AKUT MYELOSİTİK VE AKUT LENFOBLASTİK LÖSEMİ TANISINDA AKIM SİTOMETRİ; STANDART PANEL Dr. G. Hayri ÖZSAN

Transkript

1 AKUT MYELOSİTİK VE AKUT LENFOBLASTİK LÖSEMİ TANISINDA AKIM SİTOMETRİ; STANDART PANEL Dr. G. Hayri ÖZSAN Bir hücre serisinde olgunlaşmanın belirli bir kesitinde, a) normalde bulunan, b) normalden fazla sayıda bulunan, c) normalde saptanmayan ya da aynı anda bulunmaması gereken antijenik yapıların saptanması temeline dayanır. Hücrelerin detaylı fenotipik analizi, hücrenin ait olduğu seri ve olgunlaşma aşaması hakkında bilgi sağlar. a) Hücre serisinin saptanmasında; özellikle morfoloji ve histokimyanın yardımcı olmadığı durumlarda b) B- ve T-hücreli akut lösemilerin ayırımında c) Birden fazla hücre serisi ile ilişkili lösemilerin saptanmasında d) B-hücreli lenfoproliferatif hastalıkların monoklonalitelerinin saptanmasında Oldukça önemlidir. e) Genetik anormalliklerin taranmasında yardımcıdır [1-9]. f) Minimal rezidüel hastalık saptanmasında yardımcıdır [10-12]. AKUT MYELOİD LÖSEMİLER (AML) Tanı ve sınıflamadaki önemli göstergeler CD34, CD117, CD33, CD13, CD15, CD4, CD11b, HLA-DR ve sitoplazmik myeloperoksidazdır (cmpo). Nötrofil, bazofil, eozinofil, monosit, mast, eritroid ve megakaryosit hücre serileri ve dendritik hücrelerin varlığı immünofenotiplemeyi kompleks hale getirir. Aynı anda iki ya da daha fazla blast topluluğu bir arada bulunabilir. CD117, CD13 ve CD33 myeloid seriye ait gösterilebilen en erken antijenlerdir [13-18]. Daha immatür hücrelerin göstergesi olan CD34+ liği ile birlikte gözlenebilir [19-20]. Halen sitoplazmik myeloperoksidaz (cmpo), lizozim ve triptaz myeloid hücrelerin en önemli belirteçleri olarak kabul edilmektedir [21-23]. MPO granülositik seriye ait bir özellik iken triptaz mast ve bazofil hücrelerine farklılaşmanın bir göstergesidir [13]. CD15 olgun nötrofiller CD14 de olgun monositler tarafından eksprese edilir [13, 14, 18]. Bununla birlikte bu hücrelere dönüşmeden önce eş zamanlı eksprese edilmesi ayırımda kullanımını zorlaştırır [13, 17, 18]. Glikoforin A oldukça özgün bir eritroid belirteç olmakla birlikte geç evrelerde eksprese edilmektedir [13, 18, 24]. Erken dönemde eksprese edilen CD36 ise bu seriye özgü değildir. Megakaryositik lösemi tanısında kullanılan CD61, CD41 ve CD42 bu seriye ait mükemmel belirteçlerdir [25, 26]. Minimal myeloid farklılaşma gösteren AML Hücreler agranülerdir. Düşük düzeyde forward (FS) ve side scatter (SS) gösterir. Güçlü olarak CD34 ve HLA-DR, genelde CD38 ve CD117 ile CD13 ve CD33 den birini ya da her ikisini de eksprese eder. Matürasyon göstermeyen AML Blastların FS ve SS ı düşüktür. CD45 ve HLA-DR pozitiftirler. Önemli bir kısmı CD38 ve CD117 pozitiftir. Myeloid farklılaşmanın daha matür dönemlerine ait antijenleri (CD15, CD11b ve CD16) eksprese etmezler. Blastların en az %3 ü MPO eksprese eder. Granülositik farklılaşma gösteren AML En azından promyelosit ve myelosit evresine dek olan matürasyon gösterir. Hücreler daha güçlü SS örneği gösterir. CD45 hafif-orta derecede pozitif iken HLA-DR negatiftir. Varolan az sayıdaki immatür hücreler, daha matür olanlardan CD45 ya da FS/SS özellikleri ile ayrılabilir. MPO, CD13, CD33, CD34, CD65, CD117 ve HLA-DR pozitiftir. Daha matür antijenik özellikler (CD15, CD11b vd) ortaya çıktıkça CD33, CD34 ve HLA-DR ekspresyonu azalır. Monositik farklılaşma gösteren AML Blastlar daha büyüktür ve güçlü FS sinyaline sahiptir. Güçlü CD33 pozitiflikleri vardır. CD13 ve HLA-DR eksprese eder. Genelde CD34, CD117 ve CD11b negatiftir. Monositik antijenler CD64 ve CD14 ile CD4 tanıda yardımcı olabilirler. Myelomositik tip lösemide immatürite göstergeleri negatiftir. Tipik immünofenotip CD33, CD13, CD11b, CD4 ve HLA-DR dir. Megakaryoblastik lösemi Blastlar CD41 ve CD61 pozitiftir. Tekrarlayan genetik anormalliklerle birliktelik gösteren AML Bir grup AML de düzenli tekrarlayan belli genetik anormallikler vardır.

