helena www.helena-biosciences.com BioSciences Europe Kullanım Talimatları SAS-3 IMMUNOFIX Katalog No: 300300
KULLANIM AMACI SAS-3 IFE kit,agaroz jel elektroforezi ile monoklonal gammopatilerin ayrılmasını ve tanımlanmasını amaçlar. İmmünofiksasyon elektroforezi (IFE) iki adımlı bir prosedürdür, ilk adımında agoroz elektroforezin yüksek kararlılığını, ikinci adımda da immünopresipitasyonu kullanır. IFE nin kullanıldığı klinik laboratuarda en büyük istek, monoklonal gammopatilerin tespitidir. Bir monoklonal gammopati, tek sınıf ve tip bir immünoglobulinin yükseltilmiş seviyelerini üreten plazma hücrelerinin tek bir kolonu olan bir hastalık durumudur. Böyle immünoglobulinler,paraproteinler veya M-proteinleri gibi monoklonal proteinlerin yerine geçer. Onların varlığı, tehlikesiz bir tabiatta veya şüpheli bir anlamda olabilir. Bazı durumlarda, çoklu myeloma veya Waldenström s makroglubinoma gibi bir tehlikeyi belirtebilir. Farklılaştırma,,kronik karaciğer hastalığı, kollajen hastalıkları,römatoid artirid ve kronik infeksiyon gibi klinik hastalıklara bağlı ikincil hastalık durumu olan poliklonal gammopatiler gibi poliklonal ve monoklonal gammopatiler arasında yapılmalıdır. Üriner proteinler,böbrek boyunca filtre edilen plazma proteinlerinden öncelikli olarak türetilirler. İdrarda anormal plazma proteinlerinin görülmesi renal fonksiyonun değerlendirilmesinde büyük öneme sahiptir. Uygun proteinuria çalışması,salgılanan proteinlerin miktarı ve tipinin kalitatif ve kantitatif keşfini kapsamalıdır.ürin proteinlerinin elektroforetik ayrılmasının kombinasyonu,özgül protein tiplerinin tanımlandırılması için çiftlendirilmesi,proteinuria,glomeruların çeşitli tiplerinin farklılaştırılmasını immünopresipitasyon ile sağlar. Alfonso,ilk kez 1964 yılında literatürde immünofiksasyonu tanımladı.alper ve Johnson,1969 yılında çok daha pratik bir prosedür ile bu tekniği kullanan çok sayıda çalışma yayınladı.immünofiksasyon,1976 dan beri immünoglobulinlerin araştırılması için bir prosedür olarak kullanıldı.sas-3 IFE kiti,serum proteinlerini,bir agaroz jelde yüklerine göre ayırır. Daha sonra proteinler, kalitatif yorumlanma için immünopresipitasyonun görünürlüğünü sağlamak için monospesifik antisera ile inkübe edilir, yıkanır ve boyanır. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kağıdına başvurun. BİLEŞENLER 1 - SAS-3 IFE Jel Koruyucu olarak sodyum azid ve thimersal ile bir Tris/Barbital bufferı agaroz içerir. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır.
2 - Konsantre Mor Asit Boya Konsantre mor asit boya içerir. Şişe içeriği 700ml saf su ile dilüe edilir. Kullanım öncesi karıştırılır ve filtre edilir. İyi kapatılmış bir şişede saklanır. 3 - Konsantre Boya Arındırıcı Solüsyon Şişe içeriği Destain A olan solüsyon 2 litre saf su ile dilüe edilir. Sonra, şişe içeriği Destain B olan eklenir ve daha sonra 3 litre saf su yavaşça eklenir. 4 Yıkama Katkı Solüsyonu Konsantre Yıkama Katkı Solüsyonu içerir. 5 litre saline solüsyon ile şişe içeriği dilüe edilir. 5 Numune Dilüent Koruyucu olarak sodyum azid ve bromofenol mavisi ile Tris/Barbital bufferı içerir. Dilüent paketinde kullanım için hazırdır. 6 SAS-3 IFE Anti Sera Kit SP protein fiksatif (asetik asid ve sülfosalisik asid içerir) ve insan immünoglobulinlerine karşı IgG,IgA,IgM, Kappa hafif Zincir ve Lambda hafif Zincir antiserum içerir.tüm antiserumlar koruyucu olarak sodyum azid içerir. Antiserum paketinde kullanım için hazırdır. 7 Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanım için talimatlar ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda C,D kurutma kağıtları ve kurutma tarağı içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1 - SAS-3 IFE Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulması ;1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya bakteriyal yada fungal kaynaklı agarozun kontaminasyonunu belirtir. 2 - Mor Asit Boya Konsantre boya 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solusyonu 15-30 derecede 6 ay stabildir. Boya kapasitesinin azalmasını önlemek için derhal kullanılan boyanın çıkarılması tavsiye edilir. Zayıf boyama performansı, boya solüsyonunun bozulduğunu belirtebilir. 3 - Boya Arındırıcı Solusyon Konsantre boya arındırıcı solusyon 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boyadan arındırıcı solusyon 15-30 derecede 6 ay stabildir.
