REKOMBİNANT DNA TEKNİKLERİ I DR. ONUR YILMAZ 2017

Transkript

1 REKOMBİNANT DNA TEKNİKLERİ I DR. ONUR YILMAZ 2017

2 Rekombinasyon: Yenibileşim - yenidenoluşum. Bir molekülün-hücrenin, atasal wild type yada ilkin (orijinal) yapısından farklılık göstermesi durumudur. I - In vivo rekombinasyon II- In vitro rekombinasyon

3 REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ VE GEN MÜHENDİSLİĞİNİN TANIMI VE UYGULAMA ALANLARI Rekombinant DNA teknolojisine ilişkin deneysel çalışmalar 1944 yılında genetik bilginin nükleik asitlerde depolandığının bulunması ile başlamıştır. Rekombinant DNA teknolojisinin gerçek hikayesi 1970 yılında Smith in mikroorganizmalarda bulunan ve DNA yı spesifik bölgelerden kesen restriksiyon endonükleaz enzimlerini bulması ile başlamıştır.

4 Rekombinant DNA Teknolojisinin Gelişimi : Gregor Mendel Bezelye çaprazlamaları ile döllere gen geçişini ilk kez ortaya çıkardı : Watson ve Crick DNA' nın çift iplikli sarmal yapısı keşfedildi : Kornberg DNA polimeraz izole edildi 1966: Nırenberg ve ark Genetik kod çözümlendi : Gellert DNA ligaz izole edildi.

5 1970: Hamilton Smith Restriksiyon enzimlerini (DNA makasları) keşfetti DNA yı belli noktalardan kesebilen enzimler : Jackson ve ark : İlk r-dna molekülü oluşturuldu : Boyer ve ark Gen klonlama tekniğinde plazmidler keşfedildi 1975: Southern hibridizasyon tekniği geliştirildi. "Southern Blot " tekniği. 1975: Kan ve ark: ilk prenatal teşhis

6 Walter Gilbert, Allan Maxam, ve Fred Sanger ayrı ayrı laboratuvarlarda DNA nın şifresini çözecek DNA baz dizisini ortaya çıkaran DNA dizileme metodunu geliştirdiler 1978: Yuet Wai Kan ve Andree-Marie Dozy restriction-fragment-length polymorphism (RFLP) yöntemini geliştirdiler 1979: Goeddel ve ark, ilk rekombinant insülin 1982: Palmiter ve Brinster Transgenik fareler 1982: Spradling ve Rubin Transgenik meyve sinekleri üretildi.

7 : Kary Mullis arkadaşları polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) adı verilen, hızlı DNA klonlaması ve dizi tepitinde önemli bir teknik geliştirdiler 1986: İlk hastalık (kronik granulomatos) geni pozisyonel klonlama ile tayin edildi 1987: Rekombinant hepatit B aşısı üretildi. 1989: ABD de İnsan Genomu Araştırma Ulusal Merkezi kuruldu 1994: İlk transgenik domates satış izni aldı 1993: Stilman ve Hall İnsan embriyosunun klonlanması çalışmaları 1997: Wilmut Koyun klonlanması (Erişkin memeli hücrelerinden) 1998: İnsan Genom Projesi (İGP) başlatıldı 2000 li yıllar: İGP tamamlandı (2003) DNA çipleri Farmakogenetikte atılımlar, Kök Hücre - tedavi

8 REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER Özel kesici enzimler kullanarak DNA molekülünün kesilmesi DNA nın Klonlanması DNA - nukleotid dizisinin hızlı bir şekilde saptanması Nukleik asit hibridizasyonu Genetik Mühendisliği

9 DNA-RNA MODİFİKASYON ENZİMLERİ

10 DNA-RNA MODİFİKASYON ENZİMLERİ DNA/RNA modifikasyon enzimleri, katalizledikleri reaksiyonların tipine göre 4 ana sınıfa ayrılabilirler DNA/RNA Modifikasyon Enzimleri Nükleazlar Ligazlar Polimerazlar Kinaz ve Fosfotazlar

