KULLANICI KILAVUZU Genequality AZF MX Kod Kod Kod. 04-23C Kod. 04-23A Kod. 04-23R AZF lokusda delesyonların tespiti için kit Compliant to the European Guidelines EAA/EQMN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions. State of the art 2004 Simoni M., Bakker E., Krausz C. Int. J. Andrology, 2004, 27: 240-249.
1 ÜRÜN BİLGİSİ 1 2 KİT İÇERİĞİ 2 3 REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTES 4 4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 4 5 GÜVENLİK KURALLARI 5 5.1 Genel Güvenlik Kuralları 5 5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları 5 6 GEREKLİ OLAN, KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN MALZEMELER 7 6.1 Reaktifler 7 6.2 Cihazlar 7 6.3. Materyaller 7 7 REAKTİF HAZIRLAMA 7 8 GİRİŞ 8 9 TEST PRENSİBİ 9 10 ÜRÜN TANIMI 10 11 ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ 10 12 PROSEDÜR 10 12.1. DNA EKSTRAKSİYONU 10 12.1.1 Dondurulmuş yada taze tam kandan DNA ekstraksiyonu 11 12.2 DNA AMPLİFİKASYONU 11 12.3 AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ 12 12.3.1 Yüksek Resolüsyon agaroze jel elektroforezi 12 12.3.2 Örnek yükleme 12
13 SONUÇLARIN YORUMLANMASI 13 14 SORUN GİDERME 14 15 CİHAZ LİMİTLERİ 17 16 CİHAZ PERFORMANSLARI 17 16.1 Özgünlük 17 16.2 Diagnostik duyarlılık 17 17 BIBLIYOGRAFIK REFERANSLAR 18
1 ÜRÜN BİLGİSİ Bu kullanıcı kılavuzu aşağıdaki ürünlerin kullanımı için bilgiler içerir: AZF-MX KOMPLET (Kod 04-23C) Erkek infertilitesinde yer alan AZF lokusda delesyonların tanımlanması için komplet sistem Kit; DNA ekstraksiyonu, amplifikasyon ve agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme, örnek amplifikasyonunun internal kontrolü ve referans DNA için gerekli tüm reaktifleri içerir. Kod Ürün Pkg 04-23C-12 AZF-MX COMPLETE 12 test 04-23C-24 AZF-MX COMPLETE 24 test AZF-MX (Kod 04-23A) Erkek infertilitesinde yer alan AZF lokusda delesyonların tanımlanması için kit Kit; amplifikasyon ve agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme, örnek amplifikasyonunun internal kontrolü ve referans DNA için gerekli reaktifleri içerir. Kod Ürün Pkg 04-23A-12 AZF-MX 12 test 04-23A-24 AZF-MX 24 test AZF-MX amplifikasyon reaktifleri (Kod 04-23R) Erkek infertilitesinde yer alan AZF lokusda delesyonların tanımlanması için kit Kit; amplifikasyon, örnek amplifikasyonunun internal kontrolü ve referans DNA için gerekli reaktifleri içerir. Kod Ürün Pkg 04-23R-12 AZF-MX amplifikasyon reaktifi 12 test 04-23R-24 AZF-MX amplifikasyon reaktifi 24 test Sayfa.1
2 KİT İÇERİĞİ NOT: Kit içeriğinde farklı kodlarda (C,A or R) farklı komponentler bulunur. (kısaltma: X= kit içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent) KUTU P 20 C DE SAKLANIR 04-23C 04-23A 04-23R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YADA KAPAK RENGİ 12 test 24 test X X X X X X X X X X X X Multiplex II için tek-doz premiks tüpleri. Multiplex II için tek-doz premiks tüpleri. Multiplex II için tek-doz premiks tüpleri. Termostabil Hot-start Taq DNA polimeraz Süper AB Taq 5 U/μL Renksiz (T) 12 24 Mavi (T) 12 24 Sarı (T) 12 24 Kırmızı 1X 25 μl 1X 50 μl X 0 0 Proteaz Proteaz Yeşil 3X 100 μl 6X 100 μl KÜÇÜK ÇANTA 20 C DE SAKLANIR 04-23C 04-23A 04-23R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YADA KAPAK RENGİ 12 test 24 test X X X Referans DNA (delesyon olmayan bir erkekten alınan) Referans DNA (delesyon olmayan erkek) Mavi 1X 20 μl 1X 40 μl Sayfa.2
