripsiyon faktörü olarak davranarak endoplazmik retikulum

2 şaperonlarının ve protein katlanmasında görevli proteinlerin gen ürünlerinin transkripsiyonunu artırır. ATF6 aynı zamanda endoplazmik retikulum biyogenezini ve endoplazmik retikulum aracılı proteozomal degredasyon sistemini de hızlandırır. ATF6 nın aktivasyonu aynı zamanda CHOP ([C/EBP (CCAAT/enhancer-bağlanan protein)- homolog protein]) protein ifadelenme düzeylerini artırarak hücrede apoptozisi başlatır. Hatalı katlanmış proteinlerin artmış stoplazmik düzeyleri tip 1 transmembran proteini olan PERK in dimerizasyonuna ve otofosforilasyonuna neden olur. Böylece aktif olan protein eif2a (eucaryotic translation initiation factor 2, a subunit) nın fosforilasyonuna neden olur Fosforillenmiş eif2a ise hücrede protein sentezinin azaltılmasını sağlar. Bununla birlikte fosforile olmuş PERK transkripsiyon faktörü ATF4 (activating transcription factor 4) ün hücre içi ifadelenme düzeylerini artırır. Yavaşlatılmış protein sentezine rağmen ATF4 oksidatif stresle mücadelede etkin rol oynar ve amino asit metabolizmasında etkin proteinlerin ifadelenme düzeylerini artırır. PERK in kısa süreli aktivasyonu hücrenin hayatta kalmasını desteklerken kronik aktivasyonu ise hücrenin apoptozis ile ölümünde etkendir. PERK in kronik aktivasyonu ATF4 aracılı CHOP protein düzeylerini artırır. CHOP proteinin artmış düzeyleri Bcl-2 gibi apoptozisi baskılayan proteinlerin seviyelerini azaltarak hücrenin apoptozise yönelmesini kolaylaştırır. Hatalı katlanmış proteinlerin stoplazmada birikimine cevaben endoplazmik retikulum zarında IRE1 in dimerizasyonunu takiben otofosforilasyonu gerçekleşir. Böylece aktif hale gelen IRE1 bir transkripsiyon faktörü olan XBP-1 (X-kutusuna bağlanan protein 1) in hücre içi düzeylerinin artışına neden olur. XBP-1, hatalı katlanmış proteinlere bağlanarak endoplazmik retikulum lümenine taşınmada etkili proteinlerin sentezini artırır. Böylece endoplazmik retikulum lümenine alınan hatalı katlanmış proteinler endoplazmik retikulumda yer alan proteozomal sisteme yönlendirilerek ortadan kaldırılır. Bu süreç hücrenin hayatta kalabilme mücadelesinde etkindir. Diğer yandan IRE1 in uzun süreli aktivasyonu JNK (JUN N-terminal kinase) nın aktivasyonuna neden olur. JNK aktivasyonu apoptozisin uyarılmasında oldukça etkilidir. Aynı zamanda endoplazmik retikulum lümeninde biriken hatalı katlanmış proteinler endoplazmik retikulum zarında yer alan Bak/Bax kanal protein sistemini aktive ederek

3 Ca 2+ nin stoplazmaya pompalanmasını sağlar. Böylece artan stozolik kalsiyum düzeyleri kalpain aracılı prokaspaz-12 nin aktivasyonuna neden olarak kaspaz kaskadı başlatır ve hücreyi apoptozise yönlendirir. Stoplazmada artan kalsiyum düzeyleri mitokondri aracılı apoptozisi de tetikler. Mitokondriden stokrom c nin stoplazmaya salıverilmesi artar buna bağlı kaspaz-9 ve kaspaz-3 ün aktivasyonu sağlanır. Bu çalışmada diyabetinde patogonezin de önemli olan pankreatik beta hücrelerinin de endopilazmik retikulum sitresin rolü tartışılmıştır.

4 2. GENEL BİLGİLER 2.1. DİABETES MELLİTUS Diabetes Mellitus iskelet kası, karaciğer ve yağ dokusu gibi periferal dokularda insulin direncinin artması ve insilin salıvermesinden sorumlu pankreatik beta hücrelerinin fonksiyon bozukluğu ile karakterize endoprin ve metabolik bir hastalıktır. Diabetes eski yunancada sifon anlamına gelir ve aşırı idrar yapımını anlatır. Mellitus ise yine yunancada bal anlamına gelen mel kelimesinden geliştirilmiştir(3). Diyabetin tarihçesi çok eskilere dayanır. Mısır uygarlığında, milattan önce 1500 yılına ait Ebers papirüslerinde fazla idrar yapılan, idrar yolu ile şeker kaybedilen bir hastalık olarak tanımlanmış, milattan 150 yıl önce de Kapadokya da Areteus, ilk defa Diabetes terimini kullanmıştır.(4,5). Milattan önce 9.yuzyılda Razi ve 10-11. yüzyılda İbn-i Sina, bu hastaların idrarının tatlı olduğundan ve susuzluk hissinden söz etmişlerdir. 18.yuzyılda John Rollo hastalık için, Yunanca ve Latincede bal anlamına gelen mellitus takısını ilk kullanan kişi oldu. 1815 de Chevreul idrardaki bu sekerin Glukoz olduğunu açıkladı. 19. yüzyılda Claude- Bernard karaciğerde glikojen olarak depolandığını tespit etti. 1869 da Paul Langerhans pankreastaki adacık hücrelerini tanımladı. 1889 da Oskar Minkowski deneyleri ile Diabetes mellitustan sorumlu organın pankreas olduğunu gösterdi. 1921 yılında Banting ve Best insülini keşfettiler. 1955 yılında oral antidiyabetik ilaçlar (Tolbutamid) kullanıma girdi. 1973'de saflaştırılmış ve antikor oluşturmayan insülin tipleri geliştirildi. Günümüzde Rekombinant DNA teknolojisi ile tamamen sentez ürünü olan insan insülini üretilmiştir.(4,6,7) Diabetes mellitus, pankreasın insülin salgısının mutlak veya göreceli yetersizliği veya insüline periferik dokuların direnci sonucu oluşan karbonhidrat, yağ ve protein metabolizmasındaki bozukluk ile kendini gösteren hiperglisemik metabolik bir hastalıktır. Tüm dünyada en sık görülen endokrin hastalıktır. (1,2) Diabetes eski

