Moleküler Yöntemlerin Tanımlanması Uğur Özbek İstanbul Üniversitesi DETAE, Genetik A.D. 2. Ulusal Lenfoma Myeloma Kongresi Lenfomalarda Moleküler Patogenez ve Hematopatoloji 16.04.2011
Sunum I. İnsan Genomu II. Moleküler Yöntemler- III. Genom Teknolojilerinin Tıp Uygulamaları- Hangi Test?-kullanım alanları
DNA Yapısının Keşfinin 58. Yılı 25 Nisan 1953 Watson JD, Crick FHC. Nature 1953; 171: 737-8.
İnsan Genomu Projesi Uluslararasıİnsan Genomu Dizileme Konsorsiyumu İnsan Genomu Projesi ni tamamladı 14 Nisan 2003 İnsan genomunun gen içeren kısmının %99 unun nükleotid dizisi %99.99 doğrulukla belirlendi
Kompleks Genetik Hastalıklar/fenotipler Gen-3 Çevre-1 Gen-1 Gen-2 Çevre-2
Genetik Genetik hastalıklar
Dış Faktörler Genetik Genetik hastalıklar Dış çevre kaynaklı hastalıklar
Yaşam Tarzı Dış Faktörler Genetik Genetik hastalıklar Dış çevre kaynaklı hastalıklar Kompleks hastalıklar
Kanser gelişimi yıllar içinde olur
İNSAN GENOMUNDAKİ GENETİK FARKLILIKLAR
Genes mirror geography within Europe, Novembre J, ve ark., Nature, Aug 31, 2008 500,000 SNPs 3000 kişi
Mikroarray Ön bilgi
Genetik testlerle ilgili aklımızdaki sorular! Hangi test? Nasıl kullanılacak? Hastama ne faydası olacak? Bu test hastamdaki duruma ne kadar uygun? Bu testi nerde yaptırabilirim? Bu test talebi için gerekenler nelerdir? Bu durum için genetik danışma gerekir mi?
Genetik testlerle ilgili aklımızdaki sorular! Hangi test? Nasıl kullanılacak? Hastama ne faydası olacak? Bu test hastamdaki duruma ne kadar uygun? Bu testi nerde yaptırabilirim? Bu test talebi için gerekenler nelerdir? Bu durum için genetik danışma gerekir mi?
Yüksek Duyarlık ve Özgünlük Powers of Ten, Charles-Ray Eames
Kromozom, DNA ve Gen Hücre Nukleus Kromozomlar Gen Protein
DNA, Transkripsiyon ve Translasyon Amino asit zinciri mrna Ribozom Protein DNA Çekirdekcik zarı Understanding Gene Testing,, NIH, 1995 Hücre membranı
Hastalık yapan mutasyonlar protein fonksiyonunu bozar Fonksiyonel protein Nonfonksiyonel yada kayıp p protein
Genetik testlerle ilgili aklımızdaki sorular! Hangi test? Nasıl kullanılacak? Hastama ne faydası olacak? Bu test hastamdaki duruma ne kadar uygun? Bu testi nerde yaptırabilirim? Bu test talebi için gerekenler nelerdir? Bu durum için genetik danışma gerekir mi?
Klinik testler Korunma, tanı yada hasta tedavisinin bir parçası olarak kullanılma amacı ile yapılan testler. Sonuçlar klinisyene bildirilir. Araştırma testleri Klinik test geliştirme yada tamamiyle bir olayı daha iyi anlama amacı ile yaplıkır. Genellikle bireylere ait sonuçlar bildirilmez.
Üç çeşit genetik test mevcut Sitotogenetik DNA/RNA Metabolik
DNA bazlı tanı metodları Dizi analizi Mutasyon tarama Bilinen mutasyonların taranması
PCR ürünü biriktikçe büyüyenyükselen bir curve ile kendisini gösterir. İnisial log faz Ekponansiyel log faz Final plato faz Gen anlatımdüzeylerini sayısal değerlere dönüştürerek ölçmek CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA 0 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1,024 11 2,048 12 4,096 13 8,192 14 16,384 15 32,768 16 65,536 17 131,072 18 262,144 19 524,288 20 1,048,576 21 2,097,152 22 4,194,304 23 8,388,608 24 16,777,216 25 33,554,432 26 67,108,864 27 134,217,728 28 268,435,456 29 536,870,912 30 1,073,741,824 31 1,400,000,000 32 1,500,000,000 33 1,550,000,000 34 1,580,000,000
DNA bazlı tanı metodları Dizi analizi Mutasyon tarama Bilinen mutasyonların taranması
DNA dizi analizi
RT PCR 1. Amaç cdna kopyalarını çoğaltmak 2. cdna vs DNA cdna : komplementer DNA RNA dan sentezlenir İntron ve gene ait diğer kontrol elementlerini içermez RNA/protein ekspresyonu için kabaca fikir edinilebilir