KUTU F +2 / +8 C DE SAKLANIR 04-23C 04-23A 04-23R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YADA KAPAK RENGİ 12 test 24 test X X 0 X X 0 X X 0 Elektroforez yükleme buffer (6X solüsyon) Etidyum Bromür solüsyonu (2,5 mg/ml) DNA Moleküler Ağırlık Marker (MW) Bromofenol mavi Etidyum Bromür TOXIC R 23 68 S 36/37 45 Mavi 1X 200 μl 1X 350μL Kırmızı 1X 100 μl 1X 180 μl MW Marker Sarı 1X 100 μl 1X 180 μl KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR 04-23C 04-23A 04-23R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YADA KAPAK RENGİ 12 test 24 test X X X X X X Agaroz moleküler biyoloji aşaması AGAROZ 10 g 20 g Elektroforez buffer TRIS-Asetat -EDTA ph 8,0 50 X TAE 40 ml 70 ml X 0 0 Hücre Lizis Solüsyonu X 0 0 Yıkama Solüsyonu X 0 0 Yıkama Solüsyonu X 0 0 Ayrıştırma Solüsyonu SOLÜSYON 1 SOLÜSYON 2 SOLÜSYON 3 Ayrıştırma Solüsyonu 1X 3 ml 1X 11 ml 1X 10,5 ml 1X 3 ml 1X 6 ml 1X 22 ml 1X 21 ml 1X 6 ml X 0 0 Filtre kolonlar 12 24 X 0 0 2 ml tüpler 24 48 Sayfa.3
3 REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTESİ Kitin her bir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara göre saklanmalıdır. Özellikle: P kutusu -20 C de saklanır Small bag -20 C de saklanır F kutusu A kutusu +2/+8 C de saklanır +15/+25 C de saklanır (oda sıcaklığı) Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. 4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve deneyimli araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da yöntem uygulaması ile ilgili her hangi bir şüpheniz olduğunda, kit kullanmadan önce AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it ; Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, saflaştırılmış DNA, kit içeriğindeki referans DNA ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Ekstrakte edilmiş DNA kısa bir zaman için +2 / +8 C de saklanmalı veya uzun bir zaman için -20 C de dondurulmalıdır. Sayfa.4
Kullanmadan önce PCR premiksi oda ısısında eritin; Taq DNA polymerase ekleyin ve oda ısısında ya da buz kabında oldukça hızlı DNA purifiye edin. 5 GÜVENLİK KURALLARI 5.1 Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik yöntem enfektif faktörlerin yok olduğunu garanti etmez. Tüm klinik örnekleri potansiyel enfeksiyonu ajanı olarak kabul edip o şekilde kullanmak gerekir; Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solüsyonu her bir 10 hacim kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solüsyonları otoklavlamayın!!) 5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: ETİDYUM BROMÜR (04-23C ve 04-23A içerir) 3,8-diamin-1-etil-6-fenilfenantridyumbromür (Etidyum Bromür) <2% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Sayfa.5
Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Etidyum Bromür için, agaroz jelde dilüsyona kadar. Konsantre Etidyum Bromür uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Etidyum solüsyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları takip edin. Etidyum Bromür kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin. SOLÜSYON 1 ve SOLÜSYON 2 (04-23C içerir) Solüsyon 1 ve 2 guanidin hidroklorit içerir. Risk tanımı: Zararlı ve tahriş edici RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 22-36 ve R 38 S 13-26-36-46 Yutulduğunda zehirlidir. Göz ve cilt için tahriş edicidir. Yiyecek ve içecekten uzakta saklayın. Göz ile teması durumunda hemen bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. PROTEAZ (04-23C içerir) Risk tanımı: Tahriş ederek sensitizasyona neden olur. RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 37 ve R 38-41-42 S 24-26-36 S 37; S 46 Yutulduğunda zehirlidir. Göz ve cilt için tahriş edicidir. Deri ve göz temasından kaçının. Göz ile teması durumunda hemen bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. Kitin materyal güvenlik bilgi formu (MSDS) istendiğinde elde edilebilir. Sayfa.6