5 yunancada sifon anlamına gelir ve aşırı idrar yapımını anlatır. Mellitus ise yine yunancada bal anlamına gelen mel kelimesinden geliştirilmiştir(3). Diyabetin tarihçesi çok eskilere dayanır. Mısır uygarlığında, milattan önce 1500 yılına ait Ebers papirüslerinde fazla idrar yapılan, idrar yolu ile şeker kaybedilen bir hastalık olarak tanımlanmış, milattan 150 yıl önce de Kapadokya da Areteus, ilk defa Diabetes terimini kullanmıştır.(4,5). Milattan önce 9.yuzyılda Razi ve 10-11. yüzyılda İbn-i Sina, bu hastaların idrarının tatlı olduğundan ve susuzluk hissinden söz etmişlerdir. 18.yuzyılda John Rollo hastalık için, Yunanca ve Latincede bal anlamına gelen mellitus takısını ilk kullanan kişi oldu. 1815 de Chevreul idrardaki bu sekerin Glukoz olduğunu açıkladı. 19. yüzyılda Claude- Bernard karaciğerde glikojen olarak depolandığını tespit etti. 1869 da Paul Langerhans pankreastaki adacık hücrelerini tanımladı. 1889 da Oskar Minkowski deneyleri ile Diabetes mellitustan sorumlu organın pankreas olduğunu gösterdi. 1921 yılında Banting ve Best insülini keşfettiler. 1955 yılında oral antidiyabetik ilaçlar (Tolbutamid) kullanıma girdi. 1973'de saflaştırılmış ve antikor oluşturmayan insülin tipleri geliştirildi. Günümüzde Rekombinant DNA teknolojisi ile tamamen sentez ürünü olan insan insülini üretilmiştir.(4,6,7) DM un etkileri çeşitli organlarda uzun süreli hasar, fonksiyon bozukluğu ve yetersizliği içerir. Klinik olarak karakteristik belirtileri olan susama, poliüri, görme bulanıklığı ve kilo kaybı ile ortaya çıkabilir. En ağır formları ise ketoasidoz ve hiperosmolar nonketotik komadır ve tedavi edilmezse stupor, koma, hatta ölümle sonuçlanabilir. DM un uzun vadedeki etkileri, progresif gelişen spesifik komplikasyonlara yol açar. Bunlar mikrovasküler komplikasyonlar (potansiyel körlüğe gidebilen retinopati, renal yetersizlikle sonuçlanabilen nefropati ve nöropati) ve makrovasüler komplikasyonlar (miyokard infarktüsü, inme ve periferik arter hastalığı) olarak 2 grupta incelenebilir. Hipertansiyon ve lipid metabolizması anormallikleri diabetli bireylerde sıktır (8). Diabet gelişiminde çeşitli patogenetik mekanizmalar rol oynar. Bunlar mutlak insülin eksikliğine yol açan pankreas p hücre harabiyeti ve insülin direncine yol açan diğer nedenlerdir. DM un etkileri çeşitli organlarda uzun süreli hasar, fonksiyon bozukluğu ve yetersizliği içerir. Klinik olarak karakteristik belirtileri olan susama, poliüri, görme bulanıklığı ve kilo kaybı ile ortaya çıkabilir. En ağır formları ise ketoasidoz ve hiperosmolar

6 nonketotik komadır ve tedavi edilmezse stupor, koma, hatta ölümle sonuçlanabilir. DM un uzun vadedeki etkileri, progresif gelişen spesifik komplikasyonlara yol açar. Bunlar mikrovasküler komplikasyonlar (potansiyel körlüğe gidebilen retinopati, renal yetersizlikle sonuçlanabilen nefropati ve nöropati) ve makrovasüler komplikasyonlar (miyokard infarktüsü, inme ve periferik arter hastalığı) olarak 2 grupta incelenebilir. Hipertansiyon ve lipid metabolizması anormallikleri diabetli bireylerde sıktır (8). Diabet gelişiminde çeşitli patogenetik mekanizmalar rol oynar. Bunlar mutlak insülin eksikliğine yol açan pankreas p hücre harabiyeti ve insülin direncine yol açan diğer nedenlerdir. Karbonhidrat, yağ ve protein metabolizmasındaki anormallikler, insülin eksikliği veya duyarlılığında azalma sonucu insülinin hedef dokulardaki Etkisinin yokluğuna bağlıdır. Bugün artık anlaşılmıştır ki diabetes mellitus, glukoz intoleransının ortak payda olduğu genetik ve klinik olarak heterojen bi 2.2. DİYABETES MELLİTUSUN İNSİDANSI VE EPÎDEMİYOLOJİSİ Diabetes mellitusun tanınması, tedavi programlarının belirlenmesi, erken dönemde tanı konulabilmesi ve bu konuda toplumsal sağlık politikalarının oluşturulabilmesi için hastalığın epidemiyolojik özelliklerinin bilinmesi şarttır (9). Diyabet sinsi seyirli bir hastalık olduğundan prevalansmm saptanması da güçlük yaratmaktadır. Hemen hemen tüm toplumlarda görülmesine karşın diyabet prevalansı ırka bağlı olarak anlamlı farkllıklar göstermektedir. Papua Yeni Ginedeki kabilelerde, Eskimolar arasında veya Çinde % 1 olan prevalans, Avustralya yerlilerinde, Naurulularda veya Arizonadaki Pima Kızılderililerinde %20-45 e kadar çıkabilmektedir (10). Bugün yeryüzünde diyabet prevalansı en yüksek topluluk pima yerlileridir. Aksine, Alaska yöresi Eskimolarda prevalans oldukça düşüktür. Hastalık ilk yıllarda genellikle asemptomatik seyrettiğinden, gelişmiş ülkelerde bile diyabetiklerin bilinmeyen diyabetlilere oranı 2/1 dir. Dünya Sağlık Örgütü (WHO, World Health Organization) nün yaptığı çalışmalara göre 100 milyon civarındaki diyabetli sayısının önümüzdeki on yılın sonunda 200 milyona ve 21. yüzylm başlarında da 300 milyona ulaşması beklenmektedir (10,11).

