attomol Borrelia burgdorferi-dna-lina Beyin Omurilik Sıvısı, sinoviyal sıvılar, deri biyopsiler veya kenelerde B. burgdorferi-dna (sensu lato)nin tespitine yönelik test Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir! 20 tespit sipariş numarası: 1036 1.Giriş Borrelia burgdorferiyle(bb) bulaşmış bir kene ısırığı (Bb), Lyme hastalığının klinik semptomlarına sebep olabilir (Braune, 1991, Fortschr Neurol Psychiat, 59:456-467). İlk semptomlar, hastalığın çeşitli şekilde ortaya çıkması 2-32 günlük bir inkübasyon döneminden sonra görünür. Bu lezyonun en sık yerleri üst bacak, kasık ve omuzlardır. Hastaların önemli kısmında, hastalığın aşama 1 ile birleştirilen bu semptomları tamamen kaçırılır (Hechemy, 1986, Bull Soc Path Ex, 79:9-21). Hastalığın 2 inci aşamasında patojen diğer organlara saldırabilir. Semptomlar baş ağrısı, boyun sertliği, ateş, titreme, geçici kas ağrısı, bitkinlik, artraljiye ve genel rahatsızlık olarak sınıflandırılır. Lyme hastalığının erken semptomları genellikle periyodiktir. Bazı haftalar veya aylardan sonra meningoradiculitis, encephalomyelitis, ve sinir iltihabı gibi nörolojik semptomlar ilk semptom olarak radikular acıyla görünür. Haftalar içinde duyarlılık bozuklukları, sinir ileti bozuklukları (e.g. facial paresis) ve kol-bacakta kısmı felç de oluşabilir. Erken nörolojik bulgular ay içinde kaybolur ama kronik semptomlar ilerki dönemlerde görünebilir (Isselbacher et al., 1995, Harrisons Innere Medizin 1, 13. Auflage, Blackwell-Wissenschaftsverlag, S. 890f). Lyme hastalığının son aşaması (3 aşama), akrodermatitis kronik atrofikan üçüncü öncü olan bir semptom ile tanımlanır(braune, 1991, Fortschr Neurol Psychiat, 59:456-467). Hastalık özellikle 50-70 yaşındaki kadınlarda görülür. Ayrıca, yetersiz derecede tedavi edilen hastaların çoğunda büyük eklemlerde romatizma oluşur dizler gibi). Kenelerde Borrelia DNA'in tespiti Borrelia pozitif kenenin ısırığından sonra enfeksiyonu engellemek için kullanılan antibiyotiksel bir terapiye izin verir. Hastaların beyin omurilik sıvısı numunelerinde veya sinoviyal sıvılarda Borrelia nın tespiti enfeksiyonun seyri boyunca her zaman mümkün değildir. Bu nedenle, negatif bulgular klinik belirtiler veya serumun antikorları gibi bir Borrelia enfeksiyonu ve diğer kriterleri ayrı tutulmadan dikkate alınmalıdır. Bu test şu durumlarda uygulanır:
Kenenin ısırdığı bölgeden alınan deri biyopsilerinde ve kenede Borrelia DNA tespit ederek antibiyotik tedavisine gerek duyulup duyulmadığını belirlemek için Beyin omurilik sıvısı ve sinoviyal sıvılarda Borrelia DNA sını tespit etmek için Test, insanda patojen olan B. burgdorferi s.s., B. garinii, B.afzelii ve B. Valaisiana türlerinden DNA yı uygun şekilde tespit eder. Onlarla beraber, insanlar için non-patojenik olan B. Andersonii türü tespit edilebilir. Ama şimdiye kadar, bu tür sadece Kuzey Amerika'da bulundu. Muhtemelen patojen olduğu söylenen B. lusitaniae tespitine ek olarak patojen türleri B. spielmanii olarak sınıflandırılmış en son tespiti bu test tahlili ile garanti edilemez. Bu test kiti fonksiyonu bilinmeyen 66 KD proteininin bir gen kromozomal kodlu parçasını tespit eder(rosa etal., 1991, J. Clin. Microbiol. 29(3):524-532; Bunikis et al., 1995, FEMS Microbiol Lett. 131(2):139-145). 2. Genel Açıklamalar Belirtilen saklama sıcaklığında her kit bileşenini tutun Parmaklarla test şeritlerine dokunmayın, bir pens kullanın Bir bıçak veya neşter kullanarak bloktan şeritleri kesin Bu kit sadece in vitro diagnostik uygulamalar için kullanılmalıdır. Bu kiti son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız. Kullanmadan önce sıvıların küçük miktarlarını içeren tüm tüpleri santrifüjleyin Hafif ısıtma ile 5 kez yıkanan solüsyon da çökeltileri çözün Test çalışması için iyi eğitimli personel ve uygun laboratuar ekipman hususuna dikkat ediniz. Test uygulamasının tüm adımlarında eldiven giyiniz. Hasta numuneleri, potansiyel enfeksiyonlu madde olarak dikkate alınmalı ve mevcut yasalara göre hareket edilmelidir.. PCR* a yönelik reaktifleri, DNA numuneleri ile amplifikasyon ürünlerinden ayrı saklayın. PCR reaksiyonları ile amplife edilmiş numuneleri pipetlerken filtre uçlu farklı pipet setleri kullanın. Hibridizasyon solüsyon(# 127) kullanırken dikkatli olun. Bu solüsyon aşağıdaki R ve S- sınıflandırmaya bağlı olan formamide içerir: R61, S53-24/25-37-45. 3. Dahil olan malzemeler Sipariş numarası Reaktif Hacim/ Kantite Saklama Isısı 38 deiyonize PCR-H 2 O 0.2 ml -20 C
118 PCR buffer E 0.7 ml -20 C 120 Bb Primer 2 tüplü bir 8.5 μl primer solusyon, primer karışımı hazırlamak için 300 μl PCR buffer E (#118) ile her birini doldurun 122 Iç standart Bb (yeşil renkli tüpler) 125 Denatürasyon solüsyonu -20 C 2 tüplü bir 8.5 μl iç -20 C standart solusyon, 300 μl primer karışımı ile her birini doldurun. 0.75 ml 4 C 130 Bb test strips 20 strips 4 C 127 Hibridizasyon solüsyonu (2 x konsantre) 211 Yıkama solüsyonu D* (5 x konsantre) 212 Konjugat buffer (kullanıma hazır) 214 Konjugat C* (500 x konsantre) 14 ml 4 C 24 ml (2 x 12 ml) 4 C 14 ml 4 C 40 μl 4 C 75 Substrate 12 ml 4 C *Terim yıkama solusyonu ve konjugat için yukarıdaki tabloda açıklanan ürüne bu manuelden bakınız. a dahil olan üreticiden sipariş edilebilir yada defalarca kullanılabilir(# 124). Kitteki tüm reaktiflerin miyadı, kutunun dış yüzeyinde bulunan esas etikette bulunmaktadır 4. İlave Reaktifler ve Dahil olmayan malzemeler Beyin omurilik sıvısı, synovial sıvı, deri biyopsiler veya kenelerden hastaların DNA numuneleri (Qiagen dan spin kolonlar kullanılarak hazırlanır) Qiagen tarafından sağlanan HotStarTaq DNA Polimeraz Kontrol template (Bb pozitif DNA hazırlama) Eppendorf-tüpler (0.2 ml; 1.5 ml) Mikropipetler (hacim aralığı 0.5-1000 μl) ve steril filtre uçları
Thermocycler Thermoshaker Pens, beher, Falcon tüpler, distile su 5. Test Prensibi, Test sonuçlarının yorumlanması DNA LINA, saflaştırılan DNA numunesinin ve DNA iç standardının aynı reaksiyon karışımı içindeki PCR amplifikasyonuyla başlar. Amplifiye olan DNA nın tespiti strip yüzeyinde sabitlenmiş yakalama problarının yönlendirdiği ters hibridizasyon ve sonraki aşamadaki işaretleme reaksiyonu ile gerçekleşir. Hasta numunesi Borrellia DNA içerirse, patojen-spesifik bant test şeridinde görünür(fig. 1). Bütün numuneler ve kontrollerde iç standart bandı renklenmek zorundadır. Ancak hasta numunesi çok yüksek pozitifliğe sahipse iç kontrol DNA sı ile yarışır ve onu tamamıyla veya kısmen inhibe eder bu durumda iç kontrol bandında ya hiç renklenme olmaz ya da çok az renklenme olur. Bu durumda sadece kuvvetlice koyulaşan patojen-özel bant görünür. Tek başına bir diagnostik metodun sonuçlarından klinik tanıya gidilmemelidir. Doktor mevcut tüm laboratuar ve klinik sonuçları dikkate almalıdır. Özellikle, sınırlı test sonuçlarıyla ciddi bulaşıcı hastalıklardan dertli olan hastalar için numuneler diğer metotlarla ya da bu test tahlillerinde defalarca analiz edilmelidir. 6. Manuel Test protokolü için gerekli iki adım: (6,1) patojen DNA amplifikasyonu ve (6.2) test şeritleri için amplifiye olan DNA nın ters hibridizasyonudur. Hastaların numunelerine ek olarak PCR reaksiyonlarını kontrol etmek için aşağıdaki kontrolleri eklemeniz önerilir: 1. Negatif kontrol (PCR-blank) 2. Pozitif kontrol ( Bb- pozitif kontrol template) Kontrol template ayrı olarak(sipariş numaranızı 131) üreticisinden de sipariş edilebilir.
