STREPTOZOTOSİN İLE DİYABET OLUŞTURULAN SIÇANLARDA GLİKLAZİD VE ATORVASTATİN KOMBİNASYON TEDAVİSİNİN ERKEK ÜREME SİSTEMİ ÜZERİNE ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Dr. Ezgi Öztaş İstanbul Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalı 21.04.2016
İÇERİK GENEL BİLGİLER T2DM ile Kardiyovasküler Hastalıkların İlişkisi T2DM den Korunma ve Tedavi Yaklaşımları YÖNTEMLER VE BULGULAR Deney Hayvanları ve Deney Grupları Hormon Analizleri Sperm Analizleri Işık Mikroskobik İnceleme Morfometrik Analizler Ultrastrüktürel İnceleme SONUÇ
GENEL BİLGİLER
T2DM Diyabet prevalansı Nüfus artışı Yaşlanma Kentleşme Fiziksel aktivitenin azalması Obezite 2030 yılında dünyada diyabetik insan sayısının 366 milyona, Türkiye de ise 6.5 milyona ulaşacağı tahmin edilmektedir. İnsülin direnci ve dislipideminin eşlik ettiği T2DM, kardiyovasküler hastalıkların riskini artırır. HDL TG LDL
T2DM DEN KORUNMA VE TEDAVİ YAKLAŞIMLARI Doğru beslenme ve fiziksel aktivitenin arttırılması Oral antidiyabetik ilaçların kullanımı Metformin Sülfonilüre (Gliklazid, glibenklamid, glimepirid vd.) Dislipidemi tedavisi Amerika Diyabet Birliği (American Diabetes Association, ADA) HDL 40 mg/dl (E), 50 mg/dl (K) TG 150 mg/dl LDL Normal 130 mg/dl, KVH risk 100 mg/dl Farklı etki mekanizmalarına sahip antidiyabetik ve hipolipidemik ilaç kombinasyonları ile daha iyi glisemik kontrol ve lipid profili
GLİKLAZİD (GLZ) İkinci kuşak sülfonilüre grubu oral antidiyabetik. Pankreatik β-hücrelerinde SUR1 e selektif bağlanarak ve ATPbağımlı potasyum kanallarını bloke ederek insülin sekresyonunu sağlar. Karaciğer glukoz üretimini azaltır ve glukoz klirensini arttırır. Platelet adezyonunu ve agregasyonunu azaltıp fibrinolizi artırarak kardiyovasküler hastalıklardan korunmada etkili.
ATORVASTATİN (ATV) İkinci kuşak statin grubu hipolipidemik. 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A (HMG-CoA) redüktazı inhibe ederek kolesterol sentezini azaltır. LDL-reseptörlerinin up-regülasyonu VLDL üretiminin azalması TG seviyelerinin azalması enos artması aterosklerotik plakları stabilizasyonu, platelet aktivitesinin ve koagülasyonunun düzenlenmesi
ERKEK ÜREME SİSTEMİ Spermlerin üretimi (spermatogenez), beslenmesi, depolanması ve androjen biyosentezi TESTİS Sertoli Hücreleri Spermatogenik hücrelerin beslenmesi, desteklenmesi, korunması Kan-testis bariyeri Leydig Hücreleri Testosteron sentezi Sekonder seks karakteri gelişimi Seminifer tübüllerde spermatogenez İnterstisyelde ise androjen biyosentezi
YÖNTEM VE BULGULAR
DENEY GRUPLARI T2DM STZ, 35 mg/kg, tek doz, intraperitoneal, SF içinde Bir hafta sonra kan glukoz seviyeleri 150-280 mg/dl %58 yağ %20 protein %22 karbonhidrat
HORMON ANALİZLERİ Kalp kanından ELISA kitler ile çalışıldı. Hormon seviyelerinde değişiklik tespit edilmedi. Yüksek yağlı diyet? Çalışma süresi?
