VALİDASYON Prof. Dr. A. Olcay Sağırlı Yöntemin Geçerliliği (Validasyon) Geçerlilik, (Validasyon) cihazın, metodun veya ölçüm prosedürünün belirlenen amaçlara uygunluğunun objektif olarak test edilerek yazılı delillerle kanıtlanmasıdır. ALETLİ ANALİZLERDE YAPILMASI GEREKLİ VALİDASYON TÜRLERİ 1. Cihazın kontrolü ve validasyonu, (tüm donanım ve yazılımlar için geçerlidir) 2. Geliştirilen yöntemin geçerliliğini kanıtlamak için veya geliştirilmiş olan bir yöntemdeki parametre değişikliklerinden sonra yapılan validasyon 3. Sistem Uygunluk Testleri (SUT). 1
Cihaz validasyonu cihaz sağlayıcı tarafından yapılmak zorundadır. İyi laboratuar uygulamaları (GLP), İyi imalat teknikleri (GMP) ve/veya ISO 9000 vb. standartlara göre valide edilmiş bir ortamda geliştirmek ve üretmekle sorumludurlar. Analitik Metot validasyonu, bir metodun performansını belirlemek için yapılan bir takım değişkenlere göre test ve ölçme işlemleridir. Çeşitli alanlarda verilen pek çok karar, yapılan ölçümlerin sonucuna dayanılarak verilir. Doğru karar verebilmek için analitik ölçüm sonucunun doğru ve tekrarlanabilir olması gerekir. 2
Metot validasyonu hangi hallerde yapılır: Standart bir metot bir laboratuvarda ilk defa uygulanacağı zaman Bir analiz için yeni metot geliştirildiği zaman Kullanılan metotta değişiklik yapıldığında Geçerliliği belirlenmiş bir metot başka bir laboratuvarda kullanılacağı zaman veya farklı bir kişi veya farklı bir cihazla kullanılacağı zaman Metodun performansında zamanla bir değişme olduğu anlaşıldığında metot geçerliliği (validasyonu) yapılır. Uluslar arası kabul edilen çeşitli geçerlilik (validasyon) kriterleri mevcuttur. ISO/IEC, ICH, US EPA, US FDA, USP, cgmp gibi kurumlar tarafından belirlenmiş kriterler kullanılmaktadır. USP ve ICH validasyon parametreleri USP Bölüm 1225>, ICH Q2A, Validasyon ve Analitik yöntemlerle ilgili belge (Mart 1995) ve Q2B Analitik yöntemlerde validasyon (Mayıs 1997) EMEA, The European Agency for the Evaluotion of Medicinal Products, 1998 USP ye göre; Seçicilik, Doğrusallık ve aralık, Doğruluk, Kesinlik, Gözlenebilme sınırı, Tayin alt sınırı, Sağlamlık ve Kararlılık ICH e göre; Seçicilik, Doğrusallık, Aralık, Doğruluk, Kesinlik, Gözlenebilme sınırı, Tayin alt sınırı, Stabilite 3
Yöntemin Kalibrasyonu: Gravimetri ve kulometri hariç bütün Analitik yöntemler için kalibrasyon gerekir. Yöntemin kalibrasyonu ölçülen analitik sinyal ile analit derişimi arasındaki ilişkinin belirlenmesidir. En çok kullanılan üç yöntem a) Kalibrasyon grafiği yöntemi b) Standart ekleme yöntemi c) İç standart ekleme yöntemi Geçerlilik (Validasyon) Parametreleri: Performans karakteristikleri için öncelikle aşağıdaki temel geçerlilik (validasyon) parametrelerinin belirlenmesi gerekir. Uygulanamayan parametreler varsa uygulanamaz ifadesi kullanılır. Yönteme spesifik farklı parametrelerin de değerlendirilmesi gerekiyorsa onlar da eklenir. Doğruluk (Accuracy) Kesinlik (Precision) Özgünlük (Specifity) Doğrusallık (Linearity) Gözlenebilme sınırı (LOD; Limit of Detection) Tayin sınırı (LOQ; Limit of Quantification) Çalışma Aralığı (Range) Tutarlılık (Ruggedness) Sağlamlık ya da Kararlılık (Robustness) Stabilite 4
Validasyon Parametreleri: Stabilite Özgünlük (Specifity) veya Seçicilik (Selectivity ) Doğrusallk (Linearity) Sağlamlık ya da Kararlılık (Robustness) Çalışma Aralığı (Range) Tutarlılık (Ruggednes) Doğruluk (Accuracy) ve Geri kazanım (Recovery) Tayin sınırı (LOQ; Limit of Quantification ) Gözlenebilme sınırı (LOD; Limit of Detection) Kesinlik (Precision) ya da Tekrarlanabilirlik (Repeatibility) ve Uyarlık (Reproducibility) Özgünlük (Specificity): Beklenen fiziksel/kimyasal girişimler/engelleyiciler (interferences) varlığında analitik yöntemin sadece amaçlanan bileşen veya bileşenleri doğru şekilde ölçülebilme yeteneğidir. Girişime neden olabilecek ve matrikste bulunan maddeler standart üzerine eklenerek girişime neden olup olmadığı kontrol edilir. Referans madde geçerliliği belirlenen metotla analiz edilerek bulunan sonuçlar sertifika değeri ile karşılaştırılır. Girişime neden olabilecek ve matrikste bulunan maddeler elimizde yoksa Diyod Sıralı Dedektör veya Kütle Dedektörü gibi özel donanımlarla girişimler incelenebilir. 5
