ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ. Zeliha YAŞA BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ANKARA Her hakkı saklıdır

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ ASMA (Vitis vinifera L.) DA ÖNEMLİ VEGETATİF VE GENERATİF KARAKTERLER İLE HASTALIKLARA DAYANIM ÖZELLİKLERİNE YÖNELİK GENOM HARİTALAMASI Zeliha YAŞA BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ANKARA 2005 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Doktora Tezi ASMA (Vitis vinifera L.) DA ÖNEMLİ VEGETATİF VE GENERATİF KARAKTERLER İLE HASTALIKLARA DAYANIM ÖZELLİKLERİNE YÖNELİK GENOM HARİTALAMASI Zeliha YAŞA Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Danışman: Prof.Dr. Gökhan SÖYLEMEZOĞLU Bu araştırmada, V. vinifera L. varyetesi olan Italia ve Mercan üzüm çeşitlerinin melezlenmesi ile elde edilen F 1 populasyonu kullanılarak (60 F ebeveyn) genom haritasının çıkarılması ve incelenen morfolojik ve hastalıklara dayanım özelliklerine yönelik bağlantı analizinin yapılması amaçlanmıştır. Bu populasyon Tekirdağ bağcılık Araştırma Enstitüsü nde geliştirilmiştir. Populasyonun genom haritalaması amacıyla seçilmesinin nedeni F 1 populasyonunun hastalıklara dayanım ve diğer morfolojik özellikler açısından açılım göstermesidir. Araştırmada gerçekleştirilen RAPD reaksiyonlarında toplam 300 adet primer test edilmiştir. Amplifikasyon ürünleri negatif filmden "var" ya da "yok" diye değerlendirildikten sonra yapılan χ2 testleri sonucunda 1:1 ve 3:1 dağılım gösteren polimorfik lokuslar belirlenmiştir. Italia çeşidinde 59, Mercan çeşidinde ise sadece 55 adet lokus bağlantı analizlerinde kullanılabilmiştir. Haritanın çıkartılması amacıyla Mapmaker/Exp 3.0 paket programında farklı LOD değerleri kullanılmıştır. Genom haritalaması için çift yönlü-yalancı melezleme tekniği kullanılmıştır. Ana ve baba ebeveyne ait 2 ayrı genetik bağlantı haritası elde edilmiş olup 8 (ana) ve 6 (baba) bağlantı grubu içermiştir. Bağlantı gruplarına yerleşen lokusların incelenen morfolojik ve hastalılara dayanım karakterlere olan bağlantılarını tespit etmek amacıyla regresyon ve varyans analizleri yapılmıştır. Analiz sonuçlarına göre p 0.01 önem derecesinde iki adet karakterin (çiçeklenme zamanı ve küllemeye dayanım) sırasıyla 1 ve 2 markör lokusu ile bağlantılı oldukları tespit edilmiştir. Regresyon analizi diğer markör- kantitatif karakter ilişkilerini de göstermektedir. 2005, 123 sayfa Anahtar Kelimeler: Asma, genetik harita, bağlantı analizi, QTL, RAPD i

3 ABSTRACT Ph.D. Thesis GENOME MAPPING IN GRAPE (Vitis vinifera L.) FOR SOME IMPORTANT VEGETATIVE, GENERATIVE AND DISEASE RESISTANCE TRAITS Zeliha YAŞA Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Horticulture Supervisor: Prof.Dr. Gökhan SÖYLEMEZOĞLU This research was conducted to construct genetic linkage maps of Vitis (2n =38) from grape populations (60 F parents) of crossing of Italia and Mercan (Vitis vinifera L.) cultivars. This cross was developed at Tekirdağ Viticultural Research Institute in 1992 and was chosen because the progeny segregated for disease resistant and other important vegetative and generative traits. RAPD reactions was performed by using a total of 300 RAPD primers. The amplification products were scored from negatives as presence or absence. The parental data was used to calculate goodness-of-fit for the segregating markers using χ 2 analysis. Only 59 loci for Italia and 55 loci for Mercan could be used for linkage analysis. Mapmaker/ Exp.3.0 was used for genetic linkage analysis and multipoint ordering among markers at different LOD scores. Genetic linkage maps were developed by using the double-pseudotestcross mapping approach. Italia and Mercan resulted in having 8 (maternal) and 6 (paternal) linkage groups, respectively. Loci placed on the linkage groups were further analyzed by regression and variance analyses in order to determine possible linkages between the loci and morphological and disease resistance characteristics. According to the results, only two characters, flowering time and resistance to powdery mildew, were found to be significantly linked (p 0.01) to 1 and 2 marker loci, respectively. Other marker-qtl relationships are also provided from regression analysis. 2005, 123 pages Keywords: grape, genetic map, linkage analysis, QTL, RAPD ii

4 TEŞEKKÜR Asma (Vitis vinifera l.) da önemli vegetatif ve generatif karakterler ile hastalıklara dayanım özelliklerine yönelik genom haritalaması konusunda bana çalışma olanağı veren, yardımlarını esirgemeyen ve çalışmalarımın her aşamasında beni yönlendirip fikir ve tecrübelerini aktaran Danışman Hocam Sayın Prof.Dr. Gökhan SÖYLEMEZOĞLU na, Tez İzleme Komitesi nde bulunan, her konuda yardım ve desteklerini esirgemeyen Sayın Prof.Dr. Hasan ÇELİK e ve Sayın Prof.Dr. Sebahattin ÖZCAN a teşekkürlerimi sunarım. Tez kapsamında incelenen morfolojik ve hastalıklara dayanım karakterlerinin gözlem ve değerlendirmesini gerçekleştiren T.C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü nden Sayın Dr. Cengiz ÖZER e, sonuçların değerlendirilmesi konusunda eşsiz yardımlarından dolayı Sayın Prof.Dr. Zeki KAYA ya (Ortadoğu Teknik Üniversitesi) ve tezi en ince detayına kadar okuyup fikirleri ile bana yol gösteren Sayın Prof.Dr. Y.Sabit AĞAOĞLU na ve çalışmam süresince verdiği destekten dolayı Sayın Prof.Dr. Birhan MARASALI KUNTER e teşekkür ederim. Çalışmam sırasında yardım ve desteklerini esirgemeyen Sayın Doç. Dr. Ali ERGÜL e, Dr. Hüseyin KARATAŞ a, ve Mehmet TÜRKOĞLU na, biyolog Sevgi BOZTAŞ ve Sevil MADEN e teşekkür ederim. Tez sonuçlarımın istatistiki değerlendirmesi konusunda yardımcı olan Sayın Doç.Dr. Mehmet Ali YILDIZ a, Araş.Gör. Özgür KOŞKAN a ve Araş.Gör Abdullah ÖZSOY a teşekkürü bir borç bilirim. Bu çalışma boyunca sevgi, destek ve anlayışları ile her zaman yanımda olan tüm YAŞA ailesi ile özellikle ağabeyim Mehmet YAŞA ya şükranlarımı sunarım. Zeliha YAŞA Ankara, Temmuz 2005 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii SİMGELER DİZİNİ...v ŞEKİLLER DİZİNİ...vii ÇİZELGELER DİZİNİ...viii 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER Asma Islahı ve Genetiği Moleküler Markörler Markör Sistemi Seçimi Harita Oluşturma Klasik Haritalama QTL Haritalama MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Yöntem DNA ekstraksiyonu PCR uygulaması Agaroz jel elektroforezi Genetik bağlantı analizi ve kantitatif karakter lokus (QTL) Haritalama Kantitatif karakter analizi ARAŞTIRMA BULGULARI Fenotipik Analiz Moleküler Analiz Genetik Bağlantı Analizi Kantitatif Karakter Analizi TARTIŞMA ve SONUÇ...75 KAYNAKLAR...81 EKLER...91 EK EK EK EK EK EK EK EK EK EK ÖZGEÇMİŞ iv

6 SİMGELER DİZİNİ DNA Mbp Pg C RFLP RAPD cm QTL STS CAPS AFLP BSA SCAR ISSR RGA SSR cdna PCR DAF AP-PCR ng YAC MAS DDGE SSCP ASAP SPAR STR Deoksiribo Nükleik Asit Mega base pair Pikogram Replike Olmamış Haploid Kromozoma Ait DNA kapsamı Restriction Fragment Length Polymorphism Random Amplified Polymorphic DNA centimorgan Quantitative Trait Locus / Loci Sequence Tagged Sites Cleaved Amplified Polymorphic Sites Amplified Fragment Length Polymorphism Bulked Segregant Analysis Sequence Characterized Amplified Regions Inter-Simple Sequence Repeats Resistance Gene Analogs Simple Sequence Repeats cloned DNA Polymerase Chain Reaction DNA Amplification Fingerprinting Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction Nanogram Yeast Artificial Chromosome Marker Assisted Selection Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Single Strand Conformation Polymorphism Allele Specific Associated Primers Single Primer Amplification Reaction Short Tandem Repeats v

7 BC Backcross RIL Recombinant Inbred Lines DH Doubled Haploids NIL Nearly Isogenic Lines OIV Organisation Internationale de la Vigne et du Vin UPOV International Union for the Protection of New Varieties PVPP Polyvinylpolypyrolidone ml Mililitre rpm Dakikada Dönüş Sayısı TE Tris-EDTA Çözeltisi RNase Ribonükleaz RNA Ribonükleik asit EDTA Etilen aimine Tetra Asetik Asit mm Milimol M Mol CTAB Hekzadesil Trimetil-Amonyum Bromür mg Miligram µl Mikrolitre MgCl 2 Magnezyum Klorür dntp Deoksi-Nüklozid trifosfat TBE Tris-Borik Asit- EDTA Çözeltisi UV Ultraviyole LOD Maximum Likelihood Odds Value Ort. Ortalama S.S. Standart Sapma ANOVA Varyans Analizi vi

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 3.1. Italia üzüm çeşidi...42 Şekil 3.2 Mercan üzüm çeşidi...42 Şekil 4.1. Italia x Mercan populasyonunda elde edilen DNA ların agaroz jel (%1.5) üzerindeki görüntüleri...63 Şekil 4.2. Italia üzüm çeşidine ait bağlantı grupları...67 Şekil 4.3. Mercan üzüm çeşidine ait bağlantı grupları...68 vii