6 KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 6.1 Reaktifler DNA ekstraksiyonu için reaktifler (Kod. 04-23A ve 04-23R için gerekli) Steril DNase ve RNase serbest su; Distile su; 96% 100% Etanol (Kit 04-23C için gerekli) Agaroz jel elektroforezi için reaktifler (Kod. 04-23R için gerekli). 6.2 Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNA eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 μl; 0,5-10 μl; 2-20 μl; 20-100 μl; 100-1000 μl); Thermalcycler; Termoblok veya termal banyo; Mikrosantrifüj (max 12-14.000 rpm); Tartı; Vorteks; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi; Güç kaynağı (50-150 V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör. 6.3 Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 μl; 0,5-10 μl; 2-20 μl; 20-100 μl; 100-1000 μl); TAE dilusyonu için dereceli silindirler (1L); Agaroz jel hazırlamak için pireks şişe ya da Beher; Parafilm. Mikrotüpler (1,5 2,0 ml). 7 REAKTİFLERİ HAZIRLAMA 1 L TAE Buffer (1X) hazırlamak için: 20 ml 50X TAE ile 980 ml distile suyu karıştırın. Sayfa.7
8 GİRİŞ Günümüzde Y kromozom mikrodelesyonunun analizi erkek infertilite çalışması için gerekli bir diagnostik yaklaşım olarak kabul edilir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda Y kromozomu uzun kolu AZF (Azospermi Faktör) olarak adlandırılan üç bölgeye ayrılır ve bazı azoospermatik ve ciddi oligoazospermi bireylerde delesyon bölgeleri bulunur. Bu lokus (AZFa, AZFb ve AZFc) spermatogenezin doğru sıra kontrolu olan genler içerirler (Şekil 1). AZF lokusta bir veya daha fazla değişiklik tamamen yok olana kadar germinal hücrelerin ciddi bir azalmasına neden olur. Tekrarlanan DNA dizilerinin varlığı ve delesyonları arasındaki ilişkiyi belirlemiş çeşitli çalışmalar gösterir ki iki proviral dizi arasında rekombinasyonal bir vaka AZFa delesyonunun temelidir(kamp et al., 2000; Sun et al., 2000). AZFc delesyonları genellikle daha düzgündür ve bölgeye komşu tekrarlanan DNA dizilerinin blokları arasındaki rekombinasyonu takip eder(kuroda-kawaguchi et al., 2001). Y-ilgili infertilite tanısı, bilinen diğer nedenlerin yokluğunda, spermatik motilite ve/veya anormal morfolojisi ile ilgili olan ciddi Azoospermia veya Oligozoospermia sahip erkeklerde şüphelidir. Y kromozomun mikrodelesyonu bu vakadaki % 10'u ile 5 i içinde moleküler analizi ile tanımlanır. Y ökromatik bölgenin bütünlüğünü değerlendirmek için, en az dört gen araştırılmalıdır: USP9Y (veya DFFRY), DBY, RBMY ve DAZ. Bu genler doğrudan veya dolaylı olarak halen erkeğin üremesinin olduğunu gösterir. USP9Y, AZFa bölgesinde tek kopya gende bulunur, X kromozomunda onun homologu vardır ve her zaman bulunan olarak ifade edilir (Brown et al.,1998). DBY, AZFa bölgesinde yer alan X kromozomu üzerinde bir homologlu bir tek kopya gendir, ancak testis düzeyinde belirli bir transkript verir (Lahn & Page, 1997). RBMY, AZFb bölgesinde bulunan çoklu bir gendir ve testikular düzeyde yalnızca ifade edilir (Ma et al, 1993). DAZ iki küme halinde düzenlenen dört kopya içinde AZFc bölgesinde bulunan bir gendir(saxena et al., 2000). Son zamanlarda, AZF lokusu içinde kısa DNA dizilerinin (STS) PCR amplifikasyonu bu bölgelerde mikrodelesyonları tespit etmek için en iyi yöntem olarak kabul edilmiştir. SRY ZFY AZFa sy86 sy84 DFFRY, in USP9Y gen DBY, in DEAD BOX Y gen sy95 Şekil 1: Y KROMOZOM VE AZF LOKUSUN ŞEMATİK GÖRÜNTÜLENMESİ AZF lokusta mikrodelesyonun tespiti için işaretleyiciler AZFb AZFc sy117 sy125 sy127 sy134 sy254, in DAZ gen sy255, in DAZ gen Sayfa.8
