GÜVENLİ VE ETKİN LABORATUVAR UYGULAMALARI 111-546 HÜCRE KÜLTÜRÜ Doç. Dr. Hilâl Özdağ FİZİKİ ALTYAPI Ayrıbiroda ClassII Biyogüvenlik Kabini Soğutmalı santrifüj Ters mikroskop Pipetseti Pipet yardımcısı Tezgah altı buzdolabı ve derin dondurucu 1
KÜLTÜR TİPLERİ Hücrelerin kökeni: Fetal veya erişkin hayvan dokusu; Tümör dokusu; Primer hücre hattı.. Büyütülme usulleri: Süspansiyon; adherent; ankoraj bağımlı veya bağımsız KÜLTÜR TİPLERİ Orijin Primer hücre kültürleri hayvan veya bitki dokusundan izole edilip kültüre alınan hücrelerden oluşur. Devam hücre kültürleri daha hızlı bölünen, tümörijenitesi daha yüksektir. Transforme hücreler normal hücreden kanser hücrelerinin birçok özelliğini taşıyan hale geçen hücrelerdir. Yüksek yoğunlukta ürerler Büyüme faktörü ve seruma daha az ihtiyaç duyarlar. Daha ziyade ankoraj bağımsızdırlar. Sonsuz bölünme kapasiteleri mevcuttur. 2
KÜLTÜR TİPLERİ Büyüme Tipi Süspanse hücreler besiyerinde asılı olarak büyürler. Kültür edildikleri kaba bağlanmadan yaşayıp çoğalma özelliğine sahiptirler. Kan, dalak, kemik iliğinden alınan hücreler genelde süspanse olarak büyürler. Yapışık hücreler tek kat halinde kültür kabına bağlanarak büyürler. Ektodermal veya endodermal embriyonik hücre katmanları genellikle bu şekilde büyür. Buna fibroblastlar ve epitelyal hücreler dahildir. KÜLTÜR TİPLERİ Büyüme Tipi Ankoraj bağımlı hücreler hücre çoğalması için bir yüzeye ihtiyaç duyar. Ankoraj bağımsız hücreler kültür kabının yüzeyine zayıf olarak tutunmuşlardır. Büyüme için yüzeye ihtiyaç duymazlar. 3
HÜCRELERİN GÖZLEMLENMESİ Besiyerinin rengi: Besiyerlerinin çoğunda ph indikatörü bulunur. Sarı ise asidite, mor gibi ise alkaliliği işaret eder. Besiyerinin çok bazik veya asidik olması kontaminasyonu, fazla üremiş kültürü, ölmüş kültürü, veya hatalı C02 ölçüm veya verimini işaret eder. Besiyerinde bulutsu görüntü kontaminasyonu veya fazla üremiş kültürü işaret eder. Süspanse bir kültürde topaklanmış hücreler ile yapışık kültürde soyulmuş hücreler bir problemi işaret eder. HÜCRELERİN GÖZLEMLENMESİ Flasktaki hücrelerinizi kabin içine almadan 40X objektif altında ters mikroskopta incelemeyi rutin haline getirin. Yapışık hücreler: yüzeyde düzenlice yerleşmiş olurlar. Her tip hücrenin kendine göre bir şekli vardır(yuvarlak, üçgenimsi, karemsi, uzamış). Süspanse hücreler: Küre şeklindedirler. Bazı hücreler flaskın yüzeyine hafifçe tutunmuş olabilir. 4
HÜCRELERİN ELDE EDİLİŞİ Primer hücre hatları veya kan hücreleri ile çalışan bir laboratuvarda çalışıyorsanız mutlaka Hepatit B aşısı yaptırmalısınız. HÜCRELERİN ELDE EDİLİŞİ Primer Hücreler Primer hücrelerin zor ve zahmetlidir. Bir hayvanın öldürülüp dissekte edildikten sonra hücrelerin izole edilip kültüre alınmasını gerektirir. Birçok hücre tipinin primer kültüründe hücre sayısı azdır ve hücrelerin ömrü kısadır. Ancak gerçek hücreye en yakın model primer hücrelerdir. Primer hücreleri kendiniz üretmeye kalkışmadan önce: Kendi labınızda veya bölümünüzde bu hücrelerle çalıştığını bildiğiniz bir meslektaşınızdan rica edebilirsiniz. Hücrelerin hazırlanmasına yardımcı olabilirsiniz. Bu hücrelerin hazırlanması çok zahmetli olduğu için talebiniz reddedilirse şaşırmayın. Başka bir labdan isteyebilirsiniz ancak bu genellikle ortak çalışma protokolünü beraberinde getireceği için böyle bir yola girmeden önce patronunuzla konuşun. 5
