Meme infiltratif duktal karsinomlarında histopatolojik grade ve proliferasyon belirleyicilerinin prognostik amaçlı kullanımı Hatice Toy, Salim Güngör Selçuk Üniversitesi Meram Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı, Konya Amaç: Çalışmamızda meme kanserlerinde prognozu belirlemede kullanılan proliferasyon markerlarının tümörün histopatolojik grade i ve aksiller tutulumla bağlantısını araştırmayı amaçladık. Yöntem: Yaşları 35-76 arasında değişen 39 kadın hastadan alınan örnekler Selçuk Üniversitesi Meram Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalında incelendi. Arşivlenmiş bloklardan alınan kesitler immunohistokimyasal olarak c-erb-b2, p53, Ki-67, PCNA, östrojen ve progesteron ile boyandı. Hematoksilen- eosin boyamada tümörler Elston-Ellis modifikasyonuna sahip Scarff-Bloom-Richardson yöntemi (Nottingham) kullanılarak grade lendi. Bulgular: Ki-67 ile c-erb-b2; p53 ile tümör grade i; PCNA ile östrojen; progesteron ile östrojen ve PCNA ile progesteron arasında anlamlı ilişki olduğu sonucuna varıldı. Sonuç: c-erb-b2, p53, Ki-67, PCNA, östrojen ve progesteron meme kanseri grade lemesinde önemli markerlardır. Anahtar kelimeler: İnfiltratif duktal karsinom, histopatolojik grade, proliferasyon belirleyicileri Using of proliferation markers and histopathologic grade in infiltrative ductal carcinoma as a prognostic marker Objective: The aim of this study was to explain prognostically importance of cell proliferation markers and histopathologic grade in infiltrative ductal carcinoma. Methods: Therefore 39 specimens excised from women aged 35-76 and had diagnosed as infiltrative ductal carcinoma by Department of Pathology of Selçuk University, Meram Medical Faculty. The slides prepared from archived paraffin blocks were stained immunohistochemistry with estrogen protein receptor, progesterone protein receptor, Ki-67, PCNA, p53 and c-erb-b2. Grade of the tumor was determined with Nottigham system. Results: It is concluded that there are statistically significant relationships between some proliferation markers and grade of the tumor. Conclusion: c-erb-b2, p53, Ki-67, PCNA, estrogen and progesterone are important markers in the grading of breast cancer. Key words: Infiltrative ductal carcinoma, histopathologic grade, proliferation markers Genel Tıp Derg 2004;14(1):7-12 Meme karsinomu kadınlarda görülen en yaygın kanser tipidir (% 31) ve akciğer karsinomundan sonra en yüksek mortaliteye sahiptir. Son yıllarda gelişen teknolojik imkanlar ve laboratuar metodları ile erken tespit edilmeye bağlı prognozda bir iyileşme göze çarpmaktadır. Bununla birlikte meme karsinomunun tipi, proliferasyon belirleyicilerinin oranı yanısıra grade leme ile uygun Yazışma adresi: Hatice Toy, Selçuk Üniversitesi Meram Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı, Konya. e-posta: haticetoy@yahoo.com tedavi seçimi yaşam süresini belirlemede etkili olmaktadır (1). Biz çalışmamızda meme karsinomlarında proliferasyon belirleyicileri, hormon reseptörleri ve grade leme yöntemleri arasındaki bağlantıyı ortaya koymayı amaçladık. Yöntem Çalışmamıza 2001-2002 yılların arasında memede kitle şikayeti ile Selçuk Üniversitesi Meram Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalına başvuran 39 hasta alındı. Bu hastaların ameliyat spesmenleri Selçuk Üniversitesi Meram Tıp Fakültesi Patoloji 7