11 NÜKLEAZLAR NÜKLEAZLAR Nükleazlar bir DNA /RNA zincirinde bir nükleotidin sonraki ile bağlantısını, fosfodiester bağlarını kırarak yıkar. İki farklı tip nükleaz çeşidi vardır: Ekzonükleazlar (Uçlardan kesim): DNA /RNA molekülünün bir ucundan bir kerede bir nükleotidi uzaklaştırır. Ekzonükleazlar, uzaklaştırdıkları iplik sayısına göre ayrılırlar. Endonükleazlar (Dahili kesim): DNA /RNA molekülünde içteki fosfodiester bağlarını kırar. Endonükleazlar da aynı şekilde sınıflandırılır. 11

12 DNA-NÜKLEAZLAR

13 DNAZ-1 İnek pankreasından elde edilir. DNA nın hem tek hemde iki ipliğini birden kesebilen bir endonükleazdır. RNA veya protein saflaştırmasında DNA'yı yok etmek için, Shotgun sekans ile DNA kütüphanesi oluşturmada, DNA-protein bağlanma yerlerini haritalamak (DNAse I footprinting). DNA'nın nick translokasyon yöntemiyle radyokatif işaretlenmesi amacıyla DNA'nın tek zincirinde kesikler yaratmakta kullanılır. 13

14 DNAZ-1 NÜKLEAZLAR 14

15 EKZONUKLEAZ-III Çift iplikli DNA'nın 3' uçlarından nükleotitler çıkarır. Genelde linear DNA moleküllerinin uçlarından farklı miktarlarda kısaltmalar elde etmek için kullanılır. Çift iplikli DNA da 3 5 yönünde ekzonükleaz akivitesi gösterir. Tek iplik üzerinde etkili olmaz.

16 BAL-31 Alteromonas espejiana bakterisinden saflaştırılır, Hem ekzonukleaz hem de endonükleaz aktivitesi gösterir, DNA tek iplikli olduğu durumlarda endonükleaz aktivitesi gösterir. DNA tek iplikli olmadığı durumlarda çift iplikli DNA yı hem 3 - hem de 5 - yönünde keser (Ekzonükleaz aktivitesi).

17 BAL-31

18 RNA-NÜKLEAZLAR

19 RİBONÜKLEAZ-A Pirimidin bazlarında RNA yı degrede eder. Bir nükleotitin 5 -riboz ile komsu pirimidin nükleotitin 3 -ribozundaki fosfat grubu arasındaki fosfodiester bağından keser. Genomik ve plazmit DNA hazırlamada, DNA ve RNA daki tek baz mutasyonlarının taranmasında kullanılır.

20 RİBONÜKLEAZ-H RNA'yı pirimidin bazlarında keser. DNA/RNA hibritlerinde eşleşmemiş bazların olduğu noktalarda RNA'yı keserek mutasyonlarının haritalanması için kullanılır. DNA izolasyonunda RNA'yı yok etmek amacıyla kullanılır. cdna oluştururken RNA primerinin uzaklaştırılmasında, Oligo(dT) varlığında mrna dan polia kuyruğunun çıkarılmasında kullanılır.

21 RİBONÜKLEAZ-H

22 RİBONÜKLEAZ-H

23 DNA/RNA-NÜKLEAZLAR

24 S1-NÜKLEAZ Aspergillus orizae den elde edilir, Düşük konsantrasyonda kullanılınca hem DNA hem RNA'nın tek iplikli halini keser. Yüksek konsantrasyonda çift iplikli nükleik asitleri (DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA) keser.

25 S1-NÜKLEAZ DNA-DNA veya DNA-RNA hibridlerinde tek iplikli bölgeleri ortamdan uzaklaştırır. DNA:RNA komplekslerinin haritalanmasında Tek iplikli uç uzantıları olan DNA parçalarının uçlarının düzleştirilmesi için kullanılır.

26 MUNG BEAN NÜKLEAZ Mung fasulyesi (Vigna radiata) filizlerinden elde edilen tek iplikli DNA veya RNA ya özgü bir nükleazdır. Yapışkan uçlu DNA moleküllerinin uçlarının düzleştirilmesi için kullanılır. Dizinin A pn bölgesinde yüksek oranda verim gösterir. C pc ve C pg de verim oldukça düşüktür. Tek iplikli DNA veya RNA ya S1 nükleazdan spesifitesi daha fazla olduğu için tek ipliğe özgü nükleaz gerektiren çoğu uygulamada özellikle kullanılır. Çift iplikli DNA yı küt uçlu yapar.