SPERM ANALİZLERİ 1. Sperm Sayımı Kaudal epididimden izole edilen spermlerle Makler kamerasında sayım. STZ+ATV Epitel hasarı Düşük T Düşük testis ağırlığı ve hacmi STZ+GLZ Kontrol grubu düzeyine ulaşmış STZ+ATV/GLZ GLZ nin iyileştirici etkisi ATV tarafından baskılanmış olabilir
SPERM ANALİZLERİ 2. Sperm Morfolojisi Kaudal epididimden izole edilen spermlerde Diff-Quick boyama. Normal sperm Başsız kuyruk Kuyruksuz baş Düzleşmiş baş İğne uçlu baş Kırık kuyruk Kıvrık kuyruk Kırık boyun
SPERM ANALİZLERİ Anormal sperm sayısı kontrol grubu dışında bütün gruplarda arttı Diyabetik sıçanlarda ATV, GLZ ve ATV/GLZ sperm morfolojisinde iyileşme sağladı ATV/GLZ nin tek başına ATV ve GLZ ye göre iyileştirici etkisinin az olması azalan T seviyesinden kaynaklanabilir
IŞIK MİKROSKOBİK İNCELEME H&E boyama KONTROL ST yuvarlak ve düzgün şekilli Hücreler arası bağlantılar normal ST epiteli bozulmamış seminifer tübül (*) ve interstisyel alan yapıları (1), H&E X20
KONTROL Germ hücreleri sıralı Sertoli hücreleri normal Bazal lamina ile sıkı bağlantılı spermatogonyumlar Germ hücreleri ile sertoli hücre bağlantıları sıkı Lümende olgunlaşmış sperm İnterstisyel alanda normal yapılı leydig hücreleri seminifer tübül epiteli (1), bazal membran (2), Sertoli hücresi (3), spermatogonyum (4), primer spermatosit (5), geç spermatid (6), leydig hücresi (7), lümen (8), interstisyel alan (9), H&E X40
STZ ST küçülmüş, birbirinden ayrılmış Düzensiz şekilli ST İnterstisyel alan genişlemiş birbirinden ayrılmış ve düzensiz şekilli seminifer tübüller (*) ile genişlemiş interstisyel alan (1), H&E X10
STZ Lümende olgunlaşmamış germ hücreleri Germinal epitel disorganizasyonu atrofik seminer tübül (*), lümende olgunlaşmamış germ hücreleri (1), interstisyel alanda kayıp (2), kan damarı (3), H&E X20
STZ+ATV Düzensiz şekilli deforme tübüller ve tahrip olmuş epitel İnterstisyel alanda genişleme seminifer tübüller (*) ile interstisyel alan (1), kan damarı (2), H&E X10
STZ+ATV Epitelde sitoplazmik vakuoller Epitelin bazal membrandan ayrılması İnterstisyel alandaki genişleme STZ grubuyla kıyaslandığında daha az bozulan hücreler arası bağlantı sonucu disorganize epitel (1), bazal membrandan ayrılmış germinal epitel (2), epitelde sitoplazmik vakuoller (3), interstisyel alan (4), kan damarı (5), H&E X20
STZ+GLZ Pek çok tübül normal yapıda kontrol grubuna benzer şekilde normal yapıdaki seminifer tübüller (*) ile interstisyel alan (1), kan damarı (2), H&E X10
STZ+GLZ Spermatogenezin çeşitli evrelerindeki germ hücreleri Hücresel bağlantılarda minimal kayıp Lümende olgunlaşmış sperm Epitel kontrol grubuyla benzer spermatogonyum (1), sertoli hücresi (2), primer spermatosit (3), erken spermatid (4), lümen (5), leydig hücresi (6), normal hücreler arası bağlantılara sahip seminifer epitel (7), H&E X40
STZ+ATV/GLZ ST normal boyutta İnterstisyel alan genişlememiş ancak boşalmış veya amorf madde içeriği Azalmış T seminifer tübüller (*) ile boşalmış interstisyel alanlar (1), tunika albuginea (2), H&E X10
STZ+ATV/GLZ Lümende olgunlşmamış germ hücreleri Bazı tübüllerin epitelinde ayrılmalar Epitelin bazal membrandan ayrılması STZ+ATV ye göre histolojik anormallikler daha az şiddetli interstisyel alan (1), bazal membrandan ayrılmış epitel (2), lümende olgunlaşmamış germ hücreleri (3), interstisyel alanda amorf materyal (*), H+E X20
MORFOMETRİK ANALİZLER 1. Seminifer Tübül Çapının Ölçülmesi H&E boyası uygulanmış kesitlerde her deney hayvanı için 20 adet seminifer tübülün çapı µm cinsinden ölçüldü 2. Epitel Yüksekliğinin Ölçülmesi H&E boyası uygulanmış kesitlerde her deney hayvanı için 20 adet seminifer tübülde epitel yüksekliği µm cinsinden ölçüldü
MORFOMETRİK ANALİZLER GLZ seminifer tübül çapını ve epitel yüksekliğini artırarak kontrol düzeyine yaklaştırdı STZ+ATV/GLZ epitel hasar var ancak seminifer tübül çapını ve epitel yüksekliğini artırarak kontrol düzeyine yaklaştırdı
