Kullanım Talimatları TITAN III Serum Protein Elektroforezi REF. 3023
KULLANIM AMACI Serum Protein Elektroforez prosedürü selüloz asetatta elektroforez ile serum proteinlerinin ayrılması ve miktarının belirlenmesini amaçlar. Serum, farklı patolojik koşullar altında konsantrasyonunda belirli değişimlere ve fonksiyonların spesifik bir dizisine sahip yüzden fazla tek tek protein içerir. Tiselius 2 ile ve elektroforez bölgesi kullanımı sonrası hareketli-sınır elektroforezinin tanıtılması için, serum proteinleri beş klasik fraksiyon içinde kendi elektrik yükü temelinde fraksiyon edilmiştir: albümin, alfa1, alfa2, beta ve gama proteinler. Bu klasik elektroforetik bölgelerin her biri (albumin hariç) normalde iki veya daha fazla bileşen içerir. Yaklaşık on beş serum proteini kapsamlı olarak ele alınmıştır çünkü kolayca ölçülebilir. Proteinler kovalent bağlı amino asitten oluşan büyük moleküllerdir. Alt grupların kovalent veya iyonik bağlanması sonucu oluşan elektron dağılımına göre proteinler verilen bir ph da farklı elektrik yüküne sahiptir. Helena Serum Protein prosedüründe, proteinler, sistem de mevcut hem elektroforetik hem de elektroendosmotik güçleri kullanarak bir selüloz asetat plaka üzerinde ph 8.8 'de kendi elektrik yüklerine göre ayrılır. Proteinler ayrıldıktan sonra, plaka, sulfosalislik asit ve trikloroasetik asit (proteinleri immobilize etmek için) ve Ponceau S (protein bantları boyamak için) solüsyonu içine konulur. Boyanma yoğunluğu protein konsantrasyonu ile ilgilidir. Metanol de dehidratasyon sonrası, plaka arka plan bir temizleme solüsyonu ile temizlenerek şeffaf hale gelir. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kılavuzuna başvurun. BİLEŞENLER 1. Ponceau S Stain (Kat. No. 5526) Boya toz olarak verilir ve Ponceau S ve Sulphosalicylic Asit bir karışımıdır. 1 litre saf suda şişe içeriğini çözün ve tamamen çözünene kadar veya 30 dakika boyunca karıştırın. 2. Electra HR Buffer (Kat No. 5805) Tris-barbital Sodyum Barbital buffer, ph 8.6-9.0, içerir. 750ml saf su içinde bir flakon bufferı çözün. Buffer tüm materyaller çözündüğünde ve tamamen karıştığında kullanıma hazırıdır. 3. Clear Aid (Kat. No. 5005) Reaktif polietilen glikol içerir. Temizleme solüsyonu hazırlamak için, 30 parça glasial asetik asit, 70 parça absolut metanol ve 4 parça Clear Aid karıştırın. İyice karışana kadar karıştırın. 4. Titan III Selüloz asetat Plaka (Kat. No. 3023 veya 3024) Bir selüloz asetat plaka içerir. Hazırlama talimatları için kullanım talimatlarına bakın. 5. Diğer Kit Bileşenleri Her bir kit kullanım talimatları içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1. Ponceau S Stain (Kat. No. 5526) Stain, 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Sıkıca kapağı kapatılmış şişeyi saklayın. Stain istenen şekilde saklandığı takdirde birden çok kez tekrar edilebilir. Bozulma aşırı buharlaşma sonucu veya büyük miktarda çökme sonucu görülebilir. 2. Electra HR Buffer (Kat No. 5805) Paketlenmiş buffer 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Buffer solüsyonu 15...30 C de iki ay boyunca stabildir. Eğer bakteriyel kontaminasyon belirtisi görülüyorsa veya nem veya renk değişikliği görülüyorsa buffer da bozulma olabilir. 1
