Kullanım Kılavuzu Giriş 1.Kullanım Amacı 2 2. Klinik Uygulamalar ve Test prensibi 2 3. Kit İçeriği 3 4. Saklama ve Raf Ömrü 3 5. Kullanım önerileri 4 6. Numune toplama, hazırlama ve saklama 4 7. Test prosedürü 5 8. Kantitatif Yorumlama 6 9. Teknik data 7 10. Performans datası 8 11.Literatür 9 A:Pipet Şeması 10 B:Test Prosedürü 11
1.Kullanım Amacı AESKULISA Protein C sitratla insan plazmasında Protein C nin kantitatif tespiti için solid faz bir immunotesttir. Protein C nin tespiti trombozun risk tahmininde yardımcıdır. 2. Klinik Uygulamalar ve Test prensibi Protein S çoğunlukla karaciğerde karaciğer hücresi tarafından sentezlenen serine proteazin zymogen inaktif bir vitamin K bağlısıdır. Plazmasında 4 µg/ml in bir konsantrasyonunda bulunur ve 62 kda moleküler ağırlığa sahiptir. Aktive edilmiş protein C (APC), endotelyal transmembran reseptörü trombomoduline trombinin bağlanması ile aktif hale gelen protein C antikoagülan sisteminin anahtar bir bileşenidir. Trombin ve trombomodulin kompleksi Protein C yi aktif hale getirir ve aktive edilmiş Protein C fosfolipid membranlarına karşı yüksek bir ilgiye sahip olan kofaktör Protein S ile kompleks bir dönüş formları oluşturur. apc tercihen membrana-bağlı pıhtılaşma faktörleri Va ve VIIIa aktivitesini yitirdiğinden beri fizyolojik önem taşımaktadır. Ayrıca, aktive edilmiş Protein C plazmin aktivatör inhibitör-1(pai-1) inhibe ederek profibrinoltik aktiviteye sahip olur. Protein C eksikliği, kalıtsal olabilir veya sonradan kazanılabilir ve trombozun artış değişken riskiyle ilgili olabilir. Protein C eksikliğinin yaygınlığı genel nüfusta 300 de bir vaka olarak tahmin edilmiştir.kalıtsal protein C eksikliğiyle bireylerin neredeyse 50-80 % sinde 30-45 yaşından önce bir trombotik vaka gözlemlenebilir. Bir homozigot protein C eksikliği olan hastalar neonatal purpura fulminans veya büyük venöz trombozdan etkilenmiş olabilirler. Sonradan kazanılan protein C eksikliği, yani antifosfolipid sendromu,oral antikoagülan tedavisi, cerrahi, karaciğer hastalığıyla ilişkilidir.protein C eksikliği, iki durumda sınıflandırılır. Tip I eksikliğinde Protein C nin düzeyinde bir azalma olur. Tip II eksikliği, normal antijen düzeyi olan azaltılmış bir Protein C aktivitesiyle karakterizedir. Kusurun tipini belirlemek için, Protein C nin laboratuar teşhisinde her iki antijen düzeyi ve fonksiyonel tespiti gereklidir. Test Prensibi Aeskulisa Protein C, insan Protein C için spesifik olarak yakalanmış bir antikor ile kaplı microplakalarda kullanılan bir ELISA sandviçidir. 1:51 seyreltilen hasta plazması antikor karşıtı bağlanan plazmada protein C bulunmasına izin verilen kuyularda inkübe edilir. Bağlanmayan bölüm yıkamayla uzaklaştırılır. Sonra, horseradish peroxidase konjugatlı antihuman Protein C tespit antikoru inkübe edilir ve mikropleytteki örneğin antijen-antikor kompleksi ile reaksiyona girer. İnkübasyon sonrası, bağlanmamış konjugatlar yıkanarak uzaklaştırılır. TMB-substrat eklenmesi enzimatik kolorimetrik (mavi) reaksiyon oluşturur, seyreltilmiş asit ile durdurulur (renk sarıya değişir). Kromojenin renklenmesi ile ortaya çıkan renk oranı 450 nm de bir spektrofotometre ile optik yoğunluk birimlerinde ölçülür. Kitle 2