HÜCRELERİN ELDE EDİLİŞİ Primer Hücreler Primer hücreleri bir başka araştırıcı veya labdan alıyor olsanız da hücrelerin elde ediliş prosedürünü en az bir kez izleyin. Bir gün hücreleri kendiniz hazırlamanız gerektiğinde hazırlıklı olmuş olursunuz. Ayrıca verilen emeğe saygı gösterdiğinizi de ifade etmiş olursunuz. Hastane ve tıp fakülteleri bazı insan doku ve hücrelerini elde etmek için iyi bir kaynaktırlar. HÜCRELERİN ELDE EDİLİŞİ Devamlı Hücreler Eğer bir hücre hattı iyi ve hızlı bölünüyorsa hücrelerin eldesi kolaydır ancak bölünmesi problemli ise primer hücre hatlarında olduğu gibi zorluklarla karşılaşılır. Unutmayın ki devam hücre hatları sürekli kültür edilmeleri nedeni ile fenotipik kayma yaşarlar. Bu nedenle aynı hücre hattı iki farklı labda farklı karakteristikler gösteriyor olabilir. Labdaki diğer araştırmacılarla aynı hücre hattını kullanıyorsanız bir çalışma arkadaşınızdan bir tüp donmuş hücre isteyebilirsiniz. Donmuş hücreleri yeni split olmuş hücreye tercih edin zira pasaj sayısı daha az olacaktır. 6
HÜCRELERİN ELDE EDİLİŞİ Devamlı Hücreler Devamlı hücre hatlarını The European Collection of Cell Cultures (ECACC) veya American Type Culture Collection(ATCC) den satın alabilirsiniz. Bu kaynaklar insan ve hayvan hücrelerinin yanısıra mikroorganizma, virus, DNA probları sağlayan özel kuruluşlardır. Kültürlerin yaşar durumda ve kontaminasyonsuz olmaları garantilidir. Aksi durumda hücreler yenileri ile ücretsiz olarak değiştirilmektedir. Çalışacağınız hücreleri elde etme arayışında bu hücrelerle yapılmış en iyi yayınların materyel-metod kısımlarını inceleyin. Buradaki pasaj sayısı, besiyeri benzeri ayrıntılara dikkat edin. Dondurulmuş Hücrelerin Kültüre Edilmesi Ökaryotik hücreler serumlu besiyeri ve dondurucu ajan (DMSO) varlığındadondurulupsıvınitrojende(-196 o C)saklanır. Dondurulmuş hücreler kuru buzda transfer edilir. Dondurulmuş hücrelerin hızlıca çözülüp derhal kültüre edilmesi hücrelerin hayatiyetlerinin sağlanması için esastır 7
Rutin Beslenmeli: Taze besiyeri ile Split Edilmeli (bölünmeli): Kültür flaskı kapasitesi doldukça hücreler split edilmeli. Dondurulmalı: Hücreleri depolamak şarttır. Üretilen hücrelerin bir kısmı sıvı nitrojende dondurulmalıdır. Rutin 8