7 Amerikada 20-74 yaş grubunda toplumda diyabet prevalansı %6,6 bulunmuş ve bilinmeyen diyabet olgularının oranının %50 civarında olduğubildirilmiştir (12). Ülkemizde ise 1997-1998 yıllarında yapılan Türkiye Diyabet Epidemiyoloji Çalışması (TÜRDEP) na göre 20-80 yaş grubunda diyabet sıklığı %7,2 olarak bulunmuştur (13). Tip 2 Diabetes mellitus genel olarak orta yaş grubunun ve yaşlıların hastalığıdır. Ancak, son yıllarda genç erişkin ve adolesan yaş gruplarında da sıklığı artmaktadır (14-15). 2.3. SINIFLANDIRILMA VE ETİOPATOGENEZ Diabetes mellitusun bütün tipleri hiperglisemi ile karakterizedir. Ancak hipergliseminin ortaya çıktığı patogenetik mekanizma farklılık gösterir. Diabetes mellitusun bazı formları mutlak insülin yetersizliği veya insülin sekresyonunda kusura yol açan genetik bir bozukluk ile karakterize iken diğer bazı formlarında insülin direnci sözkonusudur.(lö) Başlangıçta diyabet oral glukoz tolerans testi (OGTT) ile sınıflanmaktaydı. 1979 da Ulusal Diabet Yeri Grubu (National Diabetes Data Group)nun bir çalışma grubu modifiye tanı kriterlerini önermiştir. Bu sınıflandırma şeması Tip ldiyabet (insüline bağımlı diabetes mellitus =IDDM) veya tip 2 diyabet (insüline bağımlı olmayan diyabetes mellitus=niddm) olmak üzere iki ana form diyabet tanımlanmıştır. Juvenil başlangıçlı diyabet ve erişkin başlangıçlı diyabet terimleri iptal edilmiştir. 1995 te ADA (American Diabetes Association) sınıflandırmayı tedaviden çok etyolojiye dayandırmak için diabetes mellitusun sınıflandırmasını ve tanısını tekrar incelemek üzere bir çalışma grubu kurmuştur. 2007 yılında gözden geçirilen sınıflandırma yayımlanmış, insüline bağımlı ve insüline bağımlı olmayan diyabet terimlerini kaldırmıştır, şimdi sırasıyla tip 1 ve tip 2 diyabet isimleri verilmiştir. Diğer bir değişiklik anormal glukoz toleransı ve potansiyel glukoz tolerans anormalliği kategorilerinin kaldırılmasıdır. (17). Diabetes Mellitusun sınıflaması beş klinik sınıfı içerir; Tip 1 DM, Tip 2 DM, diğer spesifik diyabet tipleri, gestasyonel diyabetes mellitus ve prediyabet. Diyabet tanısı konulması için yeterli olmayan hiperglisemi IFG (bozulmuş açlık glukozu) ve IGT (bozulmuş glukoz toleransı) ile karakterize iken şimdi pre-diyabet olarak adlandırılmaktadır. Bunun nedeni epidemiyolojik kanıtların bu düşük düzeyde karbonhidrat intoleransmm bile makrovasküler komplikasyonlarla birlikteliği ve sıklıkla diyabete ilerlemesidir.yeni sınıflama aynı zamanda malnütrisyon ilişkili diyabet

8 tanımını sınıflandırmadan çıkarmıştır, çünkü protein eksikliğinin diyabete yol açtığı konusunda bir delil bulunamamıştır. Eski sınıflama sisteminde çocukta, gençte ve erişkinde diyabeti olan ve otozomal dominant geçişin gösterildiği aileler vardı. Diyabetin bu türüne erişkin yaşta ortaya çıkan gençlerin diyabeti (maturity onset Diabetes of the young (MODY)) denilmekte ve Tip 2 diyabetin bir alt tipi olarak düşünülmekteydi. Yeni sınıflama sisteminde ise MODY diğer spesifik diyabet tipleri arasında yer almaktadır, çünkü beta hücre fonksiyonunda bu hastalığın meydana gelmesini sağlayan belirli bir genetik defekt vardır. Fakat Tip 2 diyabetin en önemli noktalarından biri olan insülin etkisinde minimal veya hiç defekt yoktur. 1998 yılında DSÖ tarafından glisemi bozukluklarının etyolojik ve klinik açıdan sınıflaması 2.4. TİP 2 DİABETES MELLİTUS ETYOPATOGENEZ Tip 2 diyabet patogenezinde beta hücre fonksiyon bozukluğu, insülin direnci ve hepatik glikoz üretimi artışı gibi üç ana metabolik bozukluk rol oynar (9,10). Primer defekt

9 olarak insülin direnci ve /veya insülin eksikliği ön plandadır (9, 19). Tip 2 diyabette primer patolojinin beta hücre fonksiyon bozukluğu veya insülin direnci olmasında yaş, etnik farklılıklar, obezite ve diyabetin heterojenitesinin kısmen de olsa belirleyici olduğu ileri sürülmektedir (20). Hem insülin direnci hem de bozulmuş insülin sekresyonu Tip 2 diyabetin patogenezinde genetik olarak kontrol edilen faktörler olup bunlardan hangisinin primer ağırlıkta rol oynadığı henüz açık değildir. Aile öyküsü hemen hepsinde olmasına karşın hastalık henüz tek bir genetik zemine oturtulamamıştır. Yine de tip 2 diyabetin çoğu formları genetik yüklülük ile ilişkilidir. Son yıllarda bunlara eklenen dördüncü bir görüş, primer defektin hiperinsülinemi olduğu ve insülin direncinin hiperinsülinemiye bağlı olarak oluştuğu hipotezidir. Hiperinsülineminin nonoksidatif glikoz kullanımını veya glikojen sentezini bozarak tıpkı Tip 2 diyabette olduğu gibi insülin direncine yol açabileceği ileri sürülmektedir (21). Açlık glikoz düzeyi 80 mg/dl dan 140 mg/dl.ye yükseldiğinde insülin düzeyi 2-2,5 kat artar. Açlık glikoz düzeyi 140 mg/dl yi geçtiğinde ise beta hücresi daha fazla insülin salgılayamaz. Sonuçta açlık hiperglisemisi arttıkça insülin salgısı da kademeli olarak azalmaya başlar. İnsülin salgısındaki bu azalmaya karşılık hepatik glikoz üretimi artmaya başlar ve açlık glisemisinin yükselmesine katkıda bulunur. 250-300 mg/dl arasındaki açlık glisemi düzeyinde ise insülin salgısı ciddi olarak azalır (9). Beta Hücre Fonksiyon Bozukluğu İnsülin salgılanmasında bozukluğa yol açan etiyolojik faktörler: 1. İnsülin Salgısında Kantitatif Bozukluklar Preklinik dönemde varolan insülin direnci, normale göre daha fazla insülin salgölanarak aşılmaya çalışılır; normal glikoz toleransı ancak bu şekilde sürdürülebilir (9). 2. İnsülin Salgısında Kalitatif Bozukluklar a) Birinci Faz İnsülin Salgısmda Bozulma İntravenöz glikoz verilmesini izleyen ilk 10 dakikada insülin salgısında hızlı artış olur ve 2 4 dakika arasında bu artış pik yapar. 6. dakikadan itibaren hızını kaybeder. Birinci faz insülin salgısının kaybolması ile glukagonun hepatik glikoneogenezi arttırıcı