ULTRASTRÜKTÜREL BULGULAR KONTROL sertoli hücresi (ok başı), spermatogenik hücreler (*), bazal membran (ok), X5000 sertoli hücre çekirdeği (*), çekirdekçiği (ok başı), mitokondri (ok), düz endoplazmik retikulum (kırmızı ok), X20000
KONTROL LÜMEN spermatid hücre çekirdeği (*), mitokondri (ok), akrozom (ok başı), X10000 sperm kuyrukları (ok), X10000
STZ Düzensiz ve kalınlaşmış bazal membran Sertoli hücresi sitoplazmasında bazıları oldukça geniş olmak üzere çok sayıda yağ damlacığı sertoli hücre çekirdeği (*), yağ damlacıkları (ok başı), bazal membran (ok), X10000
STZ sertoli hücre çekirdeği (ok başı), spermatogenik hücreler (*), X5000 hücreler arası ayrılmalar (*), X6000 Sertoli hücresinin germ hücreleri ile ilişkisi bozulmuş ve yer yer bazal membrandan ayrılmış Epitel ayrılmalar Spermatidlerin sitoplazmalarında çok sayıda vakuol ve yağ damlacığı
STZ Lümen (+), anormal hücre ve hücre atıkları (*), X5000 Lümende olgunlaşmamış hücreler (*) ve hücresel atıklar (ok başı), X5000 Lümende olgunlaşmamış hücreler, anormal hücreler ve hücresel atıklar
STZ+ATV Düzensiz ve kollajen lif artışına bağlı kalınlaşmış bazal membran Sertoli hücreleri ve spermatogonyumlar yer yer bazal membrandan ayrılmış Sertoli hücrelerinde vakuoller ve yağ damlacıkları STZ ye göre yağ damlacıkları daha az ancak daha geniş Sertoli hücresi çekirdeği (*), vakuol (ok başı), X6000
STZ+ATV bazal membran (ok), vakuol (*), geç spermatid (ok başı), X12000 lümen (*), olgunlaşmamış spermatid (ok başı), X6000 Epitelin bazal kompartmanında geç spermatidlerin görülmesi etkisiz spermatogenez varlığı Lümende olgunlaşmamış spermatidler
STZ+GLZ Sertoli hücresi çekirdeği (*), mitokondri (ok başı), X10000 Sertoli hücresi çekirdeği (*), mitokondri (ok başı), spermatogenik hücre (ok), X10000 Bazal membran genellikle düzgün ve normal kalınlıkta Sertoli hücrelerinin mitokondri kristaları normal ancak şekil değişikliği var
STZ+GLZ STZ ye göre testisin ultrastrüktürel yapısı oldukça korunmuş Sertoli hücresi çekirdeği (ok başı), spermatogenik hücreler (*), X5000 Akrozomal kep erken evresi (kesik ok), akrozomal kep (ok), rezidüel cisim (ok başı), X6000 Sertoli hücreleri ile germ hücreleri bağlantısı çok bozulmamış Epitel bütünlüğü oldukça korunmuş Akrozomal kep oluşumu ve lümendeki spermlerin aksonem yapıları normal
STZ+ATV/GLZ Bazal membran (ok), sertoli hücresi çekirdeği (*), yağ damlacığı (ok başı), X6000 Kristalarını kaybetmiş ve şişmiş mitokondri (ok), Sertoli hücresi çekirdeği (*), X7500 Düzensiz bazal membran, STZ+ATV de gözlenen kalınlaşmaya rastlanmadı Sertoli hücrelerinde STZ ye göre daha az ancak geniş yağ damlacıkları Sertoli hücrelerinde mitokondride krista kaybı ve vakuol benzeri görüntü
STZ+ATV/GLZ Sperm kuyrukları (ok başı), X7500 Vakuol (ok), sperm kuyrukları (ok başı), lümen (*), X10.000 Hücrelerarası bağlantılar STZ ve STZ+ATV ye kıyasla korunmuş Lümende kuyruk yapısı anormal ve normal spermler
SONUÇ Diyabetin hormonal değişikliklere sebep olmadığı ancak testise hasar vererek spermatogenezi bozduğu, sperm sayısını azalttığı ve anormal morfolojiye sahip sperm sayısını artırdığı, Diyabetik sıçanlara ATV uygulamasının hormonal değişikliğe neden olmadığı, sperm sayısını etkilemediği ancak morfolojisini düzelttiği, testiste meydana gelen hasarı iyileştiremediği, Diyabetik sıçanlara GLZ uygulamasının hormonal değişikliğe neden olmadığı, sperm sayısını artırdığı, morfolojisini iyileştirdiği, testis yapısında iyileşme sağlayarak spermatogenezi düzelttiği, Diyabetik sıçanlara ATV/GLZ kombinasyonu uygulamasının hormonal değişikliğe neden olmadığı, sperm sayısını etkilemediği, morfolojisini düzelttiği, testis yapısını iyileştirdiği ancak kontrol düzeyinde olmadığı saptandı
Prof. Dr. Gül Özhan İ.Ü. Eczacılık Fakültesi Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalı Arş. Gör. Tuğba Ekiz Yılmaz Doç. Dr. Elif Güzel Meydanlı İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı TEŞEKKÜR EDERİM İ.Ü BAP Proje No: 40205