helena www.helena-biosciences.com BioSciences Europe Kullanım Talimatları SAS-MX İDRAR IFE Katalog No: 100600
KULLANIM AMACI SAS-MX İdrar IFE Kiti, jel içinde proteinin immunofiksaatonu izlenerek agaroz jel elektroforez ile idrar proteinlerinin belirlenmesini amaçlar. Üriner proteinler filtre yoluyla böbrekte bulunan plazma proteinlerinden öncelikli olarak türetilmiştir. İdrarda anormal plazma proteinlerinin görünen büyük değeri renal fonksiyon değerlendirmesinde bulunur. Proteinüri uygun eğitimi türün ve ektrasyon edilen proteinlerin miktarının kuantitatif ve kalitatif değerlendirmesini içermelidir. Alfonso,ilk kez 1964 yılında literatürde immünofiksasyonu tanımladı.alper ve Johnson,1969 yılında çok daha pratik bir prosedür ile bu tekniği kullanan çok sayıda çalışma yayınladı.immünofiksasyon,1976 dan beri immünoglobulinlerin araştırılması için bir prosedür olarak kullanıldı. İmmunoçökelme ile spesifik protein türlerinin belirlenmesinde birleşen idrar protein elektroforetik ayrılığı kombinasyonu Dysglobulinaemias ile ilgili proteinüri-fizyolojik, Glomerüler (seçici ve seçici olmayan), Boru ve proteinüri çeşitli türlerinin farklılaşmasına olanak sağlar. SAS-MX İdrar IFE kiti, serum proteinlerini,bir agaroz jelde yüklerine göre ayırır. Daha sonra proteinler, kalitatif yorumlanma için immünopresipitasyonun görünürlüğünü sağlamak için monospesifik antisera ile inkübe edilir, yıkanır ve boyanır. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kağıdına başvurun. BİLEŞENLER 1. SAS-MX Ürine(İdrar) IFE Jel Koruyucu olarak sodyum azid ve thimersal ile bir Tris/Barbital buffer içeren agaroz. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2. Konsantre Tris / Barbital Buffer Koruyucu olarak sodyum azid ile konsantre Tris/barbital buffer içerir. 1 litre saf su ile şişe içeriğini dilüe edin ve iyice karıştırın. 3. İdrar Protein Boyama Coomassie Mavi toz boya içerir. Toz boya paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Suda 50% metanoldan 1 litresini şişe içeriğinde çözün. 20 ml glasial asetik asit ekleyerek asidik yapın. İyice karıştırın ve kullanım öncesi filtre edin. 4. SAS-MX Ürine IFE Anti Sera Kit a)insan Serum/İdrar Proteinleri, b)idrar Mikro Proteinler (beta-2 mikroglobülin ve retinol bağlı protein), c)idrar Mikro Proteinler (Transferrin ve alfa-1- antitripsin), d) IgG,A,M ağır zincir, e)kappa hafif Zincir (serbest ve bağlı) ve f) Lambda hafif
Zincir (serbest ve bağlı) antiserum içerir. Tüm antiserumlar koruyucu olarak sodyum azid içerir. Antiserum paketinde kullanım için hazırdır. 5. Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanım talimatları ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda Numune Aplikasyon kalıbı, Antiserum kalıbı ve kurutma kağıdı A,B,C,D ve X içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1 - SAS-MX Ürine IFE Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulması :1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya bakteriyal yada fungal kaynaklı agarozun kontaminasyonunu belirtir 2 - Tris / Barbital Buffer Konsantre buffer 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solüsyonu 15-30 derecede 2 ay stabildir. Bufferın bulanık ve zayıf performansı bozulduğunu belirtebilir. 3- Urine Protein Stain Toz boya 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solüsyonu 15-30 derecede 6 ay stabildir. Boya kapasitesinin azalmasını önlemek için derhal kullanılan boyanın çıkarılması tavsiye edilir. Zayıf boyama performansı, boya solüsyonunun bozulduğunu belirtebilir. 