6.1 Amplifikasyon Beyin omurilik sıvısında, synovial sıvı, deri biyopsiler veya keneler hastalarından DNA hazırlama Primer karışımı hazırlama: kısaca kapsül solüsyonu içeren renksiz reaksiyon tüpleri santrifüjleyin (#120) ve 300 μl PCR buffer E ile her bir tüpü doldurun(#118). Primer mix. hazırlamak için pipet kullanarak uygun şekilde karıştırın Premix hazırlama: kısaca iç standart solüsyonu içeren sarı reaksiyon tüpleri santrifüjleyin (#122) ve 300 μl primer karışımıyla her tüpü doldurun. Primer mix. hazırlamak için pipet kullanarak uygun şekilde karıştırın Dikkat: 300 μl den daha az PCR premixe ihtiyacınız varsa geri kalanı -20 C de saklayabilirsiniz. PCR premix e hot start Taq DNA polimeraz ilavesiyle PCR mix hazırlama Bir reaksiyon için kullanılacak toplam PCR premixin miktarını hesaplamak için her bir numune ve kontrol sayıları ile premix miktarı (25 μl) çarpılmalıdır ve bir miktar fazla hacim eklenmelidir (5 reaksiyon için örnek: 5 x 25 μl + 15 μl fazladan hacim = 140 μl PCR premix). Daha sonra, hot start Taq DNA polimeraz (5 U / μl) premix içine son dilüsyon 1:100 olacak şekilde ilave edilmelidir. (örneğin: 140 μl PCR premix + 1,4 μl 5 U / μl polimeraz). Şimdi, PCR mix iyice karıştırılmalıdır. PCR mixi 0.2 ml lik tüplerde eşit hacimlere ayırma: Negatif kontrol: Pozitif Kontrol: Hasta numuneleri: 25 μl PCR mix 25 μl PCR mix 25 μl PCR mix + 10 μl PCR-H2O + 10 μl kontrol template (ca. 20 ng/μl) + 10 μl DNA (ca. 20 ng/μl) PCR thermocyclerde aşağıda listelenen sıcaklık rejimi kullanılarak yapılmaktadır: 45 döngü: 35 s 95 C 35 s 50 C 45 s 72 C Durdurma: 4 C zaman sınırı yok Dikkat: a) Qiagendan hot start Taq DNA polimeraz kullanılırsa aktivasyon adımları firmanın protokolünde detaylı olarak tanıtılmalıdır(15 min at 95 C). b)bu testin PCR premixi dutpi içerir, bundan dolayı uracil-dna glycosylase (UDG)- dekontaminasyonu 8 mu/μl reaksiyonu karışımının tavsiye edilen UDG enzim konsantrasyonu kullanılarak yapılabilir. Bu durumda iki başlangıç inkübasyon adımı 10 min
için 37 C'de, (UDG-reaksiyon) ve sonra 10 min için 95 C'de (UDG de inactivati), PCRsıcaklık profiline eklenmelidir. Beyin omurilik sıvısından hazırlanan numunelerde HSV in tespiti için bir UDGdekontaminasyonu öneririz. c) Amplifikatların tespiti hemen her zaman tavsiye edilen PCR inkübasyonundan sonra PCR reaksiyonları için UDG ile ele alınmalıdır. Ayrıca UDG'in kalan aktivitesi PCR ürünlerinin bozulmasına ve amplifikasyon ürünlerinin tespitinin imkansız olmasına neden olur. 6.2 Test şeritleri için ters hybridisation tarafından amplifikasyon ürünleri tespit etme Aşağıda listelenen indüksiyon adımları için reaktiflerin miktarları, başlayıcı kit ile sağlanan indüksiyon larının türü için geçerlidir. Diğer indüksiyon ları kullanılırsa, reaktif miktarlar ona göre adapte edilmelidir. Bu durumda üretici firmadan toptan eşya gibi ek reaktifler sipariş etmek mümkündür. Protokol adımları 1.2xhibridizasyon solüsyonun 1:2 seyreltilmesi 2. 