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1. Belli başlı bitki türlerinde akış sitometrisi ile belirlenen genomik DNA kapsamı...4 Çizelge Vitis türleri, çeşitleri ve diğer Vitis cinslerine ait DNA kapsamı.5 Çizelge 3.1. Ön deneme çalışmalarında kullanılan çoğaltma ve döngü koşulları...58 Çizelge 4.1. Italia x Mercan populasyonunda incelenen fenotipik özeliklerine ait istatistiksel değerlendirme...62 Çizelge 4.2. Açılım gösteren RAPD lokusları hakkında bilgi...64 Çizelge 4.3. Italia x Mercan a ait genetik haritaların karşılaştırılması...69 Çizelge 4.4. Italia çeşidinde bağlantı gruplarına yerleşen markörler ve uzaklıkları...70 Çizelge 4.5. Mercan çeşidinde bağlantı gruplarına yerleşen markörler...71 Çizelge 4.6. Italia ve Mercan çeşitlerinde bağlantı analizi sonuçları...72 Çizelge 4.7. Binary lojistic regresyon analizi sonuçları...73 Çizelge 4.8. Hastalığa dayanım karakterleri üzerinde ANOVA testi sonuçları...74 viii

10 1. GİRİŞ Asma (Vitis vinifera L.) dünyada en fazla yetiştirilen ve en fazla ekonomik öneme sahip meyve türlerinin başında gelir. Bunun en önemli nedeni; asmanın ürünü olan üzümün sofralık, kurutmalık, meyve suyu ve şaraplık gibi çok yönlü değerlendirme şekillerine sahip olmasıdır. Aynı zamanda rakı, konyak ve hafif içkiler gibi yüksek ticari öneme sahip ürünler olarak da değerlendirilmektedir. Bağcılık ve şarap yapımı binlerce yıldan beri insan kültürünün ve bazı dinlerin bir parçası olmuştur. Bugün, ekonomik öneme sahip bir ürün olmasının dışında, Batı dünyasında değişik sektörlerde çok geniş iş sahası yaratması ve bazı durumlarda ulusal kültür veya yaşam stili ile bağlantılı olmasından dolayı ayrıca bir öneme sahiptir. Asma ıslah çalışmaları, başlangıçta filokseraya yüksek düzeyde dayanımlı, geniş adaptasyon yeteneğine sahip ve Vitis vinifera L. ile iyi uyuşan, yüksek oranda köklenen Amerikan türlerini belirlemek ve bu türler arasında amaca en uygun olanlarını seçmek veya bu türler arasında ve bu türlerle Vitis vinifera L. arasında melezlemeler yapmak suretiyle istenilen karakterlerin kombine edildiği yeni asma anaçları elde etmek, yine külleme, mildiyö ve kurşuni küfe dayanıklı ve vinifera nın verim ve kalite özelliklerini taşıyan çeşitlerin elde edilmesi konularına öncelik verilerek başlatılmış; zaman içerisinde bu konulara ek olarak verimin arttırılması, kalitenin yükseltilmesi, çekirdeksiz çeşitlerin elde edilmesi, erkenci ve geçci çeşitlerin elde edilmesi, kuraklık ve soğuk gibi stres koşullarına dayanıklılık konularında yeni çeşitler elde etmeyi amaçlayan çalışmalar şeklinde devam etmektedir. Asmalarda yukarıda belirtilen amaçlara yönelik olarak çeşitlerin geliştirilmesi, uygun ebeveynlerin melezlenerek elde edilecek F 1 populasyonlarından yapılacak seleksiyona dayanmaktadır. Kaçınılmaz olan klasik asma ıslah çalışmaları oldukça uzun ve yoğun bir emek gerektirmektedir. Asmanın diğer çok yıllık meyve türlerine göre daha kısa (3-5 yıl) gençlik kısırlığı (yenice safhası) na sahip olmasına rağmen, seleksiyon işlemi F 1 bitkilerinin fenotipleri ve genotipleri arasındaki ilişkilendirilmenin belirsizlik göstermesi nedeniyle ilk yıllarda yapılamamaktadır (Reisch et al. 1994). Amaca uygun F 1 lerin seleksiyonunun uzun yıllar alması, melezleme ıslahının en önemli dezavantajını 1

11 oluştururken, kendileme depresyonu, somatik mutasyonlar ve himeyreler bu süreçte karşılaşılan diğer problemler arasında gösterilmektedir. Bu koşullar gözönüne alındığında ıslahın seleksiyon kriterlerini oluşturan verim, kalite, çekirdeksizlik, olgunlaşma zamanı, tane rengi, salkım şekli, anacın gelişme kuvveti, abiotik ve biotik stres koşullarına dayanıklılığın belirlenmesi gibi özelliklerin tespiti uzun yıllar almaktadır. Bu araştırmada, asmanın (Vitis vinifera L.) ve bağcılık kültürünün anavatanı olan ülkemizde, ilk defa Melezleme Tekniği İle Külleme ve Mildiyöye Dayanıklı Standart Özelliklere Sahip Yeni Üzüm Çeşitlerinin Elde Edilmesi konulu ülkesel proje kapsamında Italia x Mercan çeşitlerinin melezlenmesinden elde edilen F 1 populasyonu kullanılarak, 35 adet vegetatif ve generatif karakter ile, Külleme (Uncinula necator), Mildiyö (Plasmopara viticola) ve Kurşuni Küf (Botrytis cinerea Pers.) gibi hastalıklara dayanım özelliklerini içeren asmanın genom haritasının çıkartılması amaçlanmıştır. Çalışma sonucunda ortaya çıkartılacak genom haritası aracılığıyla; 1) asma genomunu daha iyi tanımayı sağlayacak moleküler markörlerin geliştirilmesi, 2) moleküler markörlerin 38 adet vejetatif ve generatif karakterle, külleme, mildiyö ve kurşuni küf gibi hastalıklara dayanım özelliklerini kontrol eden gen/genlere bağlanması, 3) araştırmada incelenecek olan kalitatif ve kantitatif özellikleri kontrol eden gen / bölgelerin kromozom üzerindeki muhtemel yerlerinin belirlenmesi ve 4) tüm bunlardan sonra bir başka deyişle genom haritasının çıkarılmasından sonra kalıtımda dominant olan RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markörlerin kodominant olan SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sites), AS-PCR (Allele Specific-Polymerase Chain Reaction) gibi markörlere dönüştürülerek asma ıslah çalışmalarında çok erken dönemlerde arzu edilen özelliğe göre seleksiyon imkanı sağlaması ve bu markörlerin dünyanın herhangi bir yerinde oluşturulan F 1 populasyonlarında da denenmesi suretiyle, genom haritalarının birbirine bağlanması amaçlanmıştır. 2

12 2. KURAMSAL TEMELLER Asma (Vitis vinifera L.) dünyada yetiştirilen bahçe bitkileri türleri içinde çok önemli bir yere sahip türdür. Yaklaşık 7.7 milyon hektarlık alanda 65.5 milyon tona varan üretim hacmi ile ilk sıralarda yer almaktadır (Anonymous 2004). Dünya üzerinde ekonomik olarak çok büyük önemi olan üzüm yetiştiriciliği ve üzümden elde edilen ürünlerin çeşitliliği ve zenginliği, asmanın bir çok yönleri ile ele alınmasına ve üzerinde derin araştırmalar yapılmasına sebep olmuştur (Ağaoğlu 1999). Galet (1988) Vitaceae familyasına ait asmada 14 cins ve 1000 in üzerinde tür bulunduğunu ifade etmiştir. Vitis cinsi içerisinde yer alan Vitis vinifera L. türü ticari öneme sahip çeşitleri bünyesinde barındırmaktadır. Asmanın (Vitis vinifera L.) genomu hakkındaki bilgiler incelendiğinde, diğer çok yıllık bitkilere oranla nispeten küçük bir genoma sahip olduğu görülmektedir. Bazı türlerde akış sitometrisi (flow cytometry) yöntemi ile belirlenen nüklear DNA kapsamı Çizelge 2.1 de verilmiştir (Arumuganathan and Earle 1991). Elde edilen sonuçlara göre asma genomunun 483 Mbp/1C DNA kapsamına sahip olduğu belirtilmiştir. Lodhi (1994), Vitis türleri, çeşitleri ve diğer Vitis cinsleri arasında DNA kapsamını belirlemek amacıyla yaptığı çalışmada Vitis türleri arasında istatistik öneme sahip olmayan farklılık bulmuştur (Çizelge 2.2). Araştırıcı, Arumuganathan and Earle (1991) den farklı olarak asma genomunun 475 Mbp/1C olarak tespit etmiştir. Toplam genomik DNA kapsamını bilmek, asmanın genom organizasyonunu anlamak ve gen klonlamak açısından önemlidir. Ayrıca evrimsel ilişkiler kurmak, genom haritalamak ve ekolojik veya çevresel adaptasyon çalışmaları yapmak için önem arzeder. Flavell (1993) e göre diploid bir bitki, genomunda centimorgan (cm) DNA bulundurmaktadır (Lodhi 1994). 3

13 Çizelge 2.1. Belli başlı bitki türlerinde akış sitometrisi ile belirlenen genomik DNA kapsamı Tür ismi Yaygın ismi pg a /2C Mbp/1C b Allium cepa Soğan Arabidopsis thaliana Arabidopsis Brassica oleracea ssp. botrytis Karnabahar Brassica oleracea ssp. capitata Baş lahana Citrullus vulgaris Karpuz Citrus sinensis Portakal Helianthus annuus Ayçiçeği Hordeum vulgare Arpa Lactuva sativa Marul Lycopersicon esculentum Domates Malus x domestica (2n:2x) Elma Nicotiana tabacum (2n=4x) Tütün Oryza sativa ssp. Indica Çeltik Solanum melongena Patlıcan Triticum aestivum (2n=6x) Buğday Vitis vinifera L. Asma Zea mays Mısır a pg (pikogram): 965 milyon baz çifti (Mbp) b C: replike olmamış haploid kromozoma ait DNA kapsamı Kaynak: Arumuganathan and Earle (1991) 4