Anabilim Dalında incelemeye tabi tutuldu ve infiltratif duktal karsinom tanısı aldı. Materyallerin arşivlenmiş bloklarından mikrotom aracılığı ile 5 µ kalınlığında kesitler alındı. Lam üzerine alınan bu kesitler önce xylene serilerinden geçirilerek deparafinize edildi. Bu örneklerin bir kısmı rutin Hematoksilen-Eosin ile boyanırken diğer bir kısmı Avidin-Biotin Peroksidaz yöntemi (ABC metodu) kullanılarak immunohistokimyasal olarak boyandı. İmmunohistokimyasal boyamada östrojen reseptör protein (Clones; 1D5, DAKO), progesteron reseptör protein (Clones; 1A6, DAKO), c-erbb-2 (LSAB2/Envision, DAKO), Ki-67 (Clones; Ki-S5, DAKO), PCNA (Clones; PC-70, DAKO) ve p53 (Clones; DO-7,DAKO) primer antikorları seçildi. Olgular Olympus BH-2 ışık mikroskobu altında farklı büyütmelerde tüm alanlar gözden geçirilerek skorlandı. İmmunohistokimyasal olarak östrojen reseptör protein, progesteron reseptör protein, p53, Ki-67 ve PCNA primer antikorları ile boyanan kesitlerde mevcut olan neoplastik hücrelerden çekirdekleri sarıkahverengi renkte boyananlar pozitif boyanmış kabul edildi. C-erbB-2 primer antikoru ile boyanma için hücre sitoplazmasının boyanması pozitif boyanma kabul edildi. 5 farklı alanda toplam 100 adet tümör hücresi sayılarak bu hücreler arasında bulunan pozitif boyanmış hücreler hesaplandı. Pozitif boyanan hücre oranı tüm hücre sayısına oranlandı ve yüzde (%) olarak ifade edildi. Tüm vakalar Nottigham grade leme sistemi kullanılarak skorlandı. Bu sistemde tümörün içerdiği tübül formasyon yüzdesi, mitoz sayısı ve nükleer pleomorfizm tespit edildi. Verilen puanlar toplanarak grade-i ve III arasında derecelendirme yapıldı. Veriler minimum- maksimum, ortalama ± standart sapma şeklinde özetlendi. Parametrelerin genel olarak, lenf nodu pozitifliği ve grade e göre dağılımları ayrı ayrı ifade edildi. Parametreler arası ilişkinin belirlenmesinde Spearman sıra korelasyon katsayısından (r s ) yararlanıldı. Lenf nodu pozitifliği ve grade e göre parametrelerin ölçülen düzeylerindeki farklılıkların karşılaştırılmasında Kruskal-Wallis varyans analizi ve Mann-Whitney testi kullanıldı. İstatistiksel analizlerin yorumlanmasında hata düzeyi yeterli örnek hacimlerinde P= 0.05, küçük örnek durumlarında P=0.10 alındı. Bulgular Çalışmaya alınan 39 hastanın yaşları 35-73 (ortalama 45.5) arasında değişmekte idi. Nottingham grade leme sistemine göre vakalardan 13 ü grade-i (Şekil 1); 21 i grade-ii (Şekil 2) ve 5 tanesi grade-iii (Şekil 3) olarak değerlendirildi. 20 vakada aksiller tutulum varken; 19 vakada tümör meme dokusuna sınırlı idi. Tümörün histopatolojik grade i ve immunhistokimyasal olarak yapılan östrojen, progesteron ile proliferasyon markırları arasındaki bağlantılar istatistiksel olarak araştırıldı. Bu bağlantılar aksiller tutuluma göre de yeniden değerlendirildi. Ki-67 ile c-erb-b2 (P=0.045); p53 ile histopatolojik (P=0.045) grade; PCNA ile östrojen; östrojen ile progesteron (P=0.05) ve PCNA ile progesteron (P= 0.032) arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki tespit edildi. Diğer belirleyiciler arasında bir ilişki bulunamadı. Markırlar ve gruplar arasındaki bağlantılar ve katsayılar Tablo da gösterilmiştir. Tartışma Tanı ve tedavideki gelişmelere rağmen