BÖLGEMİZDEKİ HLA (HUMAN LÖKOSİT ANTİJENLERİ) DAĞILIMI

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI BÖLGEMİZDEKİ HLA (HUMAN LÖKOSİT ANTİJENLERİ) DAĞILIMI Biyolog Pınar ETİZ YÜKSEK LİSANS TEZİ TEZ YÖNETİCİSİ Prof. Dr. Akgün YAMAN Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Rektörlüğü Araştırma Fonu, TF2008YL3 nolu proje olarak desteklenmiştir. ADANA-2009

KABUL VE ONAY FORMU Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Programı Çerçevesinde yürütülmüş olan Bölgemizdeki HLA (Human Lökosit antijenleri) Dağılımı adlı çalışma, aşağıdaki jüri tarafından Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Tez Savunma Tarihi: 22/01/2009 İmza Prof. Dr. Akgün Yaman Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Jüri Başkanı İmza Prof. Dr. Fatih Köksal Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi İmza Prof. Dr. Yeşim Taşova Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Yukarıdaki tez, Yönetim Kurulunun... tarih ve... sayılı kararı ile kabul edilmiştir. Prof. Dr. Halil KASAP Enstitü Müdürü

TEŞEKKÜR Eğitim sürem boyunca bilimsel desteklerini esirgemeyen, her zaman hoşgörülü davranan her konuda rahatlıkla danıştığım, büyük desteklerini gördüğüm ve engin tecrübelerinden faydalandığım danışman hocam Sayın Prof. Dr. Akgün YAMAN a, eğitimim süresince her türlü katkılarından dolayı Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Fatih KÖKSAL ve diğer öğretim üyeleri ile Anabilim Dalı sekreteri Suna Gökmen e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmamda yardımlarını benden esirgemeyen Bio. Dr. Salih ÇETİNER e, Arş. Gör. Dr. Aygül TURAÇ BİÇER e, Y.L. öğrencisi Esra ZORLUER e, İmmünoloji Laboratuvarı çalışanlarına ve istatiksel analizlerin hazırlanmasındaki katkılarından dolayı Doç. Dr. Gülşah ŞEYDAOĞLU na ve her zaman bana destek olan, yardımlarını benden esirgemeyen sevgili aileme çok teşekkür ederim. Pınar ETİZ II

İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY I TEŞEKKÜR II İÇİNDEKİLER III-IV TABLOLAR DİZİNİ V ŞEKİLLER DİZİNİ VI KISALTMALAR VII ÖZET VIII ABSTRACT IX 1.Giriş 1 2.Genel Bilgiler 2 2.1.Major Doku Uyum Kompleksi (Majör Histocompatibility Complex-MHC) 2 2.2.İnsan Lökosit Antijeni (Human Leucocyte Antigen-HLA) 3 2.3.HLA Antjenlerinin Sınıflandırılması ve Fonksiyonları 4 2.3.1.Sınıf I Antijenler ve Fonksiyonları 4-5 2.3.2.Sınıf II Antijenler ve Fonksiyonları 5-7 2.3.3.Sınıf III Antijenler ve Fonksiyonları 8 2.4.HLA Genleri 8-15 2.5.Küçük Doku Uyum Antijenleri (Minör Histocompatibility Antigens) 16 2.6.Graft Versus Host 16-17 2.7.HLA Antijenlerinin Özellikleri 17 2.7.1.HLA Toplum ve Özel Antijenler 17 2.7.2.Dengesiz Bağlantı (Linkage Disequilibrium) 18 2.7.3.İmmun Cevap Genleri 18 III

2.8.HLA Genlerinin Kalıtımı 19 2.9.HLA Antijenlerinin Diğer Kullanım Alanları 20 2.10.HLA ve Hastalık İlişkisi 20-23 2.11.HLA Tiplendirimi 24 3.Gereç ve Yöntem 25-40 4.Bulgular 41-54 5.Tartışma 55-57 6.Sonuç ve Öneriler 58 Kaynaklar 59-61 Özgeçmiş 62 IV

TABLOLAR DİZİNİ Tablo 2.1. A-İnsanda HLA antijen sistemi 6 B-Farede H-2 antijen sistemi 6 Tablo 2.2. HLA bölgesindeki genlerin adları 10 Tablo 2.3. HLA antijenlerinin splitleri 18 Tablo 2.4. Bazı hastalıklar ve ilişkili HLA antijenleri 23 Tablo 2.5. HLA alellerini tanımlarken kullanılan terminoloji 24 Tablo 3.1. Nomenklatüre geçmiş allel listesi (2008) 27-37 Tablo 4.1. Hasta ve donör grubunda tespit edilen allel listesi 44-54 V

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1. Sınıf I ve Sınıf II HLA moleküllerin şematik görüntüsü 7 Şekil 2.2. HLA gen bölgesinin 6. kromozom üzerinde yerleşimi ve 9 Sınıf I, II, III bölgeleri Şekil 2.3. HLA ile peptid bağlanma bölgesinin şematik görünümü 11 Şekil 2.4. HLA sınıf I ve sınıf II molekülleri 13 Şekil 2.5. HLA molekülünün endojen ve eksojen peptidler ile ilişkisi 14 a. HLA-Sınıf I molekülleri ile Endojen peptidlerin ilişkisi b. HLA-Sınıf II molekülleri ile eksojen peptidlerin ilişkisi Şekil 2.6. HLA Sınıf I ile T-hücre reseptör bağlantısı 15 Şekil 2.7. HLA genlerinin kalıtımı 19. VI

KISALTMALAR AG : Allel gen cm : Santimorgan DNA : Deoksiribonükleik Asit GVHH : Graft Versus Host Hastalığı HLA : Human Leucocyte Antigen (İnsan lökosit antijeni) IDDM : Insuline Derived Diabetus Mellitus (İnsüline Bağlı Diyabet Hastalığı) KD : Kilodalton MHC : Majör Histocompatibility Complex (Majör doku uyum kompleksi) mhc : Minör Histocompatibility Complex (Küçük doku uyum kompleksi) mhag : Minör Histocompatibility Antigens (Küçük doku uyum antijenleri) PCR : Polimerase Chain Raection (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) PGM3 : Fosfogluktomutaz 3 RA : Romatoid Artrid SSO : Sequence Specific Oligonucleotides SSP : Sequence Specific Primer TAP : Transporters associated with antigen processing TNF : Tumor Necrosis Factor (Tümör nekrozitan faktör) VII

ÖZET BÖLGEMİZDEKİ HLA ANTİJENLERİNİN DAĞILIMI Bu çalışmada, bölgemizde ki Human Lökosit Antijenlerinin (HLA) sıklığı araştırılmıştır. Bu amaçla; Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi Merkez Laboratuvarı immünoloji birimine HLA antijenlerini belirlemek amacıyla gönderilen örnekler değerlendirmeye alınmıştır. Çalışmamızda 339 hasta, 432 donör olmak üzere; toplam 771 kişinin verileri incelenmiş ve her bir lökosit antijenin sıklığı hesaplanmıştır. HLA antijenlerinin belirlenmesinde PCR-SSO (squence spesific oligonucleotid) yöntemi kullanılmıştır. Hasta ve donörlerin toplamını birlikte değerlendirdiğimizde yöremizde en sık saptadığımız antijen HLA-Cw4 olup görülme sıklığı %30,5 dir. Bunu sırasıyla HLA-A2 (%29,8), HLA-Cw12 (%25,9), HLA-B35, -B51 (%21,7), HLA-A24 (%20,0) izlemiştir. En az sıklıkla tespit ettiğimiz antijenler HLA-A31, -A36, -A66, -A15, -A34, - B48, -B54, -B56, -B58, -DQ7, -DR6, -DR9 olup görülme sıklıkları % 0,1 dir. Hasta populasyonunda en sık tespit ettiğimiz alleller HLA-A2 100(%29,5), HLA-A1 74(%21,8) ve HLA-A3 60(%17,7) şeklinde sıralanmıştır. Donör grubunda da bu sıralama HLA-A2 130(%30,1), HLA-A1 88(%20,4) ve HLA-A3 67(%15,5) şeklindedir. En az sıklıkla tespit ettiğimiz alleller ise HLA-A31, -A36, -A66, -A15, - A34 şeklinde olup görülme sıklıkları % 0,1 dir. Anahtar Kelimeler: MHC, HLA, PCR-SSO VIII