14 Çizelge 2.2. Vitis türleri, çeşitleri ve diğer Vitis cinslerine ait DNA kapsamı Genotip DNA (pg/2c) Mbp/1C Vitis türleri a. Asya V. amurensis V. betulifolia V. coignetiae V. flexuosa V. thunbergii V. yenshanensis b. Kuzey Amerika V. acerifolia Seleksiyon I 0, V. aestivalis 0, V. berlandieri 1, V. champinii 0, V. cinerea 0, V. labrusca 1, V. riparia 0, V.rupestris 1, V. vulpina 0, V. vinifera çeşitleri Cabernet Sauvignon 1, Chardonnay 0, Pinot noir 0, Thompson Seedless 0, Ebeveyn ve Döller Cayuga White 1, Aurore 0, C.White x Aurore No. 89 1, C.White x Aurore No.99 0, C.White x Aurore No.135 0, Vitaceae familyasına ait diğer türler Ampelopsis brevidenculata 1, Parthenocissus tricuspidata 1, Bennett et al. (1982) ve Lukaszewski et al. (1982) e göre genomik DNA kapsamı, bir türün kromozomlarının toplam büyüklüğü ile ilişkilidir ve Shetty (1959), Vitis türlerinin 5

15 ortalama kromozom büyüklüğünün m arasında olduğunu ifade etmiştir (Lodhi 1994). Bennett and Smith (1976), çiçekli bitkilerin somatik hücrelerindeki genomik DNA miktarının 5x10 7-8x10 19 baz çifti arasında olduğunu bildirirken; Flavell (1980) bitkilerin bütün özelliklerini belirleyen DNA nın yaklaşık baz çifti olduğunu ifade etmiştir. Aynı araştırıcı, ortalama bir mrna molekülünün yaklaşık 1200 baz uzunluğunda olduğunu ve haploid genomda yaklaşık gen bulunduğunu hesaplayarak tek bir gene ait ortalama 1.8x10 7 baz çifti uzunluğundaki bir mrna molekülünün transkripsiyonda görev aldığını ifade etmiştir (Lodhi 1994). Asma genomu yaklaşık olarak 4.75x10 8 bp/2c dir. Yukarıda yapılan açıklamaya göre; gen kodlayan bölge (3.6x10 7 bp) genomun sadece %7.6 sını oluşturmaktadır. Geri kalan genom ise büyük ihtimalle tekrar bölgeleri ile kodlama yapmayan bölgeleri kapsamaktadır Asma Islahı ve Genetiği Yabancı tozlanan çok yıllık bir bitki olması nedeniyle asma, ürün görmek için beklenen sürenin uzunluğu (2-5 yıl), kendilenme depresyonu ve somatik mutasyonlar ile himeyrelerin görülmesi gibi problemlerle karşı karşıyadır. Ayrıca, uygun genetik stokların olmaması asmaya yönelik genetik bilgi elde edilmesini sınırlamaktadır. Asmalar yüksek oranda heterozigottur ve klonal çoğaltma yoluyla korunmaları birörnek ve homozigot ebeveyn hatları oluşturma ihtiyacını ortadan kaldırmaktadır. Asmada çeşit geliştirme uygun ebeveynleri melezleyerek F 1 eldesini gerektirir. Ebeveynlerin yüksek oranda heterozigot olması nedeniyle döller de heterozigottur. Döl bazı lokuslarda bir F 2 gibi davranırken (3:1) bazı lokuslarda ise bir geri melezleme populasyonu (1:1) gibi davranır. Üstün özellikli genotiplerin seçimi bu tür populasyonlarda yapılır. Diğer çok yıllık bitkilere göre daha kısa gençlik kısırlığı dönemine sahip olmalarına rağmen asmalarda seleksiyon, fide döneminin erken 6

16 aşamalarında fenotip ve genotip arasında bir korelasyon belirsizliği nedeniyle yapılmamaktadır. Bu problemi aşmanın bir yolu; moleküler markörler kullanarak çevresel varyansı azaltmak suretiyle kalıtım derecesini araştırmaktır. Kantitatif karakterler, etkileri istatistiksel terminoloji ile açıklanan bir çok gen tarafından kontrol edilmektedir. Kalıtım, karakterde genetik etkilere atfedilen gözlenebilen varyansın miktarı olarak ifade edilmektedir. Kalıtımın ölçülmesi, genetik etkilerin çevresel etkilere göre önemini tahmin etmektedir. Bitki ıslahçısının amacı, ıslah populasyonunda istenen allelerin frekansını arttırmaktır. Bir populasyonda istenilen allellerin frekansının arttırılması, fenotip ile allelin varlığı arasında korelasyon olmasını gerektiren seleksiyonla yapılabilir. Bu şekilde elde edilen seleksiyon güdümlü artışlar, generasyon başına azdır ve ıslah amacına ulaşması için çok sayıda generasyon gerektirir. Bazı meyve türlerinde populasyon geliştirme stratejileri birkaç değişiklikle tarla bitkilerinde uygulanan stratejilerle aynıdır. Oysaki, klonal olarak çoğaltılan türlerde istenilen özelliğe sahip ebeveynler seçilir, melezlenir ve döllerde değerlendirme yapılır. Açılım gösteren döller incelenir ve üstün özellikteki bireyler seçilerek vegetatif olarak çoğaltılmak suretiyle korunur. Riemenschneider et al. (1988) kantitatif karaktelerde istenilen allellerin frekansının, fenotipik değerlerine bakılarak bireylerin seçimi ile bir generasyonda hızlı şekilde arttırılabildiğini, ancak, kalıtımın düşük olduğu kantitatif karakterlerde seleksiyonun daha az etkili olduğunu ifade etmişlerdir (Lodhi 1994). Genetik markörler, fenotip ve genotip arasında bir korelasyon kurulmasını mümkün kılmıştır. Bu markörler, bütün bitki türlerinde önem kazanmıştır. İzozim, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ve RAPD gibi teknikler genetik haritaların yapılmasında ve önemli genlerin etiketlenmesinde başarı sağlamıştır. Takip eden seleksiyon, parça değişiminin olmadığı durumlarda, morfolojik karakterlere bağlı bu markörlerin varlığına ve yokluğuna dayandırılarak yapılabilir. 7

17 2.2. Moleküler Markörler Protein ya da DNA'da bulunan polimorfizme dayanan "moleküler markörler"in geliştirilmesi; taksonomi, filojeni, ekoloji, genetik ve bitki ıslahında araştırmaları büyük oranda kolaylaştırmıştır. Aşağıda belirtilen özelliklerin genellikle bir moleküler markörde olması istenir: 1. Yüksek derecede polimorfik davranış, 2. Kodominant kalıtım, 3. Genomda sıkça bulunma, 4. Genomda düzgün dağılım, 5. Seçici nötr davranış (pleitropik etkisi yok), 6. Kolay ulaşım (satın alma veya hızlı işlemler sonucunda), 7. Kolay ve hızlı değerlendirme (otomasyona uygun işlemle), 8. Yüksek tekrarlanabilirlik, 9. Laboratuvarlar arası kolay veri alışverişi. Bu özelliklerin hepsi bir moleküler markörde bulunmamaktadır. Ancak çalışmanın amacına en uygun olanı seçerken yukarıdaki özelliklerden en azından bir kaçının bir arada bulunması istenir (Tanskley 1993, Weising et al. 1995). En fazla istenen markör, dayanıklılık geni ile bağlantısı bulunan, çok değişik genotiplerde ifade edilen ve fonksiyonel olandır (Kelly 1995). Markör tipleri A. Morfolojik: Tek lokus ile idare edilen morfolojik özellikler, değişik çevre koşullarında ifade edilebildiği sürece genetik markör olarak kullanılabilir. Kodominant morfolojik markörler seleksiyonla genetik tepkinin tahmin edicisi olarak fayda 8

18 sağlasalar da çevresel ve genetik (epistasis) gibi faktörlerden etkilenirler (Staub et al. 1996). B. İzozimler: Elektroforetik işlemler (genellikle nişasta jeli) aracılığıyla birbirinden ayırtedilebilen farklı yüklere sahip protein molekülleridir. Spesifik biyokimyasal reaksiyonları katalize etmelerinden dolayı belli bir enzimin jel üzerindeki yerini, uygun kofaktör ve maddeleri sağlayarak ve renk üreten bir reaksiyonda enzimatik reaksiyon ürününü bulundurarak görsel hale getirmek mümkündür. Renkli ürün jelde birikir ve elektroforetik olarak jele yerleşen enzim belirgin bir bant oluşturur. Elde edilen bantlar protein ürünlerini gösterir, genetik temele dayanır ve kodominant markör olarak genetik bilgi sağlayabilir. Ancak, izozim lokuslarının azlığı ve translasyon sonrası değişimlere açık olmaları kullanım olanaklarını sınırlamaktadır (Staub et al. 1982, Bernatzky and Tanksley 1989). C. DNA markörleri Hibridizasyona dayalı markörler RFLP, genomik DNA'yı belli nükleotid dizilerinden (restriksiyon bölgesi) kesen ve böyle değişik uzunlukta DNA parçaları oluşturan restriksiyon enzimlerinin kullanımı ile saptanmaktadır. Bu parçaların tanımlanması elektroforez ile ayrılan DNA parçalarının nitroselüloz veya naylon filtre üzerine geçirildiği Southern blot işlemi (Southern 1975) ile yapılmaktadır. Filtreye sabitlenen DNA, radyoaktif etiketlenmiş prob DNA ile hibridize edilir. Problar genellikle küçük ( baz çifti) klonlanmış DNA (genomik veya cdna) parçalarıdır. Filtre, fotoğraf filmine yapıştırılarak radyoaktif yayılımların görünür bant haline geçmeleri sağlanır. Bu bantlar RFLP'nin görsel hale geçmesidir ve kodominant markörlerdir (Staub et al. 1996). 9

19 RFLP markörleri genetik haritaların oluşturulmasında ve mono- ve poligen lokusların tanımlanmasında kullanılmıştır. Ancak birkaç dezavantajı da bünyesinde bulundurmaktadır. İlk olarak, bir markörün tanımlanıp haritalanması; klonların elde edilmesi, bir kütüphaneden parçaların izole edilmesi, saflaştırılması ve radyoaktifle etiketlenmesi, değişik restriksiyon endonükleazlar ile parçalanan ebeveynsel ve F 2 DNA'ların Southern blot hibridizasyonu ve X-ışını filmin elde edilmesi gibi aşamaları nedeniyle oldukça pahalı olmakta ve yüksek işgücü ile zaman gerektirmektedir (Malyshev and Kartel 1997). PCR (Polymerase Chain Reaction) a dayalı markörler Yöntem DNA'nın enzimatik in vitro çoğaltımına dayanmaktadır. Çok düşük (çoğunlukla nanogram-ng) miktardaki kalıp DNA ile başlanarak bir veya daha fazla belli DNA parçalarının milyonlarca kopyası elde edilir ve elektroforez işleminden sonra boyama veya otoradyografi aracılığıyla görünür hale getirilir. PCR çok hızlı, basit ve duyarlıdır. Çok değişik organizmalara çok değişik amaçlarla uygulanması moleküler biyolojide yeni olanaklara imkan sağlamıştır (Weising et al. 1995). RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Tek primer bazlı PCR teknolojileri (DAF- DNA Amplified Fingerprinting ve AP-PCR; Arbitrarily Primed- PCR) arasında, RAPD (Wiliams et al. 1990); haritalama ve bağlantı analizlerinde en fazla kullanılmaktadır. Polimorfik DNA'nın PCR tabanlı rastgele çoğaltımı (RAPD-PCR), bir şablon genomik DNA üzerinde rastgele primerler kullanılarak yapılmaktadır. Karşılıklı iki zincir üzerine nispeten yakın şekilde yerleşen primerlere homolog kısa DNA dizileri bulunduran genomik parçalar çoğaltılmaktadır. RAPD-PCR desenlerinin polimorfizmi; tek ya da iki taraflı primer bağlanma bölgeleri arasındaki farklılıklar veya çoğaltılan parçada bulunan ekleme ve çıkarma sayesinde tespit edilmektedir (Malyshev and Kartel 1997). 10