meme karsinomu özellikle kadınlarda önemli bir ölüm nedeni olmaya devam etmektedir. Prognostik belirleyiciler üzerine yapılan çalışmalar grade leme sistemleri, proliferasyon belirleyicileri, mitoz sayısı gibi parametreleri içermektedir. Mitoz sayısı uzun yıllar prognozu tahmin etmede tek başına kullanılmıştır. Lenf nodu negatif meme tümörlü hastalarda mitoz sayısının düşüklüğü iyi prognoz göstergesi olarak kabul edilmiştir (2,3). Mitotik aktivite hücre siklusunun tamamını yansıtmamaktadır. S fazı mitotik fazdan 10 kez daha uzundur. Bunun yanı sıra tüm tümör hücreleri de mitotik fazdan geçip iki hücre oluşturamamaktadır. S fazına takılıp kalan tümörlerde mitoz sayısı azdır. Tüm bu olumsuzluklara ilave olarak dokuların fiksasyonunda bir gecikme olursa mitoz sayısı azalmaktadır. Eksizyondan sonra 30-60 dakika içinde fiksasyon gerçekleştirilmelidir. Donhuijsen ve ark (4) başlangıçta ve 3 saat sonra fiske edilen tümörlerde mitoz sayısını % 13 ve % 10 olarak bulmuşlardır. 8
Tablo. cerb-b2, grade, Ki-67, LN, östrojen, p53, PCNA ve progesteron arasındaki korelasyonlar (p değerleri parantez içinde) cerb B2 grade Ki-67 LN östrojen P53 PCNA progesteron cerb-b2 0.04 (0.77) 0.32 (0.04) -0.021 (0.9) 0.81 (0.27) 0.22 (0.17) 0.22 (0.17) 0.008 (0.96) Grade 0.04 (0.77) 0.16 (0.30) 0.17 (0.29) -0.07 (0.64) 0.33 (0.03) 0.15 (0.35) 0.04 (0.76) Ki-67 0.32 (0.04) 0.16 (0.30) 0.08 (0.6) 0.25 (0.11) 0.001 (0.9) 0.29 (0.07) 0.21 (0.18) LN -0.021 (0.9) 0.17 (0.29) 0.08 (0.6) 0.12 (0.46) -0.01 (0.9) 0.20 (0.20) -0.18 (0.25) Östrojen 0.81 (0.27) -0.07 (0.64) 0.25 (0.11) 0.12 (0.46) 0.21 (0.20) 0.27 (0.08) 0.68 (0.05) P53 0.22 (0.17) 0.33 (0.03) -0.001 (0.9) -0.01 (0.9) 0.21 (0.20) 0.16 (0.30) 0.18 (0.24) PCNA 0.22 (0.17) 0.15 (0.35) 0.29 (0.07) 0.20 (0.20) 0.27 (0.08) 0.16 (0.30) 0.34 (0.03) progesteron 0.008(0.96) -0.04 (0.76) 0.21 (0.18) -0.18 (0.25) 0.68 (0.05) 0.18 (0.24) 0.34 (0.03) Şekil 1. Grade 1 intraduktal karsinom, H-E, x10 Şekil 4. PCNA, İ.H. boyama, x10 Şekil 2. Grade 2 intraduktal karsinom, H-E, x10 Şekil 5. Cerb-B2, İ.H. boyama, x10 Şekil 3. Grade 2 intraduktal karsinom, H-E, x10 Tümörler heterojen bir büyüme paterni göstermektedir. Bu alandan alana değişen durumu mitotik figürler hariç diğer belirleyiciler daha iyi göstermektedir. Verhoeven ve ark Ki-67 belirleyicisini kullanarak yaptıkları çalışmada (5) tümör periferinde merkeze oranla daha yüksek büyüme oranı bulunduğunu rapor etmişlerdir. Hücre proliferasyon belirleyicileri meme kanserindeki malignitenin derecesini belirlemek yanı 9
sıra, tedaviye cevabı takip ve prognostik özellikleri saptamak için de kullanılmaktadır (6-9). Meme tümörlerinde çok çalışılan ve tedavi yönlendirmesinde önemli bir yere sahip olan östrojen reseptörünü biz de çalışmamızda kullandık. Östrojenin progesteronla ve daha az düzeyde olmak üzere PCNA ile aynı yönde korelasyon gösterdiği; diğer markerlardan ise bağımsız olduğu görülmektedir. PCNA ile olan ilişkisi zayıf da olsa proliferasyonla birlikte değerlendirilebileceğini düşündürmektedir. Ancak tümör grade i ve aksiller tutulumda bağımsız özelliği nedeniyle açık bir prognostik faktör olarak değerlendirilmesi zordur. Negatif östrojen değerlerine aksiller tutulum pozitif olan vakalarda daha çok rastlanması östrojen negatifliğinin kötü prognozda daha