Yirminci yüzyy. zyılda bilimsel. yaşamlar etkiler yaptı Endüstrile görülen hayat beklentisi ve yaşam am kalitesindeki artış

Transkript

1 PROTEOMICS

2 Yirminci yüzyy zyılda bilimsel keşiflerin baş döndürücü ilerleyişi i günlg nlük yaşamlar amlarımıza da önemli etkiler yaptı Endüstrile strileşmiş ülkelerde görülen hayat beklentisi ve yaşam am kalitesindeki artış tıp p ve biyolojik biimlerdeki keşiflerle bağlant lantılıdır

3 Yirminci yüzyy zyılın n başı şında,tıp p ve biyoloji makroskopik fenomenleri anlamayı amaçlayan tanımlay mlayıcı bilimlerdi Yüzyılın n bitişiyle iyle birlikte, bu bilimler yaşamlar amlarımızdaki biyolojik süres reçlerde etkileri daha çok anlaşı şılan mikroskopik ve nanoskopik dünyalara giriş yaptılar Yeni binyılın n doğuşu genomik bilginin de çok fazla birikmesiyle birlikte, karmaşı şık çokgenli hastalıklar kların n ve sistem biyolojisinin anlaşı şılması için in yeni bir paradigmayı gündeme getirmiştir. tir.

4 Yüzyılın n son çeyreğinde bazı bilim adamlarının n DNA sekans dizisinin çıkarılabileceğini ini öngörmesiyle yeni bir çağ başlad ladı. Teknolojinin gelişmesi ve yeni araçlar ların keşfiyle genom çalışmaları büyük k bir hız h kazandı.

5

6 Özellikle, büyük b k genomların n daha uygun sürelerde sekanslamasını yapabilmek için i in araç ve gereçler geliştirildi( tirildi(dovichi,1997). Bu araç ve gereçler, biyolojiyi ve hastalıklar kları daha iyi anlamamızı sağlayacak kapsamlı yaklaşı şımların iskeletini oluşturmam turmamızı sağlad ladı Daha da önemlisi biyolojik süres reçlerin sadece genomik sekanslamayla çözülemeyece lemeyeceği çok kısa k bir sürede s anlaşı şıldı

7 Daha sonra bakış ışlar RNA ekspresyon seviyelerine çevrildi. Ribonükleik asitin ekspresyon seviyelerinin kantitatif analizlerinin hızlh zlı bir şekilde yapılmas lmasını sağlayacak olan bir dizi araç kullanıma sokulmuştur. DNA/RNA array teknolojisinin ve gen ekspresyonunun seri analizi (SAGE) nin ortaya çıkışıışı RNA altbirimlerinin ve tamamının n kantitatif ekspresyon profillerinin elde edilmesini kolaylaştırm rmıştır.

8 Bu teknikler kullanılarak larak farklı RNA ekspresyon profilleri elde edilebileceği i gibi, hücreler farklı bir durumdayken ya da farklı hücreler karşı şılaştırılırken rken genlerin up ya da down regüle edildikleri tespit edilebilir. RNA çalışmalarıyla inanılmaz büyüklb klükte kte bilgi ortaya çıkarılmıştır.

9 Bununla birlikte, RNA ekspresyonunun tek başı şına gen işlevlerini i ve biyolojik prosesleri açıklamakta a yetersiz olduğu ortaya çıktı RNA ekspresyonunun protein seviyesinde meydana gelen değişikliklerle ikliklerle zayıf f bir doğrusal ilişkiye sahip olduğu u farklı çalışma grupları tarafından elde edilen kanıtlarla ortaya konurken

10

11 Maya genomu üzerinde yeni yapılm lmış geniş ölçekli bir çalışma DNA chip sonuçlar ları ve protein ekpresyonları arasında zayıf f bir ilişki bulunduğunu unu açıkça a göstermig stermiştir. tir. Bu çalışmada,bir genle bağlant lantılı olan protein sevitesinde önemli derecedeki değişim, im, RNA ekspresyon seviyesinde bir değişim im olmadan gen-altucundaki (down- stream) ) regülasyon mekanizmalarıyla gerçekle ekleştirilebileceği i bulunmuştur.

12 Protein çalışmaları,, kısmen k proteinin yapısını kesin ve kolay bir şekilde tanımlayacak olan metodların eksikliğinden inden dolayı her zaman küçük üçük ölçeklerde yapılm lmıştır 2 boyutlu jel elektroforezi tipik olarak proteomik çalışmalarında profil çıkartmak için in kullanılır, ve bu yöntemin y en önemli işlevi farklı koşullarda ifade edilen proteinlerin farklı gösterimleridir

13 Halihazırda kullanılan lan protein ekstraksiyon protokolleri tüm t m biyolojik örneklerin hepsine uygulanamamaktadır, ve ekstrakte edilmiş olan proteomdaki proteinin gösterilebilmesi g anlamında nda da sınırlılıkları vardır Hidrofobik proteinler kolaylıkla kla ekstrakte edilemez ve 2D jel üzerinde gösterilemez g Bir proteomda beklenen proteinlerin önemli bir miktarı hidrofobiktir

14

15 2D elektroforezi ve kütle k spektrometresi ile tanımlanan proteinlerden elde edilen bilgi önemli miktarda hidrofobik proteinin eksik olduğunu unu göstermektedir. g Son yıllarda, y Rabillout ve grubunun önemli çabaları hidrofobik proteinlerin tekrar eldesi (geri kazanımı) ) için i in kullanılabilecek labilecek geliştirilmi tirilmiş kimyasallar ve protokoller sağlam lamıştır Buna rağmen, proteomik çalışmalarında hidrofobik proteinlerin ekstraksiyonu halen önemli bir hedeftir.