RT-PCR Yöntemi Tekrar EDTA lı kan/ki Kan/Kemik İliğinden Lökosit İzolasyonu Yetersiz miktarda veya pıhtılı Materyal geldiği gün çalışılmalı Yeterli miktarda ve kalitede Revers transkriptaz ile cdna Sentezi Degrede RNA veya yetersiz RNA İzolasyonu Kaliteli RNA K 1 2 3 4 5 %1 lik Agaroz Jel Elektroforezi ile RNA kalitesi ve miktarı tayin edilir. Amplifikasyon olmamış ise önceki basamaklar tekrar edilir. 1 2 3 4 M -K Kontrol PCR (abl) Kontrol PCR sonucu, %2 lik Agaroz Jel Elektoforezi ile incelenir. 28 S rrna 18 S rrna 1 2 3 +K1 +K2 M 1-4 Hastalar, -K negatif kontrol, M Pucmix marker8 Amplifikasyon var ise cdna sentezi başarılı Standart (First) PCR Nested PCR %2 lik agaroz jel sonuçları Nested PCR ürünleri First PCR ürünleri 1-2 Hastalar, +K1 bcr3 pozitif kontrol, 3 negatif +K2 bcr1/2 pozitif kontrol, M Pucmix marker8
Real Time PCR çalışma prensibi
Real Time PCR verisi
Standartlar En ideali 5 farklı noktadan standartlar oluşturmak Standart dilüsyonları hazırlarken düzenli artış/azalışlara dikkat! Örn: 1:10-1:100-1:1000-1:10000-1:100000 vb En azından uç kantifikasyon noktalarında, tercihen tamamında replike-triplike çalışma yapılmalı
Takip
DNA bazlı tanı metodları Dizi analizi Mutasyon tarama Moleküler hibridizasyon (Blotlama FISH Array) Bilinen mutasyonların taranması
Moleküler Hibridizasyon DNA amplifikasyonu gerekmez Spesifik problarla DNA/RNA bölgeleri saptanabilir Southern/Northern Blot FISH
Moleküler Hibridizasyon Büyük delesyonlar Büyük genomik değişimler (translokasyon) Gen ekspresyonu tespiti (mikroaray)
Denatürasyon - Renatürasyon Denatürasyo n Renatürasyo n Tek zincir DNA Çift zincir DNA Bazların ayrılması Renatüre DNA
KARŞILAŞTIRMALARDA TANIDIK YÖNTEMLER DNA Promoter 5 3 Southern blot PCR Transkripsiyon RNA pol. II Öncül mrna AUG stop mrna CAP Ekzon İntron Ekzon İntron RNA işlenmesi AAA 3 Northern blot RT PCR, QRT PCR Translasyon Protein Western Blot ELISA
Yüksek rezolüsyon kromozom bantlama ve FISH Control Signals Region-Specific Signal
Büyük hücreli lenfoma Myc splitapart probe: Probe 1
Myc splitapart probe: Probe 2
Büyük hücreli lenfoma Myc splitapart probe: Probe 1+2
Mikroarray teknolojisi
Array Nedir? İçinde çeşitli özellikleri temsil eden probların, sabit bir yüzey üzerine geometrik olarak sıralanması
Yıllara göre array yayınlarındaki artış http://compbio.uthsc.edu/microarray/lecture1.htm
Farklılıklar fenotipik olarak gözlenebilir NORMAL NORMAL DIŞI Referans hücreler (wild tip) Deneysel karşılaştırmada baz alınan hücreler Bilinmeyen hücreler (deney hücreleri) Farklı hücresel fonksiyonu temsil edecek hücreler Çizim: Bahadır Baruter
ARRAYDE HEDEF MOLEKÜLLER Nükleik Asitler genomikdna cdna ekzonlar oligonükleotidler Proteinler Peptid fragmanları Farklı hücresel yapılar Lipidler polisakkaridler Dokular
MAKROARRAYLER Array üzerindeki prob sayısı düşük 200 5000 gen Radyoaktif işaretleme kullanılıyor Robotic olarak membran üzerine spotlanıyor
MİKROARRAYLER Cam ya da plastik slaytlar Floresan işaretleme Prob yoğunluğuoldukçayüksek Ancak problar makroarraylerde olduğu gibi robotik olarak noktalanıyor
OLİGONÜKLEOTİD ARRAY YÖNTEM AKIŞŞEMASI www.affymetrix.com
Tumors Kümelendirme C D Genes E F
Tumors Genes C D E F
HİYERARŞİK KÜMELENDİRME İki farklı profil arasındaki tüm olası benzerlikleri hesaplıyor En çok benzeyen iki küme birlikte gruplanıyor ve yeni bir küme oluşturuyor Bu yeni küme ile diğerleri arasındaki benzerlik hesaplanıyor
HİYERARŞİK KÜMELENDİRME 1. HASTA GRUBU KONTROLLER 2. HASTA GRUBU
YOLAK ANALİZLERİNDE
INGENUITY PATHWAY ANALYSIS (IPA)
33 Pediatrik TALL Hastası ve Timik Subsetler DN total (CD3 + ve/veyacd3 ) CD3 CD4 CD8 DPCD3 DPCD3 + SP4 SP8 Total Timus
DP3neg Dptot ISP T2 T07 T11 T12 T16 T18 T21 T27 T35 T37 T43 T53 T64 T65 T92 T98 T142 6 8 10 12 14 16 2Haz2009_raw DP3neg Dptot ISP T2 T07 T11 T12 T16 T18 T21 T27 T35 T37 T43 T53 T64 T65 T92 T98 T142 4 6 8 10 12 14 16 1Haz2009_rma NORMALIZASYON ÖNCESİ NORMALIZASYON SONRASI
Hiyerarsik Kumelendirme Analizi
7-65 arası genler 65-80 arası genler
I. KÜMEDEKi HASTALAR
Teşekkürler