değerli bir gösterge olduğunu düşündürmektedir. Bu bulgu literatürle de örtüşmektedir (10). Progesteron reseptörü östrojen reseptörü ile korele bir davranış sergilemektedir (11). Biz de yaptığımız çalışmada progesteron dağılımını ve diğer markerlarla ilişkisini östrojenle benzer bulduk. Tümör agresifliğinin bir göstergesi olarak kabul edilen cerb-b2, yapılan çalışmalarda (12-14) diğer proliferasyon markerları ile yakın benzerlik göstermektedir. c-erb-b2 nin meme kanserlerinde grade formasyonunu oluşturan parametrelerle bağlantısı araştırılmış, c-erb-b2 nin nükleer grade le bağlantısının tubul formasyonu ile bağlantısından daha güçlü olduğu ortaya çıkmıştır (15-16). Bizim çalışmamızda cerb-b2 ile Ki-67 arasında bir korelasyon ortaya konmuştur. Bunun yanı sıra tümör grade i ve aksiller tutulumla cerb-b2 nin birbirinden bağımsız davranışa sahip olduğu belirlenmiştir. Ki-67 nin meme kanserinde prognostik değerini ortaya koymak için yapılan çalışmalarda tedavi öncesi ve sonrasında Ki-67 boyanması karşılaştırılmıştır. Sonuçta tedavi sonrası Ki-67 boyanmasının azaldığı görülmüştür. Weidner ve ark yaptıkları çalışmada (17) Ki-67 proliferasyon belirleyicisini ve mitotik indeksini karşılaştırmış, sonuç olarak her iki parametrenin de proliferasyonu değerlendirmede açık olmayan bir öneme sahip olduklarını göstermişlerdir. Bizim çalışmamızda Ki- 67 ile c-erb-b2 arasında bir korelasyon ortaya konmuştur. Normal hücre siklusunda G1 fazında DNA sentezi başlamadan hemen önce PCNA en üst düzeye ulaşır. DNA replikasyonu ve hasar oluştuğunda tamirin yapılmasından sorumludur. Meme kanserlerinde PCNA düzeyinin yükselmesi prognozu tahminde kullanılabileceğini düşündürmüştür (10,18,19). Çalışmamızda PCNA nın diğer proliferasyon belirleyicileri ile ilişkisini gösteremedik. Bunun yanı sıra östrojenle zayıf bir bağlantının olduğu ortaya çıkmıştır. p53 bir tümör supresor gendir. Proliferasyon belirleyicileri arasında kabul edilmektedir. Warnberg in çalışmasında (20) p53 ün invazyon göstermeyen duktal karsinomlarda daha yüksek düzeyde olduğu gösterilmiştir. Bizim çalışmamızda p53 ile tümör grade i arasında orta derecede bir bağlantı ortaya konmuştur. Diğer belirleyicilerle ve aksiller tutulumla ilişkisi gösterilememiştir. Amat ve ark (21) kabul gören bir grade leme sistemi olan SBR-Elston modifikasyonunu kullanarak İDK lu hastalarda grade in neoadjuvan kemoterapiye cevabı tahminde kullanılabilir bir belirleyici olduğunu göstermişlerdir. Opere edilebilir meme karsinomlu hastaların preoperatif alınan meme biopsilerine Nottingham grade leme yöntemi uygulandı. Bu hastalara uygun kemoterapi verildikten sonra alınan biopsilere yeniden grade leme yapıldı ve ilk sonuçlarla karşılaştırıldı. Sonuçta grade-iii tümörler kemoterapiye grade-ii tümörlerden daha iyi cevap verdi. Kemoterapi sonrası tümör grade lerinde bir düşme dikkati çekti. Meme tümörlerinde grade leme tek başına bir prognostik gösterge olduğu gibi, preoperatif biopsilere uygulandığında kemoterapiye cevap hakkında da sağlam bilgiler verir (21). Meme karsinomlarında grade leme yapmak lenf nodu negatif olan hastalarda önem kazanmaktadır. Bu hastalara adjuvan kemoterapi uygulanmalı mıdır? Lenf nodu negatif hastalar kemoterapiden minör fayda görmektedir. Bazı yazarlar lenf nodu negatif meme tümörlü hastaları düşük ve yüksek risk taşıyan olmak üzere iki gruba ayırmaktadır. Düşük risk grubundaki hastalar grade-i skora sahiptir ve 10 yıllık survi bu grupta % 92 dir. Yüksek riskli grup Grade-II ya da III skora sahiptir ve 10 yıllık survi oranı % 72 dir (22). Tuczek ve ark (23) meme karsinomlarında Nottingham grade leme yöntemini kullanmışlardır. 10