ABSTRACT THE DISTRIBITION OF HLA ANTIGENS IN OUR REGION In this study, frequencies of HLA in our region have been determined. With this aim, the samples which were sent to Immunology Laboratory of the Center Laboratory Medicine Faculty of Çukurova University, were taken to be determined the types of HLA antigens. In this study, the datas of 771 person (339 patient, 432 donor) were analysed and the frequency of each lökosit antigen were calculated. PCR-SSO (sequence spesific oligonucleotid) method was used to determine HLA antigen. If we determine the datas of patients and donors totaly, the most common HLA antigen in our region is HLA-Cw4 with the frequency of %30,5. HLA-A2 (%29,8), HLA-Cw12 (%25,9), HLA-B35, -B51 (%21,7), HLA-A24 (%20,0) followed this in turn. The least common leucocyte antigens which we determine are HLA-A31, -A36, -A66, -A15, -A34, -B48, -B54, -B56, -B58, -DQ7, - DR6, -DR9 with frequency of % 0.1. The most common HLA allels in this patient population are HLA-A2 100(%29,5), HLA-A1 74(%21,8) ve HLA-A3 60(%17,7). This gradation in donor group is HLA-A2 130(%30,1), HLA-A1 88(%20,4) and HLA-A3 67(%15,5). The least common leucocyte antigens which we determine are HLA-A31, -A36, -A66, - A15, -A34 with frequency of % 0.1. Key Words: MHC, HLA, PCR-SSO IX

1.GİRİŞ MHC (majör histocompatibility complex), bütün omurgalılarda bulunan ve bağışıklıkla ilgili bir takım fonksiyonları olan ve olmayan bir gen grubudur. İnsanda MHC, insan lökosit antijenleri (HLA) olarak adlandırılır. HLA, insanda MHC gen bölgesinden ekprese edilen glikoprotein yapısında moleküllerdir. İnsanda MHC antijenlerini kodlayan gen bölgesi 6. Kromozomun kısa kolu üzerindedir. HLA antijenleri yapısal ve fonksiyonel özelliklerine göre üç farklı gruba ayrılır: Sınıf I (HLA-A, -B, -C), Sınıf II (HLA-DR, -DQ, -DP) ve Sınıf III (properdin faktör B (BF), tümör nekrozis faktör (TNF), C4A, C4B, C2) Sınıf I antijenler glikoprotein yapısında olup vücutta tüm çekirdekli hücrelerin zarında bulunurlar. İki polipeptid zincirinden oluşmuşlardır. Bunlardan 44 KD mol ağırlığında olan glikoprotein, alfa zinciridir. Bu zincire nonkovalent olarak 12 KD mol ağırlığında küçük bir protein molekülü bağlanmış olup, ''Beta-2 mikroglobulin'' adını almıştır. Alfa zinciri α 1, α 2, α 3 diye üç birimden oluşmaktadır. Sınıf II antijenleri sadece bazı hücrelerin örneğin monositler, aktive T lenfositleri ve B lenfositleri ile Langerhans ve dendritik hücrelerin yüzeyinde bulunabilmektedirler. Antijen sunan hücreler sınıf II moleküllerini yüzeyinde taşırlar. Makrofaj ve lenfositlerin etkileşiminde rol oynamaktadırlar. Sınıf II antijenleri birbirine non kovalent bağlarla bağlanmış 2α ve 2 β zincirinden oluşmaktadır. α zinciri yaklaşık 34 KD, β zinciri ise 29 KD ağırlığında bir glikoproteindir. Sınıf III antijenleri ise Sınıf I ve sınıf II bölgeleri arasında yer almaktadır. kompleman sistemin klasik yolunun C2, C4B, C4A alternatif yolun properdin faktör B komponentlerini ve tümör nekrozis faktör α ve β yı kodlamaktadır. HLA allellerinin belirlenmesi için Serolojik, Hücresel ve Moleküler yöntemler kullanılmaktadır. Günümüzde pek çok laboratuar HLA polimorfizmini moleküler metotlar kullanarak test etmektedir. Çeşitli çalışmalarda farklı toplumların HLA antijen dağılımları ve frekansları incelenmiştir. Bu çalışmada ise bölgemizde ki HLA antijenlerinin dağılımları, en sık ve en nadir görülen HLA antijenleri saptanmıştır. 1

2. GENEL BİLGİLER 2.1. Majör Doku Uyum Kompleksi (Majör Histocompatibilty Complex-MHC) 1931 yılında Landsteiner eritrosit antijenlerini keşfetmiş, kan transfüzyonu için grup uyuşumunun gerekliliğini ve doku/organ transplantasyonları için de doku antijenlerinin uyumundan söz etmiştir. 1930 lu yıllarda R.A. Gorer ve G.D. Snell farelerde doku antijenlerinin varlığından söz etmiştir (1,2). Farelerde spontan gelişen tümörlerin yine aynı farede kendiliğinden kaybolabildiği fark edilince, bu tümörleri hasta fareden alıp sağlıklı fareye aktarma girişiminde bulunuldu. Ancak tümör transplantasyonu farelerin çoğunda hüsranla sonuçlandı. Akraba fareler arasında transplantasyonun başarılı olduğunun fark edilmesi bugünkü bilgilerimizin temelini oluşturmaktadır. Bu sonuçları doğal olarak doku naklinde ki red olayının sadece tümör dokusuna karşı mı yoksa aynı zamanda sağlıklı dokulara karşı da olup olmayacağı sorusu izledi (3). Birbirine çok yakın veya daha uzak akrabalık gösteren fareler arasında yapılan transplantasyon deneyleri doku reddinde rol oynayan gen bölgelerinin saptanmasını sağladı. Böylece farelerde bir bölgenin çok güçlü etkisi olduğu, bunun dışında yer alan 10-20 kadar daha zayıf etkide bölgenin bulunduğu anlaşıldı ve bu genlerin tümüne doku uyum bölgesi (tissue histocompatibility loci) adı verildi. Farelerde bu ilk çalışmalar sonucunda bu genlere histokompatibilite antijeni karşılığı olarak H-2 adı verildi (4,5). İnsanlarda ise en güçlü etkiye sahip olan bölge, esas doku uyum bileşkesi (majör histocompatibility loci= MHC) olarak adlandırılırken diğerleri de ufak doku uyum bileşkesi (minör histocompatibility complex= mhc) olarak tanımlandı (4). MHC molekülleri peptid antijenlerini T lenfositlerinin tanıması için gösteren membran proteinleridir. MHC bireyler arasında yapılan, doku naklinde kabul ya da reddi belirleyen ana genetik lokus olarak keşfedilmiştir. Diğer bir deyişle, MHC lokusları özdeş olan bireyler arasında (eş-soylu (inbred) hayvanlar ya da tek yumurta ikizleri) yapılan değişimlerde doku kabul edilir ve MHC lokuslarında fark olanlarda doku reddi görülür. Doku reddi tabii ki, doğal bir biyolojik fenomen değildir ve bu yüzden MHC genleri ve kodladıkları moleküller yalnızca doku reddine aracılık etmek 2

için evrimleşmiş olamaz. MHC moleküllerinin fizyolojik işlevi protein antijenlerinden kaynaklanan peptidleri antijene özgül T lenfositlerine göstermektir (6,7). 2.2. İnsan lökosit antijeni (Human Leucocyte Antigen-HLA) İnsanda MHC, insan lökosit antijenleri (HLA) olarak adlandırılır (1). HLA, insanda MHC gen bölgesinden ekprese edilen glikoprotein yapısında moleküllerdir (8, 9). İnsanda MHC antijenlerini kodlayan gen bölgesi 6. Kromozomun kısa kolu üzerinde sentromere yakın bir bölgede ardışık bir DNA alanıdır (6p 21.3). Tablo 2.1.A da MHC genlerin 6. Kromozom üzerindeki organizasyonu gösterilmiştir (8). Burası 4 santimorgan (cm) büyüklüğünde bir bölge olup 203 tane gen immun sistemle ilgilidir. MHC sistemi polimorfik olup kalıtım şekli ise Mende-lian ve kodominattır (1,10,11). İnsanda MHC genleri Mendel kuralına göre ebeveynden çocuklara geçiş göstermektedir (12,13). HLA antijenleri fetusun erken safhasında (6.hafta) meydana çıkmakta ve sentezlenmeleri yaşam boyu devam etmektedir (8,14). Her bireyde bir çift kromozomun yarısı anneden yarısı babadan geçer. Böylece çocuklar ile anne-baba arasında bir haplotip uygunluğu vardır. Bir haplotipde bulunan alleller bir blok halinde geçer. Bir bireyin HLA genotipi; Örnek: A2 Cw2 B27 DR1 DQ5 DP4 A32 Cw3 B65 DR11 DQ1 DP6. Bu haplotiplerin biri anneden diğeri babadan geçmiştir. Genetik geçiş sırasında %1-3 oranında rekombinasyon (Çapraz geçme=crossing over) görülebilir. Aynı kromozom veya haplotipde bazı allellerin birbirleri ile birlikte görülme sıklıkları beklenenden daha yüksek saptanmıştır. Örneğin A1 ile B8 ve A2 ile B12 ve A3 ile B7 sıklıkla birlikte bulunur. Bu durum linkage disequlibrium olarak ifade edilir. Farklı toplumlarda bu beraberlikler değişiklikler gösterir (13). HLA moleküllerinin immün sistemdeki rolü T hücrelerine antijen sunumudur. T hücrelerinin antijen reseptörleri antijeni direkt olarak tanıyamaz, yabancı antijenler HLA moleküllerine bağlanmış küçük peptid formunda sadece tanınabilirler. HLA moleküllerine bağlanan antijenler normal adaptive immün cevapların aktivasyonunda anahtar bir rol oynar. Bir HLA molekülünün antijenik peptidi tanıması için, reseptör ve ligand arasında geometrik ve elektrostatik uygunluk kimyasal bağların formasyonu için esansiyeldir (15). 3