Yayınlanan veriler gösterir ki rutin olarak gerçekleştirilen teşhis protokoller çok farklıdır ve sık sık yanlış veya eksik teşhise neden olur. Standardizasyon ihtiyacı eksiksiz ve güvenilir teşhise sahip olan gerekli işaretler ve amplifikasyon reaksiyonun ana özelliklerinde açıklanan Avrupa Kılavuzunun ilk yayınında vurgulanır (Simoni et al., 1999). Bu ilk yayından 4 yıl sonra Y kromozomun (Skaletsky et al., 2003) komplet sırası ve delesyonun (Kampo et al., 2000; Sun et al., 2000; Repping et al., 2002) moleküler mekanizması hakkında bilgi Yeni Avrupa Kılavuzunda yayınlandı (Simoni et. Al., 2004). Avrupa Kılavuzları taranacak hastaların seçimi için kesin endikasyonlar verir. Yazarlar önerir. Genomik DNA ın bir multiplex PCR amplifikasyonu yapılmalıdır. ZFX/ZFY genin amplifikasyonu uygun bir internal PCR kontrolüdür çünkü primerler sırasıyla hem erkek hem de kadında tek bir parçada amplifiye olurlar. Seçilen markörlerin basit özellikleri: Y-özgüllük, diğer benzer dizilerin yokluğu, polimorfik olmayan. Her AZF alanında en az iki lokus analiz edilmelidir: AZFa için: sy84, sy86 AZFb için: sy127, sy134 AZFc için: sy254, sy255 SRY gen, ZFY gen yokluğunda Y-spesifik dizinin varlığı için ve Y kromozomun kısa kolu üzerinde testis-belirleme faktörü için bir kontrol olarak analize dahil edilmelidir (XX erkekte gibi). 9 TEST PRENSİBİ PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu metodudur (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Termo-stable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polimeraz primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solüsyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli döngülerden sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuvar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Multipleks amplifikasyon seçilen bir primer karışımı olan aynı reaksiyonda farklı DNA dizilerinin eş zamanlı amplifikasyonunu sağlar. Sayfa.9
10 ÜRÜN TANIMI AZF lokusta kısa DNA dizisinin (STS) amplifikasyonu Y kromozomunda mikrodelesyon varlığını onaylamak için en iyi yöntemdir. Özellikle, önerilen yöntemin stratejisi 3 multiplex PCR anlamına gelen onbir markörün amplifikasyonundan oluşur. AZF MX yöntemi, hemen hemen tüm klinik delesyon tespitini sağlamak için amplifikasyon protokolü ve primer setinin temel özelliklerini tanımlayan Y-kromozomal mikrodelesyonların (Simoni M et al., 2004) tanısal testi için son zamanlarda önerilen Avrupa Kılavuzunun göstergeleri ile uyumludur. İnternal kontrolün (ZFX/ZFY gende) ampilifikasyonu ekstrate DNA nın iyi kalitesini ve aynı zamanda hatalı pozitif sonuçlardan kaçınan amplifikasyon inhibitörlerinin yokluğunu onaylamayı sağlar. Kit, delesyon olmayan erkekten alınan referans DNA içerir. Referans DNA nın amplifikasyonu (beklenen tüm bantların varlığı ile) reaksiyonun doğru yolunun bir kılavuzudur. Referans DNA insan kaynaklıdır fakat operatör için tehlikeli değildir. Bu kit premiks formatındadır: Amplifikasyon için tüm reaktifler pre-mikstir ve Taq polymerase ve ekstrakte DNA eklenebilecek şekilde tek doz test tüplerine eşit miktarda dağıtılır. Bu premiks formatı, kullanıcı için zaman kazancı ile amplifikasyon öncesi manipulasyon aşamalarını azaltır; reaktiflerin tekrar dondurup çözülmesini engeller ve tüm bunlar nedeniyle kontaminasyon riskini minimize eder, risk yanlış pozitif sonuçlara neden olur. Bu nedenle, daima uygun amplifikasyon kontrollerini kullanmayı önerir. 