4 Yıkama Solüsyonu Konsantre yıkama solusyonu 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe yıkama solüsyonu 15-30 derecede 6 ay stabildir. Bulanıklık bozulmayı belirtebilir. 5 Numune Dilüent Numune dilüenti 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Bulanıklık bozulmayı belirtebilir. 6 SAS-3 IFE Antiserum Kiti Antiserum kiti 2-6 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı belirtebilir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Katalog No.310200 Numune Aplikatör Ucu (1 x 10) Katalog No.310300 Numune Aplikatör Ucu (5 x 10) Katalog No.210100 Tek kullanımlık numune kapları (100) Katalog No.3100 REP Prep Saline solüsyonu (0.85% NaCl) İzleyen öğeler IFE standart serum için gereksin duyulmaz fakat ileri araştırmalar ve ürin IFE araştırmaları için gereksinim duyulabilir: Katalog No.320100 İnsan Ürin Total Proteinine karşı Antiserum (5ml) Katalog No.320200 İnsan Ürin Mikro proteinlerine karşı Antiserum (5ml) Katalog No.320300 İnsan Ürin Mikro proteinlerine karşı Antiserum (5ml) Katalog No. 320400 İnsan GAM proteinlerine karşı Antiserum (5ml) Katalog No. 320700 İnsan serbest&bağlı Kappa hafif zincir (5ml) Katalog No. 320800 İnsan serbest&bağlı Lambda hafif zincir (5ml) Katalog No. 320500 İnsan serbest Kappa hafif zincirine karşı Antiserum(5ml) Katalog No. 320600 İnsan serbest Lambda hafif zincirine karşı Antiserum(5ml) Katalog No. 320900 İnsan Ürin Pentavalentin/Albumin karşı Antiserum(5ml) Katalog No. 321000 İnsan Ürin Pentavalentin karşı Antiserum (5ml) Katalog No. 9249 İnsan IgD ye karşı Antiserum Katalog No. 9250 İnsan IgE ye karşı Antiserum Katalog No. 9400 IFE Kontrol Kit NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune taze toplanan serumdur. Numuneler 15-30 derecede 4 güne kadar,2-6 derecede 2 haftaya kadar veya 20 derecede 6 aya kadar stabildir. Ürin numuneleri saf olmalıdır. Serum numuneleri numune dilüenti kullanılarak izleyen tabloya göre dilüe edilmelidir:
Monoklonal SP lane G,A,M,K,λ konsantrasyon 25-50g/L 1+2 1+19 10-25g/L 1+2 1+9 3-10g/L 1+2 1+4 <3g/L 1+2 saf ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. Cihaz aşağıda bulunan parametreler ile programlanır: Adım Zaman(dk:sn) Sıcaklık(derece) Voltaj Diğer Elektroforezler Hız 1 Numune Yükleme 00:30 21 Hız 1* Numune Uygulama 00:30 21 Elektroforez 06:30 21 650 Antisera uygulama 10:00 21 Tarakları yerleştirme 02:00 21 Kurutma D 05:00 40 Kurutma 08:00 54 * SPIFE 3000 ve SAS-3 için yerleştirme 2 kullanılır NOT 1: Serum immünofiksasyonu için,1 numune aplikasyonuna gereksinim duyulur. Ürin immünofiksasyonu için 10 numune aplikasyonuna gereksinim duyulur. NOT 2: Ürin ve serum numuneleri bir jel üzerinde aynı anda çalıştırılmalıdır. Ancak, her bir sıra ayrı ayrı sadece tek bir tür içermelidir (sıra 2 ve 8 =ürin, sıra 14= serum). Eğer serum ve idrar kombinasyonu aynı jel üzerinde kullanılacaksa, idrar örnekleri için ilk 9 yükleme/uygulaması boyunca