20 Çoğaltma ürünleri agaroz veya poliakrilamid jeller üzerinde ayrılır ve etidium bromid veya gümüş ile görünür hale getirilir. RAPD, genellikle bireyler arasında polimorfizmin bandın varlığı/yokluğu şekilde ifade edildiği bir dominant markördür (Staub et al. 1996). Devos and Gale (1992) ve Giese et al. (1994) RAPD analizini değişik türlerde polimorfizmi çalışmak amacıyla kullanmıştır (Malyshev and Kartel 1997). Birkaç RAPD markörü ise bazı hastalığa dayanım genleri ile bağlı bulunmuştur (Yoshimura et al. 1995, Naqvi et al. 1995). RAPD analizi RFLP'ye göre daha az aşama kapsar ve daha kısa sürelidir. Ayrıca, daha az miktardaki DNA (25 ng) küçük çaplı ekstraksiyon işlemleri ile sağlanabilir. RAPD markörleri özellikle koniferlerin genomlarının haritalanmasında fayda sağlamıştır (Tulsieram et al. 1992). RAPD markörleri; genom haritalama ve gen etiketleme, genetik parmakizi belirleme ve çeşit tanımlama, populasyon farklılığı, klon tanımlama, taksonomik ve filogenetik çalışmalar, genetik introgresyon, pedigri ve ebeveyn analizi, bitki büyüme ve gelişmesi, taksonomik kimliğin belirlenmesi, akrabalık derecelerin belirlenmesi ve karışık genom örneklerinin analizi, bitkinin farklı yaşam evrelerinin araştırılması, yabancı tozlanma oranlarının tahmini, ve QTL (Quantitative Trait Locus) analizi gibi çok değişik amaçlı çalışmalarda kullanılmaktadır (Lodhi 1994). RAPD markörleri kullanarak genetik haritalama ve gen etiketleme diğer metotlara göre bazı avantajlara sahiptir: 1) üniversal bir primer seti kullanılabilir ve kısa sürede taranabilir, 2) klonlanan DNA problarının izolasyonu veya hibridizasyon filtrelerinin hazırlanması gerekli değildir ve 3) sadece az bir DNA gereklidir (Kelly 1995). RAPD bazı özellikleri açısından sorun yaratmaktadır. Bu metot, Mg +2 konsantrasyonu ve primer/şablon DNA oranı gibi koşullar açısından çok duyarlıdır. Bu da laboratuvar içi tekrarları azaltmaktadır. Düşük duyarlılıkları nedeniyle karşılaştırmalı haritalama ve klonlama için çok ender kullanılırlar. Akraba türlerin genomlarını karşılaştırma her birinde homolog bölgeleri tanıyan probları gerektirmektedir. Oysaki, genomlar 11

21 arasında benzerliğin olmaması, RAPD markörlerin poliploid türlerin genom haritalamasında kullanılmasına olanak verirken, tek-kopya RFLP problar, bir çok dizi ile hibridize olur ve alternatif allellerin tanımlanmasını güçleştiren oldukça kompleks desenler oluştururlar (Malyshev and Kartel 1997). RAPD markörleri tanımlamak için kullanılan kısa primerler bağlı olmayan bölgelerden bazı dizileri çoğaltabilir. Bu nedenle, bu tür markörler belli bir gen ile yakın bağlantıları ortaya çıkarsa bile Maya Yapay Kromozom (Yeast Artificial Chromosome-YAC) veya kozmid kütüphanesinden klonların taranması için kullanılamaz (Paran and Michelmore 1993). Dominant kalıtımı ve küçük allel sayısı da RAPD'in diğer bir dezavantajıdır. Bir markör, ıslah programında ancak değişik melezlemelerde açılım gösterirse faydalı olmaktadır. Bir RAPD lokusu genellikle bir bantın varlığı/yokluğu şeklinde ifade edilen iki allele sahiptir (Malyshev and Kartel 1997) ve haritalama denemelerinde bu durum göz önüne alınmalıdır. Haritalama ve tanımlama uygulamalarında, bağlantı fazı durumu (coupling veya repulsion) mutlaka seçilmelidir. Böylece elde edilen bilgiden ıslahçının en üst düzeyde yararlanması gerçekleşebilir (Rafalski and Tingey 1993). RAPD teknolojisi, araştırıcıya çok geniş sayıdaki lokuslarda DNA dizi tabanlı polimorfizmleri etkin ve hızlı tarama olanağı sağlamıştır. RAPD çoğaltımına uygun kısa primer (genellikle 10-mer) setleri ticari olarak bulunabilmekte ve sentezletilebilmektedir. Bir PCR cihazı ve agaroz jel düzeneği dışında herhangi bir özel ekipman gerektirmez. Tekrarlanabilirlikle ilgili zorluklar DNA konsantrasyonundaki varyasyonu ortadan kaldırmak ve çoğaltma sırasında sabit reaksiyon koşulları ve sıcaklık profili kullanmak suretiyle aşılabilir (Rafalski and Tingey 1993). 12

22 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Çoğaltılmış parça uzunluk polimorfizmin üretimi, restriksiyon enzimi ile parçalara ayrılmış DNA parçalarının seçici çoğaltılmasına dayanır (Vos et al. 1995). DNA'nın poliakrilamid jelde analizi genellikle örnek başına band verir. Bantların yoğunluğuna bakarak homozigot ve heterozigot bireyler ayırtedilmektedir. Minimum primer testi ile çok sayıda markör üretmesi ve yüksek çözünürlüğü, bu teknolojiyi genetik markör olarak çekici kılmaktadır. Pahalı olmasından dolayı, bu teknolojinin MAS (Markör Aracılığıyla Seleksiyon)'ta kullanılabilmesi için otomasyonu gerekmektedir (Malyshev and Kartel 1997). SSR (Mikrosatelitler) Litt and Luty (1989) ve Weber and May (1989), ökaryötik genomda bir çok tekrar dizilerinin (satelit, mini- ve mikrosatelit, serpiştirilmiş tekrarlar, transpozonlar, yalancı genler [pseudogenes] vb.) bulunduğunu ifade etmiştir (Malyshev and Kartel 1997). Mikrosatelitler veya basit tekrar dizileri (SSR) 2-5 ardışık tekrarlı nükleotidleri ifade etmektedir. SSR sayısı bitkilere göre değişiklik göstermekte ve sıklıkları monokotiledonlarda dikotiledonlara göre daha düşük olmaktadır. Sayıları (n) 10 ila 80 arasında değişen (A) n, (AT) n ve (GA) n dizileri bitkilerde en yaygın olanıdır. Mikrosatelitler, diğer DNA dizilerinden daha hızlı evrimleşirler. Tekrar sayısında farklılık gösteren polimorfik alleller oluşturan dinamik mutasyonlar geçirirler. Geniş dağılım ve yüksek polimorfizm özellikleri nedeniyle mikrosatelitler değişik metotlarda moleküler markörler olarak kullanılmaktadır (Malyshev and Kartel 1997). 13

23 SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) İstenilen bir RAPD markörünün kullanımı, uç kısımlarının dizilerinin belirlenmesi ve daha uzun primerler (24 nükleotid gibi) oluşturmakla arttırılabilir (Paran and Michelmore 1993). Bu tür dizileri belirlemiş çoğaltılmış bölgelerde (SCAR) DNA dizi farklılıkları tek eşsiz bir bandın varlığı/yokluğu ile belirlenir. SCAR, RAPD'e göre daha fazla tekrarlanabilir ve elektroforeze ihtiyacın olmadığı var/yok dağılımlarına dönüştürülebilirler. SCAR'lar genelde dominant markörler olmalarına rağmen 4 baz çifti restriksiyon enzimleri ile parçalanmaları ve DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) veya SSCP (Single Strand Comformation Polymorphism) teknikleri ile tanımlanmaları suretiyle kodominant markörlere dönüştürülebilirler (Rafalski and Tingey 1993). ASAP (Allele Spesific Associated Primers) Gu et al. (1995) e göre bu teknoloji, belli bir bağlanma sıcaklığında tek bir DNA parçası oluşturan allel-spesifik bağlantılı primerlerin kullanılması suretiyle alkali DNA ekstraksiyonunu takiben mikrotiter tabakalar içinde DNA çoğaltımına dayanmaktadır (Malyshev and Kartel 1997). DNA parçası sadece uygun allele sahip bireylerde oluşmakta ve bu sayede çoğaltılan DNA parçalarının elektroforezde ayrımına ihtiyaç göstermemektedir. Bu metotta kullanılan etidium bromid DNA çift sarmala bağlanmakta ancak PCR karışımındaki serbest nükleotidlere bağlanmamaktadır. Bu yöntem DNA ekstraksiyon süresini kısaltmak ve geniş çaplı taramalarda PCR reaksiyonunun güvenilirliğini arttırmak için geliştirilmiştir SPAR (Single Primer Amplification Reaction) SPAR, deney başına çoklu makör üreten bir DNA markör sistemidir. Kullanılan primerler SSR tabanlıdır ve SSR'ler arası DNA dizileri çoğaltılır (Gupta et al. 1994). Polimorfizmin düzeyi tür içindeki genomik çeşitliliğe bağlıdır. Çoğu DNA markörü 14

24 dağınık genom bölgelerini haritalar. Çoğu SSR-SPAR dominant karakterde olmasına rağmen kodominant olanları da saptanabilir (Malyshev and Kartel 1997) Markör Sistemi Seçimi Bitki ıslahında DNA markör sistemimin seçimi; araştırmanın amacına, populasyonun yapısına, çalışılan türün genomik çeşitliliğine, markör sisteminin bulunma durumuna, analiz için gerekli zamana ve birim bilgi başına maliyete bağlı olarak değişir. Her bir markör sistemi avantaj ve dezavantajlara sahiptir ve bu nedenle kullanım potansiyeli değerlendirmek çok önemlidir. Örneğin, türler arası haritalar, yaygın RFLP probları ile oluşturulabilir; ancak her tür başlangıçta bir harita oluşumunu gerektirir. Türdeki polimorfizmin dağılımı da markör seçiminde rol oynar, yani kendine tozlanan türlerde RAPD, RFLP'ye göre daha fazla polimorfizm saptar. Ayrıca bir türde kullanılan markör sistemi bir diğerinde aynı etkinliği göstermeyebilir (Staub et al. 1996). Markör sistemleri aynı zamanda değişik populasyon, tür ve sınıflarda hem kullanım hem de polimorfizmi yakalamak açısından farklılık gösterir. Örneğin, bir populasyonda haritalanan RFLP'ler aynı tür içinde diğer populasyonların karakterize edilmesinde kullanılabilir. Oysaki SSR, RFLP kadar bilgi sağlayıcı olmasına rağmen bir türde belirlenen diziler diğer türlerde fayda sağlamayabilir. Aynı şekilde, RAPD, SPAR ve AFLP kullanan haritalar, kısa sürede yapılmasına rağmen her bir markörün kendi uzunluğu ile tanımlanmasından dolayı değişik populasyonlarda kullanılamazlar (yani dizi bilgisi sınırlı olabilir). Ayrıca, populasyon/tür arasında belirlenen aynı büyüklükteki bir bant, hibridizasyon ile kanıtlanmadığı sürece, aynı diziye sahip demek değildir (Thormann et al. 1994). RFLP'den farklı olarak, bu markörler PCR tabanlı sistemlerin tüm avantajlarına (küçük örnek ihtiyacı, yüksek veri eldesi ve erken seleksiyon vb.) sahiptir. Bu avantajlar tür içinde polimorfizm düşük olduğunda azalabilir. Bu durumda STR (Short Tandem Repeats) ve SSR seçilmelidir ancak bu markör sistemlerinin geliştirilmesi oldukça fazla zaman ve maliyet gerektirmektedir (Staub et al. 1996). 15

25 Birim bilgi başına maliyet; DNA ekstraksiyonun süresi, analiz için gerekli DNA miktarı, klonlama ve dizi belirlemesinin gerekliliği, elde edilen genetik bilginin potansiyel kullanım düzeyi, genetik bilgi tipi, allel varyasyonunun açıklanma durumu (dominant - kodominant), elektroforez sisteminin otomasyonu, genetik haritaların kullanım potansiyeli ve tekniğin uygunluğu konularına bağlıdır. RFLP gibi kodominant markörler MAS ve evrim çalışmaları için yararlıdır ancak çok zaman gerektirir, nispeten pahalı olabilir ve yüksek oranda teknik uzmanlık gerektirir. Yeni bir tür için RFLP markör sistemi geliştirmenin çok pahalı olması veya yüksek miktarda DNA'ya ihtiyaç göstermesi ve yavaş taraması nedeniyle MAS'da etkinliğinin olmaması çoğunlukla PCR-tabanlı sistemlerden birinin kullanma zorunluluğunu ortaya çıkarır. Fakat, baz arasında varyasyonu yakalayan PCR tabanlı teknolojilerden farklı olarak RFLP, büyük DNA parçaları (prob uzunluğu) arasında benzerliğe dayalı olarak veri elde etmesi nedeniyle sistematik ve evrim çalışmalarında avantaja sahiptir. Polimorfizmin yüksek olduğu durumda RFLP'nin bu tür çalışmalarda kullanımı artmaktadır (Staub et al. 1996) Harita Oluşturma Bitki genetik haritalarının geliştirilmesi, genlerin kromozomlar üzerinde nasıl düzenlendiği hakkında bilgi vermektedir. Haritalar, görünür fenotipik karakterleri kontrol eden genler olabilen markörlerden (klasik markörler) veya "fenotipi" modern moleküler biyoloji teknikleri ile ortaya çıkarılan moleküler markörlerden oluşmaktadır. Haritalardaki markörler, tıpkı yol işaretleri gibi, genetikçiye diğer markörlere veya önemli genlere göre nerede olduklarını gösterir. Bir dizi markör için açılım gösteren herhangi bir bitki populasyonu haritalama amaçlı kullanılabilse de geleneksel metot, uygun ebeveynleri melezleyerek haritalama için gerekli olan çabayı en aza indirmektir (Grant and Shoemaker 2001). Moleküler markör teknolojisinin gelişmesi ve birçok markör lokusunun belirlenmesi genetik haritalamaya olan ilgiyi arttırmıştır. Gen haritalaması araştırıcının; 1) en uygun populasyonu seçmesini, 2) bu populasyonları kullanarak ikili rekombinasyon 16

26 frekanslarını hesaplamasını, 3) bağlantı gruplarını belirlemesini ve harita uzaklıklarını saptamasını, ve 4) harita sırasını belirlemesini gerektirir. Büyük haritalama populasyonlarının farklı markör sistemleri ile karakterize edilmesinden dolayı harita oluşturma, bilgisayar programlarına bırakılmıştır. Linkage 1 (Suiter et al. 1983), Gmendel (Echt et al. 1992), Mapmaker (Lander et al. 1987), MapManager (Manly and Elliot 1991) ve JoinMap (Stam 1993) gibi bilgisayar paket programları haritalamada genetik bilginin analizinde kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Bu programlar, açılım gösteren populasyonlardan elde edilen bilgileri kullanarak rekombinasyon frekanslarını tahmin etmek suretiyle rekombinasyon olaylarını en aza indirmekte ve genetik markörlerin doğrusal sıralarını belirlemektedir. Genetik haritalar ve onları tanımlayan markörler çok çeşitli uygulamalara sahiptir. Örneğin, verim, tohum kalitesi veya hastalıklara dayanım gibi önemli bitki karakterlerini kontrol eden genlere yakın haritalayan ve kolayca değerlendirilebilen genetik markörler, ıslah programlarında dolaylı yoldan bu karakterlerin seçimi için kullanılabilirler. Bu "markörler aracılığıyla" seleksiyon, yeni ve geliştirilmiş bitki çeşitlerinin eldesini büyük oranda hızlandırmaktadır (Grant and Shoemaker 2001). Farklı türlere ait gen haritalarının ortak markörler kullanılarak karşılaştırılması bu türlerin tarihçesi hakkında bilgi verir. Bu tür bilgiler bitki taksonomisinde evrimin anlaşılmasında önemli araçlardır. Bu karşılaştırmalar, aynı zamanda araştırıcının bir türde elde edilen bilgiyi bir diğerinde problem çözmek için kullanmasına imkan sağlar (Grant and Shoemaker 2001). Haritalama Populasyonları Başarılı bir haritalama için populasyon seçimi çok önemlidir. Haritanın ekonomik önemi markör-karakter ilgisine bağlı olduğundan ebeveyn olarak seçilen genetik stoklarda mümkün olduğunca kalitatif kalıtıma sahip morfolojik karakterler bulunmalıdır. Ebeveynlerin kaynağı (kültür ve egzotik) da önemli bir unsurdur. Geniş çaplı melezlemelerde (kültür x egzotik) kromozom eşlemesi ve rekombinasyon oranları 17

27 önemli ölçüde zarar görür (baskılanır) ve genellikle daha kısa bağlantı uzaklıklarına neden olur. Geniş melezlemeler, dar melezlemelere (kültür x kültür) oranla nispeten geniş polimorfizme sahip açılım populasyonları oluştururlar. Bitki ıslah programlarında önemli bir değere sahip olması için, geniş melezleme ile yapılan bir haritanın, kültür ebeveynler kullanılarak elde edilen haritalarla kolinear yani lokus sıralaması benzer olmalıdır (Staub et al. 1996). Uygun haritalama populasyonunun seçimi, kullanılan markör sistemine bağlıdır. En fazla genetik bilgi tamamen sınıflandırılmış F 2 populasyonu ve kodominant markörlerle elde edilebilir. Dominant bir markör sistemi ile elde edilen bilgi ancak heterozigot F 2 bireylerinin döl testi (F 3 ve F 2 BC-backcross) ile belirlendiği durumlarda tamamen sınıflandırılmış F 2 populasyonundan elde edilen bilgiye eşdeğer olabilir. Döl testlerinin uzun ve pahalı olması nedeniyle bu işlem sınırlayıcıdır (Staub et al. 1996). Dominant markörler, rekombinant sürekli kendilenmiş hatlarda (Recombinant Inbred Lines-RIL, genellikle >F 8 ), katlanmış haploidlerde (DH) veya cis fazı halindeki geri melezleme populasyonlarında kodominat markörler kadar bilgi sağlar (Burr et al. 1988). Dominant markörlerden elde edilen bilgi, bütün lokusların neredeyse ve tamamiyle homozigot olmaları nedeniyle RIL veya DH'in kullanılması suretiyle maksimum hale getirilebilir. Reiter et al. (1992) e göre, sıkı bağlantı (~%10 rekombinasyon) durumunda, dominant ve kodominant markörler BC populasyona göre RIL populasyonunda birey başına daha fazla bilgi sağlamaktadır (Staub et al. 1996). Ancak, aradaki uzaklık arttıkça (yani lokus daha bağımsız oldukça) RIL populasyonunda birey başına elde edilen bilgi, kodominant markörlere oranla oldukça azalmaktadır. Geri melezleme (BC) populasyonları, geriye melezlenen (alıcı) ebeveynde bütün lokuslar homozigot ve alıcı ile verici (donör) ebeveyn birbirine zıt polimorfik markör allellere sahip ise dominant markörlerin haritalanması için uygundur (Reiter et al. 1992). Kodominant veya dominant markörlerin kullanıldığı BC'de elde edilen bilgi, F 2 populasyonundan elde edilenden daha azdır; çünkü bitki başına 2 yerine 1 rekombinant 18

28 gamet örneklenmektedir. Ancak, rekombinant safhat populasyonunda bağlı lokuslar arasında uzaklık artmasından (~%15 rekombinasyon) dolayı BC populasyonu (düşük markör yoğunluğunda) RIL'e göre daha fazla bilgi sağlar. Artan rekombinasyon sıkı bağların çözünmesinde fayda sağlayabilir fakat düşük markör yoğunluğunda harita oluşturmada istenmeyebilir (Staub et al. 1996). Yakın zamanda, bağlantıların hızlı tespiti için Bulked Segregant Analysis (BSA) yöntemi geliştirilmiştir. BSA'da iki grup DNA örneği, tek bir melezden gelen açılım populasyonundan elde edilir. Bu gruplarda bir özellik için birbirinin aynısı (örneğin bir hastalığa dayanıklı veya duyarlı) olan fakat diğer bağlı olmayan bölgelerde tesadüfi (heterozigot) olan bireyler veya genomik bölgeler bulunur. Bu gruplar, DNA polimorfizmi için taranır ve farklılıklar, bağlantısız lokusların tesadüfi genetik durumu ile karşılaştırılır. Böylece, bu iki grup arasındaki farklılıklar belli bir özelliğe bağlı markörleri (bantları) gösterir. BSA, geliştirilmeleri için birçok geri melezlemenin yapılması gereken neredeyse izogenik hatların (NIL-Nearly Isogenic Lines) kullanımından kaynaklanan bazı problemleri aşmaktadır. NIL'de polimorfik lokusların sadece bir kısmı seçilen bölgenin haritalanmasında kullanılırken, hedef bölgeye bağlı olmayan bölgeler BSA'da gruplar arasında farklı olmayacaktır. Ayrıca BSA'da saptanan bütün lokuslar açılacak ve haritalanacak, bu şekilde bağlantı sürüklenme problemleri (verici ebeveynden gelen DNA parçaları ile çevrilen genlerin geri melezleme ile hatlara yerleştirilmesi) saf dışı bırakılacaktır (Staub et al. 1996). Yüksek düzeydeki heterozigotluk, asmada her çeşidin aslında bir F 1 olması nedeniyle genetik çalışmaları büyük oranda kolaylaştırmıştır. Döl, heterozigot bütün lokuslar açısından açılım gösterecektir. Genetik olarak iki çeşit veya bitki arasındaki kontrollü melezleme çift yönlü yalancı melezleme tekniği olarak ifade edilir (Grattapaglia et al. 1992, Hemmat et al. 1994, Weeden et al. 1994). Yalancı melezleme populasyonu, heterozigot bir birey (+/-) ile homozigot resesif bir bireyin (-/-) melezlenmesi ile elde edilmektedir. Döl, polimorfik RAPD veya AFLP markörleri için 1:1 oranında açılım gösterir. Bu tür melezlemelerde, dominant markörler en az kodominant markörler kadar değerlidir çünkü 1:1 dağılımda fenotip genotipe eşittir (Luo et al. 2002). Bu durumda yapılan bağlantı analizi, iki genetik harita ile sonuçlanır: bir tanesi dişi ebeveyn, diğeri 19

29 baba ebeveyn içindir. Bu iki harita daha sonra kodominant markörler (izozimler, RFLP, mikrosatelitler) veya daha az etkin olan RAPD veya AFLP (3:1 açılım gösteren) markörler kullanılarak tek bir harita haline getirilebilir (Lodhi et al. 1995). Bağlantı fazı Genler aynı kromozom üzerinde olduğunda bağlıdırlar. Bir çift kromozom üzerinde iki gen iki farklı şekilde düzenlenebilir; cis (coupling) ve trans (repulsion). Cis durumunda iki resesif allel bir kromozom üzerinde, dominant alleller ise diğer kromozom üzerinde yer alır (AB//ab). Trans durumu ise alternatif düzeni (bir dominant ve bir resesif allel aynı kromozom üzerinde) anlatır (Ab//aB). Bu ilişki, harita oluştururken dominant markörler kullanıldığında özellikle önemlidir. Dominant allel olarak belirlenen iki bağlı markör (AA veya bant var (+)) sadece cis fazında iken saptanabilir; çünkü heterozigot sınıf homozigot sınıftan ayırt edilemez. Aksine kodominant markörler her iki allelin ifadesine olanak sağlar (fenotipik olarak AA, Aa, aa) (Haley et al. 1994) Klasik Haritalama Bir populasyonda genetik çeşitliliği sağlayan en önemli faktörler mutasyon ve genetik rekombinasyondur. Mutasyon genetik koddaki değişikliktir. Bu değişim, tek bir nükleotidi etkileyen basit bir tek nokta mutasyonu şeklinde olabileceği gibi daha büyük eksilme veya yeniden düzenlenme gibi bir yapısal değişim şeklinde de olabilir. Bu mutasyonlar, bireyler arasında genetik varyasyona neden olmaktadır. Bireyler ya da populasyonlar arasında farklı olan bütün karakterler, genetik koddaki değişikliğin sonucu olarak ortaya çıkar. Bu görünür karakterler (veya fenotipler) "klasik karakterler" olarak tanımlanırlar ve aksi ispat edilmedikçe tek bir gen tarafından kontrol edilen karakterlerdir. Her gen, bir genetik lokusu ifade eder ve genin her bir farklı durumu "allel" olarak bilinir. Birçok türde, iki bitkinin melezlenmesiyle elde edilen döl, ebeveyninden 1 kromozom alır ve genler kromozom üzerinde doğrusal şekilde yer aldıklarından ebeveynlere ait 20

30 lokuslar, döle ebeveynde yer aldığı sıralamanın aynısı olarak aktarılırlar, yani homolog kromozomların her bir çifti ebeveynlerde var olan tüm genetik varyasyonu kapsar. Kromozom üzerindeki herhangi bir lokus için döl homozigot (her iki ebeveyn aynı allelleri verir) veya heterozigot (ebeveynsel alleller farklıdır) olabilir. Döl daha ileri düzeyde eşeyli üreme gerçekleştirirse, mayozun bir aşamasında kromozomlar sıralanır ve homolog kromozomlar arasında genetik materyal alışverişi gerçekleşebilir. Bu alışverişe "rekombinasyon" ya da "parça değişimi" adı verilir ve her gamette kromozomlar üzerinde yeni allel kombinasyonları ile sonuçlanır. Bu rekombinant gametler daha sonra yeni ebeveyne ait olmayan allel kombinasyonları taşıyan bitkiler oluştururlar. Rekombinasyon, genetik harita oluşturmanın temelidir. Rekombinasyon tesadüfi bir olaydır; bir kromozomun herhangi bir yerinde bir rekombinasyon olayının olma olasılığı herhangi bir başka yerde oluşma olasılığı ile aynıdır. Bu nedenle, iki gen kromozom üzerinde birbirine ne kadar yakın ise rekombinasyon ile birbirinden ayrılma olasılığı o kadar düşüktür (Grant and Shoemaker 2001). Rekombinasyon frekansı genetik haritanın çıkarılmasında kullanılmaktadır. Örnek verecek olursak; A B C a b c x A B C a b c Ebeveynlere ait allel kombinasyonu Ne sıklıkta gözlendiği Ebeveynlere ait olmayan allel kombinasyonu Ne sıklıkta gözlendiği A-B veya a-b %70 A-b veya a-b %30 A-C veya a-c %95 A-c veya a-c %5 B-C veya b-c %75 B-c veya b-c %25 A, B ve C'yi oluşturan genlerin kromozomlar üzerindeki sıralaması: A--C B 21

31 Gen veya markörlerin ne sıklıkta rekombine oldukları; harita üzerindeki yerleri arasındaki genetik uzaklığı ifade eder. Harita uzaklığı ile rekombinasyon değeri arasındaki ilişki, genetik haritalama fonksiyonu (mf) ile belirtilir. mf, bir bağlantı haritasında parça değişimi frekansını kullanarak uzaklıklar arasındaki kantitatif ilişkiyi açıklayan bir formüldür. Haritalama populasyonunu en iyi temsil eden tahmini parça değişimi derecesine bağlı olarak birden fazla haritalama fonksiyonu bulunmaktadır. En yaygın olanları Haldane (1919) ve Kosambi (1944) dir. Haldane bir bölgedeki parça değişiminin yanındaki bölgede parça değişimi olmasını engellemediğini (interference) hesaplarken, Kosambi ise daha az parça değişimine neden olduğunu (positive interference) hesaplamaktadır (Malyshev and Kartel 1997). Moleküler biyolojinin başlangıcından önce genetikçiler klasik karakterleri kullanarak bir çok bitki türüne ait genetik haritaları geliştirmiştir. Değişik genotiplerde doğal olarak meydana gelen mutasyonlar boy, çiçek rengi, tohum morfolojisi gibi bitki karakterlerinde varyasyonlara yol açmıştır. Melezlemeler yaparak ve uygun alleller oluşturarak genetikçiler sadece fenotipik karakterlerin açılımını kullanmak suretiyle genetik harita çıkarabilmişlerdir. Klasik haritalar çok faydalı ve bilgi vericidir, çünkü haritada her bir markör bir bitki karakterini oluşturan genin yerini temsil etmektedir. Ancak tanımı itibariyle, bir klasik haritadaki markör sayısı, gözlenebilir karakterlere ait genlerin sayısı ile sınırlıdır. Klasik haritaları çıkarmak da zordur; çünkü çoğunlukla sınırlı sayıda gözlenebilir genetik varyasyonlar, üreme veya yaşam problemi çıkarmadan bir döl populasyonunda açılım göstermektedir. Bu nedenle, klasik genetik haritalar her zaman bir organizmada olduğu ifade edilen gen sayısından çok daha az markör bulundurur (Grant and Shoemaker 2001). 22