Besleme ve Pasaj Hücreler ne kadar hızlı büyüyorlarsa o kadar sık beslenip bölünmeleri gerekir. Bir hücre aldığınızda ilk öğrenmeniz gerekenler: Antibiyotik kullanılmış mı? Hangi antibiyotik kullanılmış? Hangi besiyeri tercih edilmiş? Hücrelerin seruma ihtiyacı var mı? Hücreleri ne kadar sıklıkla besleyip split etmem gerekecek? Antibiyotik Antibiyotik kullanımı birçok lab için standart uygulama olmakla beraber eğer layıkıyla aseptik teknikler uygulanıyorsa antibiyotiğe çok da ihtiyaç olmaz. Değerli veya kontaminasyona hassas hücrelerde tedbirli olup antibiyotiği ihmal etmemekte fayda vardır. Antibiyotikler toz halinde steril şişelerde gelir. Steril su ile sulandırılırlar. Filtre sterilizasyona gerek yoktur. 9
Kültür Kapları Flask veya petri kapları kullanılır. Tek kullanımlık, polistrenden mamuldur ve radyasyon ile sterilize edilmiştir. Yapışık hücreler için işlem görmüş plastik malzeme tercih edilmelidir(polistren yüzey amino grupları ile kaplanmış olabilir). Plate ler ise non-spesifik bağlanarak pozitif yüzey oluşturan bir protein ile(poly-d-lysine) kaplanmış olabilir. Kültür kapları laboratuvar şartlarında da işlem görebilir. Besiyeri Hazır olarak satın alınır. Raf ömrü dolmuş olan besiyerlerini hücre yıkamada kullanmak mümkündür. Besiyerleri birbirlerine benzer görüntü olarak. Genellikle ph indikatörü olarak hepsinde fenol kırmızısı bulunur. Alacağınız besiyerinin mikoplazma kontaminasyonuna karşı garantili olmasına dikkat edin. 10
FenolKırmızısı Limonsarısı<pH 6.5 Sarı ph6.5 Turuncu ph 7.0 Kırmızı ph 7.4 Pembe ph 7.6 Mor ph7.8 Birçok hücre ph 7.4 te optimum üreme gösterir. Sarımsı asidik besiyeri: Fazla üremiş kültürü Bakteri kontaminasyonunu Fazla CO2 i işaret ediyor olabilir. Morumsu bazik besiyeri: Ürememiş kültürü Küf kontaminasyonunu Az CO2 i işaret ediyor olabilir. Besiyeri Besiyeri Besiyeri kullanılmadan önce 37 o C ye ısıtılmalıdır. Su banyosunun içinde (yaklaşık 10 dak). Besiyerinin içindeki bazı bileşenler (antibiyotik) uzun süre sıcakta beklemeye dayanıklı değildir. 11
Serum Serum pahalıdır. Her zaman bölünüp dondurularak saklanmalıdır. Besiyerine kullanmadan önce eklenir. Erimiş parçalar tekrar dondurulmadan buzdolabında birkaç hafta saklanabilir. Bilinmesigerekenler: Serumun yüzdesi:%5-20 Serumun tipi: Standart olan dana serumudur. Fetal dana serumu da tercih eden hücreler mevcuttur. Isı ile inaktive edilmiş mi: Gerekiyorsa kendiniz donmuş serumu erittikten sonra 65 o C de 30 dak tutup parçalara ayırıp tekrar dondurarak prosedürü tamamlayabilirsiniz. Serumu nereden almalısınız: Üretimden üretime fark gösterebilen bir bileşendir. Ucuza kaçmamalısınız. Hücrelerin Ayrılması (split) Hücrelerin üreme hızına bağlıdır. Genellikle haftada iki kez yetecektir. Hücreleri ayırmak için çok beklemek(fazla üremiş kültür) Yeteri kadar ürememiş hücreleri ayırmak Taze besiyeri yerine eski besiyeri kullanarak hücreleri ayırmak sık yapılan hatalar arasındadır. Hücreleri split ederken flask/petri yüzeyinden ayırmak gerekir bunun için ekstraselüler matriksi degrade eden Tripsin ve bu bağlanmada esas teşkil eden Ca 2+ yı bloke eden EDTA kullanılmaktadır. 12