2 AML: t(8; 21) (q22; q22), AML1/ETO. Blastlar CD34, CD19 ve HLA-DR pozitiftir. CD13 ve CD33 ekspresyonu zayıftır. CD56 ekspresyonu CD19 kadar sık değildir. Blast olmayan hücreler matür fenotipe sahiptir. Çocuklardaki bezer karakterdeki lösemide vakaların %81 i CD19 ve %63 ü CD56 pozitiftir. CD19/CD56 birlikte eksprese edilmektedir. AML: t(15; 17) (q22; q21). Olasılıkla granüller ile ilişkili proteinlerden kaynaklanan güçlü bir çevresel ışıma vardır. CD33 ekspresyonu güçlü, CD13 ekspresyonu heterojendir. Erken myeloid antijenler CD34 ve HLA-DR ve matür dönemde izlenen antijen CD15 negatiftir. Sıklıkla CD2/CD19 birlikte ekspresyonu vardır. PML Proteinine karşı geliştirilen MoAb, PG-M3, normal ve lösemik promyelositlerin ayırımında büyük öneme sahiptir [27]. Eozinofili ile birlikte olan akut myelomonositik lösemi (M4Eo) Blastların büyük bölümü, CD2, CD4, CD7,CD13, CD14, CD15, CD33, CD34, CD64, CD65, CD117 ve HLA-DR ekspresyonu gösterir [28-30]. CD7 pozitif lösemi Karaciğere ait hematopoietik dönemin çok primitif hematopoietik öncüllerinde, normal myeloid öncüllerde ve B öncül hücrelerde saptanan bir antijendir. Diferansiye olamamış hücrelerde tek başına ya da CD13 ile birlikte saptanabilir. B- HÜCRELERİNİN OLGUNLAŞMASI ve B ALL: B-hücre serisine yönlenmenin ardından CD20, CD10, CD19, ntdt ve sitoplazmik CD79a (ccd79a) ekspresyonu ortaya çıkar. CD34 ve ntdt kaybolurken CD10 ekspresyonu azalır. CD20 ekspresyonu ortaya çıkar. Sitoplazmada (c) Ig µ ağır zincir birikimi başlar. Ig hafif zincir sentezini takiben fonksiyonel olarak olgun olmayan B-lenfositin yüzeyinde (surface; s) IgM eksprseyonu ortaya çıkar. Bu olgunlaşma aşamalarına göre prekürsör B-ALL dört gruba ayrılır [19, 21, 31-35]; 1) Bl/ProB/Early B ya da null ALL : CD19+, ccd79a+, HLA-DR+, Tdt+, CD10, CD20, cyigm, Sig 2) Bll/ EarlyB ya da common ALL : CD19+, ccd79a+, HLA-DR+, Tdt+, CD10+, CD20+/, cyigm, Sig 3) Blll ya da pre-b ALL : CD19+, ccd79a+, HLA-DR+, Tdt+, CD10+, CD20+/, cyigm+, Sig 4) BlV ya da matür B ALL : CD19+, ccd79a+, HLA-DR+, Tdt+, CD10+, CD20+/, cyigm-, Sig+ (κ ya da λ ) Ancak olgunlaşma evresindeki antijenik yapılar her zaman tam olarak bu şemaya uygun olmayabilir ve B ve T ALL hücrelerinde aberran ekspresyonlar gözlenebilir. Prognozla ilişkili genetik translokasyonları tanımlamak için spesifik antikor kombinasyonları kullanılabilir. t(12;21) (q12;q22)- (TEL/AML1) [4, 7, 36-38] ve hiperploid DNA içeriği [38-40]. iyi prognozla ilişkilidir ve immünofenotipi CD20 nin az ya da yok olması, CD10 un fazla ekspresyonu ve bimodal CD34 ekspresyonu ile karakterizedir. Kötü prognozla ilişkili t(9;22) (q34;q11) ve t(4;11) (q21;q23) translokasyonları, özgün CD34 ve CD38 ekspresyonu gösterir q23 translokasyonları NG2 ve CD15 pozitifliği ve CD10 un negatif olması ile karakterizedir.[36, 40-43]. T ALL: Benzer şekilde T ALL de dört gruba ayrılır [21]; 1) Tl ya da pro-t ALL: Diğer T antijenleri olmaksızın erken T-belirteçleri olan ccd3/cd7 birlikte ekspresyonu gösterir. 2) Tll ya da pre-t ALL: ccd3/cd7 ekspresyonuna ek olarak CD2, CD5 ve/veya CD8 ekspresyonu görülür. 3) Tlll ya da kortikal ALL: CD1a reaktivitesi izlenir. 4) TlV ya da matür ALL: scd3+, CD1a-, CD4+ ya da CD8+ olmakla birlikte bu fenotip daha çok T-lenfoblastik lenfomada izlenir. Tlll ve TlV de izlenen CD3 ekspresyonu, TCRα/ß ya da TCRγ/d tiplerinin ekspresyonu ile ilişkili olabilir.