32 2.6. QTL Haritalama Bitki ıslahı, uygulamalı bilimin dinamik bir alanı olup genetik varyasyona dayanır ve seleksiyonu kullanarak üretici ve tüketici için ilgi çekici olan karakterler açısından bitkiyi geliştirir. Kültür bitkilerinde kantitatif varyasyon; verim, kalite veya hastalıklara dayanım gibi bir çok önemli karakterin bir özelliğidir. Bu nedenle kantitatif varyasyonun araştırılması ve özellikle potansiyel genetik temelinin ortaya çıkarılması ıslah çalışmalarında birincil öneme sahiptir. W. Johannsen 20. yüzyılın başında bu tür kantitatif varyasyonun çok sayıda açılım gösteren genler ile çevresel faktörlerin birlikte hareket etmesinden kaynaklandığını göstermiştir (Asins 2002). Markör genlerin açılımı ve birey veya hatların fenotipik değerlerinin analiziyle, kantitatif karakterleri etkileyen lokusların (QTL) yerini saptamak ve tanımlamak mümkündür. QTL'lerin saptanması, kesin fenotipik açılımların olmayışı ve kompleks bir karakter ile ilgili her bir genin fenotipik etkisinin nispeten küçük oluşu nedeniyle zordur. QTL analizi, bir ya da daha fazla kalitatif karakter açısından farklı ebeveynlerin seçilmesi ve melezlenmesi ile açılım gösteren döllerin analiz edilip bilinen DNA molekülleri ile kantitatif karakter lokusu arasında bir bağlantının kurulmasıyla gerçekleştirilir. Islahçı bu bilgiyi, örneğin dolaylı seleksiyonu kullanarak, kendi avantajına kullanabilir. Seleksiyon, moleküler markörlerin uygulanması aracılığıyla elde edilen genetik bilgiye dayanıyorsa, markörler aracılığıyla seleksiyon (MAS) adını alır ve bitki ıslahı çalışmalarının etkinliğini arttırmak için kullanılabilir. Aynı zamanda baskılanmış ilginç yabani allelleri açığa çıkarır ve akraba olan ve olmayan yabani türlerden genetik materyalin daha kolay aktarılmasını sağlar (Asins 2002). QTL terimi ilk kez Geldermann (1975) tarafından ileri sürülmüştür. QTL saptama konusu ise yaklaşık 80 yıl önce Sax ın çalışmalarından sonra geliştirilmiştir. Son yıllarda DNA markörlerinin geliştirilip ıslahta kullanılması ile birlikte güçlü biyometrik metodların varlığı, bitkilerde QTL haritalamada önemli gelişmelere yol açmıştır (Asins 2002). 23

33 QTL analizinin en belirgin uygulamaları ıslah ve ıslah öncesi çalışmalar ile QTL klonlamada markörler aracılığıyla seleksiyondur. Başarı, bilginin sağlandığı QTL analizinin güvenilirliği ve doğruluğuna dayanır. QTL analizinin temel amacı, QTL i dar kromozomal bölgelere yerleştirmektir. Bu amaçla deneme şeklinin, açılım populasyonunun tipinin, büyüklüğünün, sayısının, DNA markörlerinin bilgi sağlama düzeyi ile polimorfikliği, bağlantı haritasının kurulması ve QTL analizinin yapılması için istatistiksel metodolojilerin hepsinin birlikte değerlendirilmesi gerekir (Asins 2002). Hyne and Kearsey (1995) herhangi bir anda, herhangi bir populasyonda 12 den fazla QTL saptanmasının zor olduğunu ifade etmiştir. QTL sayısı karaktere, ebeveynlerin yapısına ve fenotipik varyansa bağlıdır. QTL lerin küçük etkileri, moleküler markörler ile aşağıda belirtilen özelliklere bağlı olarak saptanabilir: (i) QTL ile ona en yakın markör arasındaki harita uzaklığı; QTL marköre ne kadar yakın ise QTL in küçük olan etkileri o kadar sağlıklı saptanabilir, (ii) açılım populasyonunun büyüklüğü; populasyon ne kadar büyük ise çok daha az etkiye sahip QTL lerin istatistiki öneme sahip olma olasılığı artar, ve (iii) kalıtsallık; kalıtsallık ne kadar az ise bir QTL in saptanma olasılığı o kadar az olur (Brar 2002). QTL in Saptanması Markör lokuslarının kullanılmasıyla QTL'lerin saptanması düşüncesinin altında yatan prensip; markör lokusu ile bağlı QTL'in allelleri arasında bağlantı dengesizliği (linkage disequilibrium) olmasıdır. Bağlantı dengesizliği, bir populasyonda farklı lokuslardaki allellerin tesadüfi olmayan ilişkisi olarak tanımlanabilir ve seleksiyon ve genetik yönlenme gibi faktörler tarafindan ortaya çıkarılır. Ancak, F 2, F 3 veya geri melezleme populasyonu gibi generasyonlarda bağlantı dengesizliğinin en önemli nedeni, lokuslar arasındaki fiziksel bağlantıdır ve bu durum geçtiğimiz yüzyılda klasik bağlantı haritalarının temelini oluşturmuştur. Lokuslardaki fiziksel bağlantıdan kaynaklanan bağlantı dengesizliği, kontrollü dölleme ile elde edilen populasyonlarda çok önemlidir 24

34 ve dolayısıyla markör lokuslarını kullanarak QTL'leri saptama ve tanımlama yeteneği en yüksek derecededir (Tanksley 1993). Tek gen karakterlerin klasik bağlantı saptaması yönteminin aksine tek QTL'in tanımlanması (saptanması ve yerinin belirlenmesi) için farklı stratejiler ileri sürülmüştür (Jiang and Zeng 1995, Lander and Botstein 1989). Bu stratejiler, karakterin varyasyonuna katkıda bulunan toplam genetik varyansın ana düzeylerini tanımlamaya çalışır. Bağlantı tahmini sırasında değerlendirdikleri markör sayısına bağlı olarak yaklaşımları farklılık gösterir. QTL/ karakter bağlantısı testleri; her seferinde bir markör (tek nokta analizi), aynı anda iki markör lokusu (aralık haritalama) veya bütün olası markör lokuslarının aynı anda değerlendirilmesini (çoklu aralık analizi) içerir. Tekmarkör karşılaştırma stratejisinde, geri melezleme populasyonunda tek yönlü varyans testi (F testi) ve geri melezleme ve F 2 populasyonlarında markör genotip ortalama karşılaştırmaları (t testi) tipiktir (Soller et al. 1976, Stuber et al. 1992). Bu yaklaşım, markör ve QTL arasında potansiyel rekombinasyonu dikkate almaz ve böylece QTL ve markör denk gelmiyorsa, QTL etkisinin daha az tahmin edilmesine yol açar. Tek markör yaklaşımı, aynı zamanda populasyon dağılımının uçlarında yer alan bireylerin markör frekansları için örneklendiği karakter merkezli analizi de devreye sokar. Bu durumda, dağılımın uçları arasında yer alan ve frekansları farklı olan markörlerin karakteri etkileyen QTL ile bağlantılı olduğu düşünülür (Staub et al. 1996). Aynı anda 2 markör lokusunu araştıran yaklaşımlar, bir çift markörün çevrelediği tek QTL'in analizinde azami olasılığın kullanıldığı aralıklı (interval) haritalama stratejilerini ifade eder (Lander and Botstein 1989, Paterson et al. 1991). Aralık haritalama yaklaşımı nispeten yüksek derecede genom doygunluğuna (her 5-20 cm'da bir markör) sahip bağlantı haritalarının sağladığı ek bilgilerden faydalanmak için geliştirilmiştir (Paterson et al. 1991). Aralık yaklaşımı, bir markör aralığında herhangi bir yerde aday QTL etkilerinin tahminine, markör sınıflarındaki ortalama ve varyanslar ile belli bir aralığı çevreleyen markörler arasındaki rekombinasyon frekanslarına dayanarak izin verir (Lander and Botstein 1989). Bu yaklaşım, kısmen bağlı olmayan markörleri test edememe ve belli bir bağlantı grubunun uç markörlerinin ötesinde QTL'i yerleştirememesinden dolayı sınırlıdır (Staub et al. 1996). 25

35 Cowen (1989), Rodolphe and Lefort (1993) ve Stam (1993) QTL analizi sırasında bütün olası markör lokuslarının aynı anda düşünülmesinin karmaşık olduğunu ve çoklu markör lokus değerleri üzerinde karakter ifadesinin regresyonunu gerektirdiğini bildirmiştir (Staub et al. 1996). Pahalı olmayan ve kolay uygulanabilir moleküler markörlerin varlığı, Vitis genetiğine yönelik araştırmaları kolaylaştırmıştır. Günümüzde asma genomunu haritalamak ve her genotipin DNA profilini çıkarmak mümkün olmaktadır. İlk bitki bağlantı haritaları görsel değerlendirebilen morfolojik markörlere dayanmaktadır. Daha sonra izoenzim ve DNA-tabanlı markörler yoğun şekilde doygun haritaların çıkartılmasında kullanılmıştır. Weeden et al. (1988) Cayuga White x Aurore melezlerinden birinde yaptıkları çalışmada değişik izoenzim sistemlerini kullanarak bağlantı analizi yapmıştır. Araştırıcılar asmada yeterince izoenzim polimorfizminin bulunduğu sonucuna ulaşmıştır. Mauro et al. (1992), Cayuga White x Aurore F 1 populasyonunda RFLP markörlerini kullanarak genetik analiz yaptıkları çalışmada, Vitis in RFLP yönünden zengin olduğunu ve Vitis gibi genomunda nispeten yüksek düzeyde polimorfizme sahip çok yıllık odunsu türlerin ilk generasyonlarında RFLP çalışmalarının yapılabileceği sonucuna varmıştır. Asmada moleküler markörler kullanılarak yapılan ilk gerçek haritalama çalışması Lodhi et al. (1995) tarafından Cayuga White x Aurore interspesifik hibrid çeşitlerinin çift yönlü yalancı melezleme tekniği kullanılarak oluşturulan F 1 populasyonunda gerçekleştirilmiştir. Çalışmada 422 RAPD ile 16 RFLP ve izoenzim markörü kullanılmıştır. Cayuga White haritası 19 kromozom üzerinde 214 markör yaklaşık 1196 cm lık alanı kapsamakta ve her biri üzerinde 4-21 markör bulunduran 20 adet bağlantı grubundan oluşmaktadır. Aurore haritası ise 225 markörün 1477 cm lık alana yayıldığı ve her biri üzerinde 3-21 adet markör bulunduran 22 bağlantı grubundan oluşmaktadır. Kullanılan toplam 443 markör ile Cayuga White x Aurore bağlantı 26