Kromatografik Analizlerde Özgünlüğün Saptanması: 1) Tayini yapılan bileşik ile girişim yapması olasılığı bulunan maddelerin Ayırım gücü (Rs) değerlerine bakılır. Bu değer (Rs) 2.0 olmalıdır. 2) Spesifik bir dedektör seçilebilir. İncelenecek bileşiğe cevap verme yeteneğine sahip olan dedektörler Elektrokimyasal veya Radyoaktivite dedektörleridir. Bu dedektörler belirli maddelere karşı duyarlıdır. 3) LC-MS gibi duyarlı ve hassas tekniklerle, DAD dedektörü ile değişik dalga boyunda deney anında taramalar yaparak herhangi ilave bir pik olup olmadığı kontrol edilir. Doğruluk (Accuracy) : Ölçülen değerin doğru ya da doğru kabul edilen değere yakınlığını gösterir. Mutlak hata ya da bağıl hata ile verilir. Uluslar arası bağımsız laboratuvarlar tarafından tayin edilmiş değerleri doğru değer olarak kabul edilen Standart Referans Maddelerin tayininden elde dilen sonuç ile aynı maddenin kullanılan yöntemle elde edilen sonuçları karşılaştırılır. Bir yöntem için doğruluk, geri kazanım çalışmaları ile belirlenir: a) Referans standart bir yöntemle karşılaştırmak, b) Boş matriks ortamına analizi yapılan maddeyi ilave etmek, c) Analizi yapılan maddeye bulunduğu ortamda standart ekleme yöntemi ile saf madde ilavesidir. % Gerikazanım = (Cu / Cs) x 100 Cu= Çalışma sonucunda bulunan konsantrasyon Cs= Bilinen ya da standart çalışma sonucunda elde edilen konsantrasyon 6
a) Referans Standart İle Karşılaştırmak: Üç farklı konsantrayonda hazırlanan çözeltilerden üçer ölçüm alınır, hesaplanan konsantrasyon değerlerinden % geri kazanım değerleri bulunur, sonra bu değerlerin ortalamaları alınır. Sonuçlar referans olarak seçilen başka bir yöntemden elde edilen sonuçlarla istatistiksel olarak karşılaştırılır (Student t, Fisher testleri gibi). Ortalamalar yönünden Student t testi Varyans yönünden Fisher testi b) Boş matriks ortamına analizi yapılan maddeyi ilave etmek: Farmasötik dozaj formları gibi matriks etkisi olan numunelerle çalışıldığı zaman kullanılan bir yöntemdir. Analizi yapılacak madde boş matrikse değişik derişimlerde eklenir. Bu matriks ilaç dozaj formları için (etken maddesiz) yardımcı maddelerden oluşan karışımdır (Plasebo). Genellikle ilaç etken maddesinin % 50, 75, 100, 125 ve 150 oranında madde ilavesi yapılır ve her seviyede en az üçer ölçüm yapılır. Sonuçlar % geri kazanım olarak ifade edilir. 7
c) Standart ekleme yöntemi ile saf madde ilavesi: Analizi yapılacak maddenin bilinen ve değişik miktarları matriks içerisinde yer alan ve miktarı aynı maddenin üzerine ilave edilir. Orijinal numunedeki etken madde derişimi deney verilerinden matematiksel olarak hesaplanır. Genellikle % 25, 50, 100 ilave etmek iyi bir yaklaşımdır. Madde ilave edilmiş ve ilave edilmemiş bütün numuneler en az üçer defa analiz edilir. Sonuçlar ilave edilen ve ölçülen madde miktarları verilerek ifade edilir. Bu yöntem, matriksin numune sinyaline girişim yaptığı durumlarda, katkı maddelerinin ve yardımcı maddelerin bilinmediği durumlarda tercih edilir. 8
Kesinlik Ölçüm sonuçlarının birbirlerine yakınlığını (tekrarlanabilirliği) gösterir. Standart sapma, Bağıl standart sapma, Varyans veya varyasyon katsayısı ile verilir. Kesinlik 3 gruba ayrılarak incelenmektedir a) Tekrarlanabilirlik (Gün içi tekrarlanabilirlik), b) Orta-Kesinlik (Günler arası tekrarlanabilirlik) c) Tekrar Üretilebilirlik (Reproducibility) 9