11 ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, MANİPULASYON VE ÖN HAZIRLIKLARI Y kromozom mikrodelesyonların analizi için prosedür tam kan numunelerinin toplanması ile başlar. Numune toplamak için tüm sterillik önlemleri takip etmelidir. Kan EDTA ile işlenmelidir. Diğer pıhtılaştırma ajanları, heparin gibi Taq polimeraz ın güçlü inhibitörleridir ve bundan dolayı amplifikasyon reaksiyonunun verimliliğini değiştirebilir. Taze kan kısa bir zaman için +2 / +8 C de saklanmalıdır; eğer DNA ekstraksiyonu kısa bir zamanda yapılamazsa, numunenin dondurulması gereklidir. 12 PROSEDÜR 12.1 DNA ekstraksiyonu AB ANALITICA, standardize olmuş yöntem ile ekstraksiyon sistemi içeren AZF MX KOMPLET kiti (Kod. 04-23C) kullanımı göstermektedir. Her durumda, herhangi bir DNA ekstraksiyon yöntemi kullanılabilir ve saf ve integral DNA nın ekstraksiyonunu sağlar. Ekstre edilmiş DNA nın spektrofotometrik ölçümü ile miktarı belirlenmelidir. DNA nın miktarı amplifikasyonda kullanmak için 180 ng dir, bu nedenle, saflaştırılmış DNA solüsyonu 6 μl sahip her primeks tüpünde mevcut olan hacim ile dilüe edilmelidir. Yöntemin uygulanmasında oluşacak herhangi bir sorun için, AB ANALITICA teknik dstek ile irtibata geçebilirsiniz: laboratorio@abanalitica.it. Aşağıdaki ekstrasksiyon yöntemi AZF MX KOMPLET (Kod 04-23C) kiti için tanımlanmıştır. Sayfa.10
12.1.1 Taze veya dondurulmuş tam kandan DNA ekstraksiyonu 1. 1.5 ml bir tüpe 20 μl Proteaz ekleyin. 2. 200 μl dondurulmuş yada taze tam kandan ekleyin (EDTA ile işlenmiş) 3. Vorteksleyin ve Solüsyon 1 karıştırın; sonra bu solüsyondan 200 μl numuneye ekleyin. 15 dakika boyunca vorteksleyerek karıştırın. 4. 10 dakika 56 C de inkübe edin. 5. Kapağın içinden damlacıkları kaldırmak için kısa bir süre santrifüjleyin; sonra 200 μl Etanol (96%-100%) ekleyin ve 15 saniye vorteksleyerek karıştırın. 6. Kısa bir süre santrifüjleyin; sonra filter kolonunun içine karışımı aktarın; kapağı kapatın ve 1 dakika boyunca 8000 rpm de santrifüj edin. 7. Yeni bir 2 ml tüpe filter kolonunu aktarın ve filtrat içeren kolonu atın. 8. Filtre kolonunun kapağını açın ve 500 μl Solüsyon 2 ekleyin; kapağını kapatın ve 1 dakika 8000 rpm de santrifüj edin. 9. Yeni bir 2 ml tüpe filter kolonunu aktarın ve filtrat içeren kolonu atın. 10. Filtre kolonunun kapağını açın ve 500 μl Solüsyon 3 ekleyin; kapağını kapatın ve 3 dakika 14000 rpm de santrifüj edin. 11. Filtrat ile filtrenin en alt bölümünün ıslak olmamasına dikkate ederek 1.5 ml tüp içine filtre kolonunu aktarın. Kısa bir süre için santrifüjleyin. 12. Filtre kolonunun kapağını açın ve 200 μl Elüsyon Solüsyonu veya steril distile su ekleyin. 1-5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin ve sonra 1 dakika 8000 rpm de santrifüj edin. Filtratda bulunan ekstre edilmiş ve saflaştırılmış DNA eğer 20 C de saklanırsa, en az 1 yıl için stabilidir. 12.2 DNA AMPLİFİKASYONU Her numune için, her bir premiks tüpüne ekleyin: 0,2 µl Süper AB Taq 6 µl Ekstrakte DNA Farklı işaretlerin tüm bantlarını gösterecek olan referans DNA yı (delesyon olmayan bir erkeğin DNA sı) ve kontaminasyonu (ekstrakte DNA yerine karışıma distile su ekleyin) izlemek için her deneyde bir negatif kontrolün dahil edilmesi önemlidir. Mikrotüpleri aşağıdaki programda termalcyclera koyun: 1 döngü 94 C 5 dk 40 döngü 94 C 60 C 72 C 1 dk 1 dk 1 dk 1 döngü 72 C 7 dk Depolama 4 C Sayfa.11