16 Proteom çalışmalarında özellikle her biri kendi proteomuna sahip, farklı safhalarda bulunan birçok farklı hücreden oluşan dokularla çalışıldığında problemler ortaya çıkmaktadır. Doku parçalar alarının lize edilmesi sonucunda bir proteom çorbası meydana gelir. Bu sorunu bertaraf etmek için i in hücre h kültürüyle çalışılmaya başlanm lanmıştır.

17 Bitki, hayvan ve klinik örneklerden de proteomik çalışmları yapılm lmıştır. Dokulardan elde edilen hücrelerin h fraksiyonlara ayrılmas lması proteomun karmaşı şıklığını azaltır.

18

19 Belli hücre h tiplerine özgü immobilize antibadiler kullanılarak, larak, proteomik çalışmaları için in hücre h populasyonlarını ayıracak immünomagnetik teknikler keşfedilmi fedilmiştir.

20 İki boyutlu Jel Elektroforeziyle Protein Ayrış ıştırılması Proteomların bazılar ları,, diğerleri binlerce protein taşı şırken, birkaç yüz z ya da daha az protein taşı şıyan göreceli g olarak daha küçük üçük proteomlardır. Proteomics çalışmalarında, 2D jel elektroforezinde en sık s k yapılan şey, birinci boyutta proteinleri pi larına göre daha sonra da ikinci boyutta MA lar larına göre ayırmakt rmaktır

21 Açıkçası, pi ve MA bazında ayırman rmanın kombinasyonu yapıld ldığında doğru bir ayırım m vermekte ve bu durum 2D jel elektroforezinin eşsiz çözme(ay zme(ayırma) gücünü yansıtmaktad tmaktadır. Her ne kadar 2D elektroforez sistemi güçg üçlü bir ayrış ıştırma tekniği i olsa da, başlang langıçta oldukça a kullanış ışsızdı 80 lerin ortalarında immobilize ph gradiyenti (IPG strip) ) ortaya konarak bu teknik ticari olarak kullanılabilir labilir hale geldi

22 1980 lerin ortalarında, amfolit özellikteki akrilamid monomerleriyle akrilamidin düşük çapraz bağlarla kopolimerlerize edilmesiyle ph gradiyentinin stabilize ve immobilize olabileceği i görülmg lmüştür

23 Uygun bir IPG şerit elde edildiğinde, inde, protein ekstraktı ve yükleme y tamponu karışı ışımı bu şeride yüklenir y Şerit boyunca küçük üçük k bir elektrik akımının verilmesi proteinlerin IPG şeride transferini artırır Şerit tam olarak yüklendiy klendiğinde, inde, daha büyük k bir alanı IPG şeridi boyunca uygulanır

24

25 Pozitif yüklenen y proteinler katoda doğru hareket ederler ve pi lar larına ulaşana ana kadar artan ph la karşı şılaşırlar Negatif yüklenen y proteinler ise anoda doğru hareket ederler ve pi lar larına ulaşana ana kadar azalan ph a maruz kalırlar Her bir protein kendilerine ait pi lar larında odaklanırlar.

26 İki-Boyutlu Jel Elektroforeziyle Ayrılm lmış Proteinlerin Tespiti Jel elektroforeziyle ayrış ıştırılmış proteinleri görüntülemek için i in yıllar y boyu farklı metodlar geliştirilmi tirilmiştir. tir. Her ne kadar farklı kimyasallar kullanılsa lsa da, kullanılan lan metod ya birinci boyuttan sonra proteinlerin etiketlenmesini ya da ikinci boyuttan sonra proteinlerin etiketlenmesini içerir i

27 2D jel elektroforezinden önce gerçekle ekleştirilen protein önetiketlenmesi sıklıkla kla büyüme b ortamına radyoizotopik olarak etiketlenmiş amino asitlerin eklenmesiyle gerçekle ekleştirilir Proteinlerin önetiketlenmesinde kullanılan lan başka bir yaklaşı şım nötral kvalent bağlanan floresan boyalar kullanılmas lmasıdır

28 Bu boyalar 2D jel elektroforeziinden önce proteinlere kovalent olarak bağlan lanır Yüklü olmadıklar klarından dolayı,, boyalar proteinlerin izoelektrik noktalarını minimal bozmaları avantajını taşı şırlar Bununla birlikte, bu yaklaşı şımın n duyarlılığı ığı absorpsiyonun zayıfl flığından dolayı kötü etkilenmektedir

29 Yeni elde edilmiş floresan boyalar 2D jel elektroforeziyle ayrılm lmış proteinler için i in nanogram seviyesinde hassasiyet kazandırm rmıştır Bu yaklaşı şımın n dezavantajı ise bir floresan tespit sisteminin ve her bir protein lekesinin daha ileri prosesleri için i in otomatize edilmiş bir leke toplayıcıya ya gerek duyulmasıdır

30 Proteinlerin seperasyon sonrası tespiti,2d-jelde ayrılm lmış proteinlerin görüntg ntülenmesinde en çok tercih edilen yoldur Özellikle, kullanımlar mlarının n kolaylığı ve duyarlılıklar klarından dolayı koloidal komasi boyama ve gümüşg boyama tercih edilen metodlardır Koloidal komasi boyama genellikle 25 ila 50 ng civarında proteinlerin tespitini sağlarken, gümüşg boyama 5ng seviyesindeki proteinlerin tespitine izin verir.