2.3. HLA Antijenlerinin Sınıflandırılması ve Fonksiyonları HLA antijenleri yapısal ve fonksiyonel özelliklerine göre 3 farklı sınıfa ayrılır: a) Sınıf I Antijenler: Bu grupta HLA-A, -B, -C antijenleri yer alır b) Sınıf II Antijenler: Bu grupta HLA-DR, -DQ, -DP antijenleri yer alır. c) Sınıf III Antijenler: Bu grupta properdin faktör B (BF), C2, C4A, C4B, TNF, Steroid 21 hidroksilaz A ve B yer alır. 2.3.1. Sınıf I Antijenler ve Fonksiyonları Sınıf I antijenler glikoprotein yapısında olup vücutta tüm çekirdekli hücrelerin zarında bulunurlar (16,17). İki polipeptid zincirinden oluşmuşlardır. Bunlardan 44 KD mol ağırlığında olan glikoprotein, alfa zinciridir. Bu zincire nonkovalent olarak 12 KD mol ağırlığında küçük bir protein molekülü bağlanmış olup, ''Beta-2 mikroglobulin'' adını almıştır. Bu molekül MHC bölgesi dışında 15. kromozomdaki genler tarafından sentezlenmekte ve moleküle sonradan bağlanmaktadır. Bu molekül bütün insanlarda aynıdır. Serum ve idrarda da bulunur. Yapı olarak Ig molekülünün sabit kısmındaki domainlere benzer disülfit bağı vardır. β 2 mikroglobulin, alfa zincirinden ayrılırsa ya da konjenital olarak yoksa HLA sınıf I molekülü fonksiyonunu kaybeder (8,18). Sınıf I moleküllerinin hücre yüzeyine yerleşebilmeleri için β 2 mikroglobuline gereksinimleri vardır (8,10). β 2 mikroglobulin molekülün üç boyutlu yapısının korunmasında rol almaktadır (19). Alfa zinciri α 1, α 2, α 3 diye üç birimden oluşmaktadır. Molekülün N ucundaki α 1 ve α 2 birimlerinin aminoasit sıralamalarındaki farklılıklar, molekülün polimorfizmini oluşturmaktadır. Burası peptid bağlama bölgesi olup alfa zincirinin önemli kısımlarından biridir. HLA ile peptid bağlama bölgesinin şematik görünümü şekil 2.3. te gösterilmiştir (3). Fonksiyonel bakımdan da en önemli bölgedir. HLA moleküllerinin esas fonksiyonlarından biri immünojenik peptidleri bağlamaktır. CD + 8 T lenfositleri endojen sentezlenen protein moleküllerini, HLA sınıf I antijeniyle birlikte tanımaktadır. Bu bağlanmada T hücre reseptörü immünojen peptidi tanırken T + hücresinin CD 8 molekülüde HLA sınıf I antijenin peptid bağlama bölgesi dışındaki yerine bağlanmaktadır. Bu tanıma ve bağlanma sonucu CD + 8 T lenfositi hedef hücreyi lizise uğratmaktadır. Şekil 2.5a da HLA sınıf I molekülleri ile endojen peptidlerin ilişkisi gösterilmiştir (3). Sitotosik T hücrelerinin virusla enfekte hücreleri tanımada HLA 4

sınıf I antijenlerine bağımlılığı vardır. Yani yabancı virus antijeni, enfekte hücre yüzeyinde HLA-A, B, C antijenleri ile beraber olursa tanınmaktadır. Sitotoksik T hücresi ile virusla enfekte hücrenin HLA sınıf I antijeni farklı ise bu tanıma olmamakta ya da çok az olmaktadır (6,8,18). HLA sınıf I molekülünün ikinci bölgesi α 3 birimi taşımaktadır. α 2 segmentinin COOH terminalinden başlayıp plazma membranına kadar uzanır (20). Polimorfizmi yoktur. T lenfosit tanıma olaylarında, T hücresinin CD 8 molekülü HLA sınıf I molekülünün α 3 birimine bağlanmaktadır (8). HLA molekülünün üçüncü bölgesi zar içerisinde kalan kısımdır. Hidrofobik 25 aminoasitlik bu kısım, plazma zarının lipid çift tabakasına bağlanmaktadır (8). Molekülün dördüncü bölgesi ise sitoplazma içerisine giren 30 amino-asitten oluşmaktadır. Bazı kısımları büyük ölçüde korunmuş olsa da molekülün değişkenlik gösterebilen kısımlarından biridir. Bu kısımın fosforilasyonu, transpeptidasyonu molekülün diğer hücre içi proteinlerle iletişimini sağlarken bazı kısımların delesyonu da class I molekülün internalizasyonunu önler (20). Bu kısım bütün HLA sınıf I tiplerinde aynıdır (6). 2.3.2. Sınıf II Antijenler ve Fonksiyonları Sınıf II antijenleri sadece bazı hücrelerin örneğin monositler, aktive T lenfositleri ve B lenfositleri ile Langerhans ve dendritik hücrelerin yüzeyinde bulunabilmektedirler. Kısacası antijen sunan hücreler sınıf II moleküllerini yüzeyinde taşırlar. Makrofaj ve lenfositlerin etkileşiminde rol oynamaktadırlar (4,21). HLA sınıf II antijenleri, başlangıçta HLA-D olarak adlandırılmış daha sonra farklı antijenler bulununca D ile ilgili anlamında HLA-DR (D-related) antijeni denmiştir. Alfabede yatkınlığı nedeniyle bu bölgede ki diğer farklı antijenlere de HLA-DQ, HLA- DP denmiştir. Farelerde HLA-D bölgesine karşılık I bölgesi vardır. Bu bölgede eski terminolojide 5 alt bölge tanımlanmıştır (I-A, I-B, I-J, I-E ve I-C). A α ve A β peptidleri I-A molekülünü, E α ve E β peptidleride I-E molekülünü oluşturur. I-J bölgesinin salgılarının supresör T fonksiyonunda etkili olduğu sanılmaktadır. İnsanda ki HLA-DP, DQ ve DR faredeki I-A ve I-E bölgelerine eşdeğer bölgelerdir (16,14,8). Farede MHC gen bölgesi tablo 2.1.B de gösterilmiştir (8). 5

Tablo 2.1.A- İnsan doku uygunluk antijenlerini kodlayan (MHC) genlerin 6. Kromozomun kısa kolu üzerindeki organizasyonu (8) Tablo2.1.B- Farede H-2 doku antijenlerini kodlayan (MHC) genlerin 17. Kromozomun kısa kolu üzerindeki organizasyonu (8) HLA sınıf II moleküller, non-kovalent bağlarla bir arada tutulan alfa ve beta olmak üzere iki adet transmembran glikoprotein zincirinden oluşan heterodimerlerdir. Her iki zincirinde hücre zarı dışında sırasıyla α 1, α 2 ve β 1, β 2 olmak üzere 2 domainleri bulunur. Membranın distaline yerleşen ve polimorfik bir yapı gösteren α 1 ve β 1 zincirleri sınıf I moleküllerde olduğu gibi antijenlere ait peptidlerin yerleşebileceği kovuğa benzer bir yapı oluştururlar. Buraya yerleşenler, hücre dışından kaynaklanan (eksojen), daha büyük peptidlerdir. α 2 ve β 2 bölgeleri, sınıf I moleküllerdeki gibi Ig benzeri yapılar oluştururlar (19). Hücreler arası tanıma reaksiyonlarında, CD + 4 T lenfositi immünojen peptidi HLA sınıf + II antijeni ile birlikte tanımaktadır. CD 4 T lenfositi reseptörü, HLA sınıf II + molekülünün peptid bağlama bölgesindeki yabancı peptide, CD 4 molekülü ise HLA sınıf II nin polimorfizim göstermeyen bölgelerine bağlanmaktadır. Bu tanıma ve bağlanma sonucu yabancı peptide karşı immün yanıt oluşmaktadır. HLA sınıf II molekülleri ile eksojen peptidlerin ilişkisi şekil 2.5b. de gösterilmiştir (3). Molekülün 6

üçüncü bölgesi 25 aminoasitlik hidrofobik transmembran kısımdır. Hücre membranına tutunmayı sağlar. Dördüncü bölge olarak da hidrofilik özellikte sitoplazmik bölge vardır (8,22). Sınıf II moleküllerin hücre içi dağılımlarını ve diğer moleküllerle ilişkilerini belirlemede rol almaktadır (20). Sınıf-I ve Sınıf-II HLA molekülünün şematik yapısı Şekil 2.1. de gösterilmiştir (19). Şekil 2.1. Sınıf I ve Sınıf II HLA moleküllerin şematik görüntüsü (19) 7

2.3.3. Sınıf III Antijenler ve Fonksiyonları Sınıf I ve sınıf II bölgeleri arasında, kompleman sistemin klasik yolunun C2, C4B, C4A alternatif yolun properdin faktör B komponentlerini ve tümör nekrozis faktör α ve β yı kodlayan sınıf III bölgesi yer almaktadır. Steroid 21 hidroksilaz A ve B de bu grupta yer alır. Transplantasyon antijenleri olarak rol oynamadıkları gibi T hücrelerine de antijen sunmamaktadırlar (8,23). Görevleri, inflamasyon oluşumu, yabancı materyalin fagositoz için opsonize edilmesi, çeşitli hücre ve mikroorganizmalara karşı antikorla ilişkili sitotoksisitenin düzenlenmesi olan kan proteinleri ile ilgili bir kompleksin üyeleridir. C2, C4, BF genleri kompleman komponenti C3 proteinini aktive ederler. TNF ateş yükselmesi, tümörlerin inhibisyonu, kompleman genlerinin transkripsiyonun uyarılması ve nötrofilik granülositlerin aktivasyonu ile görevlidir. 21-hidroksilaz ise kortizol biyosentezi ve TNF sentezi ile ilgilidir (24,25). 2.4. HLA Genleri HLA antijenlerinin sunumundan sorumlu olan genler 6. kromozomun kısa kolu üzerine sentromere yakın bir bölgede (6p21.31) yerleşmiş olup yaklaşık olarak 4 Mbp lik bir yer kaplar. HLA antijenlerinin 6. Kromozom üzerindeki yerleşimi şekil 2.2. de gösterilmiştir (3). İlk tanımlamayı, Jan Klein 1977 yılında sınıf I, II, III şeklinde yapmıştır. Günümüzde HLA sınıf III e ait olan bölgenin telomerik ucundaki 0.3 Mbp lik kısmın sınıf IV bölgesi olarak isimlendirilmesi önerilmektedir (26,27). Sınıf I HLA-A, -B, -C, -D, -E, -F ve -G genleri işlevsel HLA izoformlarını oluşturur. Bunlardan ilk üçü klasik sınıf I antijenlerini sentezletir (3). Klasik olmayan HLA-E, -F ve -G ise doğal öldürücü hücreler ile ilişkili immün yanıtta görev almaktadırlar. Buna ilaveten HLA-H, -J, -K ve -L olarak adlandırılan ve bugün için henüz immünolojik özelliği olmadığı düşünülen yalancı genler bulunmaktadır. Tüm bireylerde, 6. kromozom HLA-A dan -G ye kadar tüm 6 bölge genleri bulunurken bazı bireylerde HLA-H yalancı gen bölgesini içeren delesyonlar saptanmıştır. Moleküler HLA sınıf I tiplendirilmesinde kodlama ve polimorfik özelliklerine sahip ekson 2 en çok kullanılan bölgedir. Tüm sınıf I genler 3-6 kb uzunluktadır (4,5). Sınıf II bölge genleri 6 kromozom üzerine yerleşmiş olan beş izoform (HLA-DM, - DO,-DP,-DQ ve DR) ve her birinin hem alfa hem beta zincir genleridir. Klasik sınıf II 8

antijenleri olan HLA-DR, -DQ ve -DP nin sentezlenmesini sağlarlar. Sınıf II genler 4-11 kb uzunluktadır (4). HLA bölgesindeki genlerin adları tablo 2.2 de gösterilmiştir (19). Şekil 2.2. HLA gen bölgesinin 6. kromozom üzerinde yerleşimi ve Sınıf I, II, III bölgeleri (3) 9

Tablo 2.2. HLA bölgesindeki genlerin adları (19) Adı Eski Adı Moleküler Özellikler HLA-A - Class I α -zinciri HLA-B - Class I α -zinciri HLA-C - Class I α -zinciri HLA-E E, 6,2 Class I gen HLA-F F, 5.4 Class I gen HLA-G G, 6.0 Class I gen HLA-H H, AR, 12.4 Class I psödogen HLA-J cda12 Class I psödogen HLA-K HLA-70 Class I psödogen HLA-L HLA-92 Class I psödogen HLA-N HLA-30 Class I gen HLA-S HLA-17 Class I gen HLA-X HLA-X Class I gen fragmanı HLA-Z HLA-Z1 HLA class II bölgesi içinde Class I gen fragmanı HLA-DRA DRα DR α - zinciri HLA-DR1 DRβ1, DR1B DR1, DR2, DR3, DR4, DR5 gibi özellikleri belirleyen DR β1- zinciri HLA-DRB2 DRβII DR β- benzeri sekanslar taşıyan bir pseudogen HLA-DRB3 DRβIII, DR3B DR52 ve Dw24, Dw25, Dw26 yı belirleyen DR β3 zinciri HLA-DRB4 DRβIV, DR4B DR53 ü belirleyen DRβ4- zinciri HLA-DRB5 DRβIII DR51 i belirleyen DR β5- zinciri HLA-DRB6 DRBX, DRBσ DR1, DR2 ve DR10 haplotiplerinde bulunan DRB pseudogeni HLA-DRB7 DRBψ1 DR4, DR7 ve DR9 haplotiplerinde bulunan DRB pseudogeni HLA-DRB8 DRBψ2 DR4, DR7 ve DR9 haplotiplerinde bulunan DRB pseudogeni HLA-DRB9 M4,2 β exon DRB pseudogeni HLA-DQA1 DQα1, DQ1A DQ α-zinciri eksprese edilir HLA-DQB1 DQβ1, DQ1B DQ β-zinciri eksprese edilir HLA-DQA2 DXα, DQ2A DQ α- zincirle ilişkili dizi, ekspresyon? HLA-DQB2 DXβ, DQ2B DQ β - zincirle ilişkili dizi, ekspresyon? HLA-DQB3 DVβ, DQB3 DQ β - zincirle ilişkili dizi, ekspresyon? HLA-DOA DZα, DOα, DNA DO α-zinciri HLA-DOB DOβ DO β-zinciri HLA-DMA RING6 DM α-zinciri HLA-DMB RING7 DM β-zinciri HLA-DPA1 DPα1, DP1A DP α-zinciri, eksprese edilir HLA- DPB1 DPβ1, DP1B DP β-zinciei eksprese edilir HLA-DPA2 DPα2, DP2A DP α- zincirle ilişkili psödogen HLA-DPB2 DPβ2, DP2B DP β- zincirle ilişkili psödogen HLA-DPA3 DPA3 DP α- zincirle ilişkili psödogen TAP1 ABCB2, RING4, Y3, PSF1 ABC (ATP Binding Cassette) transporter TAP2 ABCB3, RING11, Y1, PSF2 ABC (ATP Binding Cassette) transporter PSMB9 LMP2, RING12 Proteosomla ilişkili dizi PSMB8 LMP7, RING10 Proteosomla ilişkili dizi MICA MICA, PERB11.1 Class I zincirle ilişkili gen MICB MICB, PERB11.2 Class I zincirle ilişkili gen MICC MICC, PERB11.3 Class I zincirle ilişkili psödogen MICD MICD, PERB11.4 Class I zincirle ilişkili psödogen MICE MICE, PERB11.5 Class I zincirle ilişkili psödogen 10

Sınıf II antijen ve genlerin hepsinde ortak D harfinin bulunmasının nedeni bu antijenlerin varlığını gösteren serolojik yöntem dışında farklı bir yöntem olarak hücre kültürüne dayanan bir çeşit MLC (Mixed Lymphocyte Culture) reaksiyonu ile gösterilen HLA-A, B ve C den sonra gösterilen bir antijen, HLA-D olarak adlandırılmasından kaynaklanmaktadır. Daha ileriki tarihlerde alloreaktif antikorların yardımı ile de HLA-DR ve DQ antijenleri tanımlanabilmiştir. HLA-DP için bu yöntem geçerli olamamıştır. HLA-DQ nun alfa ve beta zincirini sentezleyen genler HLA- DQA1 ve HLA-DQB1 olarak adlandırılır. A1 ve B1 genleri peptid bağlayan bölgeleri kodlarken A2 ve B2 bölgeleri ise immunglobulin benzer yapıda molekülleri kodlar. DRB genlerinin ancak % 6 kadarı kodlama yapar ve ekson 1-6 olarak sıralanmışlardır. Ekson 1 sinyal peptidi için kodlama yaparken, ekson 2 polimorfik olan β 1 bölgesi, ekson 3 korunan β 2 bölgesi, ekson 4-6 ise transmembran ve sitoplazmik bölgeler için kodlama yaparlar (4). Şekil 2.3. HLA ile peptid bağlanma bölgesinin şematik görünümü (3) 11

. Terminolojik olarak HLA-DRB1*O401 gibi bir örnek verildiğinde anlatılmak istenen şudur: moleküler tiplendirme sonucunda (* bunu göstermektedir) sınıf II nin R ailesinde β 1 zincir geninde 0401 allelik varyantı saptanmıştır. Bu allele karşılık gelen bir serolojik antijen HLA-DR 04 tür. Başka bir örnek olarak HLA-DRB1*0402 ise serolojik olarak yine aynı reaksiyonları verdiği için ancak moleküler tiplendirme ile diğer varyantlardan ayırt edilebilir. Saptanan allelin serolojik karşılığı olan numara ilk iki rakamı oluştururken bunu takip eden iki basamakta moleküler tiplendirme ile ulaşılan yüksek çözünürlükteki allel tipi verilir. Eğer düşük çözünürlükte bir analiz yapıldı ve 3. ve 4. basamak karşılıkları bilinmiyor ise bilinmiyor anlamına gelecek şekilde ''XX'' koyulacaktır. Örneğin; HLADRB1*04XX. HLA-DR bölgesi genlerinin yapısı biraz karmaşıktır. Burada da hem işlevsel olan hem de yalancı gen özelliğinde bölgeler üstelikte aralarında belli bir düzenleme içerisinde bulunmaktadırlar. Bunlara DRB haplotipleri denilmektedir (4, 28). Sınıf II molekülleri ile sınıf I moleküllerinin benzer görevleri vardır. Burada ki en önemli farklılık, sınıf I moleküllerinin genelikle endojen kökenli peptidleri, sınıf II moleküllerinin ise ekzojen kökenli peptidleri bağlayarak hücre membranına taşıması ve eliminasyonun da rol oynamalarıdır. Ayrıca sınıf I ve sınıf II moleküllerinin yapısal farklılıkları da bağlayacakları peptidin özelliklerini ve bağlanma gücünü farklı kılmaktadır. Sınıf I in daha kıvrımlı ve uçları kapalı yapısı, sınıf II ye oranla daha küçük peptidleri bağlamaya olanak verir. Oysa sınıf II daha açık ve daha düz yapısı ile büyük peptidleri, kenarları dışa taşsa da, bağlamaya müsaittir. HLA sınıf I ve sınıf II molekülleri şekil 2.4. de gösterilmiştir (3). Monosit, B lenfositi gibi class II molekülleri sentezleyebilen hücrelere fagositozla alınan ve lizozomlarda peptidlere parçalanan proteinler HLA-DM molekülünün yardımı ile sınıf II molekülüne bağlanır. Oluşan MHC-peptid kompleksi ekzositozla hücre membranına taşınır. Burada devreye CD4 yardımcı lenfositler girer. T lenfosit reseptörü ile sınıf II molekülü arasında oluşan köprü sonucunda yardımcı T lenfositinden interferon sentezi başlar ( Şekil 6). İnterferon ise uyaran hücreden daha fazla sınıf II molekülü yapılmasını dolayısıyla daha güçlü bir immun yanıtın ortaya çıkmasını sağlar (3,5). 12

Şekil 2.4. HLA sınıf I ve sınıf II molekülleri (3) 13

Şekil 2.5. HLA molekülünün endojen ve eksojen peptidler ile ilişkisi (3) a. HLA-Sınıf I molekülleri ile Endojen peptidlerin b. HLA-Sınıf II molekülleri ile eksojen peptidlerin ilişkisi 14

Şekil 2.6. HLA Sınıf I ile T-hücre reseptör bağlantısı (3) 15

2.5. Küçük Doku Uyum Antijenleri (Minör Histocompatibility Antigens) Küçük doku uyum antijenleri (mhag), MHC moleküllerine bağlanan ve T lenfositler tarafından tanınan immunojenik peptidlerdir. HLA uyumlu bireyler arasında yapılan nakillerde de Graft Versus Host Hastalığı (GVHH) na rastlanılmasının nedenleri araştırılırken Goulmy ve ark. alıcı ve vericinin mhag arasında farklılıklarını saptamışlardır. Bu peptidlerde MHC ye bağlanarak T lenfositlere tanıtılırlar. Her bireyin farklı MHC antijenlerini taşıması nedeniyle minör doku uyum antijenleri farklı bireylerde farklı şekilde reaksiyona sebep olurlar. Bazı kişilerin MHC molekülleri bu peptidleri bağlayamaz ve immun yanıt oluşturamazken bazılarının ki bir immun yanıt oluşmasına neden olurlar. Bu peptidler genel olarak sınıf I moleküller aracılığı ile tanıtılır ve nakil yapılmış hastalarda verici kaynaklı bu peptidlere özgün sitotoksik T lenfositler gelişebilir. Doku ve organ nakillerinde önemi gösterilmiş mhag ler arasında HA-2, HA-3, HA-4, HA-5 ve sadece Y kromozomunda bulunan H-Y sayılabilir. Bu antijenlerin tanınması bugün için sadece moleküler yöntemlerle mümkün olabilmektedir (4,29). 2.6. Graft Versus Host Lenfositler ve lökositler, yabancı doku antijenleri (HLA sınıf I ve II antijenleri) taşıyan kan hücreleridir. İçerisinde bu hücrelerin olduğu kan ve kan komponentleri, immün sistemi güçlü olan hastaya (host) verildiğinde immün sistem tarafından reddedilecektir. İmmün sistemi zayıf ve/veya hastalıkları ya da tedavileri nedeniyle tamamen yok olmuş hastalar ise kendisine yabancı olan bu hücreleri reddedemez. Buna karşılık verilen kandaki immünolojik olarak sağlıklı hücreler, doku grubu farklı olan hastayı yabancı olarak tanır, aktive olur, çoğalır ve hastanın dokularını infiltre ederek organ fonksiyonlarını bozar. Hastanın ölümüne neden olan bu olaya ''Graft Versus Host Hastalığı'' (TİGVHH: Transfüzyonla İlişkili Graft Versus Host Hastalığı) denir. Hastalık transfüzyondan ortalama 1-2 hafta sonra başlar. Genellikle tablo akut seyirli olup nadiren kronik olgular bildirilmiştir. Ateş, sulu ve/veya kanlı ishal, hepatoselüler hasar ve buna bağlı sarılık, bulantı, kusma görülür. En çok hasar gören organların başında kemik iliği olduğundan hastaların %90 ında pansitopeni gelişir. Çoğu olgu ağır nötropeni sırasında gelişen enfeksiyonlarla kaybedilir. Akut GVHH özellikle ağır 16

seyrediyorsa %90 oranında ölümle sonlanır. Bu nedenle hastalığı tedavi etmek yerine oluşmasını önlemek gerekir. En iyi yöntem, transfüze edilen kanın içindeki immünolojik yönden aktif hücrelerin çoğalmasını önlemektir. Bu amaçla uygun dozda gamma ışınlama yapılmalıdır. Böylece, komponentdeki lenfositler fonksiyonel olarak aktivitesini koruyacak fakat üreyemediğinden hasta dokularını infiltre edemeyecek ve TİVGHH na neden olamayacaktır. Gamma interferon; makrofajlarda, maling melanoma hücrelerinde, bazı epitel hücrelerinde ve parankim (pankreas, troid) hücrelerinde DR ve DP antijenlerini arttırırken, prostoglandin E2, glukokortikoidler ve siklosporin-a ise ekspresyonu azaltan ajanlardır (26,30). 2.7. HLA Antijenlerinin Özellikleri 2.7.1. HLA Toplum (public) ve Özel (private) Antijenler Tek bir tip molekül üzerinde bulunan ve diğerlerinde bulunmayan HLA antijenlerine HLA özel antijenleri denir. HLA toplum antijenleri ise; her birinde aynı HLA özel antijeni bulunan çeşitli HLA moleküllerinin ortak determinantıdır (25,31). Örneğin; HLA- Bw4, Bw6 gibi. Bw4 antijeni B 13, B 27, B 37, B 38 gibi birçok antijenlerde rastlanan bir determinanttır. Bw6 antijeni de B 7, B 8, B 14 de bulunmaktadır (8). Önceleri tek bir özel antijen olduğu düşünülen birçok HLA antijeninin sonraları birbiri ile çok yakın ilişkili 2 veya 3 antijen grubunun olduğu anlaşılmıştır. Bu özel antijenler, orijinal ve daha geniş spesifitedeki antijenlerin ''splitleri'' (dalları) olarak adlandırılmıştır. Örneğin, HLA-A25 (10) ve -A26 (10) un anlamı HLA -A25 ve A26, HLA-A10 un splitleridir (25). Tablo 2.3. te HLA antijenlerinin splitleri gösterilmiştir (16). 17