SAS-3 üzerinde giden uçların olduğundan emin olun. Final (10th ) yükleme/uygulama boyunca yalnızca serum numuneleri için aplikatör ucunu ekleyin. Adım Zaman(mm:ss) Sıcaklık(derece) Diğer Kurutma Yıkama 00:03 Dolaşım AÇIK Yıkama 10:00 Dolaşım AÇIK Boyama 04:00 Dolaşım AÇIK Boya arındırma 02:00 Dolaşım AÇIK Boya arındırma 02:00 Dolaşım AÇIK Kurutma 12:00 63 2. Aplikatör ucunun doğru sayısını cihaz üzerinde pozisyonunda bağlayarak koyun:
Numune sayısı Aplikatör Pozisyonu SPEIFE Kombo SPEIFE 2000/3000 ve SAS-3 9 4,11,18 2,8,14 6 4,11 2,8 3 4 2 3. i) SPIFE Kombo Kullanıcıları: Numune bazının uygun kuyusu içine 17μl numune pipetleyin. Buharlaşmadan numuneleri koruyun. ii) SPIFE 2000 / 3000 / SAS-3 Kullanıcıları: Tek kullanımlık uygun numune kaplarına 35μl numune pipetleyin. Buharlaşmadan numuneleri koruyun. 4. Jeli paketinden çıkarın ve kaplamasını atın. 5. 2ml REP Prep i bölmenin sol tarafına boşaltın ve dikkatlice bölme içine jeli koyun, bölme içinde iğneler ile jel bağlarındaki delikleri hizalayın ve jelin altında kabarcık oluşturmamaya dikkat edin. Elektrot kollarına elektrotlar eklenir böylece jel blokları ile temasa ederler. 6. Jelin yüzeyi kurutma kağıdı C ile kurutulur, kurutma kağıdı alınır. 7. IFE test programını seçin ve uyarıları izleyin, numuneleri uygulayın ve elektroforezi yapın. 8. Elektroforezi takiben, elektrotları alın ve Gel Block Remover kullanarak her iki jelin kurutucusunu alın. Jel yüzeyinde antiserum aplikasyon tablası pozisyonlandırılır. NOT: Numunelerin uygulandığı jel üzerinde yazılı kutu merkezine doğru antiserum kanalları ayarlanmalıdır. 9. Protein fiksatiften veya total antiserumdan 2 damla (yada 60μL) SP lane nin deliğine ve 2 damla uygun antiserumdan immünoglobulin hattının deliğine damlatılır. Fiksatif ve antiserumun tamamen kanalları doldurduğundan emin olunur. 10. Jeli inkübe edin. 11. İnkübasyonu takiben, antiserum tablasının deliklerine bir kurutma tarağı yerleştirilir. Fazla antiserumu aspirasyonu için 2dk izin verilir, tarak ve tabla jel yüzeyinden geri alınır. 12. Jelin yüzeyine bir kurutucu D yerleştirilir ve kurutucu yüzeyi tutturmak için antiserum tablası yerleştirilir. Jel kurutulur. 13. Kurutucu D alın ve jeli kurutun. NOT: Kullanımdan sonra hemen antiserum tablası hafif, biyosidal deterjan ile temizlenir. Eğer mümkün ise, tüp fırçası ile dip kısımları da temizlenir. Antiserumun tablada kurumasına izin vermeyin. Antiserum uygulama adımı boyunca tablanın yüzeyindeki antiserumun birikmesi hava kabarcığı olmasına neden olacaktır. Deliklerde su kalması, sonraki kullanım için antiserum uygulamasını engelleyecektir. Hava sirkülasyonunu arttırmak için tabla baş-aşağı saklanır. 14. Boyama kabı jel tutucusuna jel tutturulur. 15. Boyama ünitesinde IFE test programı seçilir ve izleyen uyarılar, Yıkama, Boya, ve jel kurutma. 16. Boyama döngüsünün sonunda, boyama alanından jeli alın. Jel şimdi incelenmek için hazırdır.