10 etkisi belirginleşir (9). b) Pulsatil İnsülin Salgılanmasında Bozukluk Normalde her 5-15 dakikada bir periyodik olarak salgölanan insülin hedef dokularda insülin reseptörlerinin down regülasyonunu önleyerek insülin sensitivitesinin normal sönörlarda kalmasını sağlar. Pulsátil olmayan sürekli insülin salgılanması ise reseptörlerde down regülasyona yol açarak insülin direncine sebep olur. Tip 2 diyabetli ve obez hastalarda bu defektler kilo verilmesi ve metabolik kontrol ile büyük oranda düzelmekle beraber tamamen normalleşmez (9). 3. Proinsülin Salgılanmasında Anomaliler Proinsülin insülinin ancak %5.i kadar biyolojik aktiviteye sahip olup insülin immünoreaktivitesinin normal bireylerde %2-4 ünü, Tip 2 diyabette ise %8-10.unu oluşturur. Proinsülinin %70 ini 32-33 split proinsülin oluşturur. Proinsülin ve kırılmış proinsülinlerin klirensi yavaş olduğundan ve de ölçümde kullanılan RIA (RadioímmunAssay) yöntemleri insülinin yanında proinsülini de (sağlam ve kırılmış) ölçtüğünden insülin düzeyleri olduğundan yüksek çıkar.insülin direnci ve kronik hiperglisemi, beta hücrelerinin sürekli uyarılması ile proinsülin sentezini artırarak 32-33 kırılmış proinsülin/insülin oranının artmasına neden olur. Tip 2 Diabetes mellitusta açlık total immünoreaktif insülin artışı ortaya çıkar; bu da normal insülin düzeyleri üzerine eklenmiş olan artmış proinsülin düzeyi sonucu olarak hiperinsülinemiyi gösterir. Ancak bu hiperinsülinemi gerçek olmayıp, artmış proinsülin/insülin göz önüne alındığında aslında insülopeni söz konusudur (9). Yakın zamanda yapılmış bir çalışmada açlık parçalanmamış proinsülin düzeyinin ilerlemiş beta hücre disfonksiyonunun ve insülin direncinin oldukça spesifik bir belirteci olduğu bildirilmiştir (22). 4. Düşük Doğum Ağırlığı (Thrifty-İdareli Fenotip Hipotezi) Sadece beta hücre yetmezliği olan bireylerin Tip 2 diyabete yakalanacağını öne süren bir hipotez olmakla birlikte son yıllarda yapılan çalışmalar düşük doğum ağırlığı ile erişkin yaşta ortaya çıkan bozulmuş glikoz toleransı ve Tip 2 diyabet arasmda da böyle

11 bir bağlantının olabileceğini göstermektedir. ínutero malnütrisyon sonucunda nütrisyonu idareli kullanmak için karaciğer ve pankreas gibi daha az hayati organların daha az beslenmesine yol açar (9). 5. Glikoz Toksisitesi Hipergliseminin beta hücreleri üzerine olan olumsuz etkisine glikoz toksisitesi adıverilmektedir. Hiperglisemi hem beta hücresi üzerine etki ederek insülin salgılanmasını baskılar hem de periferik dokularda insülin kullanılmasını azaltır. Ayrıca yüksek glikoza sürekli maruz kalan beta hücresinde insülin gen transkripsiyonunun bozulduğu; bunun da insülin sentezini ve sekresyonunu azalttığı gösterilmiştir (9). 6. Amilin (Adacık Amiloid Polipeptid, IAPP) Beta hücrelerindeki insülin salgı granüllerinde insülin ile birlikte üretilip beraberce salgölanan bir hormondur. Normalde akut hiperglisemi sörasönda veya diğer uyaranlara karşö insülin ile birlikte salgılanır. Kanda insülinden çok düşük seviyede bulunmaktadör (insülinin 1:10-50 oranında ). Obez, glikoz intoleransı olan bireylerde, Tip 2 diyabetli bireylerin glikoz intoleransı bulunan birinci derece yakınlarında yüksek bulunmuştur. Amilinin hücre dışında beta hücresine bitişik olarak birikmeye başlayarak nütriyentlerin plazmadan beta hücresine girişini engellediği ve sonuçta beta hücresinin ölümüne yol açtığı ileri sürülmektedir (9). 7. Kalsitonin geni ile ilişkili Peptid (CGRP ) Amilin ile moleküler olarak %46 oramnda benzemektedir. Ancak hayvan deneylerinde intravenöz olarak verildiğinde insülin salgılanması üzerine herhangi bir etkisi görülmemiştir (8). 8. İnkretinler (GLP-1, GIP, Galanin) Oral glikoz verildiğinde insülin sekresyonunun artmasöna neden olan faktörlerdir. Glukagon like peptide 1 (GLP-1) ince barsakta sentezlenen potent insülin salgılatıcısıdır. Besin maddeleri ile uyarılarak beta hücresi üzerinde spesifik reseptörüne bağlanör ve insülin salgılanmasına yol açar. Tip 2 Diabetes mellitusda GLP-l e karşı beta hücre rezistansı bulunmuştur. Güçlü bir insülin salgılatıcısı olan gastrik inhibitör

12 polipeptid (GIP) farmakolojik dozda verildiğinde post prandiyal insülin salgılanması üzerine herhangi bir etkisi görülmemiştir. Nöral uyaranlara bağlı olarak pankreastaki sempatik sinir uçlaröndan salgölanan galaninin; yapılan hayvan deneylerinde bazal ve öğün sonrası insülin salgısını inhibe ettiği gösterilmiştir. İnsan galanininin ise insülin salgısı üzerine bir etkisi gözlenmemiştir (9). 9. Lipotoksisite Bozulmuş glikoz toleransöndan Tip 2 diyabete geçişte beta hücre fonksiyonlarında azalmayı açıklamak için glikotoksisite gibi lipotoksisite kavramı üzerinde de durulmaktadır. Yüksek düzeyde serbest yağ asitlerine maruz kalma sonucunda beta hücresinde trigliserid birikerek apopitozise yol açmaktadör. Yağ asitleri aynı zamanda proinsülinin insüline çevrilmesinde rol alan enzimlerin posttranslasyonel işlemini de azaltmaktadır (9). 10. İnsülin Salgılanması Bozukluğunda Genetik Nedenler Glikozun beta hücresi tarafından tanınmasında, insülin sentezi ve salgılanmasında rol oynayan spesifik proteinlerdeki mutasyonlar beta hücre disfonksiyonundan sorumlu tutulmaktadır. Glikokinaz geninde çeşitli defektlerin görüldüğü MODY tipi diyabette olduğu gibi. Bu mutasyonlar oldukça nadir olup Tip 2 diyabetlilerin %l-2 sini oluşturmaktadır (9). Hepatik Glikoz Üretiminde Artış Diabetes mellitus patogenezinde üçüncü ana metabolik bozukluktur. Karaciğerde glikoz yapömö glikojenoliz veya glikoneogenez yoluyladır. Hepatik glikoneogenezdeki artöşön nedeni henüz kesin olarak bilinmemekle birlikte hiperglukagonemi ve laktat, alanin ve gliserol gibi glikoneojenik prekürsörlerin artışı söz konusudur. Sonuçta açlık hiperglisemisine neden olur. Hatta açlık hiperglisemisinin tamamının karaciğer glikoz yapımındaki artışa bağlı olduğu kabul edilmektedir. Hepatik glikoneogenez artışının diyabetiklerde primer defekt olduğunu gösteren pek az bulgu vardır. Bu faktörün sekonder olay olduğu ancak glikoz toksisitesini daha da artırdığı düşünülmektedir (9).