4 SAS-MX Ürine IFE Antiserum Kiti Antiserum kiti 2-6 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı belirtebilir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Katalog No.4063 SAS-MX Odası Katalog No.1525 EPS600 Güç kaynağı Katalog No. 9400 IFE Kontrol Kit Katalog No. 4062 Inkübasyon odası Katalog No.9035 Immuno SuperPress / Katalog No.5014 Gelişme Ağırlığı 60-70 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını Boya arındırıcı solüsyon: 1300 ml saf su ve 300 ml metanolu karıştırın. 400ml glasial asetik asit ekleyin. İyi kapatılmış bir şişede saklanır Tuz solüsyonu (%0.85 NaCl) Saf su İzleyen öğeler ürin IFE standart serum için gereksin duyulmaz fakat ileri araştırmalar için gereksinim duyulabilir. Katalog No.220500 İnsan ürine serbest Kappa hafif zincirine karşı Antiserum(2ml)
Katalog No.220600 İnsan ürine serbest Lambda hafif zincirine karşı Antiserum(2ml) Katalog No.220900 İnsan Ürin Pentavalentin/Albumin karşı Antiserum(2ml) Katalog No.221000 İnsan Ürin Pentavalentine karşı Antiserum(2ml) NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune taze toplanan idrardır. Numuneler 2...6 C de 72 saate kadar yada -20 C de 2 haftaya kadar buzdolabında saklanmalıdır. Total hat 1000g/L ya da 5g/L den diğer hatlara göre daha az konsantrasyona sahip olmalıdır. Bazı numuneler, eğer total protein düşükse konsantrasyon gibi yada eğer total protein yüksekse yada eğer hafif zincir zayıfsa dilüsyon gibi özel tedavi gerektirir. Daha fazla bilgi için SINIRLAMALARA bakın. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1.Jeli paketinden çıkarın ve kağıt havlu üstüne koyun. Ambalajını çıkarın ve kurutucu C ile jel yüzeyini kurutun ve kurutucuyu atın. 2.Jel köşesindeki oklarla numune aplikasyon kalıbını hizalayın ve kalıbın başına kurutucu A yı koyun ve iyi temas sağlaması için yarığın içine parmağınızı sürtün. Kurutucuları alın ve adım 5'te kullanmak için saklayın. 3.Her yarığa 3μl numune uygulayın ve 5 dakika absorb olması için bırakın. 4. Numune emiliyorken, SAS-MX odasının her iç bölümüne 25 ml buffer dökün. 5.Numune emilimi ardından, adım 2 den kalan kurutucu A ile kalıbı kurutun ve hem kurutucuyu hem de kalıbı alın. 6. Jeli oda içine agoraz tarafı aşağı olacak şekilde yerleştirin. Odanın başına karşılık gelen pozisyonlar ile pozitif (+) ve negatif (-) tarafları hizalayın. 7.Elektroforez jel: 120 volt, 40 dakika 8. Elektroforezin ardından, bir ıslak kurutucu içeren inkübasyon odasına jeli yerleştirin ve jel yüzeyine antiserum aplikasyon kalıbını koyun. Not: Jel ve kalıbın iyi temas ettiğinden emin olun. 9. Her bir hatta 2 damla uygun antiserumdan/fiksatiften damlatın. Fiksatif ve serumun tamamen kanalları doldurduğundan emin olun. 10. 15...30 C de 15 dakika boyunca jeli inkübe edin. 11. İnkübasyonu takiben, yavaşça çalkalama ile tuz solüsyonunda 5 dakika boyunca jeli yıkayarak antiserum kalıbını alın. 12. Bir kurutucu D agaroz üzerine jel yerleştirin. X i takiben jelin yüzeyine bir kurutucu B (tuz içinde ıslatılmış) yerleştirin. 10 dakika geliştirme ağırlığı kullanılarak yada 5 dakika bir IFE SüperPress içinde jel yüzeyine bastırın. 13. Kurutucuları alın ve hafifçe çalkalayarak 10 dakika boyunca saline solüsyonunda jeli yerleştirin. 15. Bir kurutucu D agaroz üzerine jel yerleştirin. Kurutucu D i takiben jelin yüzeyine bir kurutucu B (tuz içinde ıslatılmış) yerleştirin. 3 dakika geliştirme ağırlığı kullanılarak yada 1 dakika bir IFE SüperPress içinde jel yüzeyine bastırın. 16.Kurutucuları alın ve 60-70 C de jeli kurutun. 17. Kuru jeli boya solüsyonu içine 5 dakika daldırın. 18. Boya arındırıcı solüsyon 2 x 15 saniye yıkayarak jeli boyadan arındırın. 19.Saf suda kısa süre jeli yıkayın ve kurutun.
