Ticari Olarak Satılan Farklı Renklerdeki Gıda Ve Kumaş Boyalarının P.Aeruginosa Ve Metisilin Dirençli S.Aureus Üzerine Etkisinin İn Vitro Araştırılması# Mehmet Emin Bozdoğan, Burcu Bozdoğan, Şener Çolak, Aykut Kılıç, Elif Sungur Danışman: Prof. Dr. Julide Sedef Göçmen 2, # Bu çalışma Başkent Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Araştırma Kurulu tarafından onaylanmış (Proje no: DA12/14) ve Başkent Üniversitesi Araştırma Fonunca desteklenmiştir. ÖZET Amaç: Günlük yaşantımızda kullandığımız kumaş ve gıda boylarının Metisilin Dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ve Pseudomonas aeruginosa bakterilerinin üremesi üzerine etkilerini belirlemek ve bu amaçla bu çalışmada kırmızı, mavi, yeşil ve sarı tonda gıda ve kumaş boyalarının farklı konsantrasyonlarının bu bakteriler üzerine ne şekilde etki ettiği invitro koşullarda araştırılmak amaçlanmıştır Yöntem: Ticari olarak satılmakta olan kırmızı, yeşil, mavi,sarı kumaş ve gıda boya maddelerinin steril solüsyonlarının %16-%8-%4-%2-%1-%0,5 konsantrasyonlarda seri dilüsyonları yapıldı. P. aeruginosa ve MRSA suşları Müeller Hinton agarda üretildi. İki suşun ayrı ayrı 0,5 McFarland sulandırımları hazırlandı. Bu sulandırımlardan 100 er mikrolitre, %16-%8-%4-%2-%1-%0,5 konsantrasyonlarda seri dilüsyonları yapılan kumaş ve gıda boyalarına her bir dilüsyonuna eklendi. 37 C de 18-24 saat inkübasyonu takiben her bir dilüsyondaki üremelerin tespiti için 1 mikrolitrelik steril tek kullanımlık özelerle Müeller Hinton agar besi yerine pasajları yapıldı. Bu besi yerleri 37 C de 18-24 saat inkübe edildikten sonra her bir alandaki koloniler sayıldı. Sonuç ve Yorum: Değişkenler normal dağılım göstermediğinden, veri seti logaritmik transformasyon sonrası Faktöriyel düzende 4 faktörlü varyans analizi yöntemi ile değerlendirilmiştir. Sonuçlar ort±std. sapma, ortanca değer, en küçük-en büyük değerler ve geometrik ortama olarak ifade edilmiştir. p<0.05 düzeyi istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Veri analizi SPSS 17.0 (SPSS Ver.17.0, Chicago IL, USA) yazılımı ile gerçekleştirilmiştir. Çalışma sonucunda; hem gıda hem kumaşta yeşil, sarı ve kırmızı renklerde P. aeruginosa, MRSA dan istatistiksel olarak anlamlı derecede fazla ürediği görüldü (p<0,001). Ancak kumaş ve gıda da mavi renkte hem P. aeruginosa hem de MRSA bakterilerinin diğer renklerden istatistiksel olarak anlamlı derecede düşük ürediği belirlendi(p<0,001). Bu sayede günlük hayatımızda bu kadar iç içe yaşadığımız, yediğimiz, içtiğimiz gıdalarda ve değişik amaçlarla kullandığımız kumaşlarda boya maddesi olarak kullanılan
maddelerden kırmızı, yeşil, sarı ve mavi renkte olanlarının bakteri dünyasından MRSA ve P.aeruginosa bakterilerini ne şekilde etkilediği invitro olarak göstermeye çalıştık. Bulgularımız gerek gıdalarda gerekse kumaşlarda kullanılan boya alternatiflerini daha doğru değerlendirmemizi ve seçimlerimizin bu boyaların bakterilerin üzerine etkisine dayandırılarak daha doğru yapılmasını sağlayacaktır. Anahtar Kelimeler: Gıda boyası, Kumaş boyası, Metisilin Dirençli Staphylococcus aureus, P. aeruginosa GİRİŞ Boya, herhangi bir nesnenin renk vermek amacıyla veya koruma amaçlı olarak içine konulmasına yada kaplanmasına denir. Boyama işlemi gıda maddelerine renk vermek için veya kumaşlara renk vermek için kullanıldığı gibi, kozmetik maddelerde, duvar, bina boyamalarında, yol şeritlerinin belirlenmesinde