3 Tablo 1: Akut lösemilerde immünofenotipleme [44]. Geniş spektrumlu ekspresyon gösteren antijenler Pan-myeloid: CD13, CD33, CD64, MPO Pan-B-hücre: ccd22, CD19, CD24, ccd79α β Pan-T-hücre: ccd3, CD5, CD7 İmmatürite göstergesi antijenler Pan-lenfoid and myeloid: Tdt, CD34, CD133, CD135 Pan-myeloid CD117 Hücre serisine özgü ve matürasyon bağımlı antijenler Myeloid hücreler: CD14, CD15, CD65, Laktoferrin Eritroid hücreler : Glikoforin A Trombositler : CD41a, CD61 B-hücre : CD20, clgµ, slg, κ λ T-hücre : CD1a, CD2, scd3, CD4, CD8 NK-hücre : CD16, CD56 Tablo 2: B-ALL tanımlanmasında kullanılabilecek antikor kombinasyonları [44]. CD19 POZİTİF BLASTLAR FITC R-PE Üçüncü renk CD2 HLA-DR CD19 CD24 CD33 CD19 CD65 CD13 CD19 CD38 CD22 CD19 CD34 CD135 CD19 CD16 CD56 CD19 CD15 CD14 CD19 CD61 GlycoA CD19 ccd79α CD79β CD19 TdT cigµ CD19 SmIg CD20 CD19 κ λ CD19 FITC R-PE Üçüncü renk Dördüncü renk CD66c NG2 CD45 CD34 CD34 CD133 CD19 CD38 CD15 CD14 CD19 HLA-DR CD65 CD33 CD19 CD13 CD2 CD22 CD19 CD38 SmIg cigµ CD19 CD20 CD61 CD135 CD19 CD45 TdT cigµ CD19 CD20 CD10 CD34 CD19 CD20 CD58 CD10 CD19 CD45 ccd79α CD79b CD19 CD20 CD16 CD56 CD19 CD24

4 Tablo 3: T-ALL tanımlanmasında kullanılabilecek antikor kombinasyonları [44]. CD7 POZİTİF BLASTLAR FITC R-PE Üçüncü renk CD3 CD5 CD7 CD10 CD2 CD7 CD1a HLA-DR CD7 CD65 CD13 CD7 CD34 CD38 CD7 CD33 CD117 CD7 CD16 CD56 CD7 CD15 CD14 CD7 CD61 Glikoforin A CD7 TdT ccd3 CD7 TCRαβ TCRγδ CD3 CD45RA CD45R0 CD7 FITC R-PE Üçüncü renk Dördüncü renk CD66c NG2 CD45 CD34 CD10 CD5 CD3 CD7 CD1a CD38 CD3 CD7 CD65 CD33 CD45 CD7 CD15 CD2 CD14 CD7 CD16 CD56 CD8 CD7 CD13 CD33 CD45 CD7 CD61 GlikoforinA CD45 CD7 CD45RA CD45R0 CD3 CD7 CD13 CD117 CD34 CD7 TdT ccd3 CD3 CD7 TCRαβ TCRγδ CD3 CD7 Referanslar: 1] Bene MC, Bernier M, Castoldi G, Faure GC, Knapp W, Ludwig WD, Matutes E, Orfao A, Van t Veer M on behalf of EGIL (European Group on Immunological Classification of Leukemias). Impact of immuno-phenotyping on management of acute leukemias. Haematologica 1999; 84: ] Orfao A, Chillon MC, Bortoluci AM, Lopez-Berges MC, Garcia-Sanz R, Gonzalez M, Tabernero MD, Garcia-Marcos MA, Rasillo AI, Herna ndez-rivas JM, San Miguel JF. The flow cytometric pattern of CD34, CD15 and CD13 expression in acute myeloblastic leukemia is highly characteristic of the presence of PML-RAR-alpha gene rearrangements. Haematologica 1999; 84: ] Ortuno Giner F, Orfao A. Aplicacion de la citometria de flujo al diagnostico y seguimiento inmunofenotipico de las leucemias agudas. Med Clin (Barc) 2002; 118: ] De Zen L, Orfao A, Cazzaniga G, Masiero L, Cocito MG, Spinelli M, Rivolta A, Biondi A, Basso G. Quantitative multiparametric immunophenotyping in acute lymphoblastic leukemia. Correlation with specific genotype. IETV6/AML1 