Tablo 2.3. HLA antijenlerinin splitleri (16) Antijenler Splitleri Antijenler Spiltleri A9 A23, A24 DR2 DR15, DR16 A10 A25, A26, A34, A66 DR3 DR17, DR18 A19 A29, A30, A31, A32, A33, A74 DR5 DR11, DR12 A28 A68, A69 DR6 DR13, DR14 B5 B51, B52 DQ1 DQ5, DQ6 B12 B44, B45 DQ3 DQ7,DQ8, DQ9 B14 B64, B65 B15 B62, B63, B75, B76, B77 B16 B38, B39 B17 B57, B58 B21 B49, B50 B22 B54, B55, B56 B40 B60, B61 2.7.2. Dengesiz Bağlantı (Linkage Disequilibrium) İnsan çiftleşmesi rastlantısal olduğundan bir HLA lokusu üzerinde ki belli bir allelin diğer bir HLA lokusu üzerinde ki belli bir allelle birlikte bulunma sıklığının, her iki allellin toplumda birlikte bulunma sıklığının çarpımına eşit olması beklenir. Ancak bazı allel kombinasyonları bu beklenen sıklıktan daha fazla görülmektedir. Buna dengesiz bağlantı denir. 2.7.3. İmmün Cevap Genleri (Ir) İmmün cevap (Ir) genleri, bir bireyin belirli bir yabancı antijene cevap verip vermeyeceğini belirleyen genlerdir. Ir genlerinin kontrol ettiği antijenler Ia antijen olarak adlandırılır. Monositlerin en az bir alt grubu, yüzeylerinde Ia antijenini taşırlar. Bu Ia antijenlerini taşıyan hücreler saldırgan antijenleri ( bakteri, virus, fungus gibi ) fagosite eder ve diğer hücrelere sunmak üzere hazırlarlar (25). 18

2.8. HLA Genlerinin Kalıtımı Bireyler her bir ebeveynden bir kromozom aldıklarından biri anneden diğeri babadan gelen iki haplotipine sahiptirler. Tüm HLA genleri kodominanttır, böylece herhangi bir HLA lokusundaki her iki allel de eksprese edilir. Basit mendel kalıtımına göre iki kardeşte 2 haplotipin birden aynı olma şansı % 25, bir haplotipin ortak olma şansı % 50, tamamen farklı haplotip olma şansı % 25 dir. Mayoz bölünme sırasında çapraz reaksiyonlar gerçekleşebilir ve rekombinasyonlar görülebilir. HLA da çok sayıda gen lobları olduğuna göre normal bir populasyonda çok sayıda farklı haplotipler olacaktır (24,25). Şekil 2.7. HLA genlerinin kalıtımı 19

2.9. HLA Antijenlerinin Diğer Kullanım Alanları 1- HLA antijenleri tayini, kan grup antijenleri ile beraber organ ve doku transplantasyonların da önemlidir. Genellikle HLA-A, -B ve HLA-D/DR antijenleri tiplendirilmesi yapılarak haploid benzerlikleri araştırılmalıdır. 2- Babalık tayininde ilk önce kan grup antijenleri tayini yapılmaktadır. Daha sonra HLA tiplendirilmesi yapılabilir. Kan grubu antijenlerinde olduğu gibi, babada bulunan bir HLA tipinin bebekte bulunmasından ziyade, babada bulunmayan HLA tipinin çocukta bulunması, babalığın reddi bakımından önemlidir. 3- Antropolojik araştırmalarda HLA tiplendirilmesi kullanılmaktadır. Toplumların kökleri ve göçleri ile ilgili çalışmalarda faydalı olabilmektedir. Örneğin, Amerika Birleşik Devletlerinde beyazlar arasında HLA-B27 tipi % 8 sıklıkla bulunmaktadır. Amerikalı zencilerde HLA-B27 % 2 oranındadır. Halbuki Afrika zencilerinde HLA-B27 tipine rastlanmamaktadır. Bu bulgular Amerikalı zencilerin beyazlarla karışmış olduğunu göstermektedir. 4- HLA tiplendirilmesi bazı hastalıkların tanısında da yardımcı olmaktadır. Bazı hastalıklarda yüksek oranda belirli HLA tipleri görülmektedir. Örneğin, ankilozan spondilit olgularında HLA-B27 tipi % 90 oranında saptanmaktadır (8). 2.10. HLA ve Hastalık İlişkisi HLA antijenleri ile hastalıklar arasında ki ilişkiyi gösteren çok sayıda yayın vardır. Bu tür çalışmalar hastalığın risklerini ve koruyucu faktörleri saptamak, tedavileri planlayabilmek, genetik geçişli olup olmadığını anlamak ve sonuçta moleküler patogeneze ulaşmak amacıyla yapılmaktadır (3). HLA ve hastalık ilişkisi çalışmaları, bağlantı (linkeage) ve ilişki (association) şeklinde gruplandırılır. Ailesel veriler kullanılacaksa bağlantı, populasyon tabanlı veriler kullanılacaksa ilişki çalışmaları yapılır. Aile çalışmaları HLA lokusu ile hastalığı kontrol eden genler arasında bir beraberlik olup olmadığını ortaya koymakta yararlı olur. Populasyon çalışmaları bir hastalık ile HLA antijenleri arasındaki ilişki, hasta ve kontrol gruplarında yapılan çalışmalar sonucunda belirlenir (3,32). 20

Ayrıca populasyon çalışmaları belli bir HLA marker geni ile bir hastalık arasında ki istatiksel ilişkilerin belirlenmesinde rol oynamaktadır. Bu gibi ilişkiler hastalık geni ile HLA marker geni arasındaki genetik bağlantının kanıtı olarak kabul edilemez. Çünkü ilişki ne önemli bir genetik bağlantıyı gösterir nede bağlantı önemli bir ilişkiyi göstermektedir. Örneğin hastalık geni 6. Kromozomdan başka bir kromozom üzerindedir ve HLA ile bağlantılı değildir fakat belli bir HLA antijeni varlığı bu hastalık geninin fenotipik ekspresyonu için gereklidir. Bu yüzden HLA ve hastalık ilişkisi kurulabilmektedir (8,34). Tablo 2.4. te HLA ile ilişkilendirilen hastalıklardan bazı örnekler ve rölatif riskleri gösterilmiştir (1). Rölatif risk, bir antijeni taşıyan bireyin, taşımayana göre herhangi bir hastalığa yakalanma şansını gösteren parametre olup iki veya üstü anlamlı kabul edilir. Rölatif risk ne kadar yüksek ise o antijene hasta populasyonunda o kadar sık rastlanır (16). Buna karşılık fosfogluktomutaz 3 geni (PGM3) 6. Kromozom üzerindedir ve HLA ile bağlantılıdır fakat hiç HLA ilişkili PGM3 hastalığı bulunamamıştır (8). HLA molekülleri sadece hastalığa yatkınlığı gösteren bir özellik olup genellikle hastalığın ortaya çıkmasına çok sayıda faktörün beraber bulunması neden olmaktadır. Sunulacak peptidleri ve dolayısıyla oluşacak immun yanıtın özelliklerini, HLA molekülleri kadar, antijenlerin işlenmesi sırasında oluşan peptidlerin yapısıda belirlemektedir. Bu nedenle sınıf II MHC genleri arasında yer alan ancak yapısal olarak onlara benzerlik göstermeyen ve antijen işlenmesinde rol alan LMP ve TAP genlerindeki çeşitliliğinde hastalıklar ile ilişkili olabileceği düşünülmektedir. HLA nın çeşitli hastalıklar ile ilişkisi bazen antijen sunumundaki farklılıklar ile bazen de moleküler benzerlik veya taklit (mimicking) mekanizmaları ile izah edilmeye çalışılmıştır. Bu konuda şimdiye kadar çeşitli hipotezler ileri sürülmüştür. HLA ve hastalık ilişkisi ile ilgili hipotezler: 1. HLA molekülleri etiyolojik ajanların reseptörleridir. Bazı HLA molekülleri, virusler, toksinler, bazı yabancı maddeler gibi etiyolojik ajanlar için reseptör görevi görürler. 21