ve resim sanatı gibi sanatlarda da kullanılmaktadır. Boya maddeleri ilk kez ne zaman ve ne şekilde kullanıldığı hakkında kesin bilgiler yoktur. Bitki ve hayvanlardan elde edilen doğal boyaların çok eski bir geçmişi olduğu kesindir. Eski mısırlılar bitki köklerinden, ağaç kabuklarından, meyvalardan, hatta bazı böcek ve yumuşakçalardan doğal boya maddeleri elde ederek ipek, keten, yün gibi dokudukları kumaşları boyamışlardır. Çinliler MÖ 3000 yıllarında dokumaları boyamak için bitkilerden elde ettikleri boya maddelerini kullanmışlardır. Teknik olarak gıda boyası; gıdaya, ilaca, kozmetik ürünlere veya insan vücuduna uygulandığı, ilave edildiği zaman renk veren boya, pigment veya maddelere denir. Gıda boyalarının değişik renk tonları kullanılarak, yeni ve çeşitli ürünler oluşturmak süsleyici özellik kazandırmak lezzeti arttırmak mümkün olabilir. Renk veren maddelerin insanlar tarafından emniyetle tüketilmesinde belirli ölçme değerleri kullanılır Gıda renkleri E numarası ile değerlendirilir ve bu Avrupa güvenlik onayını gösterir. Gıda renklerinin spesifik isimleri veya E numaralarıyla gıda bileşenleri etiketinde bulunması, tüketicilerin bilinçli seçim yapmalarını sağlar. E kodu, her bir gıda katkı maddesini tanımlamak ve bir karışıklığa yer vermemek için kullanılan ve Avrupa Birliği (EC) simgesi olarak E harfi ve 3 veya 4 basamaklı sayıdan oluşan bir kodlama sistemidir. Doğal renklendirici maddeler; mikrobiyal, bitkisel, hayvansal ve mineral kaynaklardan elde edilen pigmentlerdir. Bunlar; Bitkisel materyalin doğrudan kullanımı(kırmızı pancar, safran ve meyve suları) Bitkisel materyalden ekstraksiyon yada konsantrasyonla elde edilenler(yağ) Hayvansal materyalden ekstraksiyon yada konsantrasyonla elde edilenler(kırmız)
Karbonhidratlardan ısı işlemiyle elde edilenler(karamel) Doğal olarak bulunan ama kimyasal olarak sentezlenenler(karotenoidler) İnorganik ve vitamin kökenliler (Riboflavin) olarak sayılabilir. Bu renk maddeleri Konserve içecekleri, pişirilmiş ürünler, süt ve süt ürünleri, dondurma, yoğurt, bisküvi, patlamış mısır, çikolata (özellikle beyaz çikolatalarda hoş pastel rengi oluşturmak için), yoğurt (limon sarısından kayısı rengine, şeftali renginden hafif kırmızıya ), dondurma (vanilya sarısından, kırmızımsı turuncuya kadar birçok rengi oluşturmada ), margarin ve tereyağı, işlenmiş peynir, meyveli jeller, meyve suları, domates ürünleri, alkolsüz ve alkollü içecek, sirke, meyve preparatlarında, marmelatlarda kullanılır.taze veya donmuş meyve, konserve meyvelerde (ananas,dometes) kullanılmaktadır. Gıda boyaları elde edildikleri kaynağa göre üç gruba ayrılmaktadır. Doğal Yarı sentetik Sentetik Gıda boya maddeleri; Sertifikalı ve sertifikasız renk maddeleri Doğal, doğala özdeş ve yapay renk maddeleri olarak gruplandılmaktadır. Kumaşlarda boyanırlar. Bu amaçla tekstil maddelerini boyamak için Selülozik Protein Sentetik yapıda boyar maddeler kullanılmaktadır Mikrobiyolojide; Mikroorganizmaları iyi görebilmek ve ayrıntılarını tetkik edebilmek için bir çok genel ve özel boyama yöntemleri ortaya konulmuştur. Bunlar; 1. Basit boyamalar: Mikroorganizmalar hakkında kısa süre içinde bilgi edinmek için tek boya solusyonu kullanılır. Bu amaçla karbol füchsin, kristal violet ve metilen mavisi gibi genellikle bazik boya solusyonlarından birisi seçilir. 