27

28 LİGAZLAR

29 LİGAZLAR İki büyük molekül arasında bir kimyasal bağ oluşturarak onları birleştiren bir enzimdir, Genelde reaksiyonu sırasında bu büyük moleküllerden birine ait küçük bir kimyasal grup hidroliz olur.

30 DNA-LİGAZLAR

31 DNA LİGAZ LİGAZLAR Hücredeki DNA ligazın işlevi, çift zincirli DNA molekülünün tek zincirde meydana gelen kırıkları tamir etmektir. Pekçok organizmadan elde edilen DNA ligazlar çift zincirli DNA nın iki ayrı fragmentini (3 -OH ve 5 -P) fosfodiester bağı ile birbirine bağlayabilir. 31

32 T4 DNA LİGAZ Escherichia coli bakteriyofaj T4 kodlar, DNA ve RNA daki 5 -fosfat ile 3 -hidroksil uçları arasındaki fosfodiester bağını katalizler. Kofaktör olarak ATP ve Mg +2 gerekir. Hem küt uçlu kesimi hem de yapışkan uçlu kesimi ligasyon yapabilir. Bu enzim ile Bir vektöre DNA parçası eklenir. DNA parçası ile Linker veya adaptör ligasyonu yapılır. 32

33 T4 DNA LİGAZ Kısa uzantılı yapışkan uçların ligasyonu düşük sıcaklıkta (4-8 C) uzun süre içinde (genelde bir gece boyunca) gerçekleştirilir. 5' ucunda fosfat olmayan DNA'ların ligaz tarafından birleştirilebilmesi için 5' uçlarının fosforile edilmesi gerekir. Küt uçlu DNA'ların da ligasyonu mümkündür ama reaksiyon çok daha yavaştır. Reaksiyon ortamında polietilen glikol ve mm NaCl bulunması DNA moleküllerinin ligasyonunu kolaylaştırır.

34 ECOLİ DNA LİGAZ NA molekülünün 3' hidroksil ucu ile bir diğerinin 5' fosfat ucu arasında bir fosfodiester bağ oluşturmaktır. DNA sentezi sırasında oluşan Okazaki parçalarının birleştirilmesi, ayrıca DNA tamiri için gereklidir.

35 RNA-LİGAZLAR

36 T4 RNA LİGAZ T4 bakteriyofaj tarafından kodlanan bir enzimdir. Kofaktör olarak ATP ye ihtiyaç vardır. RNA nın 3 -OH ucuna 5 -fosfat ucunun bağlanmasını katalizler. RNA-RNA ligasyonu yapabildiği gibi DNA-RNA ligasyonu da yapabilir, ancak yavaş olur. DNA-DNA ligasyonu oldukça yavaştır ve bu ligasyon çift zincirli nükleik asitleri tanımada başarısız olmaktadır. 36

37 POLİMERAZLAR

38 POLİMERAZLAR İşlevi RNA ve DNA gibi nükleik asit polimerleri ile ilgilidir, Esas fonksiyonu, mevcut bir DNA veya RNA kalıbı kullanarak, yeni bir DNA veya RNA'nın polimerizasyonudur, Bir grup başka enzim veya protein eşliğinde, çözeltide bulunan nükleotitleri alırlar ve bir polinükleotit iplikçiğin karşısında yeni bir polinükleotit iplikçiğinin sentezini katalizler. 38

39 POLİMERAZLAR 39

40 DNA-POLİMERAZLAR

41 DNA POLİMERAZ I Hem ikileşme hem de tamir mekanizması içerir, Mg +2 iyonuna gerek duyar, RNA polimerazdan farklı olarak, sentezlediği yeni ipliği sadece nükleotitlerden başlayarak uzatamaz, ancak mevcut bir DNA zincirini uzatabilir. 41