ALLs identification. Leukemia 2000; 14: ] Tabernero MD, Bortoluci AM, Alaejos I, Lopez-Berges MC, Rasillo A, Garcia-Sanz R, Garcia M, Sayagues JM, Gonza lez M, Mateo G, San Miguel JF, Orfao A. Adult precursor B-ALL with BCR/ABL gene rearrangements displays a unique immunophenotype based on the pattern of CD10, CD34, CD13 and CD38 expression. Leukemia 2001; 15: ] Weir EG, Borowitz MJ. Flow cytometry in the diagnosis of acute leukemia. Semin Hematol 2001; 38: ] Borowitz MJ, Rubnitz J, Nash M, Pullen DJ, Camitta B. Surface antigen phenotype can predict TEL-AML1 rearrangement in childhood Bprecursor ALL: a pediatric oncology group study. Leukemia 1998; 12: ] Borowitz MJ, Hunger SP, Carroll AJ, Shuster JJ, Pullen DJ, Steuber CP, Cleary ML. Predictability of the t(1;19)(q23;p13) from surface antigen phenotype: implications for screening cases of childhood acute lymphoblastic leukemia for molecular analysis: a pediatric oncology group study. Blood 1993; 82: ] Navid F, Mosijczuk AD, Head DR, Borowitz MJ, Carroll AJ, Brandt JM, Link MP, Rozans MK, Thomas GA, Schwenn MR, Shields DJ, Vietti TJ, Pullen DJ. Acute lymphoblastic leukemia with the (8;14)(q24;q32) translocation and FAB L3 morphology associated with a B- precursor immunophenotype: the pediatric oncology group experience. Leukemia 1999; 13: ] Szczepanski T, Orfao A, van der Velden VH, San Miguel JF, van Dongen JJM. Minimal residual disease in leukaemia patients. Lancet Oncol 2001; 2: ] Campana D. Determination of minimal residual disease in leukaemia patients. Br J Haematol 2003; 121: ] Vidriales MB, Orfao A, San-Miguel JF. Immunologic monitoring in adults with acute lymphoblastic leukemia. Curr Oncol Rep 2003; 5: ] Orfao A, de Santiago M, Matarraz S, Lopez A, del Canizo MC, Fernandez ME, Villaron E, Vidriales B, Suarez L, Ortuno F, Escribano L, San Miguel JF. Contribucion del inmunofenotipo al estudio de los sindromes mielodisplasicos. Haematologica 2003; 88 (supp 6): ] Terstappen LW, Hollander Z, Meiners H, Loken MR. Quantitative comparison of myeloid antigens on five lineages of mature peripheral blood cells. J Leukoc Biol 1990; 48: ] Almeida J, Bueno C, Alguero MC, Sanchez ML, de Santiago M, Escribano L, Diaz Agustin B, Vaquero JM, Laso FJ, San Miguel JF, Orfao A. Comparative analysis of the morphological, cytochemical, immunophenotypical, and functional characteristics of normal human

5 peripheral blood lineage(-)/cd16(+)/hla-dr(+)/cd14(-/lo) cells, CD14(+) monocytes, and CD16(-) dendritic cells. Clin Immunol 2001; 100: ] Terstappen LW, Loken MR. Myeloid cell differentiation in normal bone marrow and acute myeloid leukemia assessed by multidimensional flow cytometry. Anal Cell Pathol 1990; 2: ] Terstappen LW, Safford M, Loken MR. Flow cytometric analysis of human bone marrow. III. Neutrophil maturation. Leukemia 1990; 4: ] Wells DA, Loken MR. Normal antigen expression in hematopoiesis. In: Stewart CC, Nicholson JKA, editors. Immunophenotyping. New York: John Wiley & Sons Inc.; p ] Menendez P, Prosper F, Bueno C, Arbona C, San Miguel