13 İnsülin Direnci İnsülin direnci ve Tip 2 diyabet patogenezindeki rolü ayrı bir başlık altında ayrıntılı olarak açıklanacaktır. İnsülin ve Etkisi İnsülin pankreastaki langerhans adacıklarının beta-hücreleri tarafından üretilen polipeptit yapıda 6000 dalton molekül ağırlığında bir hormondur.birbirine iki disülfur köprüsü ile bağlı 2 aminoasit zincirinden oluşmaktadır. Betahücreleri pankreas kütlesinin yaklaşık %1 ini oluşturur (23). İnsülin, dokular tarafından yakıtların kullanımım düzenleyen ve enerji homeostazisini sürdüren en önemli hormonlardan biridir. Metabolik etkileri anaboliktir. Glikojen, triaçilgliserol ve protein sentezini uyardıkları gibi birçok membran enzimini aktive ve inaktive edebilir, birçok protein ve mrna nm sentez veya yıkım hızını değiştirebilir, hücre büyüme ve farklılaşmasını etkileyebilirler(23). İnsülinin sentezi şu şekilde gerçekleşir: 1) Nükleusta insülini kodlayan genlerden mrna transkripsiyonu gerçekleşir. 2) Oluşan mrna sitoplâzmaya gelerek kaba endoplazmik retikulumda translasyona uğrar. 3) Polipeptit sentezi, N-Terminal sinyal polipeptidi oluşumuyla başlatölör ve kaba endoplazmik retikulum membranı içine penetre olur. 4) Polipeptit zinciri, kaba endoplazmik retikulum lümeni içine doğru uzayarak sonuçta preproinsülini oluşturur. 5) Sinyal peptidi ayrılır ve sistemada proinsülin oluşur. 6) Proinsülin kaba endoplazmik retikulumdan golgi kompleksine taşınarak orada proteazlarön etkisiyle c-peptid segmentini kaybeder ve insüline dönüşür. Dönüşüm golgi cisimciğinden oluşan depo veziküllerinde devam eder.

14 7) İnsülin parsiyel ekzositozla salgılanırken onunla birlikte ekimolar miktarda C- peptid de salgılanır. Proinsülinin bir kısmı intakt olarak dolaşıma verilir. Dolaşımdaki insülin benzeri immün reaktivitenin %20 sini teşkil eder. Proinsülinin biyolojik etkinliği insülininkinin %10 u kadardır (23). C-peptid insülin sekresyonunun periferik göstergesidir ve insülin gibi karaciğer tarafından tutulmaz (24). İnsülin sekresyonunu uyaran en önemli maddeler glikoz, aminoasitler özellikle arginin ), glukagon, gastrointestinal hormonlar (sekretin, gastrin, vazoaktif intestinal peptit, kolesistokinin), büyüme hormonu, glikokortikoidler, prolaktin, plesantal laktojen hormon, cinsiyet hormonları ve parasempatomimetik ajanlardır. Hipertroidi, P hücrelerinin glikoza duyarlılığını arttırır. PTH düşük dozlarda beta hücresini uyarırken yüksek dozlarda inhibe eder. Somatostatin ve epinefrin insülin sekresyonunu inhibe ederler. İnsülinin glikoz metabolizması üzerine etkileri özellikle üç dokuda belirginleşir: karaciğer, kas ve yağ dokusu. Karaciğerde glikoneogenez ve glikojen yıkımını inhibe ederek, glikoz üretimini azaltör. Kas ve karaciğerde, glikojen sentezini arttırır. Kas ve yağ dokusunda, hücre membranlarmdaki glikoz alıcılarını arttırarak glikoz alımmı çoğaltır. însülin verilmesinden birkaç dakika sonra, yağ dokusundan yağ asidi salınmasında belirgin düşme görülür. însülin, dokusunda hormon duyarlı lipazın aktivitesini inhibe ederek dolaşımdaki yağ asitlerini azaltır. Çoğu dokuda aminoasitlerin hücre içine girişini ve protein sentezini uyarır (23). İnsülin karaciğer, kas ve yağ dokusu gibi çoğu dokuda, hücre zarında bulunan yüksek afiniteli özgün reseptörlerine bağlanör. İnsülin reseptörü, tek bir polipeptit olarak sentezlenir, glikozillenir ve alfa-beta subünitlerine ayrılır. Bunlar daha sonra disülfıt bağlarıyla bağlı bir tetramer oluşturmak üzere bir araya gelirler. Her beta subunitinin hidrofobik bölümü plazma membranı içinde yer alır. Hücre dışında bulunan alfa subünitini insülin bağlanma bölgesi içerir. Beta subunitinin sitozolik bölümü, bir tirozin kinazdır ve insülin ile aktive olur. İnsülinin kendi reseptörünün alfa subünitlerine bağlanması, konumsal değişikliklere neden olur. Bu değişiklikler, beta subünitlerine iletilir ve beta subunitindeki özgün bir tirozin biriminin hızlı otofosforilasyonuna neden olur. Ancak, reseptör tirozin kinazm, insülinin hücre içi etkileriyle bağlantısını sağlayan birçok aracı molekül vardır (23). İnsülin aktivitesinin bir kısmının, hedef proteinlerin serin veya treonin birimlerinin