2. Bileşik boyamalar: Birden fazla boya ile yapılan boyama yöntemleridir. Bunlar arasında: a) Mikroorganizmaları birbirinden ayırmada kullanılan (Gram, Ziehl-Neelsen). b) Bakterilerin iç ve dış yapıları hakkında bilgi edinmek için kullanılan (spor, kapsül, flagella) boyaları sayılabilir. Boya maddeleri bakterileri üretmek için kullandığımız bazı besiyerlerine indikatör (fenol mavisi, fenol kırmızısı, brom krezol yeşili, bromkrezol moru, metil kırmızısı gibi) yada inhibitör (metielen mavisi, eozin Y, malaşit yeşili gibi) olarak da ilave edilmektedir. Kısaca mikrobiyolojide boyar maddeler bakteri morfolojisini belirlemede, bakterinin
varlığını tesbit etmekte veya üremesini istemediğimiz bakterileri inhibe etmede kullanılmaktadırlar. Stafilokoklar deri ve nazofarinkte bulunurlar Sık olarak hastane enfeksiyonlarına neden olurlar. Yüksek sıcaklığa, dezenfektan ve antiseptik solüsyonlara duyarlı olmakla beraber kuru yüzeylerde uzun süreler canlı kalabilirler. Stafilokoklar duyarlı bireylere doğrudan temas veya eşyalarla temas (kontamine giyseler yatak çarşafları gibi) ile bulaşırlar. Hemen bütün doku ve organlarda bölgesel yada yaygın enfeksiyon etkeni olabilirler. S. aureus toksin oluşturarak veya dokulara yayılıp zarar vererek hastalık oluştururlar. Metisilin dirençli Staphylococcus aureus (MSRA) suşları hastane yatan bireylerde 1980 li yılların başlarında hızla yayılmaya başlamıştır. MRSA hastene enfeksiyonu oluşturan dirençli ve önemli bir bakteridir. Pseudomonas türleri ise farklı çevresel yerleşim gösteren fırsatçı bir patojenlerdir. Pseudomonas spp. 4-42 C arasında üreyebilir. Bir çok antibiyotiğe ve dezenfektana dirençlidirler. Psedomonas spp. çevresel kaynaklarda (örneğin hastane lavaboları, yerler ) saptanabilir. Hastanelerde yatan hastalarda psedomonas türlerinin izolasyonu hemen her zaman kaygı vericidir. Fakat hastanın geçici kolonizasyonuna veya örnek alınımı veya laboratuvar uygulamaları sırasında bulaş söz konusu olabilir. P. aeruginosa asemptomatik kolonizasyondan başlayarak solunum yolu, deri kulak, üriner sistem, göz enfeksiyonları ve septisemiye de neden olabilir. Günlük yaşantımızda karşılaşabileceğimiz bakterilerle, gıda ve kumaş boya maddeleri birbirleri üzerine etkileri olabilir. Bu amaçla kullanılan kırmızı, sarı, yeşil ve mavi renkteki gıda ve kumaş boyaları bakterilerin üremesine farklı şekillerde etki edebilir. Bu düşünceden yola çıkarak günlük yaşantımızda kullandığımız kumaş ve gıda boylarının MRSA ve P. aeruginosa bakterilerinin üremesi üzerine etkilerini belirlemek ve bu amaçla bu çalışmada kırmızı, mavi, yeşil ve sarı tonda gıda ve kumaş boyalarının farklı konsantrasyonlarının bu bakteriler üzerine ne şekilde etki ettiği invitro koşullarda araştırılmak amaçlanmıştır GEREÇ VE YÖNTEM Ticari olarak satılmakta olan kırmızı, yeşil, mavi,sarı kumaş ve gıda boyalarının %16 lık ana stok solüsyonları distile su ile sulandırılarak hazırlandı. Stok solüsyonların her biri 0,45 mikrometre çaplı milipor filtrelerden süzülerek steril edildi. Kumaş ve gıda boya maddelerinin steril solüsyonlarının %16-%8-%4-%2-%1-%0,5 konsantrasyonlarda seri dilüsyonları yapıldı. American type culture collection(atcc) 27853 P. aeruginosa ve ATCC 43300 MRSA suşları Müeller Hinton agarda üretildi ve her iki suşun ayrı ayrı 0,5 McFarland sulandırımları hazırlandı. Bu sulandırımlardan 100 er mikrolitre, %16-%8-%4-%2-%1- %0,5 konsantrasyonlarda seri dilüsyonları yapılan kumaş ve gıda boyalarına her bir dilüsyonuna eklendi. 37 C de 18-24 saat inkübasyonu takiben her bir dilüsyondaki