sağlanmış Referans plazmasından hazırlanan bir eğri kullanılarak hasta plazmasında protein C antijen relatif yüzde konsantrasyonu belirlenebilir. 3. Kit İçeriği Hazırlanacak: 5xnumune buffer 50xyıkama buffer Referans Plazma Kontrol N Kontrol D 1 şişe, 20 ml - 5x konsantre ( beyaz kapaklı: sarı solusyon) İçerik: Tris, NaCl, BSA, sodyum azit < 0.1% (koruyucu) 1 şişe, 20 ml - 50x konsantre (beyaz kapaklı: yeşil solusyon) İçerik: Tris, NaCl, Tween 20, sodium azide < 0.1% (koruyucu) 3 şişe, 0.4 ml lyophilized Referans Plazma İçerik: insan plazma 3 şişe, 0.2 ml lyophilized Normal Plazma İçerik : insan plazma 3 şişe, 0.2 ml lyophilized Eksik Plazma İçerik : insan plazma Kullanıma hazır: Konjugatlar TMB Substrat Stop Solusyonu Mikrotiterplate 1 şişe 15 ml IgG (mavi kapaklı: mavi solusyon) İçerik: Anti-human immünoglobulin horseradish peroxidase için konjugat 1 şişe, 15 ml (siyah kapaklı) İçerik: stabilize TMB/H 2 O 2 1 şişe, 15 ml (beyaz kapaklı: renksiz solusyon) İçerik: 1M Hidroklorik Asit Kırılabilir mikrokuyucuklu 12x8 kuyucuklu stripler Paragraf 1e bakınız Kiti içeriğinde bulunmayan gerekli materyaller: Mikrotiter plate okuyucu, 450 nm okuma filtresi ve opsiyonel 620 nm referans filtresi (600-690 nm) ile. Cam eşya (silindir 100-1000ml), dilusyon için test tüpleri. Vorteks mikser, pipetler (10, 100, 200, 500, 1000 µl) ya da ayralanabilir multipipet (100-1000ml). Mikroplate yıkama cihazı (300 µl tekrar ya da multikanal pipet ya da otomatik sistem), emici kağıt. Testimiz United States Pharmacopeia (USP 26 - NF 21) ve European Pharmacopeia (Eur.Ph. 4th ed.) göre belirlenmiş purifiye su kullanılmak üzere dizayn edilmiştir. 4. Saklama ve Raf Ömrü Tüm reaktifleri ve mikropleyti kendi orjinal ambalajında 2-8 C/35-46 F de saklayın. Hazırlanan solusyonlar 4 C/39 F de en az 1 ay saklanabilir. Reaktifler ve mikroplate herbir komponentin üzerinde yazan son kullanma tarihlerine kadar kullanılabilir. TMB solusyonunu güçlü ışıkta bırakmayın. Mikropleyti folyosunda, kurutucu ile ve sıkı bir şekilde kaplı olarak saklayın. 3
5. Kullanım Önerileri 5.1 Sağlık tehlike bilgisi BU ÜRÜNLER SADECE İN VİTRO DİAGNOSTIK KULLANIM İÇİNDİR. Bu yüzden, bu kiti sadece eğitimli ve deneyimli personel kullanması tavsiye edilir. Bu ürün, normal kullanımda toksik ya da zaralı olmamasına rağmen aşağıdaki maksimum güvenlik önlemlerini yapmanız önerilir: Öneriler ve Uyarılar Bu kit potansiyel zararlı komponentler içerir. Kit reaktifleri gözler ve deri için tahriş edici olmamasına rağmen, göz ve deri ile temasından kaçınmanızı ve eldiven kullanmanızı öneririz. UYARI! Kalibratörler, Kontroller ve Bufferlar koruyucu olarak sodium azide (NaN 3 ) içerir. NaN 3 yenildiğinde ya da deri ve gözler tarafından emildiğinde toksik olabilir. NaN 3 kurşun ve bakır borular ile reaksiyona girerek patlayıcı metal azidelere dönüşebilir. Atılımlarında bol su ile azide oluşumu önlenmelidir. Lütfen, CDC ve diğer yerel/ulusal yasalara göre belirlenen dekontaminasyon