a) Tekrarlanabilirlik: Aynı gün, aynı laboratuar, aynı araştırmacı, aynı cihaz ile 5-6 paralel tayin 2-3 farklı derişimle yapılır. Sonuçların RSD değerleri kıyaslanır. *Enjeksiyonun tekrarlanabilirliği, Analizi yapılacak maddenin çalışma ortamındaki çözeltisi hazırlanır ve bu çözeltiden en az 10 enjeksiyon yapılır. Sonuçta, kesinlik elde edilen değerlerin % RSD si verilerek ifade edilir ve % RSD 1.0 olmalıdır. b) Orta-Kesinlik: Farklı günlerde, aynı laboratuar, aynı araştırmacı, aynı cihaz ile 5-6 paralel tayin 2-3 farklı derişimle yapılır. Sonuçların RSD değerleri kıyaslanır. c) Tekrar Üretilebilirlik (Reproducibility): Çok ortaklı çalışmalarda laboratuarlar arası kesinliğin tayini için istenen bir parametredir. 10
11
Gözlenebilme sınırı (LOD; Limit of Detection): Analizi yapılan örneğin belirdiği fakat kantitatif sınırlar içerisine girmeyen en düşük derişimdir. Doğrudan yapılan deneylerden veya hesapla bulunabilir. Doğrudan yapılan deneylerden gözlenerek hesaplamada HPLC de Sinyal/Gürültü oranı 3 olarak kullanılır. Hesaplama yolu ile Teşhis Sınırı saptanmasında; LOD= 3.3 x SD/ m eşitliği kullanılır. SD= Boş çözeltinin; çok az derişimdeki madde çözeltisinin veya kesişim değerinin standart sapması, m= Kullanılan kalibrasyon eşitliğinin eğim değeridir. Tayin sınırı (LOQ; Limit of Quantification): Analizi yapılan örneğin kabul edilebilir düzeyde kesin ve doğru olarak miktarının tayin edilebileceği doğrusallık sınırları içerisine girmeyen veya doğrusallığın en alt derişimini oluşturan düzeyidir. Doğrudan yapılan deneylerden veya hesapla bulunabilir. Doğrudan yapılan deneylerden gözlenerek LOQ tespiti için Sinyal/Gürültü oranı 10 olarak alınır. Hesaplama yolu ile TAS saptanmasında LOQ= 10 x SD/ m eşitliği kullanılır. SD ve m değerleri LOD eşitliği ile aynıdır. 12
Doğrusallık (Linearity): Analit derişime karşı dedektör cevabın doğru orantılı olarak artması ve çizilen grafikte noktaların doğru üzerinde veya yakın olarak yer almasıdır. Eğim, kesişim ve korrelasyon katsayısı (R 2 ) doğrusallığı veren parametrelerdir. R 2 = 0.999 ve üzerinde olmalı ve değerler çizilen doğrunun üzerinde yer almalıdır. 1,2 1 y = 0,4678x + 0,0022 R 2 = 0,9999 0,8 Sinyal 0,6 0,4 0,2 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Derişim 13
Çalışma Aralığı (Range): Kalibrasyon eğrisinde tayin edilebilen en düşük derişimden, doğrusallıktan sapma gösterdiği derişime kadar olan derişim aralığını kapsar. Hedef miktarın % 50, 75, 100, 125 ve 150 olacak şekilde aralık düzenlenebilir. Sağlamlık ya da Kararlılık (Robustness): Yöntemin, parametrelerdeki ufak değişimlerden etkilenmeden kalabilme kapasitesidir. Bu parametreler organik çözücü yüzdesi, ph, iyonik güç, sıcaklık gibi etkenlerdir. Kararlılık yöntem geliştirilirken değerlendirilmesi gereken bir aşamadır. Örneğin ph 3 de ± 0.1 kadar bir değişim gösteren bir madde ph 4.5 da değişmeden aynı sonucu veriyorsa ph 4.5 ortam olarak seçilmelidir. 14
Tutarlılık (Ruggedness): Yöntemin gerçek kullanım koşulları altında tekrar edilebilirliğinin saptanmasıdır. Bunun için çalışmanın: a) Aynı laboratuvarda farklı analizciler tarafından, b) Aynı laboratuvarda farklı cihazlar tarafından, c) Farklı laboratuvarlarda gerçekleştirilmesi, d) Reaktif ve çözücülerin markalarının değiştirilmesi, e) Aynı marka ve modele sahip yeni bir kolon kullanarak tekrarlanması gereklidir. Tutarlılık; Orta kesinlikle de benzeşmektedir. % RSD ile ifade edilir. ICH (Uluslar arası uyum konferansı) bunu yapılması kesin olarak zorunlu işlemler grubuna dahil etmemiştir. 15
Stabilite: Zorunlu bir validasyon parametresi olmamakla beraber yapılması tavsiye edilir. Tekrar edilebilir ve güvenilir sonuçlar elde edebilmek için numunelerin, standart maddelerin ve kullanılan çözücülerin uygun bir süre (örneğin 1 gün, 1 hafta, 1 ay veya ne kadar süreye ihtiyaç duyuluyorsa o kadar süre) stabilitesini koruması gereklidir. 16