15 fosforilasyonu veya defosforilasyonuyla olduğu bilinmektedir. Bu nedenle reseptör tirozin kinaz aktivitesiyle insülin reseptör substratı (IRS-1, IRS-2) adı verilen bir peptidin tirozinlerinin fosforile edildiği düşünülmektedir. IRS-1 geni silinmiş farelerde glikoz homeostazmm bozulduğu, glikoza intoleransınm geliştiği bulunmuştur. Belirgin diyabet oluşmaması, kaybolan IRS-1 yerine, kısmen IRS-2 tarafından tutulmasıyla açıklanmıştır. Birçok dokuda insülin varlığında glikoz taşınımı artmaktadır. İnsülin glikoz taşıyıcılarının (glikoz transport molekülleri, GLUT) hücre içi vezikül havuzundan hücre yüzeyine devamlı hareketini sağlamaktadır. Çizgili kas ve yağ dokusunda insülin GLUT-4 yardımıyla transloke olur. İnsülin bağlandıktan sonra, hormon reseptör kompleksi hücre içine alınır. Hücre içinde, insülin lizozomlarda yıkılır. Reseptörler de yıkılabilir, fakat çoğu hücre yüzeyine geri döner. Yüksek insülin düzeyleri reseptör yıkımını arttırır, böylece yüzey reseptörlerinin sayösö azaltılır (down regülasyon) (23). İnsülinin bağlanması çok geniş etkilere yol açar. En erken yamt, glikozun hücre içine girişinin artmasıdır. Bu olay, membran reseptörüne bağlandıktan sonra saniyeler içinde olmaktadır. İnsülinin neden olduğu fosforilasyonla ilişkili enzimatik aktivite değişikleri ise, dakikalar ve saatler içinde meydana gelir. İnsülin aynı zamanda birçok enzimin miktarını da arttırır. Bunun için ise saatler veya günler gereklidir.insülin başta karaciğer, böbrek ve çizgili kaslar olmak üzere yağ dokusu, monosit, eritrosit, granülosit, plasentada yıkılır. Pankreastan salındıktan sonra yaklaşık %50.si hepatositlerde yıkılır. Böbreklerde glomerüllerden süzülür ve proksimal tubulusta reabsorbsiyona uğrar, tubulus hücrelerinde kısmen yıkılır. İnsülinin hücre içinde yıkımında, birçok enzim rol alır, bunların en önemlisi glutation insülin transhidrojenaz.dır (23).

16 3. DİYABET VE PANKREATİK BETA HÜCRESİ 3.1. Pankreatik Beta Hüclererinin Fizyolojisi Pankreatik beta hücreleri, pankreasın langerhans adacıklarında bulunan endokrin hücrelerdir. Langerhans adacıkları insan pankreasının kuyruk kısmında yer alır ve tüm pankreas ağırlığının % 1-2 sini oluşturur[24]. Beta hücresi içeren adacıklar yaygın damar ve sinir ağı ile kaplıdır. Sağlıklı insan pankreası yaklaşık olarak 10 6 adacık içerir, her bir adacıkda ise yaklaşık 2000 beta hücresi yer alır[25]. (Şekil 1) İnsan pankreasında adacık hücrelerinin % 65-80 i beta hücresidir. Bu hücreler artan kan glukozu veya diğer besin maddelerine cevaben insulin salgılanmasından sorumludur[26]. Bu hücreler insulin dışında ayrıca C-peptin ve amilin salgılar. C-peptit pro-insulinden olgun insuline dönüşümde oluşan yan üründür ve özellikle tip 2 diyabetin komplikasyonları arasında yer alan nefropatinin engellenmesinde önemli role sahiptir. Diyabetik hayvan modellerinde C-peptin in glamerular filtrasyon hızını artırtığı ve fibrozisi gerilettiği gösterilmiştir[27]. Amilin insulin ile aynı anda (1:100,amilin/insulin) salgılanır. Amilin Alfa hücrelerinden glukagon salgılanmasını baskılar ve böylece gulukoz metabolizmasını düzenler. Bununla birlikte amilin, dolaşımdaki glukoz emilimini geçiktirir, besin tüketimini sınırlar ve sindirim enzimlerini baskılar[28]. Alfa hücreleri pankreatik adacıkların % 15-20 sini oluşturur. Bu hücreler salgıladıkları glukagon hormonu ile karaciğer ve iskelet kasında glikojen yıkımını artırarak glukozon dolaşım sisteminde artışını sağlar. Böylece kan şekerini yükseltir. Somatostatin delta hücrelerinden salgılanır. Bu hücreler pankreatik adacıkların % 3-10 unu oluşturur.

17 Adacıklarda varolan diğer hücreler ise pankreatik polipeptit salgılayan hücreler ve grelin üreten epsilon hücreleridi[26]. Şekil 1: İnsan ve kemirgen pankreasının adacık hücreleri ve genel dağılımı 2 3.1.1. Insulin Sentezi Salgılanması ve Fonksiyonu İnsulin iki disülfit köprüsü ile birbirine bağlı iki polipeptitten oluşur. Pankreatik beta hücrelerinde var olan transkriptin % 10-15 ini insulin mrna sı oluşturur. İnsulin in düşük kan glukoz konsantrasyonlarında translasyonu çok azdır[29]. İnsulin proteini preproinsulin formunda sentezlenir. Glukoz insulin in translasyona başlama ve uzama evrelerini hızlandırır. İnsulin mrna sı stoplazmadan granüllü endoplazmik retikuluma geçer bununla birlikte SRP (Signal recognition particle) proteininin reseptöründen ayrılmasını sağlar[30-31]. Preproinsulin N-terminal bölgede taşıdığı hidrofobik bölge ile kolaylıkla endoplazmik retikulum zarını geçer ve translasyon sonrası değişimlere katılır. Endoplazmik retikulum lümeninde preproinsulinden sinyal dizisi proteolitik olarak kesilir ve proinsulin oluşur. Proinsulinde disülfit bağları kurulduktan sonra golgiye taşınır[32]. Proinsulin golgide iki endoproteaz PC1 (prohormon konvertaz-1), PC2 (prohormon