prosedürlerini uygulayın. Kit ile çalışırken sigara içmeyin, yemek yemeyin yada birşey içmeyin. Ağız ile pipetleme yapmayın. Bu kitte Referans Plazma ve Kontroller dahil onaylanmış metotlarla test edilmiştir ve HbsAg, Hepatit C ve HIV 1 testleri için negatif bulunmuştur. Buna rağmen, hiçbir test materyallerde tamamen viral ajanların yok olduğunu garanti edemez. Bu nedenle, Referans Plazma, Kontroller ve hasta numuneleri sanki enfeksiyon ajanı taşıyormuş gibi ve uluslararası gerekliliklere göre kullanılmalıdır. 5.2 Kullanım için genel talimatlar Farklı lot numarasındaki reaktifler ya da mikroplate ile karıştırmayın ya da değiştirmeyin. Bu sonuçlarda varyasyona neden olabilir. Kullanmadan önce tüm komponentlerin oda ısısına (20-32 C/68-89.6 F) ulaşmasını sağlayın, iyice karıştırın ve optimum test performansı için önerilen inkübasyon şemasını uygulayın. İnkübasyon: Otomatik sistemler ile 30 C/86 F de test performası öneririz. Asla komponentleri 37 C/ 98.6 F den yüksek ısılara maruz bırakmayın. Daima substrat solusyonlarını yeni bir pipet ucu ile pipetleyin. Bu reaktifleri ışıktan koruyun. Asla bir önceki reaktifi pipetlediğiniz ucu konjugatlarda kullanmayın. Kesin klinik tanı sadece bu test performansına dayanmamalıdır, doktor tarafından tüm klinik ve laboratuar bulguları araştırıldıktan sonra konulmalıdır. Konulan tanı farklı diagnostik metodlar kullanılarak doğrulanmalıdır. 6. Örnek Toplama, Hazırlama ve Saklama Tercihen bir antikoagülan olarak 3.2% veya 3.8% sodyum sitratla toplanan taze plazma numuneleri kullanılır. Ulusal gerekliliklere göre kan toplanmalıdır. İkterik, lipemik, hemolizli ya da bakteriyolojik kontaminasyonlu örnekleri kullanmayın. Kan örnekleri temiz, kuru ve boş tüplere alınmalıdır. Ayırdıktan sonra serum örnekleri hemen 4
kullanılmalıdır, 2-8 C/35-46 F de 3 güne kadar ya da -20 C/-4 F de dondurularak daha uzun süre saklanabilir. 7. Test Prosedürü 7.1 Pipetlemeden önce hazırlık Konsantre reaktifleri seyreltin: Konsantre örnek buffer 1:5 distile su ile seyreltin ( 20 ml ye 80 ml gibi). Konsantre yıkama buffer 1:50 distile su ile seyreltin (20 ml e 980 ml gibi). Referans Plazma: Referans Plazmaya 0,4ml distile su ekleyerek ve yavaşça sallayarak sulandırın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kullanımdan önce durması için sulandırılan plazmayı bekletin. Referans Plazma 2-8 C/35-46 F da saklandığında 8 saat boyunca kararlıdır. Kontroller: Kontrol N ve kontrol D yi 0,2 ml distile su ekleyerek ve yavaşça sallayarak sulandırın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kullanımdan önce durması için sulandırılan kontrolleri bekletin. Kontroller 2-8 C/35-46 F da saklandığında 8 saat boyunca kararlıdır. Referans Plazmasının predilüsyonu: Predilüsyon edilmiş (1x) numune bufferda sulandırılmış bir referans plazmanın 1:2 oranında dilüsyon ederek hazırlayın ve iyice karıştırın, 100 µl numune buffer + 100 µl plazma gibi. Referans eğrisi hazırlama: Dilüsyon setleri Referans Plazmasının predilsyonları kullanılarak hazırlanmıştır. Referans Plazma Hacmi Numune Buffer Hacmi Referans Düzeyi 60 µl 1000 µl 150 % 40 µl 1000 µl 100 % 30 µl 1000 µl 75 % 20 µl 1000 µl 50 % 10 µl 1000 µl 25 % 10 µl 2000 µl 12.5 % 5