42 DNA POLİMERAZ I

43 KLENOW FRAGMENT DNA nükleotit dizilerinin bulunmasında kullanılan ve ekzonükleaz faaliyetlerine sahip DNA polimeraz I enziminin parçası olan bir proteindir. Polimeraz I den farkı 5 3 yönünde ekzonükleaz aktivitesi gösterir. 43

44 KLENOW FRAGMENT Tek iplikli DNA dan çift iplikli DNA eldesinde, Küt uçlu DNA parçası yapımında, Radyoaktif DNA problarının hazırlanmasında, Dizilemede kullanılır. 44

45 T4 DNA POLİMERAZ Tek iplikli DNA da Klenow fragmentinden çok daha spesifik 3 5 yönünde ekzonukleaz aktivitesi gösterir, 5 3 ekzonükleaz aktivitesi göstermez, Güçlü 3 5 ekzonükleaz aktivitesi ile DNA parçalarının 3 ucunun işaretlenmesinde, DNA parçasını küt uçlu yapmada kullanılır. 45

46 T4 DNA POLİMERAZ 46

47 T7 DNA POLİMERAZ 5 3 yönünde DNA sentezler, Çok uzun DNA fragmanlarını sentezleyebilir, Tek ve çift iplik üzerinde klenow fragmentinden 1000 kat daha güçlü 3 5 ekzonükleaz aktivitesi gösterir, Hem ikileşme hem de tamir mekanizması içerir, 5 overhang DNA yı keserek o bölgeyi doldurma, Apoptosiste DNA parçalanmasının belirlenmesi, Kalıntı genomik DNA nın ortamdan uzaklaştırılarak halkasal DNA nın purifiye edilmesinde kullanılır. 47

48 RNA-POLİMERAZLAR

49 T7 RNA POLİMERAZ DNA dan 5 3 yönünde RNA sentezler, Hibridizasyonda, Genomik DNA sekanslama Için kalıp olarak kullanılır. 49

50 SP6 RNA POLİMERAZ Salmonella typhimurium LT2 dan enfekte olan faj SP6 DNA sının kodladığı bir enzimdir. Template olarak SP6 promotor dizisi, subtsrat olarak NTP içeren çift iplikli DNA dizisinin kullanıldığı 5 3 yönünde RNA sentezler. Northern ve southern hibridizasyonunda işaretli RNA problarının hazırlanmasında, Invitro translasyon Için RNA sentezinde kullanılır. 50

51 SP6 RNA POLİMERAZ

52 KİNAZ VE FOSFOTAZLAR

53 T4 POLİNUKLEOTİT KİNAZ T4 bakteriyofajı genomundan kodlanan bir enzimdir. DNA ve RNA nın 5 -OH ucuna ATP nin ATP varlığında 5 -OH ucuna fosfat ekler. -fosfat ının transferini katalizler. ADP varlığında 5 -ucundaki fosfatın koparılmasını sağlar. DNA ve RNA nın 5 -ucunun işaretlenmesini sağlar. Yapay DNA linkerların 5 -ucuna fosfat bağlanmasını sağlar. DNA veya RNA nın 5 -ucunun 32 P veya 33 P ile işaretlenmesinde yaygın olarak kullanılır. ADP varlığında 5 -ucundaki fosfat grupları ve ATP nin değiş-tokuş mekanizmasını katalizler. 53

54 T4 POLİNUKLEOTİT KİNAZ 54

55 BAKTERİYEL ALKALEN FOSFOTAZ DNA ve RNA dan 3 - ve 5 - uçlarında bulunan fosfat grubunu ortamdan uzaklaştırır. Koparılan parçaların tekrar ligasyonunu önlemek amacıyla vektör DNA nın 5 -fosfat ucundaki fosfatı koparır. T4 polinükleotit kinaz ile işaretlemeden önce nükleik asitlerin 5 -ucundaki fosfatın koparılmasını sağlar. En etkili alkali ortamda işlev görür. Sekanslamadan önce PCR ürünündeki degrede DNA nın temizlenmesinde kullanılır. 55

56 BAKTERİYEL ALKALEN FOSFOTAZ Bu enzimler işgalci DNA yı keserek, onu zararsız hale getirirler. Virüs ve yabancı DNA lardan bakteriyi korur 56