4. Clear Aid (Kat. No. 5005) Clear aid,15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Bozulma kontaminasyon veya renk değişikliği ile endike olabilir. Temizleme prosedürü sonrası, plakalar bulanık görünürse atın. 4. Titan III Selüloz asetat Plaka (Kat. No. 3023 ve ya 3024) Selüloz asetat plaka 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. NUMUNE ALMA VE HAZIRLAMA Serum tercih edilen örnektir. Plazmanın kullanımından fibrinojen gamma ve beta fraksiyonları arasındaki farklı dar bant olarak göründüğünden dolayı sakınılmalıdır. Beyin omurilik sıvısı eğer yaklaşık 100 kat konsantre edilirse kullanılabilir; idrar orijinal protein konsantrasyonuna bağlı olarak 300 kata kadar konsantre ise kullanılabilir. Etkileyici Faktörler: 1) Hemoliz, alfa 2 ve beta fraksiyonlarında yanlış yükselmelere sebep olabilir. 2) Buharlaşmaya bağlı olarak,kapatılmayan numunelerde yanlış sonuçlar elde edilebilir. Saklama ve Stabilite: Tercih edilen taze serum ya da plazmadır. Eğer saklama gerekliyse, numuneler 48 saat boyunca 2...6 C de saklanabilir. Beyin omurilik sıvısı ve idrar örnekleri yoğunlaştırıcı ile uygun konsantrasyon sonrası kullanılabilir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER 5% asidik asit: 950ml saf suya 50ml of glasiyal asidik asit ekleyin. Absolute metanol, reaktif grade Kat. No. 3024 Titan III Cellulose Acetate Plates (94 x 76 mm) Kat. No. 3023 Titan III Cellulose Acetate Plates (60 x 76mm) Kat. No. 4084 Super Z Applicator Kat. No. 4090 Super Z-12 Applicator Kat. No. 4085 Super Z-12 Sample Well Plate (2) Kat. No. 4096 Super Z-12 Sample Well Plate (2) Kat. No. 4094 Super CPK Aligning Base Kat. No. 4086 Super Z Aligning Base Kat. No. 5114 700 Staining Set Kat. No. 5122 1000 Staining Set Kat. No. 5526 Ponceau S Kat. No. 5093 Bufferizer Kat. No. 5005 Clear Aid Kat. No. 5090 Zip Zone Prep Kat. No. 1283 Zip Zone Chamber Kat. No. 5081 Zip Zone Chamber Wicks Kat. No. 5037 Blotter Pads (102 x 108 mm) Kat. No. 5034 Blotter Pads (76 x 102mm) Kat. No. 5805 Electra HR Buffer Kat. No. 5053 Titan Plastic Envelopes (102 x 120 mm) Kat. No. 5052 Titan Plastic Envelopes (63 x 120mm) Kat. No. 6008 Microdispenser and Tubes Kat. No. 8008 Micro-Hood (220V) Kat. No. 5205 Electrophoresis Manual Kat. No. 5211 Serum Protein Report Forms Kat. No. 5000 Helena Marker Kat. No. 5109 Quality Control Chart Kat. No. 5015 Titan Identification Labels Kat. No. 5002 Glue Stick 2
ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. Helena BioSciences Markerın parlak sert tarafından işaretleyerek Titan III Plakalara gerekli sayıda uygun kod verin. Her zaman örnek No.1 ile hizalanabilmesi için tanımlama markasını bir köşeye yerleştirin. 2. 20 dakika HR Buffer içinde plakaları ıslatın. Plakalar kullanım talimatına göre buffer içinde ıslatılmalıdır. Alternatif olarak, plakalar yavaş ve düzgün şekilde buffer içine plakaların bir rakı düşürülerek ıslatılabilir. NOT: Aynı ıslatılan buffer eğer kapağı sıkıca kapatılarak saklanırsa, yaklaşık bir hafta için veya 12 plaka ıslatmak için kullanılabilir. Eğer uzun süreli saklama için kullanılırsa, plakalardan artan çözücü buffer da birikebilir ve proteinlerin zayıf ayrılmasına neden olur veya buharlaşma daha büyük buffer konsantrasyonuna neden olabilir. 3. Tankın her bir dış bölümüne yaklaşık olarak 100ml dilüe HR Buffer dökün. 4. Buffer içinde tek kullanımlık 2 fitili ıslatın ve buffer ile temasını sağlamak için destek köprüsü kurun ve fitillerin altında hava kabarcıkları olmamasına dikkat edin. 5. Buffer buharlaşmasını önlemek için tankı kapatın. 