üremelerin tespiti için 1 mikrolitrelik steril tek kullanımlık özelerle Müeller Hinton agar besi yerine pasajları yapıldı. Bu besi yerleri 37 C de 18-24 saat inkübe edildikten sonra her bir alandaki koloniler sayıldı. Testler 9 kez tekrarlandı. Kontrol olarak Serum fizyolojik + bakteri karışımı ve bakteri eklenmemiş boya dilüsyonları kullanıldı. Farklı boyaların farklı konsantrasyonlarda her iki bakterinin üremesi üzerine etkisi istatistiksel olarak değerlendirildi. BULGULAR Değişkenler normal dağılım göstermediğinden, veri seti logaritmik transformasyon sonrası Faktöriyel düzende 4 faktörlü varyans analizi yöntemi ile değerlendirilmiştir. Sonuçlar ortalama±standart sapma, ortanca değer, en küçük-en büyük değerler ve geometrik ortalama olarak ifade edilmiştir. p<0.05 düzeyi istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Veri analizi SPSS 17.0 (SPSS Ver.17.0, Chicago IL, USA) yazılımı ile gerçekleştirilmiştir. Hem gıda hem kumaş boyalarında yeşil, sarı ve kırmızı renklerde P. aeruginosa nın, MRSA dan istatistiksel olarak anlamlı derecede fazla ürediği görüldü (p<0,001). Ancak kumaş ve gıda boyalarında mavi renkte hem P. aeruginosa hem de MRSA bakterilerinin diğer renklerden istatistiksel olarak anlamlı derecede düşük ürediği belirlendi(p<0,001) (Grafik1-2). Kumaş ve gıda boyalarının,mrsa ve P.aeruginosa üzerine % inhibisyon etkisi(mg/ml)ne bakıldığında mavi renkte bu etkinin en belirgin olduğu saptanmıştır (Tablo 1). Negatif kontrolde üreme olmazken, pozitif kontrol grubunda10 5 CFU in üzerinde üreme saptandı. TARTIŞMA Ticari olarak satılan kumaş ve gıda boyalarının bakteri üremesi üzerine etkisinin olduğunu gördük. Kumaş ve gıda boyalarının farklı renklerinin bakterilerin üremeleri üzerine farklı etkileri farklı konsantrasyonlarının farklı etkileri ayrıca kumaş ve gıda boyalarının farklı renklerinin farklı bakterilere etkileri de farklı olduğunu belirledik. Bu konuda yapılmış benzer bir çalışmaya rastlamadık. Bu sayede günlük hayatımızda bu kadar iç içe yaşadığımız, yediğimiz, içtiğimiz gıdalarda ve değişik amaçlarla kullandığımız kumaşlarda boya maddesi olarak kullanılan maddelerden kırmızı, yeşil, sarı ve mavi renkte olanlarının bakteri dünyasından MRSA ve P.aeruginosa bakterilerini ne şekilde etkilediği invitro olarak gösterilmiştir. Kaynaklar: 1. www.kimyaevi.org
2. Rasooly R. Expanding the bactericidal action of the food color additive phloxine B to gram-negative bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology 45 (2005) 239 244 3. Hassan GM. Effects of some synthetic coloring additives on DNA damage and chromosomal aberrations of rats. Arab J. Biotech., 2010; 13 (1):13-24. 4. Çalış_A, Yuvalı Çelik G, Katırcıoglu H. Antimicrobial effect of natural dyes on some pathogenic bacteria. African Journal of Biotechnology Vol. 2009; 8 (2), 291-293. Grafik 1:Denenen boyaların bakterilerin koloni sayılarına etkisi; Ortalama Grafik 2: Denenen boyaların bakterilerin koloni sayılarına etkisi; Ortanca
YEŞİL SARI MAVİ KIRMIZI RENK TİP BAKTERİ KUMAŞ GIDA KUMAŞ GIDA KUMAŞ GIDA %100 İnhibisyon (mg/ml) %50 İnhibisyon (mg/ml) MRSA 160 <0.005 MRSA >160 160 MRSA 5 <5 PSEUDOMONAS 5 <5 MRSA 8 5 PSEUDOMONAS >160 0.04 MRSA <5 <5 MRSA >160 160 KUMAŞ MRSA 8 1 GIDA MRSA >160 160
Tablo 1: Kumaş ve gıda boyalarının,mrsa ve etkisi(mg/ml) P.aeruginosa üzerine % inhibisyon