Gıda Analizlerinde LC-MS/MS Aplikasyonları Yem, Tahıl ve Yağlı tohum matrislerinde LC-MS/MS ile Mikotoksin ve Aflatoksin Kalıntısı miktarlandırma analizi, aplikasyon Çalışması. (Varian 320 MS Tandem Gold Triple Quadrupole LC-MS/MS Sistemi Kullanılmıştır.) İçerik: Aspergillus, Penicillium, Fusarium ve Alternaria spp. gibi küfler tarafından üretilen ikincil metabolizma ürünleri olan mikotoksinler, doğada 100'ün üzerinde küf türü tarafından üretilebilmektedir. Tarımsal ürünlerde mikotoksin oluşumu, uygun koşullarda ürüne bağlı olmak üzere, hasattan tüketime kadar hemen her aşamada meydana gelebilmektedir. Mikotoksinlerin gıdalardaki oluşumu ve miktarları azaltılabilmekte ancak, gıdalarda oluştuktan sonra tümüyle uzaklaştırılabilmeleri mümkün olmamaktadır. Dolayısıyla, özellikle tahıllar, kurutulmuş meyveler, fıstık, fındık, badem, ceviz gibi gıdalarda belli sıklıkta ölçülebilir miktarlarda aflatoksin bulunabilir. Mikotoksinler kanser yapıcı, DNA tahrip edici, anne karnındaki fetüsü etkileyici özelliğe sahiptirler. Ayrıca özellikle böbrek ve karaciğer gibi organları olumsuz etkilerler. Özellikle aflatoksinler mısır, buğday, pirinç gibi tahıllarda, antep fıstığı, fındık, toz kırmızı biber, baharatlar, kakao, kahve, etler, süt ve süt ürünleri ve kurutulmuş meyveler (incir, kayısı, üzüm gibi) ile hayvan yemlerinde bulunabilir. Uzun vadede düşük dozda aflatoksine maruz kalınması çok tehlikeli sonuçlara neden olabilmektedir.hayvanlarda yapılan çalışmalarda aflatoksin B1 in tümör oluşumunu tetiklediği belirlenmiştir. Yasal düzenlemeler doğrultusunda kabul edilen sınırlardan daha yüksek değerlerde aflatoksin içeren gıda ve yemlerin tüketilmesine izin verilmemelidir. HPLC Parametreleri : Enjeksiyon Hacmi : 20 ul Analiz Süresi: 12 dakika Kolon Frını : 25 C Analitik Kolon: Dikma C18 İnspire, 150*2,1, 3um
LC Gradient şartları : Zaman (dk.) % A % B Akış (ml/dk) 00:00 90 10 0.25 01:30 90 10 0.25 09:00 10 90 0.25 09:01 90 10 0.25 12:00 90 10 0.25 MS/MS Parametreleri: Detector Voltage + 1800 V Needle Positive Voltage 5000V Needle Negative Voltage (-)5000V Spray Shield Voltage Positive 600 Spray Shield Voltage Negative (-)600V Spray Chamber Temperature 60 C Drying Gas Temperature 350 C C.I.D Gas Pressure 2.40 mtorr Nebulising Gas Presuure 50 psi Drying Gas Pressure 35 psi
Numune Hazırlık Prosedürü: Seçilmiş toplam 10 adet Mikotoksinler ve Aflatoksinler (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, OTA, FB1, FB2İ DON, ZON, T2) organik solvent yardımı ile tahıl, kurutulmuş gıda, yem ve yağlı tohum matrislerinden ekstrakte edilir. Ekstraksiyon metodu Quechers metodunun modifiye edilmesi ile geliştirilmiştir. 10 g kurutulmuş gıda numunesi 10 ml R1 ile karıştırılarak homojenize edilir. Homojenize edilmiş örnekten 10g tartılarak 50 ml lik santrifüj tüpüne alınır. 100 μl R2 ve 10 ml R3 ilave edilir. 2 dk vorteks karıştırıcıda karıştırılır. 4000 rpm de 5 dakika santrifüj edilir. Santrifüj sonunda, üstteki çözeltiden pipet ile 8 ml alınıp 15 ml lik cam tüpe aktarılır ve azot akımı altında yaklaşık 0,5 ml kalana kadar uçurulur. 1 ml R4 ilave edilerek çözülür. Numune enjektöre takılan 0.45 µm filtreden süzülerek HPLC flakonuna alınır ve LC-MS/MS sistemine 20 ul enjeksiyon yapılır. Mikotoksinlerin tespiti için kullanılan MRM geçiş değerleri : Analit ESI (Polarite) MW Capillary MS (m/z) MS-MS (m/z) Parçalama Enerjisi (CE) Aflatoksin B1 (AFB1) + 312,3 30 313 285-22 Aflatoksin B2 (AFB2) + 314,3 30 315 287-25 Aflatoksin G1 (AFG1) + 328,3 30 329 243-25 Aflatoksin G2 (AFG2) + 330,3 30 331 245-30 Okratoksin A (OKR) + 403,8 30 404 239-22 Deoxynivalenol (DON) - 296,3 30 (-) 341 294,8 8 Zearalenone (ZON) - 318,4 30 (-) 317 174,7 22 Fumonisin B1 (FB1) + 721,8 30 722,6 334,3-35 Fumonisin B2 (FB2) + 705,8 30 706,6 336,3-40 T-2 Toxin (T2) + 466,5 30 484,4 305,1-14
Validasyon Sonuçları : Analit Doğrusallık (R 2 ; 0-100 µg/l) Geri Kazanım (%) LOQ (µg/l) Kesinlik (%RSD; Intraassay): Aflatoxin B1 0,9993 98,22 0,362 3,1 Aflatoxin B2 0,9994 99,55 0,341 2.2 Aflatoxin G1 0,9983 99,76 0,243 1,7 Aflatoxin G2 0,9975 99,44 0,274 1,1 Ochratoxin A 0,9988 100,63 0,459 1.6 Fumanisin B1 0,9990 91,63 28,04 1,9 Fumanisin B2 0,9992 90,63 25,62 3,1 Deoxynivalenol (DON) 0,9979 100,63 22,06 1.4 Zearalenone (ZON) 0,9985 98,63 8,93 1,9 Toxin (T2) 0,9992 99,57 26,3 2,7
Spike Yapılmış yem numunesinde çoklu Mikotoksin analizine ait Kromatogram Örneği : (Spike Miktarı : 5 ppb AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 ve OTA, 100 ppb T2, 125 ppb FB1, FB2, DON, 20 ppb ZON, yem numunesi )