Tablo 1: Amplifikasyon ürünlerinin uzunluğu MX 1 bp MX 2 bp MX 3 bp ZFX/ZFY 495 ZFX/ZFY 495 DBY 689 SRY 472 SRY 472 ZFX/ZFY 495 sy254 380 sy95 303 SRY 472 sy86 320 sy117 262 sy84 326 sy127 274 sy125 200 sy134 301 sy255 120 DFFRY 155 NOT: ZFX/ZFY gen amplifikasyon internal PCR kontrolüdür çünkü primerler sırasıyla hem erkek hem de dişi DNAın benzersiz bir parçasını amplifiye eder. 12.3 AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ 12.3.1 Agaroz jel elektroforezi %3 agaroz jel hazırlayın: 1,5 g toz agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Solüsyon berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı üzerine ya da mikrodalga içine bırakın. Jelin soğumasına izin verin (3-5 dakika), sonra 10 μl Etidyum Bromür solüsyonu ekleyin. DİKKAT! Etidyum Bromür güçlü bir mutajenik ajandır: Daima eldiven kullanın ve bu reaktifle ya da içeren jel ile çalışırken tercihen kimyasal güvenlik kabini altında çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jeli katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Jel katılaştığında tarakları dikkatlice alın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin) ve trayi elektroforez tankına geçirin. Jeli tamamen kaplayacak şekilde (jel yüzeyinin 1-2 mm üzerinde) uygun miktarda 1X TAE buffer dökün. 12.3.2 Örnek yükleme Amplifikasyon ürünlerin görüntülenmesi için, test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: ve 2 µl 6X Mavi* 10 µl Her multipleks PCR ın Ampifikasyon ürünü 2 µl 6X Mavi* Sayfa.12
10 µl DNA Moleküler Ağırlık Markır * NOT: 6X Blue* ve DNA Moleküler Ağırlık Markır 04-23A ve 04-23C içinde bulunur; Başka bir yükleme buffer ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır kullanıldığında üretici bilgilerini takip edin. Karışımı jel kuyucuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı 80-100 V ayarlayın. Yaklaşık 2 saat jeli çalıştırın, sonra jeli UV transilluminatöre koyun ve amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans DNA Moleküler Ağırlık Markır ile karşılaştırarak sonuçları analiz edin. * DNA Moleküler Ağırlık Markır (Marker MW): 501-489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34x2, 26 bp. (NOT: %2,5 agaroz jelde 501-489 bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları %2,5 agaroz jelde bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın. 13 SONUÇLARIN YORUMLANMASI Kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir: KONTROL SONUÇ YORUM referans DNA Beklenen tüm bantların varlığı Multipleks PCR amplifikasyon doğru çalışır. Negatif kontrol bantların yokluğu Kontaminasyon yokluğu Agaroz jelde bantların yorumlanması için aşağıdaki tabloya bakın: AZF MARKERS SONUÇ YORUM ZFX/ZFY bant AZF markırlar yok yok (hepsi yada bazıları) Örnek amplifikasyon için uygun değildir* ZFX/ZFY bant Tüm AZF markırlar SRY band ZFX/ZFY bant tüm AZF markırlar var var var var yok AZF lokusta delesyon olmadan ve testis belirleme faktörü varlığında örnek amplifiye olabilir. AZF lokussuz ve testis belirleme faktörü (XX-erkek gibi) varlığında Sayfa.13