18 konvertaz-2) ve bir ekzopeptitaz PCH (Karboksipeptidaz H) aktivitesi sonucu olgun insulin ve C-peptit e dönüşür. Bu değişim asidik ve kalsiyumca zengin ortamda gerçekleşir. Ayrıca karboksipeptidaz H ın aktivitesi çinkoya bağımlıdır[33-34]. Glukoz bu değişimi PC1 ve PC2 sentezini etkileyerek düzenler. İnsulin daha sonra salgı granüllerine alınarak stoplazmada bekletilir. Her bir pankreatik beta hücresi yaklaşık 10000-13000 salgı granülü içerir, her bir salgı granülü ise yaklaşık 10 6 insulin molekülü, düşük moleküler ağırlıklı bileşikler, ATP, çinko gibi metal iyonları içerir. Salgı granüllerindeki çinkonun çoğu hekzamerik insulin oluşumu ile ilişkilendirilir[35]. Beta hücreleri glukoza duyarlı hücrelerdir. Dolaşımda artmış glukoz hızla beta hücre zarını tip 2 glukoz transport proteini (GLUT-2) aracılığı ile geçer[36]. Glukoz stoplazmada glukokinaz ile hızlıca fosforillendikten sonra glikoliz ve devamında respiratuvar döngüye katılarak ATP üretir. Artmış ATP/ADP oranı beta hücre zarında ATP ye duyarlı potasyum kanallarının kapanmasına neden olur. Bu durumda hücrede depolarizasyon gerçekleşir ve voltaja duyarlı kalsiyum kanalları açılır ve hücre içi kalsiyum düzeyleri artar. Artan kalsiyum düzeyleri ise insulin in salgı granüllerinden ekzositozunu uyarır[37]. Açlık durumunda salgılanan insulin miktarı 2 pmol/kg/dakika iken beslenmeden sonra bu seviye 5-10 kat artar[38]. Beta hücrelerinden glukozla uyarılmış insulin salgılanması glukozun hücre içersine alınması, metabolizması ve kalsiyum aracılı insulin ekzositozu ile koordine edilir. Bu koordinasyon GLUT2 ve Rab3 gibi çeşitli genlerin değişimine bağlı tip 2 diyabette bozulmuştur ve bu durumda diyabetin en önemli karakteristiğidir[39]. İnsulin amino asit dizisi her ne kar türler arasında farklılık gösterse de ana segment türler arasında korunmuştur ve bu da insulin in üç boyutlu yapısının türler arasında benzerliği sağlamaktadır. İnsulin glukoz metabolizmasını düzenlediği gibi protein ve yağ metabolizmasını da düzenler. Kaslar, karaciğer ve yağ dokusunda glukozon depolanması veya kullanılmasını düzenler. İnsulin hücrede reseptörüne bağlandığı zaman hem reseptörün otofosforilasyonuna hemde insulin reseptör substrat-1 (IRS-1) proteininin fosforillenmesine neden olur. IRS- 1 daha sonra Grb2 benzeri adaptör proteine bağlanarak fosfoinozitol-3-kinazı aktive

19 eder. Fosfoinozitol-3-kinaz sinyali diğer moleküllere ileterek glukozun hücre içersine alınımını artırır, diğer anabolik yolların aktivasyonu ile birlikte artan glukozon hücre içersinde depolanmasını uyarır. İnsulin glukoz un hücre içersine alınımını GLUT-4 ün stoplazmik veziküllerden zara transportunu artırarak sağlar. GLUT-4 özellikle kas ve yağ dokusunda glukozun hücre içersine girişinden sorumludur[40]. İnsulin in plazmada yarılanma ömrü yaklaşık 6 dakikadır. İnsulin in çoğu karaciğer ve böbreklerde insulin proteazlar tarafından parçalanarak inaaktive edilirken hücreye internelizasyonuda inaktivasyonunda etkili mekanizmadır[41]. 3.1.2. Diyabet ve Beta Hücre Apoptozisi Hücre ölümü esasen nadiren nekrozis veya aktif olarak apoptozis ile gerçekleşir. Vücutta genelde enfeksiyon, farklılaşmave hasarlı hücrelerin ortadan kaldırılmasında kullanılan temel mekanizma apoptozisdir. Pankreatik beta hücreleri diyabetin patogenezinde etkili bir çok ajanın proapoptotik etkilerine karşı oldukça duyarlıdır[42]. Yeni tip 1 diyabet tanısı almış hastalardan alınan pankreas örneklerinde yapılan histıpatolojik çalışma sonucu beta hücrelerinde % 70-80 kayıp olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte daha önceki çalışmalarda elde edilen verilere göre pankreatik beta hücreleri otoimmün atakta hedef hücrelerdir ve hücre kaybında etken mekanızma apoptozisdir. Tip 1 diyabet oluşturulmuş hayvan modellerinde insulitis in (Langerhans adacıklarının infilamasyonu) erken evresinde çoğunlukla makrofajların ve ayrıca +CD4, +CD8 lenfositler, doğal öldürücü hücreler ve B lenfositler gibi diğer immün hücrelerin adacıklara infiltrasyonu gösterilmiştir. İmmün hücrelerden pankreatik beta hücrelerine salgılanan temel sitokinler interlökin-1β (IL-1β), interferon-γ (IFN-γ), tümor nekrozis faktör-α (TNF-α) olarak tanımlanmıştır 21. Bu sitokinlerin yüksek dozlarda pankreatik beta hücreleri için proapoptotik olduğu bilinse de, ilginç olarak beta hücrelerinin de bunlara benzer IL-1β, monosit kemoatraktan protein 1 (MCP-1), IFN-γ, IP10, TNF-α gibi sitokinleri ürettiği ve salgıladığı gösterilmiştir[43-44]. Beta hücre apoptozisinde bu sitokinlerin yanında aktif makrofaj ve T lenfositler salgılanan nitrik oksit ve reaktif oksijen radikallerinin etkili olduğu vurgulanmıştır. Tüm bu bilgiler ışığında beta hücrelerinde apoptozisi hangi mekanizmanın başlattığı hala tartışma konusudur. Her ne kadar perforin, FasL, IL-1β, IFN-γ ve nitrik oksit beta hücre kaybında etkili olsa da bu