JF, Garcia Conde J, Sola C, Cortes Funes H, Orfao A. Sequential analysis of CD34+ and CD34- cell subsets in peripheral blood and leukapheresis products from breast cancer patients mobilised with SCF plus G-CSF and cyclophosphamide. Leukemia 2001; 15: ] Menendez P, Canizo MC, Orfao A. Immunophenotypic characteristics of PB-mobilised CD34+ hematopoietic progenitor cells. J Biol Regul Homeost Agents 2001; 15: ] Bene MC, Castoldi G, Knapp W, Ludwig WD, Matutes E, Orfao A, Van t Veer MB for the European Group for the Immunological Characterisation of Leukaemias. Proposals for the immunological classifi-cation of acute leukemias. Leukemia 1995; 9: ] Sperr WR, Jordan JH, Baghestanian M, Kiener HP, Samorapoompichit P, Semper H, Hauswirth A, Schernthaner GH, Chott A, Natter S, Kraft D, Valenta R, Schwartz LB, Geissler K, Lechner K, Valent P. Expression of mast cell tryptase by myeloblasts in a group of patients with acute myeloid leukemia. Blood 2001; 98: ] Escribano L, Diaz-Agustin B, Lopez A, Nunez R, Prados A, Orfao A on behalf of the Spanish Network on Mastocytosis (REMA). Immunophenotypic analysis of mast cells in mastocytosis: when and how to do it? Proposals of the Spanish Network on Mastocytosis (REMA). Clinical Cytometry DOI: /cyto.b ] Loken MR, Shah VO, Dattilio KL, Civin CI. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development. Blood 1987; 69: ] Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HT, Sultan C. Criteria for the diagnosis of acute leukaemia of megakaryocyte lineage (M7). A report of the French-American-British Cooperative Group. Ann Int Med 1985; 103: ] San Miguel JF, Gonzalez M, Canizo MC, Ojeda E, Orfao A, Moro MJ, Fisac P, Romero M, Lopez Borrasca A. Leukaemias with megakaryoblastic involvement: clinical, hematological and immunological characteristics. Blood 1988; 72: ] Flenghi L, Fagioli M, Tomassoni L, et al. Characterization of a new monoclonal antibody (PG-M3) directed against the aminoterminal portion of the PML gene product: immunocytochemical evidence for high expression of PML proteins on activated macrophages, endothelial cells, and epithelia. Blood 1995; 85: ] Paietta E, Wiernik PH, Andersen J, Bennett J, Yunis J. Acute myeloid leukemia M4 with inv(16) (p13q22) exhibits a specific immunophenotype with CD2 expression. Blood 1993; 82: ] Adriaansen HJ, te Boekhorst PA, Hagemeijer AM, van der Schoot CE, Delwel HR, van Dongen JJ. Acute myeloid leukemia M4 with bone marrow eosinophilia (M4Eo) and inv(16) (p13q22) exhibits a specific immunophenotype with CD2 expression. Blood 1993; 81: ] Larson RA, Willians SF, Le Beau MM, Bitter MA, Vardiman JW, Rowley JD. Acute myelomonocytic leukemia with abnormal eosinophils and inv (16) or t(16;16) has a favorable prognosis. Blood 1996; 68: ] Loken MR, Shah VO, Dattilio KL, Civin CI. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood 1987; 70: ] Ciudad J, San Miguel JF, Lopez-Berges MC, Garcia-Marcos MA, Gonzalez M, Vazquez L, del Canizo MC, Lopez A, van Dongen JJM, Orfao A. Detection of abnormalities in B-cell differentiation pattern is a useful tool to predict relapse in precursor-b-all. Br J Haematol 1999; 104: ] Lucio P, Parreira A, van den Beemd MWM, van Lochem EG, van Wering ER, Baars E, Porwit-MacDonald A, Bjorklund E, Gaipa G, Biondi A, Orfao A, Janossy G, van Dongen JM, San Miguel JF. Flow cytometric analysis of normal and leukemic bone marrow B-cell differentiation: a frame of reference for the detection of minimal residual disease in precursor B-ALL patients. Leukemia 1999; 13: ] Dworzak MN, Fritsch G, Froschl G, Printz D, Gadner H. Four-color flow cytometric investigation of terminal deoxynucleotidyl transferase-positive lymphoid precursors in pediatric bone marrow: CD79a expression precedes CD19 in early B-cell ontogeny. Blood 1998; 92: ] Rudin CM, Thompson CB. B-cell development and maturation. Semin Oncol 1998; 25: ] Trka J, Zuna J, Haskovec C, et al. Detection of BCR/ABL, MLL/AF4 and TEL/AML1 hybrid genes and monitoring of minimal residual disease in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia. Cas Lek Cesk 1999; 138: ] Raynaud SD, Dastugue N, Zoccola D, Shurtleff SA, Mathew S, Raimondi SC. Cytogenetic abnormalities associated with the t(12;21); a collaborative study of 169 children with t(12;21)-positive acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 1999; 13: ] Maloney K, Mc Gavran L, Murphy J, et al. TEL-AML1 fusion identifies a subset of children with standard risk acute lymphoblastic leukemia who have an excellent prognosis when treated with therapy that includes a single delayed intensification. Leukemia 1999; 13: ] Behm FG, Raimondi SC, Schell MJ, Look AT, Rivera GK, Pui CH. Lack of CD45 antigen on blast cells in childhood acute lymphoblastic leukemia is associated with chromosomal hyperdiploidy and other favorable prognostic features. Blood 1992; 79: ] Forestier E, Johansson B, Gustafsson G, et al. Prognostic impact of karyotypic findings in childhood acute lymphoblastic leukaemia: a Nordic series comparing two treatment periods. For the Nordic Society of Paediatric Haematology and Oncology (NOPHO) Leukaemia Cytogenetic Study Group. Br J Haematol 2000; 110: ] Pui CH, Behm FG, Downing JR, et al. 11q23/MLL rearrangement confers a poor prognosis in infants with acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol 1994; 12: ] Behm FG, Smith FO, Raimondi SC, Pui CH, Bernstein ID. Human homologue of the rat chondroitin sulfate proteoglycan, NG2, detected by monoclonal antibody 7.1, identifies childhood acute lymphoblastic leukemias with t (4;11) (q21;q23) or t(11;19)(q23;p13) and MLL gene rearrangements. Blood 1996; 87: ] Smith FO, Rauch C, Williams DE, et al. The human homologue of rat NG2, a chondroitin sulfate proteoglycan, is not expressed on the cell surface of normal hematopoietic cells but is expressed by acute myeloid leukemia blasts from poor-prognosis patients with abnormalities of chromosome band 11q23. Blood 1996; 87: ] Basso G, Buldini B, Zen LD, Orfao A. New methodologic approaches for immunophenotyping acute leukemias. Haematologica 2001; 86: