Erzurum Bölgesinde Temin Edilen Çeflitli Peynir Örneklerinde Brucella Antijenlerinin ELISA ile Saptanmas Medine GÜLLÜCE(*), Ahmet ADIGÜZEL(*), Ö. Faruk ALGUR(*) (*) Atatürk Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü, Erzurum ÖZET Bu çal flmada, Erzurum piyasas ndan toplanan çeflitli peynir örneklerinde Brucella abortus antijenlerinin s kl ELISA tekni i ile araflt r lm flt r. Antikor olarak Brucella abortus'a karfl oluflan antikorlar iceren antiserum, konjugat olarak peroksidaz enzimi ile iflaretli Protein G, substrat olarak da sitrik asit içinde %3'lük hidrojen peroksit ilaveli ABTS (2-2- azino di-3- ethyl benthiozaline- 6 sulfanate) kullan lm flt r. Toplam olarak 120 beyaz peynir, 60 civil peynir ve 52 lor peyniri örne i incelenmifl ve 120 beyaz peynir örne inin 26's nda (%21.66) Brucella abortus antijeni saptanm flt r. Civil peynir ve lor peyniri örneklerinde ise Brucella abortus antijenine rastlanmam flt r. Anahtar Kelimeler: Peynir, bruselloz, Brucella abortus, ELISA ABSTRACT Detection of Brucella Antigens in Different Cheese in the Erzurum Area by ELISA In this study, the occurence of Brucella abortus antigens in different cheese samples collected from Erzurum has been investigated by using enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA). Brucella abortus antiserum was used as antibody. Peroxsidase- labeled Protein G was used as conjugate. Hidrogen peroxidase (3%) and ABTS (2-2- azino di-3- ethyl benthiozaline- 6 sulfanate) in citric acid was used as substrate. Totally 120 white cheese, 60 civil cheese and 52 lor cheese were analyzed and 26 of totally 120 white cheese were found to be Brucella positive. In civil and lor cheese samples no antigen of Brucella was encountered. Key Words: Cheese, brucellosis, brucella abortus, ELISA G R fi Brucella cinsine ait bakteriler taraf ndan oluflturulan bruselloz, dünyan n birçok ülkesinde görülen bir zoonozdur. Hastal k, abortus,süt verimi kayb, dam zl k de eri kayb ve infertilite gibi sebeplerle, hayvansal üretimde kay plara neden olurken, infekte hayvanlarla do rudan temas veya kontamine süt ve süt ürünlerinin tüketimi yoluyla insanlara da bulaflarak, önemli bir halk sa l problemi oluflturmaktad r (1-3). Brucella cinsi içerisinde B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B.canis ve B. neotomae olmak üzere 6 tür bulunmaktad r. nsanlarda hastal a neden olan B. melitensis, koyun ve keçilerde; B. abortus, s r ve mandalarda, B. suis domuzlarda bulunur. B.canis ise köpeklerde bulunur ve insanda nadiren hastal k oluflturur (4,5). Biyoteknolojik çal flmalar, Brucella cinsinin Proteobacteria s n f n n bir üyesi oldu unu ve Agrobacterium-Rhizobium kompleksindeki bitki patojenleri ile ayn kökten geldiklerini göstermifltir(6,7). Ülkemizde bu güne kadar koyun ve keçilerde görülen bakteriyel orjinli yavru atmalar n genellikle bruselloz sonucu olufltu u, farkl bölgelerimizde hastal k prevalans n n % 0.6 ile % 22 aras nda de iflti i belirtilmektedir (8,9). Brucella etkeninin insanlara bulaflmas nda, infekte hayvanlardan elde edilen süt ve süt ürünlerinin çi olarak tüketilmesi, özellikle çi sütten yap lan ve olgunlaflmadan tüketime sunulan taze beyaz peynirlerin önemli bir rol oynad bildirilmektedir (10,11). 356 356
M. Güllüce ve ark., Erzurum Bölgesinde Temin Edilen Çeflitli Peynir Örneklerinde Brucella Antijenlerinin ELISA ile Saptanmas Ülkemizde sütün yaklafl k % 20 si peynir üretiminde kullan lmaktad r. 1985 y l nda 210.000 ton peynir üretilmifl olup bu miktar dünya peynir üretimine % 1.1'lik bir katk y ifade etmektedir. Çeflitli peynir türleri içerisinde dünyada ve Türkiye'de en fazla tüketilen peynirlerin bafl nda beyaz peynir gelmektedir. Di er taraftan, daha çok Erzurum ve Kars illerinde ya al nm fl sütün de erlendirilmesi amac yla yap - lan ve ülke çap ndaki tüketimi gittikçe art fl gösteren bir di er peynir türü de civil peynirdir. Bu peynir türü, ya s z olmas nedeniyle bir diyet peyniri gibi kullan lmaktad r (12,13). Ayr ca lor peyniri denilen ve peynir alt suyunun kaynat ld ktan sonra p ht laflt r lmas suretiyle elde edilen peynir türü de gelecek için ümit veren bir potansiyele sahiptir (14). Süt ve süt ürünlerinde Brucella cinsi bakterilerinin izolasyonunun zaman al c ve zor olmas, teflhiste indirekt yöntemlerin daha fazla kullan lmas na yol açm flt r (8,15,16). Serolojik testler içerisinde ELISA, yüksek duyarl k ve özgüllü e sahip olmas, çok say - da örnekle çal flmaya imkan sa lamas ve ucuz olmas gibi nedenlerle son y llarda tercih edilmektedir (17-19). Bu araflt rmada Erzurum piyasas ndan temin edilen, çeflitli peynir örneklerindeki Brucella antijenlerinin ELISA ile saptanmas amaçlanm flt r. GEREÇ VE YÖNTEM Peynir örnekleri Erzurum'a ba l köylerden al nm flt r. Peynirlerin taze ve herhangi bir ifllemden geçirilmemifl olmas na dikkat edilmifltir. Pozitif ve Negatif Kontrol Örnekleri Brucella abortus S 19'un potasyum klorür ekstresi ( KCl extract ) ile kontamine edilmifl peynir örnekleri pozitif kontrol olarak kullan lm flt r. Bu antijen Dr. C.O. Thoen'dan ( IOWA State University Brucella ve Mycobacterium laboratuvar ) temin edilmifltir. Negatif kontrol olarak ise, belirli kullan m sürecinden geçen peynir örnekleri kullan lm flt r (20). Antiserum Brucella abortus antiserumu, Pendik Hayvan Hastal klar Araflt rma Enstitüsünden temin edilmifltir. Konjugat Konjugat olarak, % 1 tween 80 içeren 0.5 M NaCl (ph: 7.5 ) içerisindeki, peroksidaz ile iflaretli Protein G (Sigma) kullan lm flt r. Substrat Antijen ve konjugat titreleri için substrat olarak sitrik asit içinde % 3 lük hidrojen peroksit ilaveli ABTS (Sigma) kullan lm flt r. Peynir örneklerinin ELISA için haz rlanmas 25 g'l k peynir örnekleri, 500 ml PBS içerisinde blender ile homojenize edilmifl ve Eppendorf tüplerine konularak -20 0 C' de kullan l ncaya kadar saklanm flt r (PBS; litrede 8,2 g NaCl, 15.5 ml 0.5 M Na 2 HPO 4 ve 5.5 ml 0.5 M NaH 2 PO 4 içermektedir.). ELISA y kama solusyonu olarak, 1000 ml destile su içerisinde 29 g NaCl, 23 g Na 2 HPO 4, 0.2 g NaH 4 PO 4 ve 5 ml tween 80 içeren çözeltisi kullan lm flt r. ELISA'n n ( Enzymme Linked Immunosorbent Assay) Uygulan fl Thoen ve ark (16) bildirdikleri yöntem modifiye edilerek afla daki flekilde yap lm flt r. Mikropleytin herbir çukuruna, antiserumun Na 2 CO 3 de haz rlanan 1/100 dilüsyonundan 0,1 ml konarak 4 0 C de bir gece inkübe edilmifl, pleyt 3 kez ELISA y kama solusyonu ile ( % 0.5 tween 80 içeren 0.5 M NaCl) y kanarak 30 dakika kurumas için bekletilmifltir. Daha sonra bütün çukurlara 0.1 ml NaH 4 Cl 2 konulmufl, 30 dakika çalkalay c da inkübe edildikten sonra sekiz kez ELISA y kama solusyonu ile y kanarak, 30 dakika kurutulmufltur. Her bir çukur bir örne e ait olmak üzere, birinci s ra pozitif, ikinci s ra negatif kontrollere ayr lm flt r. Bütün çukurlara 0.1 ml peynir örne- i konulmufl ve bir saat süreyle çalkalay c da inkübe edilmifltir. nkübasyon sonunda plate 8 kez ELISA y kama solusyonu ile y kanm fl ve tekrar 30 dakika oda s cakl nda kurutulmas için bekletilmifltir. Bütün çukurlara 1/500 oran nda haz rlanan konjugattan 0.05 ml konulmufl ve bir saat çalkalay c da inkübe edilmifltir. Tekrar sekiz kez ELISA solusyonu ile y - kanan pleyt çukurlar na 0.1 ml substrat konulduktan sonra oda s cakl nda bir saat bekletilmifl ve çukurlar n 405 nm deki absorbans ELISA okuyucusunda okunarak de erlendirilmifltir. Cut-off De erinin Hesaplanmas Kontrol grubunun optik dansidite (OD) ortalamas na 2 SD ilave edilerek hesaplanm flt r (21). 357 357
BULGULAR Antikor ve konjugat n uygun konsantrasyonunun saptanmas amac ile yap lan denemeler sonucunda, antikor için en yüksek OD de erinin ölçüldü ü 1/100 oran uygun antikor titresi olarak, konjugat için de en yüksek OD de erinin ölçüldü ü 1/500 oran uygun konjugat titresi olarak belirlenmifl (fiekil 1) ve örneklere ELISA uygulanmas bu de erlerde gerçeklefltirilmifltir. fiekil.1. Antikor ve konjugat n farkl konsantrasyonlardaki OD de erleri Negatif kontrol gruplar esas al narak hesaplanan cut-off de eri 0.388 olarak bulunmufl ve bu de erden fazla OD veren örnekler pozitif olarak kabul edilmifltir. Toplam olarak 120 beyaz peynir, 60 civil peynir ve 52 lor peynirinin incelendi i bu araflt rma sonucunda, beyaz peynirlerden 26 s nda (% 21.66) pozitiflik görüldü ü halde di er 2 peynir örne inde pozitifli e rastlanmam flt r ( fiekil 2 ). fiekil.2. ELISA ile incelenen örneklerin OD de erlerinin Cut-off de erine göre da l m TARTIfiMA Bu araflt rma sonucunda beyaz peynirlerde saptad - m z pozitiflik oran n n ( % 21.66 ), ülkemizde daha önce peynirler üzerinde yap lm fl araflt rma sonuçla- r na göre oldukça yüksek oldu u görülmektedir. Nitekim Ünel (22), Bal kesir yöresi beyaz peynirlerinde % 16; Mert (23), Ankara piyasas ndan toplanan beyaz peynirlerde % 19.3; Tunçbilek (20), yine Ankara piyasas ndan toplanan beyaz peynirlerde % 5.2 oranlar nda Brucella saptam fllard r. Ayaz (24) ise Ankara da çeflitli marketlerden toplad beyaz peynirlerde Brucella izole edemedi ini belirtmektedir. Ayr ca Sert ve K vanç (14), Erzurum piyasas ndan toplanan 30 adet taze peynir örne inin hiçbirinde Brucella üremedi ini kaydetmifllerdir. Bu bulgular, araflt rmam zda yüksek oranda Brucella içeren örnek bulundu unu gösterse de, hem daha önce yap lm fl araflt rmalar n azl, hem de bu araflt rma da dahil olmak üzere ülkemizde bu konuda yap lm fl bütün araflt rmalarda örnek say lar n n azl ve örneklemenin iyi yap lamamas, böyle bir genelleme yapmam - z güçlefltirmektedir. Nitekim Ankara ilinde birbirine çok yak n tarihlerde yap lan çal flma sonuçlar ndaki çeliflki, bu yarg y do rular niteliktedir. Araflt rmam zda seropozitiflik oran n n, di er araflt rma sonuçlar na göre yüksek ç kmas, ELISA tekni ini kullanmam zdan kaynaklanabilir. Çünkü yukar da s ralanan araflt rmalarda genellikle klasik kültürel (veya baz serolojik) yöntemler uygulanm fl olup, bu yöntemlerin ELISA ya göre etken teflhisinde daha az hassas olduklar, ELISA n n ise sensitivite ve spesifite bak mlar ndan di er yöntemlerden üstün oldu u belirtilmektedir (18,25,26). Üstelik bu araflt rmada peroksidazla iflaretli protein G kullan lmak suretiyle ELISA'n n yukar da belirtilen özelliklerinin daha da iyilefltirilmesi sa lanmaya çal fl lm flt r. Nitekim, protein G'nin ELISA'da spesifiteyi art rd, daha kolay haz rland, daha ucuza mal edildi i ve biyoteknolojik yollarla üretildi i kaydedilmektedir (27,28) Hem bu araflt rmada, hem de daha önce yap lm fl araflt rmalarda, peynir örneklerinde Brucella saptanmas, ülkemizde hala geleneksel usullerle ve çi sütten peynir yap m n n devam etti ini göstermektedir. Nitekim, ülkemizde köy ve mand ra peynirlerinin büyük bir k sm n n çi sütten ve ilkel flartlarda yap ld, fabrika peynirlerinin ise pastörize sütten yap ld belirtilmektedir (24). Çi sütten yap lan peynirlerin, en az 90 günlük olgunlaflma dönemini tamamlamadan tüketime verilmemesi gerekti i de belirtilmifltir (29). 358 358
M. Güllüce ve ark., Erzurum Bölgesinde Temin Edilen Çeflitli Peynir Örneklerinde Brucella Antijenlerinin ELISA ile Saptanmas Bu araflt rma sonucunda civil peynir ve lor peyniri örneklerinde Brucella antijenine rastlanmam flt r. Sert ve K vanç (14) taraf ndan ayn bölgede yap lan çal flmada da civil ve lor peynirlerinde Brucella izole edilmedi i belirtilmektedir. Araflt rma sonuçlar - m z bu bulguyu destekler niteliktedir. Bu peynirlerde bruselloz etkeninin bulunmay fl, her iki peynirin yap m tekni inde s l ifllem uygulanmas n n varl na ba l olabilir. Ülkemizde bruselloz ile mücadele konusunda yap - lan çal flmalar küçümsenmeyecek boyuttad r. Nitekim Tar m ve Orman Bakanl taraf ndan 1984 y - l nda "Bruselloz Kontrolü ve Eradikasyonu" program bafllat lm fl ve bu proje kapsam nda 2010 y l na kadar 4-8 ayl k bütün difli buza lar n Brucella abortus S 19 ile, koyun ve kuzular n ise Brucella melitensis REV-I ile afl lanmas hedeflenmifltir. Projenin uygulanmaya geçirilmesini takip eden 1989 y l nda s - r ve koyun bruselloz sero-prevalans s ras yla %3,56 ve %1,26 iken bu oranlar 1991 y l nda %1,01 ve %1,83 olarak de iflmifltir. Ancak projenin yürütüldü ü y llarda insan bruselloz vakalar nda bir art fl kaydedildi i görülmüfltür. 1986'da 100.000'de 3,03 olan insanlarda bruselloz s kl, 1996'da 100.000'de 15,11'e yükselmifltir (7,30). Araflt r c lar, bu durumun infeksiyona yakalanma vakalar ndaki art fltan ziyade, tarama çal flmalar n n kalitesinin ve say s n n artmas na ba l oldu unu belirtmektedirler. fiüphesiz g dalardan yap lan izolasyon ve teflhis çal flmalar içinde durum ayn d r. Bu nedenlerle, ister hayvanlar üzerinde, isterse g dalar üzerinde yap lm fl olsun, araflt rmalardan elde edilen bulgular n do rudan karfl laflt r lmas, ancak araflt rmalar n yap ld ülkelerdeki tarama say lar ve kaliteleri dikkate al nd nda bir anlam ifade edecektir. Dolay s yla, yap lmas gereken en do ru fley, ülkemizdeki bu çeflit çal flmalar n say ve kalitesini artt rmakt r.. TEfiEKKÜR Bu araflt rma Atatürk Üniversitesi Araflt rma Fonu taraf ndan desteklenmifltir. KAYNAKLAR 1.Akritidis N and Pappas G: Ascites caused by brucellosis: a report of two cases. Scand. J. Gastroenterol 36 : 110 (2001). 2. Boschiroli M-L, Foulongne V and O' Callaghan D: Brucellosis: a worldwide zoonosis. Curr Opin Microbiol 4: 58 (2001). 3. zgür M: Hayvanc l k ve Brucellosis. Ankara Üniversitesi T p Fakültesi Bruselloz Sempozyumu Kitapç S. 68-78 (2000). 4.Al-Eissa YA, Fap MD: Brucellosis in Saudi Arabia:past, present and future. Ann Saudi Med 19 (5): 403-405 (1999). 5. Corbel MJ: Brucellosis An overview. Emerg Infect Dis 3 : 1 (1997). 6. De Ley J, Mannheim W, Segers P, L evens M, Denijn M, Vanhoucke M, Gillis M: Ribosomal ribonucleic acid cistron similarities and taxanomic neighborhood of Brucella and CDC group Vd. Int J Syst. Bacteriol 37 : 35 (1987). 7.Anonymous, Türkiye'de s r ve koyunlarda brusellosis'in sero-epidemiyolojisi. Tar m ve Köyiflleri Bakanl Tar msal Araflt rmalar Genel Müdürlü ü Hayvan Sa l Araflt rmalar 2000, Ankara s 5-(2001). 8. Muz A, Özer H, Eröksüz H, Ertafl HB, Öngör H, Gülcü HB, Dabak M, Baflbu O ve Kalender H: Elaz ve çevresinde koyun ve keçilerde abortus olgular n n bakteriyolojik, serolojik ve patolojik olarak incelenmesi. Tr J Vet Anim Sci 23: 77 (1999). 9.Öngör H, Muz A, Çetinkaya B: At k yapm fl koyunlarda brusellozis'in teflhisinde ELISA ile di er serolojik testlerin karfl laflt r lmas. Tr J Vet Anim Sci 25: 21 (2001). 10. Sancak YC, Boynukara B, Yard mc H: Van otlu peynirlerinde Brucella'lar n varl ve dayanma süresi üzerine bir araflt rma. Veterinarium 4 : 1 (1993). 11. Çetin ET ve ark: Türkiye'de insanda bruselloz insidans n n saptanmas. Do a Tr J Medical Sci 14 : 324 (1990). 12. Demirci M, fiimflek O, Tafltan M: Ülkemizde yap - lan muhtelif tip yerli peynirler. Trakya Üniv Ziraat Fak Derg 125: 273 (1994). 13. Kara A, Algur ÖF, Kaya M: Erzurum piyasas ndan temin edilen beyaz ve civil peynirlerden Listeria türlerinin izolasyon ve identifikasyonu. Tr J Biology 23: 331 (1999). 14. Sert S, K vanç M: Taze civil ve lor peynirleri üzerinde mikrobiyolojik çal flmalar. Atatürk Üniversitesi Ziraat Fak. Tar m Ürünleri Teknolojisi Bölümü 5: 287 (1985). 15. Güllüce M, Lelo lu N: Kars ve çevresinde, süt s rlar nda, Brucella abortus'a karfl oluflan antikorlar n ELI- SA ve MRT ile saptanmas, sonuçlar n n karfl laflt r lmas. 359 359
Tr J Vet Anim Sci 20: 251 (1996). 16. Thoen CO, Haas CA, Angus RD, Thownsend AS: Evaluation of potassium chloride extract of Brucella abortus in an ELISA for detecting Brucella antibodies in bulk tank milk samples from cows. Vet Microbiol 45: 185 (1995). 17. Uzal FA, Carrasco AE, Nielsen K, Echaide S, Cabrera RF: An indirect ELISA using a monoclonal anti Ig G1 enzyme conjugate for the diagnosis of bovine brucelosis. Vet Microbiol 52 : 175 (1996). 18. Vanzini VR, Aguirre N, Lugaresi CI, De Echaide ST, De Canavesia VG, Guglielmone AA, Marhesino MD, Nielsen K: Evaluation of an direct ELISA for the diagnosis of the bovine brucellosis in milk and serum samples in dairy cattle in Argentine. Prev Vet Med 36 : 211 (1998). 19. Shamelian SOA: Diagnosis and treatment of brucellosis. Neth J Med 56: 198 (2000). 20. Tunçbilek M: Ankara piyasas nda sat lan taze peynirlerin brucellosis riski yönünden incelenmesi. A.Ü. Sa l k Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi. Ankara ( 1992). 21. Keskin O: S r tüberkilozis'inin teflhisinde ELISA'n n kullan lmas ve allerjik yöntemle karfl laflt r lmas. A.Ü. Sa l k Bilimleri Enstitüsü. Doktora Tezi. Ankara (1996). 22. Ünel S, Williams CF ve Stableforth AW: Bal kesir bölgesinde süt krema imalathane ve köylü beyaz peynirlerinde Brucella melitensis'in kalma süresi. Pendik Mikrob Enst Derg 2 : 67 (1968). 23. Mert A: Ankara yöresinde pazarlanan taze beyaz peynirlerde Brucella'lar n varl üzerinde araflt rmalar. Doktora Tezi. A.Ü. Sa l k Bilimleri Enstitüsü. Ankara (1984). 24. Ayaz Y: Ankara piyasas nda sat lan beyaz peynirlerde brucellosis etmenlerinin araflt r lmas. Etlik Vet Mikrob Enst Derg 5 : 109 (1986). 25. Batra HV, Chand P, Ganju L, Mukherjee R, Sanada JR: Dot-Enzyme Linked Immunosorbent Assay for the detection of antibodies in bovine brucellosis. Res. Vet. Sci 46: 143 (1989). 26. Mongini C, Fernandez T, Truvetzky A, Hajos SE: Comperative study of cell- immunoenzymatic methods for the estimation of IgG ve IgM anti- Brucella antibodies in the diagnosis of human brucellosis. J Appl Microbiol 69 : 86 (1990). 27. Diaz -Aporicio E, Marin C, Alonso-Urmeneta B, Aragon V, Perez-Ortiz S, Pardo M, Blasco JM, Diaz R, Moriyon I: Evalution of serological tests for diagnosis of Brucella melitensis infection of goats. J Clin Microbiol 32 : 1159 (1994). 28. Falkenberg C, Bjorck EL, Akerstrom B, Nilsson S: Purification of Streptococcal protein G expressed by Escherichia coli by high performance liquid affinity chromatography using immobilized immunoglobulin G and albumin. Biomed Chromatogr 2 : 221 (1987). 29. Anonymous: VIII. Befl y ll k (2001-2005) kalk nma plan süt sanayii özel ihtisas alt komisyonu çal flmas. s 13 (2000). 30. Ad güzel A: Erzurum'a ba l baz köylerden toplanan süt örneklerinde Brucella abortus antikorlar n n ELISA ile araflt - r lmas. Ata. Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi. Erzurum (2001). 360 360