6. Microdispenser kullanarak 3μl örnek ile örnek plakasında her bir kuyuyu doldurun. Cam tüp ucunda bir boncuk gibi örnekleri çıkarın, sonra da bu boncuğa dokunmayın. Eğer örnekler 2 dakika içinde kullanılmazsa, cam bir slayt ile örnekleri kapatın. 7. 3 veya 4 kez numune kuyulara uçları bastırarak aplikatörü prime edin. Kurutucu kağıdı parçasına bu yüklemeyi uygulayın. Tekrar aplikatörü yüklemeyin ve bir sonraki adıma geçin. 8. Buffer dan ıslatılmış plakayı alın ve iki kurutucu arasında sıkıca kurutun. Hizalama tabanına plakayı yerleştirmeden önce hizalama tabanının ortasına bir damla buffer veya suyu dökün. Bu örnek uygulama sırasında plakanın kaymasını önler. "MERKEZ UYGULAMA" işaretli siyah çizici hattı ile plakanın alt kenarını hizalayarak, selüloz asetat yukarı olacak şekilde, hizalanan tabana plakayı koyun. Tanımlama markası örneği No 1 ile uyumlu olmalıdır. 9. 3 veya 4 kez numune kuyusu içine aplikatör uçları bastırarak plakaya numuneyi uygulayın ve hizalayarak tabanına aplikatörü transfer edin. Aşağıdaki düğmeye basın ve 5 saniye tutun. 10. Selüloz asetat aşağı olacak şekilde tank içine plakaları koyun. Fitiller ile temasından emin olmak için plaka üzerine bir ağırlık koyun. 11. Elektroforez: 15 dakika, 180 volt. NOT: Plaka(lar) tank içine yerleştirildikten sonra 5 dakika içinde güç uygulanabilir. 12.Elektroforezin ardından, tanktan plaka(ları) alın ve 6 dakika boyunca 40-50ml Ponceau S içinde boyayın. 2 veya daha fazla plaka boyandığında, rak içinde dikey olarak protokolü gerçekleştirin. NOT: Plaka arka plan boya çökeltisi içerene kadar boyama yeniden yapılabilir. 13. % 5 asetik asit ile 3 kez peş peşe yıkayarak boyadan arındırın. Plakaları 2 dakika boyunca her bir yıkamada kalmasını için bekletin. Plakalar kurutulmalıdır ve bu noktada kalıcı bir kayıt için saklanmalıdır. Eğer şeffaf bir arka plan isteniyorsa (yani Dansitometrisi için) sonraki adıma geçin. 14. Plakalar absolute metanol içinde 2 kez peş peşe yıkayarak kurutulmalıdır. Plakaları 2 dakika boyunca her bir yıkamada kalmasını için bekletin. 5-10 dakika boyunca yıkama solüsyonu içine plakayı koyun. 15. 5-10 dakika boyunca temizleme solüsyonu içine plakayı koyun. 16. Fazla solüsyonu alın, sonra kurutucu üzerinde ve fırın içine 50...60 C de 15 dakika boyunca veya kuruyana kadar selüloz asetat yukarı doğru olacak şekilde plakaları koyun. Protein Bantların değerlendirilmesi Dar yarıkları ve 525 nm filtre kullanarak Densitometer içinde plakaları tarayın. Son Ürünün Kararlılığı: Kurutulmuş Serum protein plakaları belirsiz bir süre boyunca stabildir ve Titan Plastik Zarflar içinde saklanabilir. 3
Kalibrasyon Optik Yoğunluk Adım Tablet (Kat. No 1030) cihazın doğrusallığını sağlamak için kullanılmalıdır ve Neutral Yoğunluk Dansitometre Standart cihazın sıfır ayarı ve duyarlılığını doğrulamak için kullanılmalıdır. SONUÇLARIN YORUMLANMASI 5,7 Hızlı hareket eden bant ve normalde en önemli plakanın anodik kenarına yakın bulunan albümindir. Alfa2 globulin, beta ve gama globulin ardından bunun yanında soluk bant alfa1 globulindir. Bilinmeyenin hesaplanması Bilgisayar aksesuarları ile diğer Helena densitometreleri ve Helena BioSciences CliniScan Densitometer otomatik olarak bantları relatif yüzde ve her bir bant için absolute değer verecektir. Alternatif olarak, her bir bandın relatif yüzdesi tarama üzerinde entegratör skaladan manuel