2. HLA antijenik peptid için seçicidir. Sadece belirli HLA moleküllerinin antijen bağlama bölgeleri, hastalığa neden olan antijenik peptid fragmanını bağlayabilir. 3. T hücre reseptörü predispozisyonunu belirler. T hücre antijen reseptörü hastalığa eğilimden sorumludur. Fakat T hücresinin antijeni tanıması HLA molekülü tarafından sınırlandırılmıştır. Böylece HLA ile hastalık arasında dolaylı bir ilişki bulunmaktadır. Mesela B-27 pozitif kişilerden bir kısmı B-27 antijen kompleksini tanıyabilen T hücre reseptörlerini içeren B-27 sınırlı (B-27 restricted) T lenfositlerine sahiptir. Böylece B-27 antijen kompleksinin, bu B-27 sınırlı T lenfositleri tarafından tanınması ankilozan spondilite neden oluyorsa o zaman belirli T lenfositlerine sahip kişilerde hastalık gelişir. 4. Hastalık ajanları HLA molekülünü taklit ederler (moleküler mimik). Hastalık ajanı ile hastalıkla ilişkili HLA antijeni immünolojik olarak benzerlik gösterebilir. Bu moleküler benzerlik hipotezi şu şekilde açıklanır: 1) HLA antijeni ve etiyolojik ajan arasındaki benzerlikten dolayı etiyolojik ajan vücudun kendi molekülü gibi algılanır ve hiçbir immün cevap oluşturulmaz. Etiyolojik ajan konağın immün sistemini harekete geçirmeden hastalık oluşturur. 2) Etiyolojik ajan yabancı olarak algılanır ve şiddetli bir immün cevap oluşturur ve otoimmün bir hastalık oluşur (25,34,26). Otoimmun hastalıkların çoğunun HLA ile ilişkisi bulunmaktadır. Yani belli hastalıklar belli allelleri taşıyan bireylerde daha sık görülür. HLA hastalık ilişkisi; Romatoid Artirit (RA), İnsüline Bağımlı (IDDM) Diyabet Hastalığında, Behçet Hastalığında, Ankilozon Spondilitte gösterilmiştir (3,22). Ankilozan spondilit in (AS) prototipini oluşturduğu seronegatif spondiloartropatilerde (SPA) enflamatuvar periferik ve aksiyel eklem tutulumu ve HLA-B27 doku antijeni arasında kuvvetli bir ilişki bulunmaktadır. İnsüline Bağımlı (IDDM) Diyabet Hastalığı ile de HLA molekülü ilişkilendirilmiştir: HLA sınıf II bölgesindeki 4 genin (LMP2, LMP7, HLADRB1, HLADQ1) polimorfizmine bakılmıştır. LMP7 polimorfizmi ile IDDM arasında güçlü bir ilişki saptanırken; LMP2 polimorfizmi ile IDDM arasında sadece HLA DR4- DQB1*0302 haplotiplerini içerenlerde ilişki saptanmıştır (26,3,35). 22

Türklerde yapılan bir çalışmada HLA-DR3, HLA-B8, HLA-A1 ve HLA-A2 antijenleri ile Myastenia Graves hastalığı arasında bağlantı olduğu gösterilmiştir. Yine otoimmun bir hastalık olan oral submukoz fibrozis nedeni ile takip edilen Tayvan lı hastalarda yapılan çalışmada HLA-B76, HLA-B48/Cw7, HLA-B51/Cw7 ve HLAB62/Cw7 frekansının normal populasyona göre yüksek olduğu saptanmıştır (25, 36). HLA antijenleri ile birliktelik gösteren hastalıkların birkaç ortak özelliği vardır. Bu hastalıkların özellikleri şu şekilde sıralanabilir: a) Nedenleri ve patogenezleri bilinmez. b) Herediter bir dağılım paternine sahiptirler, fakat penetrans gösterirler ve bu nedenle belirli bir HLA antijeni ile mutlak bir beraberlik yoktur. c) İmmün sistem hastalıkları ile birlikteliği vardır. d) Üreme üzerinde çok az etkili olmakta veya hiç etkili olmamaktadır (25,34). TABLO 2.4. Bazı hastalıklar ve ilişkili HLA antijenleri (1) HASTALIK Hematokromozis Narkolepsi Ankilozan spondilit Reiter sendromu Psoriatik spondilit Akut anterior üveit Behçet hastalığı Romatoid artrit Pausi artiküler romatoid art. Kronik hepatit Sistemik lupus eritematozus Sjögren sendromu İnsulin bağ. Diabetes mellit Goodpasture Multiple skleroz Myastenia gravis Hodking hastalığı Preeklampsi İLGİLİ HLA ANTİJENİ ORTALAMA RÖLATİF RİSK A3 DR2 B27 B27 B27 B27 B5 DR4 DR5/DP2 B8 DR3/C4 DR3 DQ8/DR3/4 DQ57 DR2 DR2/B8/A2 B18 DR4 - - 81.8 40 10 8 3.3 6.4 7 17.1 5.6 31.8 0.1 20 6 23

2.11. HLA Tiplendirimi HLA alellerinin belirlenmesi için farklı yöntemler kullanılmaktadır. Bunlar; a-serolojik b-hücresel c-moleküler yöntemler Günümüzde pek çok laboratuar HLA polimorfizmini moleküler metotlar kullanarak test etmektedir. Serolojik yöntemlerin HLA alellerindeki polimorfikliği belirlemede yetersiz kalması sonucunda, serolojik olarak ayırt edilemeyen fakat fonksiyonel olarak ayrı olan HLA allel ürünlerini tiplendirmek için geliştirilmiştir (15). Böbrek alıcıları gibi çok hızlı sonuç gerektiren örneklerde, PCR tabanlı sekans spesifik primer analiz tekniği (PCR-SSP) kullanılır; eğer çok sayıda örneğin tiplendirilmesine ihtiyaç varsa (örneğin kemik iliği) PCR tabanlı sekans spesifik oligonükleotid problar (PCR-SSO) kullanılarak tiplendirilme yapılması tercih edilebilir (3,37). Son yıllarda HLA tipinin belirlenmesi çok duyarlı yöntemlerle yapılabilmektedir. HLA tiplerini tanımlarken kullanılan terminolojide kullanılan yöntemlerle ilişkilidir. Terimler arasında bir bağlantı kurmak güç olabilir. Örneğin DRB1*1501 olarak tanımlanmış bir genin DR2 nin bir alleli olduğunu tahmin etmek güç olabilir ya da DR4 olarak tanımlanmış bir antijenin hücresel yöntemlerle belirlenmiş Dw4, Dw10, Dw14 gibi alt tipleri bulunabilir. Ancak moleküler yöntemlerin giderek diğer yöntemlerin yerini alması nedeni ile güncel olarak kullanılan alelleri tanımlayan terminolojidir. Bu amaçla kurulmuş olan bir komisyon (W.H.O Nomenclature Committee), sürekli olarak bilgileri güncelleyerek yayınlamaktadır, Tablo 2.5. te kullanılan adlandırma sisteminin mantığı bir örnek üzerinde özetlenmiştir (19). Tablo 2.5. HLA alellerini tanımlarken kullanılan terminoloji (19) Terminoloji Rakam Sıra No İfade Ettiği Bilgi HLA HLA bölgesini ifade eder ve bir HLA genine ön ek olarak kullanılır HLA -DRB1 Belli bir HLA lokusu Ör: DRB1 HLA -DRB1*13 1-2 Spesifik bir antijeni (Ör:DR13) kodlayan bir allel grubunu tanımlar HLA-DRB1*1301 3-4 Spesifik bir HLA allellini tanımlar. (DR13 ün 01 allelli) HLA -DRB1*1301N 5/9 Eksprese edilmeyen (Null) bir allel gösterir HLA- DRB1*130102 5-6 Sessiz (Sinonim) mutasyonu olan bir allelli ifade eder HLA -DRB1*13010102 7-8 Kodlama bölgesi (exon) dışında mutasyonu olan bir allelli gösterir HLA- DRB1*13010102N 5/9 Kodlama bölgesi dışında mutasyonu olan Null bir allelli gösterir 24