SRY bant var örnek amplifiye olabilir. ZFX/ZFY bant AZF markırlar var yok (bir yada daha fazlası) AZF lokusta delesyon ile örnek amplifiye olabilir. *Eğer örnek gösteren sonuçlar amplifiye değilse (ZFX/ZFY internal kontrol bant varlığı), analiz tamamen tekrar edilmelidir. SRY markır ve internal kontrol ZFX/ZFY ın paralel amplifikasyonu kadınların kontaminas yon izlenmesini verir. MARKERS / INTERNAL CONTROL AZF NOT-DELETED XY MALE XX ERKEK XX KADIN + -- -- + / -- MARKERS ZFX / ZFY + + + + SRY + + -- + DELETED XY MALE Bir ya da birden fazla markörların bantlarının yokluğu durumunda, amplifikasyonun tekrar edilmesi önerilir. 1 2 3 Şekil 2. Üç multipleks PCR amplifikasyonun 2.5 % yüksek resolüsyon agoraz jel elektroforezi. 1. DNA Moleküler Ağırlık Markırı 2. Multiplex I 3. Multiplex II 4. Multiplex III 5. Analiz edilmiş hasta herhangi bir işaretleyici için silinmez. Herhangi bir sorun için AB ANALITICA teknik destek iletişim hatları ile bağlantı kurabilirsiniz: e-mail: laboratorio@abanalitica.it fax N +39 049-8709510. Sayfa.14
14 SORUN GİDERME Amplifikasyon ürünü ya da pozitif kontrol DNA bandı yoksa TAQ polymerase premikse doğru eklenememiştir - Uygun hacimde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); -Görsel olarak TAQ polimerazın premiksi difüze olduğunu gözleyin: Bu basittir, çünkü enzim, yüksek bir yoğunluğa sahip olan gliserolde çözülür; - Alternatif olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polimerazı görsel olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır. - Thermalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini kontrol edin. Kit uygun şekilde çalışmaz. - Premiks, TAQ polimerazı ve referans DNAyı -20 C de saklayın; - Premiks ve reaktifleri tekrar dondurup/çözdürmekten kaçının. Amplifikasyon bandı (ya da sadece bazı markırlar için) ZFX/ZFY bandın yokluğunda yoktur fakat referans DNA için iyi bir bant vardır. Ekstraksiyon adımı sırasında olası problemler: Eğer AZF MX KOMPLET ( 04-23C) kit kullanılırsa, lütfen aşağıdaki sayfadaki tabloya bakın. Olası nedenler Solüsyon 1 in yetersiz karışımından dolayı yetersiz hücresel lizis. Proteaz aktivitesinin azalmasından dolayı yetersiz hücresel lizis. Etanol (96%-100%), filtre kolonu içine transfer edilmeden önce lizate eklenmemiştir. Lökopenik hasta Filtre kolonlara transfer edilmeden önce lizata Ethanol (%96-100) eklenmemiştir(nokta 6, par. 11.1) ya da düşük oranlı bir ethanol ile solüsyon kullanılmıştır. Yorum ve Öneriler Yeni bir örnek ile ekstraksiyonu tekrarlayın; vorteksleyerek Solüsyon 1 ile örneği karıştırırken dikkat edin (Nokta 11, par. 11.1) Proteazdan bir miktar kullanarak yeni bir örnek ile ekstraksiyonu tekrar edin; solüsyonun tekrar dondurma/eritme işlemlerinden kaçının. Yeni bir örnek ile doğru şekilde ekstraksiyonu tekrar edin. Tam kan kullanmayın fakat örneğin lökosit fraksiyonu zengin olanı kullanın (buffy coat, Ficoll-Hypaque). Yeni bir örnek ile doğru şekilde ekstraksiyonu tekrar edin. Sayfa.15
Filter kolonu 2 dakika boyunca oda sıcaklığında (+15 C/+25 C) inkübe edilmemiş olabilir (nokta 12, par.11.1). DNA etkili olarak elute edilememiştir. Solüsyon 1 ve 2 doğru olarak kullanılmamış olabilir. Fazla miktarda Elusyon Solusyonu ile Elusyon yapılmıştır. Elut içinde az miktarda DNA görülür. Filtre kolon, Elüsyon Solüsyonu eklemeden önce oda sıcaklığında en az 1 saat inkübe edilmelidir. DNA elusyonunun etkisini artırmak için filtre kolonu oda ısısında 5 dakika inkübe edin. Her iki solusyonunda doğru sırada kullanıldığından emin olun. Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar ekstraksiyon yapın. Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar ekstraksiyon yapın. Amplifikasyon reaksiyonunun İyi sonuçları için gerekli DNA miktarı 180 ng. Eğer elute edilmiş DNA konsantrasyonu çok düşük ise (fotometrik ölçüm ile belirlenmiş), ekstraksiyonu 200 μl den düşük miktarda elusyon ile tekrar etmenizi öneririz. Eğer elusyon miktarı <200 μl ise, DNA konsantrasyonu elut içinde artar, fakat final ekstraktte görülen ürün azalır. Kit AZF MX 04-23A ve 04-23R kullanıldığında, aşağıdaki noktaları ve önerilen işlemleri kontrol edin: Ekstraksiyon kiti kullanıcı manuelinde belirtilenleri doğru şekilde izleyin. Ekstraksiyon kitinin kullanıcı kılavuzu bölümünde giderme bakın. Yeni bir örnek ile DNA ekstaraksiyonu tekrar edin. Amplifikasyon reaksiyonu ile engelleyici diğer faktörler veya bazı inhibitörler mevcuttur. Elde edilen DNA solüsyonu saf değildir (A260/A 280 oranı düşüktür). İzlenen ekstraksiyon protokolünü doğru şekilde doğrulayın ve yeni bir örnekten başlayarak ekstraksiyonu tekrar edin; Elde edilen DNA solüsyonunda, RNAase ile sindirim adımında elimine edilebilen kalan RNA (A260/A 280 oranı çok yüksektir) vardır. Kit AZF MX COMPLETE Kod. 04-23C kullanıldığı durumlarda: Eğer filtrenin en düşük parçası Solüsyon 3 ün (Nokta 14, par 11.1) filtratı ile ıslatılırsa, filtre kolonunu yeni bir 2 ml tüpe aktarın ve 14000 rpm de 1 dakika boyunca santrifüj edin. Solüsyon 2 ve 3 protokolde belirtildiği gibi doğru sırada çalışılmışmı kontrol edin. Sayfa.16
Her hangi bir sorun için, AB ANALITICA teknik destek ile temasa geçebilirsiniz: e-mail: laboratorio@abanalitica.it 15 CİHAZ SINIRLARI Eğer klinik örnek bu analiz için uygun değilse, kit performansını azalabilir (kan örneği doğru şekilde saklanmamışsa veya anti-koagülant olarak heparin ile işlenmemişse). 16 TEST PERFORMANSI 16.1 Özgünlük Primerler kromozomda tekrar edilmiş dizilerde amplifiye olmazlar ya da DNA sırası popülasyonlar arasında farklı büyük nükleotitlere sahip olmadıkları için bu yöntem kullanılarak çalışıldı. En önemli databanklarda primer sıra uyumu spesifik olmayan uyumun yokluğunu gösterir. Ayrıca, deneysel veriler (kadınsı DNA amplifikasyonunun toplam yokluğu) gösterir ki her işaretleyici için kullanılan primerler Y-spesifiktir. 16.2 Diagnostik duyarlılık Avrupa Kılavuzunda (Simoni et al., 2004) önerilen STS primerlerin temel bir setinin kullanımı literatürde üç AZF lokusta bildirilen delesyonların 95% üzerindedir ve tüm ilgili delesyonların klinik olarak hemen hemen tespitini sağlar. Sayfa.17
17 BIBLIYOGRAFIK REFERANSLAR Brown GM, Furlong RA, Sargent CA, Erickson RP, Longepied G, Mitchell M, Jones MH, Hargreave TB, Cooke HJ, Affara NA. Hum Mol Genet. Jan;7(1):97-107, 1998 Kamp C, Hirschmann P, Voss H, Huellen K, Vogt PH., Hum Mol Genet. Oct 12;9(17):2563-72, 2000. Kuroda-Kawaguchi T, Skaletsky H, Brown LG, Minx PJ, Cordum HS, Waterston RH, Wilson RK, Silber S, Oates R, Rozen S, Page DC, Nat Genet. Nov;29(3):279-86, 2001. Lahn BT, Page DC, Science. Oct 24;278(5338):675-80, 1997 Ma K, Inglis JD, Sharkey A, Bickmore WA, Hill RE, Prosser EJ, Speed RM, Thomson EJ, Jobling M, Taylor K, Cell. Dec 31;75(7):1287-95, 1993 Saiki RK, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich and N Arnheim, Science 230, 1350-1354, 1985. Saxena R, de Vries JW, Repping S, Alagappan RK, Skaletsky H, Brown LG, Ma P, Chen E, Hoovers JM, Page DC, Genomics. Aug 1;67(3):256-67, 2000 Simoni M., Bakker E., Eurlings M. C. M., Matthijs G., Moro E., Muller C. R. et Vogt P. H., Int. J. Andrology, 1999; 22:292-299. Simoni M., Bakker E., Krausz C. Int. J. Andrology, 2004, 27: 240-249. Sun C, Skaletsky H, Rozen S, Gromoll J, Nieschlag E, Oates R, Page DC., Hum Mol Genet., Sep 22;9(15):2291-6. 2000 Vogt P.H., Edelmann A., Kirsch S.; Hum. Mol. Genet., 5:933-943, 1996 Sayfa.18
AB ANALITICA srl Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it