Numunenin ve Kontrollerin dilüsyonu: 100 µl (1x) numune bufferına 20 µl plazma ekleyin ve iyice karıştırın. Yıkama Her bir 8 kuyucuk için 20 ml seyreltilmiş yıkama buffer (1x) ya da 96 kuyucuk için 200 ml hazırlayın. Örnek: 4 ml konsantre + 196 ml distile su. Otomatik yıkama: Cihazın gerektirdiği miktarda ve robot pipetin ölü miktarı göz önüne alınmalıdır. Manual yıkama: Pleyti ters çevirerek içindeki sıvıyı boşaltın. Temiz emici kağıt üzerinde pleyti sertçe vurun. Herbir kuyucuğa 300 µl seyreltilmiş yıkama buffer ekleyin ve 20 saniy bekleyin. Tüm prosedürü iki kez tekrar edin. Microplateler Test için yeterli miktarda kuyucuk ayırın. Kullanılmayan kuyucukları çerçevesinden ayırın, kurutucu ile birlikte plastik posetine geri koyun ve sıkıca kapatın. (2-8 C/35-46 F). 7.2 Çalışma Akışı Pipetleme şeması için Ek A ya bakın, test prosedürü için Ek B ye bakın: Örnekler, Kontroller ve Referans Plazma iki kopya olarak çalışmanızı tavsiye ederiz. Uygun mikrokuyucuklara 100 µl seyreltilmiş hasta plazmasından koyun. Uygun kuyucuklara 100 µl Kontrolleri ve Referans Plazmanın koyun. 20-32 C/68-89.6 F de 30 dakika inkübe edin. 300 µl yıkama buffer (seyreltilmiş 1:50) ile 3x yıkayın. Herbir kuyucuğa 100 µl konjugat ekleyin. 20-32 C/68-89.6 F de 30 dakika inkübe edin. 300 µl yıkama buffer (seyreltilmiş 1:50) ile 3x yıkayın. Herbir kuyucuğa 100 µl TMB substrat ekleyin. 20-32 C/68-89.6 F de 30 dakika inkübe edin, direk ışıktan koruyarak. Herbir kuyucuğa 100 µl stop solusyonu ekleyin, substrat ile aynı sırada. 5 dakika inkübe edin. Pleyti 5 saniye dikkatlice sallayın. 30 dakika içinde 450 nm de (opsiyonel 450/620 nm) absorbanslarını okuyun. 8. Kantitatif Yorumlama Kantitatif yorum için %'de(x-eksen) referans düzeyinin uygun değerine karşı referans plazmasının(y-eksen) her dilüsyonunun (O.D.) optikal yoğunluğunu çizilerek referans eğrisi 6
kurulur. En iyi sonuçlar için log/lin koordinatları ve 4-Parametre Fit önerilir. Her numunenin O.D. dan gelen, % de uygun hasta relatif değer ifadesi okunur. Protein C antijen düzeyleri normalin % de hesaplamak için kalite kontrol broşüründe başvurulan uygun faktör tarafından elde edilen hasta relatif değeriyle çarpılır. Bir referans eğrisinin örneği Her kullanım için Referans Plazmanın paralel pipetlenmesi önerilir. Referans Düzeyi OD 450/620 nm Sonuç (%) CV % (Değişken) 12.5 % 0.569 11.95 1.05 25 % 0.874 26.68 0.94 50 % 1.163 48.06 1.04 75 % 1.434 77.70 0.97 100 % 1.583 99.61 1.01 150 % 1.826 147.73 1.02 Hesaplama örneği Hasta Tekrarlama (OD) Ortalama (OD) Hasta relatif değeri (%) Faktör Hasta Protein C (%) P 01 0.933/0.927 0.930 62.1 0.96 28.32 P 02 1.860/1.866 1.863 31.8 0.96 118.56 Tüm spesifik bilgilere göre kalite kontrol ekine bakın. Medikal laboratuarlar, EU düzenlemelerine göre kendi kontrol ve/veya iç serum havuzlarından in-house Kalite Kontrollerini kullanabilirler. Bu örnekleri hastalarınızı yorumlamak için kullanmayın! Beklenen değerler Protein C değerleri, toplanmış normal plazmaya kıyasla yüzde relatifde(%) verilir. Protein C konsantrasyonu normal insan plazma aralığı genellikle 70 % ve 140 % arasındadır. Referans eğrisinin aralığı üstündeki değerlerle numuneler doğru sonuçlar için daha yüksek dilüsyonda tekrar test edilebilir. Her laboratuar kendi kuruluş prosedürlerine göre kendine uygun bir dizi teknikleri, kontrolleri, donanımları ve hasta nüfusunu temel alarak kurulmalıdır. 7