SONUÇLARIN YORUMLANMASI Monoklonal proteinlerin çoğunluğu protein modeli alanında gama bölgesine göç eder fakat onların anormal doğasına göre protein elektroforezinde globulin bölgesinde herhangi bir yere göç edebilirler. İmmünofiksasyon modelinde monoklonal protein bant, serum protein modelinde anormal bant gibi aynı şekil ve pozisyonda tutulur. Reaksiyon verdiği antiserum tipi ile anormal protein tanımlandırılır. Mevcut anormal proteinin düşük konsantrasyonları olduğu zaman, anormal bant normal poliklonal immünoglobulin içinde bir bant gibi görülebilir. Ayrıca bir bant, bir büyük poliklonal immünoglobulin mevcut olduğunda bir poliklonal içinde görülebilir. İstek üzerine Helena BioSciences den, Monoklonal Gammopatilerin tanımlandırılması için İmmünofiksasyon yayınına ulaşılabilir. Ürin İmmünofiksasyon: Proteinuria nın tipi Jelde görülen bantlar Mevcut proteinler Normal ürin Küçük albümin bant albümin Glomerular Albümin,alfa1,Beta, gama Albümin,alfa1,antitripsin, transferin, Gama globulinler Tubüler alfa1,alfa2, beta Retinol bağlayıcı protein,beta2-mikroglobulin alfa 2-mikroglobulin Taşan gama veya çeşitli İmmünoglobulin,Serbest ışık zinciri SINIRLAMALAR 1. Antijen fazlalığı Presipitasyon alanında antijen fazlalığı, eğer antikor miktarı az veya antijen/antikor eşitsizliği varsa meydana gelecektir. IFE de antijen fazlalığı genellikle hasta numunesindeki immünoglobulin fazlalığına dayanır. Antijen fazlalığı prozoning ile karakterize edilir. Numunenin yüksek dilüsyonu immünoglobulin konsantrasyonunu optimize etmek için kullanılmalıdır. 2. Tüm immünoglobulin hatlarında özgül olmayan çökelti Genellikle tamamlanan IFE pletleri, karşı pletin her örneğinde aynı pozisyonda bir presipitet bant sergiler. Bu sonuç aşağıdaki sebeplerden olabilir: a)igm monoklonal immünoglobulinler IgM monoklonal proteinleri jel matriksine yapışabilir. Jelin hatlarının tüm 5 antiserumunda bir band görülecektir. Tanımlandırılacak immünoglobulin tipi için, ağır zincir ve hafif zincir için özgün antiserum ile reaksiyona girebilir, bandın boyanma yoğunluğunda ve hacminde bir artış olmasını sağlar. Numunenin ilave dilüsyonu teşhisi kolaylaştıracaktır.
b)rf nin yüksek titreleri veya immün kompleksler Yüksek RF titreli numuneler veya diğer immün kompleksler, numune aplikasyon noktasında bir prepiteyt band gösterebilir. DTT ile veya beta-2-merkaptoetanol bu özgül olmayan elimine edici reaksiyon numune indirgenmesini sağlar ( 0.85% saline solüsyon içinde 1% (w/v) DTT in 10μL ile 190μL dilüe serum karıştırılır veya su içinde 1:10 oranında dilüsyon edilmiş β-2-merkaptoetanol ın 10μL ile 100μL serumu karıştırın. Not: β-2-merkaptoetanol kullanıyorken çeker ocakta çalışın). c)fibrinojen Fibrinojen, eğer numunede mevcut ise immünofiksasyon modelinin tüm hatlarında bir ayrık band gösterecektir. Plazmada bulunan fibrinojen bazen antikoagülant tedavisinde hastaların serumunda bulunabilir. 3.Kappa veya Lambda hafif zincir antiserumu ile reaksiyon fakat IgG,IgA veya IgM ağır zincir antiserumu ile reaksiyonsuz Bu örneği gösteren numuneler ya da bir serbest ışık zinciri monoklonal gammopati veya bir IgD yada IgE monoklonal proteini olanlardır. Bu durumda IFE tekrarlanmalıdır. IgD veya IgE antiserumları ile bir reaksiyon sonucu başarısızlık serbest hafif zincir hastalığını belirtebilir. 