20 moleküllerin sinyal yolaklarının baskılanması hala beta hücre kaybını yeterince engelleyememiştir. Tip 2 diyabet beta hücrelerinde fonksiyon bozukluğu ve insulin direnci ile karakterizedir. Obezite ve insulin direnci tip 2 diyabetin nedenleri arasında iki major faktördür. Son yapılan çalışmaların sonuçlarına göre hiperglisemi beta hücre kaybında önemli etkendir. Yakın zamanda tip 2 diyabet tanısı almış hastalardan alınan biyopsi örneklerinde beta hücrelerinde % 25-50 kayıp gözlenirken daha ileri evre tip 2 diyabetiklerde bu kayıp % 65 e yakın gözlemlenmiştir. Buna göre geç evre tip 2 diyabetin patogenezinde beta hücre kaybı major etkendir 24. Burada artmış beta hücre ölümü veya bozulmuş proliferasyon kapasitesi beta hücre kaybında etken mekanizmalar olabilir. Otopsiden elde edilmiş tip 2 diyabetik insan pankreas dokularında hücre kaybında etken mekanizmanın apoptozis olduğu gösterilmiştir. Her ne kadar tip 2 diyabette beta hücre apoptozisinde hangi temel sinyal yolunun aktif olduğu tam olarak bilinmese de, beta hücrelerinin uzun süreli yüksek glukoz, lipid ve toksik oligomerlere maruziyeti, amiloyid polipeptit, reaktif oksijen radikalleri, endoplazmik retikulum stres ve proinfilamatuvar sitokinler gibi birçok faktörün etkin olabileceği vurgulanmaktadır[45]. Düşük doz glukoz konsatrasyonlarının kültüre edilmiş insan pankreas hücrelerinde proliferasyonu artırdığı gözlemlenmişken kronik yüksek doz glukoz uygulamasının apoptozisi artırdığı gösterilmiştir. İlginç olarak apoptozis genel olarak proliferatif beta hücrelerinde gözlemlenmiş bu da buda beta hücrelerinin proliferasyon anında apoptozise hassasiyetini göstermektedir. Yüksek glukoz konsantrasyonları pankreatik beta hücrelerinde glukozun metabolizmasını dolayısıyla oksidatif fosforilasyonunu artırır, bu durum mitokondriyal fonksiyon bozukluğuna bağlı reaktif oksijen radikallerinin artışına neden olur. Beta hücreleri reaktif oksijen türlerinin artışına karşın oldukça zayıf enzimatik antioksidan savunma sistemine sahiptir. Reaktif oksijen radikallerinin beta hücrelerinde artışı NFkB ve JNK gibi strese duyarlı çeşitli metabolik yolları aktive eder. Düşük doz IL-1β beta hücre proliferasyonunu aktive ederken kronik yüksek dozlarda NFkB, JNK ve belki de diğer strese duyarlı mekanizmaların aktivasyonuna neden olur 26. Tüm bunlara ek olarak endoplazmik retikulum stres pankreatik beta hücrelerinde JNK yolu, aktive edici transkripsiyon

21 faktörü 3 (ATF3) ve B hücresi lenfofa geni 2 (Bcl-2) ailesinin proapoptotik üyelerinin aktivasyonuna neden olarak hücrede apoptozis in ilerleyişini sağlar[46]. Tip 2 diyabette görülen bir diğer normal dışı durum artmış plazma lipid değerleridir. Rat pankreatik beta hücrelerinin 48 saat boyunca 2 mmol/l yağ asidine maruz bırakılması hücrede oksidatif stresi oldukça artırmıştır. Artmış yağ asidi konsantrasyonunun beta hücrelerinde hücre apoptozisini tam olarak hangi mekanizma ile ilerlettiği bilinmese de endoplazmik retikulum stresi aktive ettiği, JNK aktivasyonuna neden olduğu, reaktif oksijen türlerini artırdığı ve mitojenle aktine olan protein (MAP) kinaz yolunu aktive ettiği gösterilmiştir[47]. NFkB aktivasyonu, endoplazmik retikulum stres ve diğer mekanizmalar tip 2 diyabetin patogenezinde etkin apoptozis in ilerleyişinde etkin yollardır. Yüksek doz lipid konsantrasyonlarının pankreatik beta hücrelerinde toksik etkisinin yanında hücre apoptozisinde bir diğer etken mekanizma da artan reaktif oksijen radikallerinin etkisi ile gerçekleşen lipid peroksidasyonu sonucu oluşan toksik aldehitlerin etkileridir. Bununla birlikte daha önceki çalışmalarda sitokinlerinde pankreatik beta hücrelerinde lipid peroksidasyonunu artırdığı gösterilmiştir 29. Lipid peroksidasyonu sonucu oluşan 4-hidroksinonenal, akrolein ve malondialdehit gibi toksik aldehitlerinde beta hücre apoptozisinde etkili olabileceği düşünülmektedir ve bu alanda hızla çalışmalar gerçekleştirilmektedir. 4-hidroksinonenal in beta hücrelerinde toksik etkilesi, bu aldehit in beta hücrelerinde glutatyon tüketimine neden olarak hücre ölümünü artırması ile gösterilmiştir[48]. Böylece apoptotik beta hücre kaybının gerek tip 1 gerekse tip 2 diyabetin patogenezinde ve ilerleyişinde etkili olduğu bilinmektedir. Burada beta hücre kaybının önlenmesi tedaviye yönelik oldukça anlam ifade etmektedir. 3.2. Endoplazmik retikulum stres Ökaryotik hücreler çoğu zaman membran ağı veya membran labirentine benzetilen endoplazmik retikulum (ER) sistemine sahiptir ve bu sistem hücrelerin çekirdeğine oldukça yakındır. ER, ökaryotik hücrelerde sentezlenen tüm proteinlerin yaklaşık üçte birinin sentezinden sorumludur. Ayrıca proteinlerin oksidatif katlanmaları, hücre zarı,

22 organel zarları ve diğer hücre kompartmanlarına gönderilmek üzere proteinlerin translasyon sonrası değişimi ER da gerçekleşir. Kalsiyum ve redoks hemostazında bozulma, ksenobiyotik aldehitlerin artmış düzeyleri, salgı proteinlerinin sentezindeki artış, hatalı katlanmış proteinlerin birikimi, glukoz yoksunluğu, artmış glikozilasyon, gibi birçok stres faktörü hatalı veya katlanmasını tamamlayamamış proteinlerin ER lümeninde birikmesine neden olur.(şekil:2) Bu durum hücreler için ciddi tehdit oluşturur. Artmış hatalı proteinler ER da sinyal yolaklarını uyararak birçok diğer sinyal proteinlerinin transkripsiyonel veya translasyonel aktivasyonlarına neden olurlar. ER da ki bu değişim katlanamamış veya hatalı katlanmış proteinlere karşı cevaptır (Unfold protein response; UPR)[49-50]. UPR un gerçekleşmesinde önemli proteinlerin mekanizması 1990 ların başında Saccharomyces cerevisiae de yapılan çalışmalarla açıklanmaya başlandı. UPR sinyalinde ve hücrenin hayatta kalmasında etkin ER transmembran protein kinaz/endoribonükleaz (Ire1p/Ern1p) proteini tanımlandı ve UPR sinyali başlatabileceği ortaya konuldu[51-52]. Bundan sonraki çalışmalarda bu sinyal yolunun tüm ökaryotlarda korunmuş olduğu gösterilmiş bu çalışmalar paralelinde UPR sinyalin oluşumunda etkin diğer proteinlerde tanımlanmaya başlamıştır. Şekil 2: Endoplazmik stresi uyaranlar ve endoplazmik retikulumdaki etkisi 31