olarak hesaplanabilir. the dansitometresi ile sağlanan Çalışma kılavuzuna bakın. Her bir bandın relatif yüzdesi aşağıdaki formüle göre hesaplanır: Bandın Entegrasyon Birimleri sayısı x 100 = Bandın Relatif Yüzdesi Toplam Entegrasyon Birimleri Bandın Relatif Yüzdesi x Total Serum Protein = Her bantta Proteinin Mutlak değeri. KALİTE KONTROL Normal aralığın iki farklı türü kalite kontrol materyallerinde serum protein elektroforezi kitleri ile kullanım için mevcuttur. Her bir plaka çalışmasında bu kontrol serumlarının en az birini kullanın. Kat. No. 5112 Electrophoresis Serum Control Kat. No. 7024 Kemtrol Serum Control-Normal REFERANS DEĞERLERİ Ponceau S ile boyanan selüloz asetat üzerinde serum protein elektroforezi için beklenen değerler 51 normal bireyle yapılan bir çalışma ile belirlendi. Bu değerler sadece bilgi amaçlıdır. Her laboratuar kendi normal değer aralıklarını oluşturmalıdır. Beklenen Değerlerin Varyasyonları 4 Çalışmalar değerleri hem erkeklerde hem de gebe olmayan kadınlarda aynı olduğunu göstermektedir (Bazı farklılıklar oral kontraseptifde kadınlarda ve gebe kadınlarda görülür). Yaşın normal seviyelerde bir miktar etkisi vardır. Kordon kanında total protein, albumin, alpha2 ve beta fraksiyonları, biraz artmış alfa1 ve normal veya artmış gama fraksiyonları azalmıştır. Diğer fraksiyonlar bu zamana kadar yetişkin seviyesine ulaşmış ise gama yaklaşık yaşın 3 ayında kadar hızla düşer. Gamma globulinlerin yetişkin düzeyleri 10-16 yaşa kadar ulaşmaz. Albümin azalır ve 40 yaşından sonra beta globulin artar. Normal bireyler üzerinde sonuçlar yaş ve cinsiyet ile ilgili farklılıklar ve gün-gün biyolojik değişimler ele alınacaktır. Anormal paternlerde hastalık durumlarında inflamatuar yanıt, romatizmal hastalıkları, karaciğer hastalıkları, protein kaybı bozuklukları, plazma hücre 4
dysorasias ve genetik eksikleri gözlenmiştir. Varyant paternler gebelik sırasında da gözlenmiştir. Daha fazla gerekli Test Serum protein elektroferogram veya dansitometrik izlemesi anormallikler için değerlendirilmelidir. Eğer anormallikler görülür ise, uygun izleme çalışmaları başlatılmalıdır. Bu immünoelektroforezleri, immünfiksasyonu, tek tek bileşen immünoglobulinlerin kantitatifasyonunu, kemik iliği incelemesini ve diğer uygun testleri içerebilir. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Normal serum yukarıda açıklanan yöntem kullanılarak ardışık 26 kez çalıştırıldı. Aşağıdaki veriler elde edildi: BİBLİYOGRAFİ 1. Alper, C.A., Plasma Protein Measurements as a Diagnostic Aid, N Eng J Med, 291:287-290.1974. 2. Tiselius, A., A New Approach for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures, Trans Faraday Soc, 33:524-531, 1937. 3. Ritzmann, S.E. and Daniels, J.C., Diagnostic Proteinology: Separation and Characterization of Proteins, Qualitative and Quantitative Assays in Laboratory Medicine, Harper and Row Inc., Hagerstown, 1979. 4. Ritzmann, S.E, and Daniels, J.C., Serum Protein Abnormalities: Diagnostic and Clinical Aspects, Little, Alan R. Liss Inc., 1982. 5. Killingsworth. L.M. et al, Protein Analysis, Diag Med, Jan/Feb., 47-58, 1980. 6. Henry, R.J., Cannon, D.C., and Winkelman, J.W., ed., Clinical Chemistry Principals and Techniques, 437, Harper and Row, Hagerstown, 1974. 7. Killingsworth, L.M., Plasma Protein Patterns in Health and Disease, CRC Crit Rev in Clin Lab Sci, 1-30, August, 1979. 5