Bu yöntemde yer alan tubul formasyonu, mitoz sayısı ve nükleer pleomorfizm ile 18 özellik içeren görüntüleme analizleri arasındaki bağlantı araştırılmıştır. Görüntüleme analizleri nükleus alanı, çapı, şekil indeksi, görünen yoğunluğu gibi parametreler içeriyordu. Bu parametrelerin mitoz sayısı ve nükleer pleomorfizm ile yakından bağlantılı iken; tubul formasyonu ile herhangi bir bağlantı içermediği tespit edilmiştir. Bizim çalışmamızda grade i oluşturan parametreler ayrı ayrı değerlendirilmemiştir. Proliferasyon markerlarından bağımsız ya da sadece bir-ikisi ile ilişkili görünme sebebi buna bağlı olabilir. Tubul formasyonunun agresiviteyi yansıtmama ihtimali gradeleme yönteminin güvenirliliğini azaltmaktadır. Bunun yanı sıra Norveç te yapılan bir çalışmada (24) ortalama nükleus alanının prognostik bir gösterge olmadığı; tümör grade i, aksiller tutulum ve primer tümörün büyüklüğünün survi ile yakından ilişkili olduğu ortaya konmuştur. Meme karsinomlarının prognozunu belirlemede kullanılan markırlara her geçen gün bir yenisi eklenmektedir. Genetik ve moleküler çalışmalar artmaktadır. Yapılan incelemeler bir markırın diğerine üstünlüğünü açıkça gösterebilmiş değildir. Bu, çalışmanın yapıldığı bölgedeki insanların genetik yapısına ya da gruptaki vaka sayısının azlığına bağlı olabilir. Nitekim çalışmamızda rastgele seçtiğimiz vakalar içinde grade-iii skora sahip hasta sayısı grade-i ve grade-ii olanlarda daha az sayıda bulunmuştur. Bu durum istatistiksel değerlendirmeyi etkilemiş, olası bağlantıları perdelemiş olabilir. Daha büyük serilerde yapılacak çalışmalar ışık tutucu olabilir. Meme kanserlerindeki markırların çeşitliliği de dikkati çeken bir başka durumdur. Uzun yıllar tek bir markırın diğerlerine üstünlüğü araştırılmıştır. Bunun yerine birden çok parametrenin ifade ettiklerinin değerlendirilmesi daha yerinde olacaktır. Kaynaklar 1. Rosai J: Breast. In: Ackerman s Surgical Pathology. 1996, 8. ed. Vol: 2. Chapter: 20, 1623-6. 2. Clayton F. Pathological correlates of prognosis in lymph node-negative infiltrating ductal carcinomas: Mitotic count is the best single indicator. Cancer 1991;68:1309-17. 3. Aranda I F, Laforga B J. Cellular proliferation in breast ductal infiltrating carcinoma. Pathol Res Pract 1997;193:683-8. 4. Donhuijsen K, Schmidt U, Hirche H. Changes in mitotic rate and cycle fractions caused by delayed fixation. Hum Pathol 1990;21:709-14. 5. Verhoeven D, Bourgeois N, Derde MP. Comparison of cell growth in different parts of breast cancers. Histopathology 1990;17:505-9. 6. Jensen R A, Page DL, Dupont WD, Rogers LW: Benign disorders and disease of the breast. 1989, Biliere Tindall, London. 7. Bottini A, Berruti A, Bersiga A, Brizi MP, Bruzzi P, Aguggini S. Relationship between tumour shrinkage and reduction Ki- 67 expression after primary chemotherapy in human breast cancer. Br J Cancer 2001;19:1106-12. 