4.IFE antiserumu ile reaksiyon göstermeyen gama bölgesindeki bant C reaktif protein (CRP),hızlı cevap ile hastada tespit edilebilir. CRP,serum protein örneğinin katodik sonuna yakın bir bant olarak görülür.crp nin destekleyici kanıtları,yükseltilmiş alfa 1,anttripsin ve haptoglobulindir. CRP bantlı hastalar, muhtemelen CRP için test edildiği zaman yüksek seviyeye sahip olacaktır. Numune aplikasyon noktasına yakın bir bant, dondurulmuş numunelerde çökelti protein veya serumda şilomikronlar nedeniyle görülebilir. 5.Kappa ve Lambda antiserumları ile reaksiyonsuzluk Genellikle bir numune ağır zincir antiserumu ile reaksiyon verir fakat belli hafif zincir reaksiyonu vermez. Bu durumda, izleyenler ihtimal dışı bırakılır; a)ağır zincir hastalığı, b)hafif zincirlerinin çok yüksek konsantrasyonlarını izleyen antijen fazlalığı,c)hafif zincirinin düşük konsantrasyonları,d)antiserum ile reaksiyon vermeyen atipik hafif zincir molekülü,e)saklı ışık zincir determinantları ile hafif zincirleri. Kesin sonuçlar almak için, test çalışması içermelidir; a) antikor/antijen eşitliliği optimizasyonu için çok yüksek veya düşük numune dilüsyonu,b) atipik immünoglobulinlerin tanımlandırılmasında yardım için bir üreticiden daha çok antiserum,c) açıkta kalan hafif zincirleri için beta-2- merkaptoethanol ile numune muamelesi. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Numune serileri test edildi ve diğer ticari test kiti ile karşılaştırıldı-her iki kit de eşit sonuçlar gösterdi. KALİTE KONTROL
Helena Biosciences IFE Kontrol Kiti (Katalog. No 9400) tüm antiserum hatlarında monoklonal bantlama varlığını doğrulamak için kullanılabilir. Helena Biosciences Kemtrol Anormal Serum Kontrol (Katalog. No 7025) 100 de 1 oranında dilüe edildi ve idrar IFE için pozitif bir kontrol olarak kullanıldı. BİBLİYOGRAFYA 1. Fauchier, P. and Catalan, F. Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis Alfred Fournier Institute, Paris, France, 1988. 2. Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. Finding Clues to Disease in Urine Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : 69-75. 3. Umbreit, A. and Wiedemann, G. Determination of Urinary Protein Fractions. A Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172. 4. Wiedemann, G. and Umbreit, A. Determination of Urinary Protein Fractions by Different Electrophoretic Methods, Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262. 5. Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and Lockhart, S. A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : 371-374. 6. Alfonso, E., Quantitation Immunoelectrophoresis of Serum Proteins, Clin. Chim. Acta., 1964; 10 : 114-122. 7. Alper, C.A and Johnson, A.M., Immunofixation Electrophoresis: A Technique for the Study of Protein Polymorphism, Vox. Sang., 1969; 17 : 445-452. 8. Alper, C.A., Genetic Polymorphism of Complement Components as a Probe of Structure and Function, Progress in Immunology. First International Congress of Immunology. 1971 : 609-624, Academic Press, New York. 9. Johnson, A.M., Genetic Typing of Alpha(1)-Antitrypsin in Immunofixation Electrophoresis. Identification of Subtypes of Pi M., J. Lab. Clin. Med., 1976; 87 : 152-163. 10. Cawley, L.P., Minard, B.J, Tourtellotte, W.W., Ma, B.I. and Chelle, C., Immunofixation Electrophoretic Technique Applied to Identification of Proteins in Serum and Cerebrospinal Fluid, Clin. Chem., 1976; 22 : 1262-1268. 11. Ritchie, R.F and Smith, R. Immunofixation III, Application to the Study of Monoclonal Proteins,Clin. Chem., 1976; 22 : 1982-1985. 12. Jeppsson, J.O., Laurell, C.B. and Franzen, B., Agarose Gel Electrophoresis, Clin. Chem., 1979;25 (4) : 629-638. 13. Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M., Protein Analysis, Diagnostic Medicine, 1980; Jan/Feb : 3-15.