5xyıkama solüsyonun 1:2 seyreltilmesi İhtiyaç duyulan solüsyonlar ve bileşenler Reaksiyon ampül Sıcaklık Zaman Aletler 14ml 2xhibridizasyon solüsyonu + 14ml distile su=28 ml kullanıma hazır 1xhibridizasyon solüsyonu (4 C de saklayın,4 ay sonra kullanım süresi dolar) Her test şeriti 1 ml 1xhibridizasyon solüsyonuyla inkübe edilmelidir. 12 ml 5xyıkama solüsyonu + 48ml distile su=60 ml kullanıma hazır 1xyıkama solüsyonu (4 C de saklayın,4 ay sonra kullanım süresi dolar) Her test şeriti için 4.5 ml 1xyıkama solüsyonunun toplam miktarına ihtiyaç vardır. 3. Solüsyonun RT dengesi 1xhibridizasyon solüsyonu 1 kullanıma hazır (line 1 bak ) 1xyıkama solüsyonu kullanıma hazır (line 2 bak ) konjugat buffer kullanıma hazır Falcon tüpü gibi RT 4.Amplifikasyon ürününün denatürasyonu 5.hibridizasyon 30 μl amplifikasyon ürünü + 30 μl denatürasyon solüsyonu 42 C 5 dak. Termo Çalkalayıcı (0 rpm) 42 C 60 dak. Termo Çalkalayıcı
6. Hibridizasyon solüsyonu başka bir yere boşaltın 7.Yıkama adımaları (iki Her şerit için 1 ml 1xyıkama kez) solüsyonu(rt)ekleyin, inkübe edin ve sonra tekrar yıkama döngüsünden önce yıkama solüsyonu başka yere boşaltın 8.Konjugat dilusyonu Konjugat buffer da 1:500 (RT) (5 şerit için örnek: 5.4 μl konjugat + 2.7 ml konjugat buffer [RT]) 9. Konjugat Her şerit için 500 μl inkübasyonu konjugat dilusyonu ekleyin 10. Konjugat dilusyonunu başka bir yere boşaltın 11. Yıkama Her şerit için 1 ml adımaları (iki 1xyıkama kez) solüsyonu(rt)ekleyin, inkübe edin ve sonra tekrar yıkama döngüsünden önce yıkama solüsyonu başka yere boşaltın Falcon tüp yada küçük beher 12. Substrat Her şerit için 500 μl reaksiyonu substrat ekleyin 13. Substrat başka bir yere boşaltın 14. Stop substrat Şeritler için 1 ml reaksiyonu distile su ekleyin 15. Test şeritlerini kurutun(ışıktan koruyun) ve test sonuçlarını yorumlayın 42 C 2x6 dak. Termo Çalkalayıcı RT RT 20 dak. Çalkalayıcı RT 2 x 1 dak. Çalkalayıcı RT 20 dak. Çalkalayıcı RT 5 dak. Çalkalayıcı İlk kez her test kiti kullanmadan önce, sadece bir kez gerçekleşmesi için istenen protokol adımları gri ile vurgulanmıştır. RT = oda sıcaklığı *) Eğer 3x konsantre yıkama solüsyonunda çökelti oluşmuşsa hafif ısıtma ile seyreltmeden önce çözün. (30-50 C, su banyosu için). Test uygulaması sırasında sorunlar ile ilgili olarak üretici veya distribütör firmayla bağlantı kurmakta tereddüt etmeyin.
EK 1 Kit etiketlerinde kullanılan sembollere genel bakış Sembollerin açıklaması Üretici Lot numarası Son kullanma tarihi 2 C ve 6 C arasında saklayın Max. -20 C de saklayın Katalog numarası In vitro diagnostik medikal ürünler <n> determinations için yeterli içerik Kullanım talimatına bakınız