SONUÇLARIN YORUMLANMASI Numunede bulunan proteinlerin olası tanımlanması, diğer hatlarda mevcut toplam protein paternlerinde bulunan bantları karşılaştırarak tespit edilebilir. Jelde mevcut bantların kalitatif Değerlendirme / görsel yorumu: Proteinuria nın tipi Jelde görülen bantlar Mevcut proteinler Normal ürin küçük albümin bant albümin Glomerular albümin, alfa-1, beta, albümin, alfa-1, antitripsin, gama transferrin, gama globulinler Tubüler alfa-1, alfa-2, beta Retinol bağlayıcı Protein, beta2-mikroglobulin, alfa-2 mikroglobulin Taşan gama veya çeşitli immunoglobulins, Serbest ışık zincirleri SINIRLAMALAR 1. Antijen fazlalığı Çökelti alanında antijen fazlalığı, eğer antikor miktarı az veya antijen/antikor eşitsizliği varsa meydana gelecektir. IFE de antijen fazlalığı genellikle hasta numunesindeki immünoglobulin fazlalığına dayanır. Antijen fazlalığı prozoning ile karakterize edilir. Numunenin yüksek dilüsyonu immünoglobulin konsantrasyonunu optimize etmek için kullanılmalıdır. 2. IFE antiserumu ile reaksiyon göstermeyen gama bölgesindeki bant C reaktif protein (CRP),hızlı cevap ile hastada tespit edilebilir.crp, serum protein örneğinin katodik sonuna yakın bir bant olarak görülür. CRP nin destekleyici kanıtları, yükseltilmiş alfa 1-anttripsin ve haptoglobulindir. CRP bantlı hastalar,muhtemelen CRP için test edildiği zaman yüksek seviyeye sahip olacaktır. 3.Kappa ve Lambda antiserumları ile reaksiyonsuzluk Genellikle bir numune ağır zincir antiserumu ile reaksiyon verir fakat belli hafif zincir reaksiyonu vermez. Bu durumda, izleyenler ihtimal dışı bırakılır; a)ağır zincir hastalığı, b)hafif zincirlerinin çok yüksek konsantrasyonlarını izleyen antijen fazlalığı,c)hafif zincirinin düşük konsantrasyonları,d)antiserum ile reaksiyon vermeyen atipik hafif zincir molekülü,e)saklı ışık zincir determinantları ile hafif zincirleri. Kesin sonuçlar almak için,test çalışması içermelidir;a) antikor/antijen eşitliliği optimizasyonu için çok yüksek veya düşük numune dilüsyonu,b) atipik immünoglobulinlerin tanımlandırılmasında yardım için bir üreticiden daha çok antiserum,c) açıkta kalan hafif zincirleri için beta-2-merkaptoethanol ile numune muamelesi. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Numune serileri test edildi ve diğer ticari test kiti ile karşılaştırıldı-her iki kit de eşit sonuçlar sergiledi.
BİBLİYOGRAFYA 1. Fauchier, P. and Catalan, F. Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis Alfred Fournier Institute, Paris, France, 1988. 2. Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. Finding Clues to Disease in Urine Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : 69-75. 3. Umbreit, A. and Wiedemann, G. Determination of Urinary Protein Fractions. A Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172. 4. Wiedemann, G. and Umbreit, A. Determination of Urinary Protein Fractions by Different Electrophoretic Methods, Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262. 5. Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and Lockhart, S. A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : 371-374. 6. Alfonso, E., Quantitation Immunoelectrophoresis of Serum Proteins, Clin. Chim. Acta., 1964; 10 : 114-122. 7. Alper, C.A and Johnson, A.M., Immunofixation Electrophoresis: A Technique for the Study of Protein Polymorphism, Vox Sang., 1969; 17 : 445-452. 8. Alper, C.A., Genetic Polymorphism of Complement Components as a Probe of Structure and Function, Progress in Immunology. First International Congress of Immunology. 1971 : 609-624, Academic Press, New York. 9. Johnson, A.M., Genetic Typing of Alpha(1)-Antitrypsin in Immunofixation Electrophoresis. Identification of Subtypes of P.M., J. Lab. Clin. Med., 1976; 87 : 152-163. 10. Cawley, L.P. et al. Immunofixation Electrophoretic Technique Applied to Identification of Proteins in Serum and Cerebrospinal Fluid, Clin. Chem., 1976; 22 : 1262-1268. 11. Ritchie, R.F and Smith, R. Immunofixation III, Application to the Study of Monoclonal Proteins, Clin. Chem., 1976; 22 : 1982-1985.