Hücrelerin Dondurulması Hücreleri dondurmadan önce ATCC kataloğundan kullandığınız hücrenin dondurulma protokolünü kontrol edin. Laboratuvarda uygulanan prosedürü arkadaşlarınızdan öğrenin. Olası modifikasyonları ATCC protokolü ile karşılaştırarak tespit edin. Eğer yeni bir hücre hattı ise hattı geliştiren lab ile irtibata geçin veya literatüre bakın. Hücreler kryotüplerde dondurulup sıvı nitrojen tanklarında saklanır. Saklama için kullanılan sıvı nitrojen tanklarının raklı sistemde olması gerekir. Tüpler bu tanklara kataloglanarak yerleştirilmelidir. Nitrojen tanklardaki sıvı nitrojen tankın özelliğine bağlı bir hızda buharlaşır. Periyodik olarak nitrojen seviyesinin kontrolü ve tamamlanması gerekmektedir. Sıvı nitrojen tankları ile çalışılırken mutlaka kryoeldivenler giyilmeli ve koruyucu gözlük takılmalıdır. Sıvı nitrojen buharı solunmamalıdır. Elinizle oluşan buharı dağıtmamaya gayret edin. Kontaminasyon Kontaminasyon bakteri, küf, mantar, mikoplazma veya başka hücre kültürlerinden kaynaklı olabilir. Makroskopikolarak Bulutsu görünüm Besiyerinin renk değişimi Koku: Flask kapağı açılıp koklanmaz şüphesiz ancak ilerlemiş kontaminasyon inkübatörün kapısı açılır açılmaz kendisini hissettirecektir. Mikroskopikolarak Diğer organizmaların varlığı bakteri veya küf gibi kendisini hemen gösterecektir. Hasar görmüş hücreler mikroskop altında kolayca gözlenir. 13
Mikoplazma Kontaminasyonu Mikoplazmalar 0.3um büyüklüğünde çok küçük organizmalardır. Çoğunlukla ters mikroskopta gözlenmezler. Hücre duvarları yoktur ve bu nedenle antibiyotikten etkilenmezler. Özel boyama yolları ve tekniklerle varlıkları tespit edilebilir. Enfeksiyon ağır ise hücre hasarı da enfeksiyonun varlığını gösterecektir. Mikoplazma kontaminasyonunu engellemek için kullanılan besiyeri ve serumların mikoplazmasız olması gerekir. Garantili ürün kullanın. Başka bir araştırmacıdan hücre aldığınızda mikoplazma testi yapılıp yapılmadığını sorun, en iyisi siz kendiniz bu testi yapın. Mikoplazma Kontaminasyonu Mikoplazma kontaminasyonun varlığı bir hücre yüzey proteinine karşı onca uğraşıya rağmen neden antikor üretilememiş olmasının nedeni olabilir. Mikoplazma testi için Floresan boyama PCR Eğer kontaminasyon varsa İlgili hücreyi atın Mikoplazma hücrenin biyolojisini bozar. Deneylerinizi ve sonuçlarınızı anlamsız kılar. Bir karantina hücre kültürü odanızın olması ve test edilmemiş hücreleri yalnızca burada açmanız mikoplazma kontaminasyonunun hücrelerinize yayılmasını engelleyecektir. 14
Hücreden hücreye kontaminasyon Hücrelerinizi güvenilir kaynaktan alın. Aynı anda birden fazla hücre tipi ile çalışmayın. Asla aynı pipeti farklı hücreler için kullanmayın. Hücreye kullandığınız bir pipetle asla besiyeri şişesine girmeyin. CO2 İnkübatörleri İnkübatör içindeki tepsiyi steril distile su ile doldurmayı unutmayın ve her hafta bu suyu tazeleyin. Her hafta rafları%70 EtOH ile silip her ay otoklavlayın. İnkübatör kapısını uzun süre açık bırakmayın. CO2 okumasının doğruluğunu zaman zaman kontrol ettirin. Isı takibi için ayrıca bir termometreyi inkübatör içinde bulundurun. 15