9. Teknik Bilgi Örnek materyal: plazma Örnek miktarı: 1x numune buffer ile 20 μl plazma 1:51 oranında dilüsyon edildi Total inkübasyon zamanı: 90 dakika 20-32 C/68-89.6 F de Kalibrasyon aralığı: 12.5-150 % Analitik duyarlılık: 6.0% Saklama: 2-8 C/35-46 F de, orjinal şişesinde Belirleme sayısı: 96 test 10. Performans Bilgisi 10.1 Analitik duyarlılık Örnek bufferın AESKULISA Protein C ile 30 kez test edilmesi sonucu analitik duyarlılık 6.0% bulunmuştur. 10.2 Özgünlük Microplate human Protein C için spesifik bir antikorla kaplanmıştır. 10.3 Doğrusallık Seçilen plazma bu kitle test edildi ve doğrusal dilüsyon için bulundu. Numune No Dilüsyon faktörü ölçülen konsantrasyon (%) Beklenen Konsantrasyon (%) Düzelme (%) 1 1 / 50 115.30 120 96.1 1 / 100 60.88 60 101.5 1 / 200 31.71 30 105.7 1 / 400 14.41 15 96.1 2 1 / 50 41.47 40 103.7 1 / 100 19.86 20 99.3 1 / 200 9.48 10 94.8 1 / 400 4.85 5 97.0 10.4 Kesinlik Test kesinliğini belirlemek için değişkenlik (test-arası), standart eğrinin üzerinde bir aralık gösteren üç serum örneği çoğalabilirliği test edilmiştir. 8
Test-içi Test-arası Örnek No. Ortalama (U/ml) VK (%) Örnek No. Ortalama (U/ml) VK (%) 1 115.0 5.3 2 93.0 1.7 3 27.0 2.1 1 116.2 2.4 2 43.3 7.4 3 8.1 3.7 10.5 Kalibrasyon Bu kantitatif test Protein C için WHO ikinci uluslararası standarta karşı kalibre edilir. Değerler, toplanmış normal plazmaya kıyasla yüzde relatif (%)verilmiştir. 11.Literatür 1. Dahlbäck B, Villoutreix BO (2005). The anticoagulant protein C pathway. FEBS Letters 579: 3310-3316. 2. Esmon CT (2003). The Protein C Pathway. Chest 124: 26-32. 3. Miletich JP (1990). Laboratory diagnosis of Protein C deficiency. Hemostasis 16: 169-176. Seminars in Thrombosis and 4. Griffin JH, Evatt B, Wideman C, Fernandez JA (1993). Anticoagulant Protein C Pathway defective in majority of thrombophilic patients. Blood 82: 1989-1993. 5. Preissner KT (1990). Biological relevance of the Protein C system and laboratory diagnosis of Protein C and S deficiencies. Clinical Science 17: 351-364. 9
EK A: Pipetleme Şeması Kontroller, numuneler ve Referans Plazmanın işleyiş dilüsyonları pipetleme için aşağıdaki gibi önerilir: Kantitatif yorumlama için standart bir eğri kurmak için Referans Plazma işleyiş dilüsyonları kullanın. 10
EK B: Test prosedürü 11
12
In vitro diagnostik medikal gereç Katalog numarası Lot numarası EC Declaration of Conformity/Uyumluluk Bildirisi 96 Testler Kullanım bilgileri İle Kullanım Sıcaklık sınırlamaları Üretici Cut-off kalibratör Pozitif kontrol Negatif kontrol Kalibratör Recovery/düzelme Konjugat Kaplı microtiter plate Kaplı pinplate Yıkama buffer Substrat Buffer Stop Solusyonu Numune buffer 13