8. Shoker BS, Jarvis C, Clarke RB, Anderson E, Munro C, Davies MP. Abnormal regulation of the estrojen reseptor in benign breast lesions. J Clin Pathol 2000; 53:778-83. 9. Ringberg A, Anagnostaki L, Anderson H, Idvall I, Ferno M. Cell biological factors in ductal cacinoma in situ (DCIS) of the breast- relationship to ipsilateral local recurrence and histopathological characteristics. Eur J Cancer 2001;37:1514-22. 10. Horita K, Yamaguchi A, Hirose K, Ishida M, Noriki S, Imamura Y, et al. Prognostic factors affecting disease-free survival rate following surgical resection of primary breast cancer. Eur J Histochem 2001;45:73-84. 11. Aziz SA, Pervez S, Khan S, Kayani N, Azam SI, Rahbar MH. Case control study of prognostic markers and disease outcome in inflammatory carcinoma breast: A unique clinical experience. Breast J 2001;7:398-404. 12. Jarvinen TA, Tanner M, Rantanen V, Barlund M, Borg A, Greinman S. Amplification and deletion of topoisomerase IIa associate with ErbB-2 amplification and affect sensitivity to topoisomerase II inhibitor doxorubicin in breast cancer. Am J Pathol 2000;156:839-47. 13. Bezwoda WR. C-erb-B2 expression to treatment in metastatic breast cancer. Med Oncol. 2000;17:22-8. 14. Soslow RA, Carlson DL, Horenstein MG, Osborne MP. A comparison of cell cycle markers in well differentiated lobular and ductal carcinomas. Breast Cancer Res Treat 2000;61:161-70. 15. Birner P, Oberhuber G, Stani J. Evaluation of the United States food and drug administration- approved scoring and test system of HER-2 protein expression in breast cancer. Clin Cancer Res 7:2001:669-75. 16. Fitzgibbons ER, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM. Prognostic factors in breast cancer. College of American Pathologists Concensus Statement 1999. Arch Pathol Lab Med 124:2000:66-78. 17. Silva JM, Gonzales R, Provencio M, Dominguez G, Garcia JM, Gallego I, et al. Loss of heterozygosity in BRCA1 and BRCA2 markers and high grade malignancy in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 1999;53:9-17. 18. Dutta A, Chandra R, Leiter LM, Lester S. Cyclins as markers of tumour proliferation: Immunohistochemical studies in breast cancers. Proc Natl Acad Sci 1995;92:5386-90. 19. Kato T, Kimura T, Takami N, Miyakawa R, Tanaka S. New prognostic factors associated with long-term survival in nodenegative breast cancer patients. Breast Cancer 1999; 6:370-7. 11
20. Warnberg F, Nordgren H, Bergkvist L, Holmberg L. Tumour markers in breast carcinoma correlate with grade rather than with invasiveness. British J Cancer 2001:85,869-74. 21. Amat S, Penault-Llorca F, Cure H. Scarff- Bloom- Richardson (SBR) grading: A pleiotropic marker of chemosensitivity in invasive ductal breast carcinomas treated by neoadjuvant chemotherapy. Int J Oncology 2002;20: 791-6,. 22. Raabe N, Schistad O, Sauer T, Bofin A. Prognosis of radically operated breast carcinoma patients. APMIS 1997;105:363-70. 23. Tuczek HV, Fritz P, Schwarzmann P. Breast carcinoma: Correlations between visual diagnostic criteria for histologic grading and features of image analysis. Analyt Quant Cytol Histol 1996;18:481-93. 24. Smith B F, Zappi E M. Relationships between image cytometric DNA index, proliferation fraction and multipoidy and conventional nuclear grade in breast carcinoma. Modern Pathology 1993;6:606-11. 12