3. GEREÇ VE YÖNTEM Mart 2008 ile Ekim 2008 tarihleri arasında Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi Merkez Laboratuvarına çeşitli polikliniklerden gönderilen 339 u hasta 432 si donör olmak üzere toplam 771 örnek çalışma kapsamına alınmıştır. Bu çalışmada PCR-SSO yöntemi ile HLA-A, B, C, DQ, DR antijenleri tespit edildi. İlk olarak test edilecek hasta ve donörlerden EDTA içeren tüplere 4 ml kan örneği alınarak hazır DNA ekstraksiyon kitleri (Qıagen) kullanarak DNA izolasyonu (GenoVision Geno M-6 cihazında) yapıldı. DNA izole edildikten sonra aynı gün inceleme yapılacaksa +4 C de daha sonra işlem yapılacaksa -20 C de saklandı. Tiplendirilmesi yapılacak DNA örnekleri HLA-A, B, C, DQ, DR kitleri ile (Tepnel Lifecodes) amplifikasyon için hazırlandı. Her bir HLA tiplendirmesi için mastermix, distile su ve Taq polimeraz enzimi hazırlanarak 8 li PCR tüplerinin içerisine konuldu(thermo) ve üzerine DNA eklendi. Bu işlemden sonra amplifikasyon işlemi (Corbett research marka Palmcycler cihazında) yapıldı. (95 C de 5 dakika 1 döngü ardından 95 C de 30 saniye, 60 C de 45 saniye, 72 C de 45 saniye 8 döngü ardından 95 C de 30 saniye, 63 C de 45 saniye, 72 C de 45 saniye 32 döngü ardından 72 C de 15 dakika 1 döngü ve son olarak 4 C de 5 dakika 1 döngü) Bu 2 saat 43 dakikalık bir süreye eşdeğerdir. Amplifikasyon işleminden sonra eğer örnekler hemen çalışılmayacaksa +2 - +8 C de 24 saat saklanabilir. Çalışma esnasında amplifiye ürünlerden Costar Platelere 5ml konuldu. Daha sonra 55 C de 7 dakika ısıtlıp (Ultrasonic cleaner marka sonicatör cihazında) 15 saniye bekletildikten sonra 15 saniye de HLA-A, B, C, DQ, DR kitleri içerisinden çıkan beadler vortexlendikten (Biosan marka Biovortex V1 marka vortex cihazında) sonra costar plate içerisindeki 5 ml lik DNA örnekleri üzerine 15 ml eklendi. Bu işlemden sonra tekrar Palmcycler (Corbett research marka) cihazına yüklendi ve bu kez hidribizasyon programı seçilerek hidribizasyon işlemi başlatıldı. (97 C de 5 dakika, 47 C de 30 dakika, 56 C de 10 dakika, 56 C de 10 dakika) Sürenin bitimine yakın kitler içerisinden çıkan Dilution solüsyonları ( her bir costar plate kuyucuğu için hesaplandı) ve streptavidin hazırlanarak süre bitiminde kuyucuklara 170 µl dilution + streptavidin karışımı konuldu ve plate Luminex (Tepnel Lifecodes Lifematch fluoroanalyzer) cihazına konularak değerlendirme işlemi sistem tarafından otomatik olarak yapıldı. 25

Aşağıda da bir hastaya ait final tiplendirme sonuçları gösterilmiştir. İstatistiksel analiz: Verilerin normal dağılıma uygunluğu test edilmiş, normal dağılım gösteren sürekli değişkenlerin analizinde bağımsız gruplarda t testi kullanılmıştır. Kategorik değişkenlerin analizinde ise ki-kare testi kullanılmıştır. Sonuçlar ortalama±standart sapma, n ve yüzde olarak ifade edilmiştir. Verilerin analizinde ise SPSS ver 15.0 istatistik programı kullanılmıştır. 26

Tablo 3.1. Nomenklatüre geçmiş allel listesi 2008 (39) 27

Tablo 3.1. (Devam) Nomenklatüre geçmiş allel listesi 2008 (39) 28

Tablo3.1. (Devam) Nomenklatüre geçmiş allel listesi 2008 (39) 33

Hasta grubunda tespit edilen allel listesi HLA-A lokusunun ürünleri: HLA-A AG1; HLA-A-A1, -A2, -A3, -A11, -A23, -A24, -A25, -A26, -A29, -A30, - A31, -A32, -A36, -A66, -A68, -A80 HLA-A AG2; HLA-A-A1, -A2, -A3, -A11, -A23, -A24, -A25, -A26, -A29, -A30, - A31, -A32, -A33, -A34, -A36, -A66, -A68, -A69, -A74, -A80 HLA-B lokusunun ürünleri: HLA-B AG1; HLA-B7, -B8, -B13, -B14, -B15, -B18, -B27, -B35, -B37,-B38, -B39, - B40, -B41, -B42, -B44, -B45, -B47, -B48, -B49, -B50, -B51, -B52, -B53, -B57, -B58, HLA-B AG2; HLA-B7, -B8, -B13, -B14, -B15, -B18, -B27, -B35, -B37,-B38, -B39, - B40, -B41, -B42, -B44, -B46, -B47, -B49, -B50, -B51, -B52, -B53, -B55, -B56, -B57, - B58, -B73, -B78 HLA-Cw lokusunun ürünleri: HLA-Cw AG1; HLA-Cw1, -Cw2, -Cw3, -Cw4, -Cw5, -Cw6, -Cw7, -Cw8, -Cw12, - CW14, -CW15, -CW16, -CW17 HLA-Cw AG2; HLA-Cw3, -Cw4, -Cw5, -Cw6, -Cw7, -Cw8, -Cw12, -Cw14, -CW15, - Cw16, -Cw17, -Cw18 HLA-DQ lokusunun ürünleri: HLA-DQ AG1; HLA-DQ2, -DQ3, -DQ4, -DQ5, -DQ6 HLA-DQ AG2; HLA-DQ2, -DQ3, -DQ4, -DQ5, -DQ6, -DQ7, -DQ15 HLA-DR lokusunun ürünleri: HLA-DR1 AG1; HLA-DR1, -DR3, -DR4, -DR7, -DR8, -DR9, -DR10, -DR11, - DR13, -DR14, -DR15 HLA-DR1 AG2; HLA-DR1, -DR3, -DR4, -DR6, -DR7, -DR8, -DR9, -DR10, -DR11, - DR12, -DR13, -DR14, -DR15, -DR16 HLA-DR3 AG1; HLA-DR1, -DR2, -DR3 38

HLA-DR3 AG2; HLA-DR1, -DR2, -DR3 HLA-DR4 AG1; HLA-DR1 HLA-DR4 AG2; HLA-DR1 HLA-DR5 AG1; HLA-DR1, -DR2 HLA-DR5 AG2; HLA-DR1, -DR2 Donör grubunda tespit edilen allel listesi HLA-A lokusunun ürünleri: HLA-A AG1; HLA-A-A1, -A2, -A3, -A11, -A23, -A24, -A26, -A29, -A30, -A32, - A33, -A68, -A80 HLA-A AG2; HLA-A-A1, -A2, -A3, -A11, -A15, -A23, -A24, -A25, -A26, -A29, -A30, -A31, -A32, -A33, -A66, -A68, -A69, -A74, -A80 HLA-B lokusunun ürünleri: HLA-B AG1; HLA-B7, -B8, -B13, -B14, -B15, -B18, -B27, -B35, -B37,-B38, -B39, - B40, -B41, -B42, -B44, -B45, -B47, -B49, -B50, -B51, -B52, -B53, -B54, -B56, -B57, - B58 HLA-B AG2; HLA-B7, -B8, -B13, -B14, -B15, -B18, -B27, -B35, -B37,-B38, -B39, - B40, -B41, -B42, -B44, -B47, -B48, -B49, -B50, -B51, -B52, -B53, -B55, -B56, -B57, - B58, -B73, -B78 HLA-Cw lokusunun ürünleri: HLA-Cw AG1; HLA-Cw1, -Cw2, -Cw3, -Cw4, -Cw5, -Cw6, -Cw7, -Cw8, -Cw12, - CW14, -CW15, -CW16, -CW17 HLA-Cw AG2; HLA-Cw1, -Cw3, -Cw4, -Cw5, -Cw6, -Cw7, -Cw8, -Cw12, -CW14, - Cw15, -Cw16, -Cw17 HLA-DQ lokusunun ürünleri: HLA-DQ AG1; HLA-DQ2, -DQ3, -DQ4, -DQ5, -DQ6, -DQ7 HLA-DQ AG2; HLA-DQ2, -DQ3, -DQ4, -DQ5, -DQ6, -DQ7, -DQ15 39