36 haritaları orta derecede doygundur. Araştırıcılar bu haritanın hibrit bitkilerin gelişmenin erken dönemlerinde markör aracılığıyla seleksiyon programlarında kullanılabileceğini ileri sürmüştür. Ye et al. (1995) asmalarda özellikle küllemeye (Uncinula necator) karşı dayanım haritasının oluşturulması amacıyla; iki interspesifik hibritten (Horizon ve Illinois 547-1) elde edilen F 1 populasyonunda, küllemeye dayanıma yönelik veriler 4 yıl boyunca hastalığın kontrol altında tutulmaya çalışıldığı alanlarda ebeveyn ve döllerin yetiştirilmesiyle elde etmiştir. İncelenen 327 RAPD primerinden sadece 90 adedi ile 504 adet skorlanabilen ve açılım gösteren DNA parçası çoğaltılmış ve haritalamada kullanılmıştır. Bunlardan 42 adedi Horizon çeşidinde 19 bağlantı grubunda 1099 cm lık ve 48 adedi de Illinois çeşidinde 20 bağlantı grubunda 1059 cm lık alana yayılmıştır. Çalışmanın sonuçlarına göre araştırıcılar 3 yıllık arazi gözlemlerinin de yardımıyla çeşidinde (dayanıklı) 10 numaralı bağlantı grubunda bir bölgenin, büyük bir ihtimalle, küllemeye dayanımı etkileyen bir QTL taşıdığı sonucuna ulaşmışlardır. Bouquet and Danglot (1996) çekirdeksizliğin birbirinden bağımsız kalıtım gösteren 3 adet tamamlayıcı resesif gen ile 1 adet dominant gen (sdi, seed development inhibitor) tarafından kontrol edildiğine dair bir model ileri sürmüştür. Early Muscat ve Flame Seedless çeşitleri arasında yapılan melezleme çalışmasından elde edilen populasyonda çekirdeksizlik ile bağlantılı markörler araştırılmıştır (Striem et al. 1996). 82 bireyden oluşan bu populasyonda çekirdeksizlik karakteri ile ilgili 7 özellik analiz edilmiştir. Bu özellikler; bir çekirdeğin ortalama taze ağırlığı, tanedeki çekirdeklerin toplam taze ağırlığı, çekirdeğin kapsam algısı, görsel değerlendirilen çekirdek büyüklüğü kategorileri, tohum kabuğunun sertlik derecesi, endospermin gelişme derecesi ve embriyonun gelişme derecesidir. İncelenen 160 RAPD primerinden 110 adedi belirgin bant desenleri vermiştir. 12 markör özellikle kantitatif karakter olan bir çekirdeğin ortalama taze ağırlığı ve tanedeki çekirdeklerin toplam taze ağırlığı ile önemli korelasyon göstermiştir. 4 markör, 9 adet çekirdekli bireyi tanımlamıştır. Ek 27

37 olarak, 3 markör, 21 adet çekirdekli ve 4 görülebilen çekirdek izine sahip bireylerin tanımlanmasını sağlamıştır. Bu işlem ile populasyon büyüklüğü %44 oranında azaltılabilmiştir. Bu sonuçların ön seleksiyon amaçlı kullanılabileceği araştırıcılar tarafından ifade edilirken, öncelikle seçilen markörlerin, ebeveynler arasında polimorfik olduğunun belirlenmesi gerektiği ifade edilmiştir. Reisch and Pratt (1996), külleme (Uncinula necator) nin asmanın zarara yol açan en önemli hastalıklarından biri olduğunu ifade etmiştir (Dalbó et al. 2001). Islah programları, bu nedenle, dayanıklı çeşitler geliştirmek üzerine yoğunlaşmıştır. Küllemeye dayanımda birden fazla genin görev aldığı düşünülmüştür (Boubals 1961). Markör aracılığıyla seleksiyon yaklaşımına tek engel, yeterli düzeyde dayanım için birden fazla genin gerekli olabilmesidir. Ancak küllemeye dayanım üzerinde nispeten güçlü etkiye sahip bir genomik bölgenin tespit edilmesi (Dalbó 1998), bir major genin veya gen salkımının rol oynadığını düşündürmektedir. Ye et al. (1995) ın oluşturduğu Horizon x Illinois populasyonunda, Dalbó (1998) külleme ve siyah çürüklük hastalıklarına dayanımın kalıtımını çalışmıştır. RAPD markörlerin kullanıldığı haritalama çalışmasında her iki ebeveyne ait genetik haritalar çıkarılmış ve 20 adet bağlantı grubu belirlenmiştir. Çalışmaya 30 mikrosatelit ve 4 STS (Sequence Tagged Sites) markörünün de eklenmesiyle 10 adet homolog bağlantı grubu tespit edilmiştir. Birbirlerinden ortalama uzaklığı 7.5 cm olan 451 markör haritalar üzerine yerleştirilmiştir. Araştırıcılar dayanıklı çeşit olan üzerinde 10 numaralı bağlantı grubu üzerinde küllemeye dayanım için güçlü bir QTL tespit etmişlerdir. CS markörü bu QTL ile sıkı ilişkili bulunmuştur. İki küllemeye dayanım QTL i ise Horizon (duyarlı) çeşidinde 16 ve 18 no lu bağlantı grubunda bulunmuştur. İlginç bir şekilde, küllemeye dayanım QTL inin bulunduğu bağlantı gruplarında aynı zamanda süyah çürüklük için de QTL bulunmuştur. Çalışmanın sonucunda elde edilen bulguların ıslah programında kullanılma olasılığı da araştırılmıştır. Buna göre, küllemeye dayanımda görev alan en güçlü QTL (547-1 çeşidinde 10. bağlantı grubu) seçilmiştir. Bu QTL e yakından bağlı bir RAPD markörü (CS25b) ve bir AFLP markörü (AfAA6), CAPS markörlerine dönüştürülerek aynı dayanım kaynağının kullanıldığı farklı 28

38 melezlerde QTL açılımı takip edilmiştir. Bütün melezlerde, küllemeye duyarlı bireylerin yüzdesinin, bu markörler esas alınarak yapıldığında önemli ölçüde azaltılabileceği sonucuna varılmıştır Fungal hastalıklara dayanıklı Regent ve duyarlı Lemberger çeşidi arasındaki melezleme ile elde edilen 150 bireylik populasyon, asmanın moleküler haritasını çıkarmak amacıyla kullanılmıştır. 47 birey üzerinde test edilen RAPD markörlerin tüm populasyona uygulanması ile 11 bağlantı grubu ortaya çıkarılmıştır (Buck and Zyprian 2000). Antcliff (1980) çiçek cinsiyetinin tek lokus tarafından yönetildiğini, Carbonneau (1983) ise bu karakterin bir başka lokus tarafından epistatik olarak etkilendiğini ifade etmiştir (Dalbó et al. 2000). Horizon ve Illinois in melezlenmesi ile oluşturulan 58 F 1 bitkisinde gerçekleştirilen genetik haritalama çalışmasında 277 RAPD, 25 mikrosatelit, 4 CAPS ve 12 AFLP markörü kullanılmış ve asmalarda cinsiyeti kontrol eden tek bir lokusun bir mikrosatelit (VVS3) ve bir RAPD (GY104i) markörü ile yakından bağlantılı olduğu bulunmuştur. Bazı rekombinantların varlığına rağmen VVS3, Vitis ıslah programlarında erkek tiplerin çıkartılması amacına yönelik olarak en fazla kullanılma olanağına sahip olmuştur (Dalbó et al. 2000). Grando et al. (2000) Moscato bianco ve Vitis riparia arasındaki melezleme ile elde ettikleri populasyonda (90 bitki) polimorfizm ve moleküler karakterlerin açılımını test etmek amacıyla mikrosatelit ve RAPD markörleri kullanmışlardır. Ebeveynlere ait bütün allel büyüklükleri analiz edilen bütün lokuslarda farklı olmuştur. Allel açılım oranları Mendel değerlerine yakın olmuş ve VVMD6 ve VVMD7 lokusları dışındaki tüm lokuslar bağımsız şekilde kalıtım göstermiştir. Bant desenlerinin tekrar elde edilmesi aşamasında karşılaşılan zorluklar nedeniyle populasyondaki RAPD markörlerinin açılımı haritalama için daha az yararlı olmuştur. 29

39 Vitis amurensis hibritleri, Vitis vinifera çeşitleri ve Franko-Amerikan hibritlerinin kullanıldığı bir çalışmada Kozma (2000), fungal hastalıklara dayanımı araştırmıştır. Doğal ve yapay enfeksiyonun yapıldığı çalışmada, dayanım düzeyleri tespit edilmiştir. Külleme ve mildiyöye dayanımın dominant karakterde olduğu tespit edilmiştir. Dayanım derecesi ebeveynin genetik kaynağına göre değişmiştir. Franko-Amerikan hibritleri ile Doğu Asya V. amurensis hibritlerinin dayanım ıslahı çalışmaları için iyi bir kaynak olabileceği araştırıcı tarafından belirtilmiştir. Milutinovic et al. (2000) tarafından gerçekleştirilen çalışmada, renkli meyve suyuna sahip çekirdeksiz bir çeşit elde etmek amacıyla yapılan melezlemede (Evita x Beogradska Besemena) kalıtım şekli de incelenmiş ve tane rengi ile meyve suyu rengi için tek gen kalıtımının olduğu gözlenmiştir. Çekirdeksizliğin monogenik kalıtımın dışında bir kalıtıma sahip olduğu belirlenmiştir. Verim ve salkım ağırlığı için, düşük verim ve salkım ağırlığına sahip ebeveynin (Evita) dominantlığı saptanmış ve tane ağırlığı için düşük tane ağırlıklı ebeveynin (Evita) kısmi dominantlığı belirlenmiştir. Ren et al. (2000) iki muskadin üzüm çeşidi Summit (beyaz) x Noble (kırmızı) kullanarak tane rengine yönelik markör tespit etmeye çalışmıştır. F 1 populasyonunda tane rengine yönelik açılım kırmızı rengin tek bir dominant gen tarafından kontrol edildiğini göstermiştir. RAPD-PCR tekniği ve BSA yöntemi tane rengi karakterini etiketlemek için kullanılmıştır. Toplam 350 adet primer, 7 şer bireyden oluşan kırmızı ve beyaz DNA havuzunda polimorfizm açısından incelenmiştir. Hedef gene bağlı 2 RAPD markörü tespit edilmiştir. Bir tanesi (650 baz çiftlik) kırmızı taneli 56 bireyle birlikte açılım gösterirken, beyaz bireyler bu markörü taşımamıştır. Sonuçlar RAPD markörünün tane rengine yönelik erken seleksiyonda güvenilir olduğunu göstermiştir. M. rotundifolia, Xiphinema index e (kamalı nematod) karşı çok güçlü dayanıma sahiptir. V. rupestris x M. rotundifolia melezi olan 200 F 1 birey X. index dayanımı yönünden taranmış (Walker and Yin 2000) ve 70 adedi dayanıklı bulunmuştur. İki F 1 (8909 ve 8913) DNA markör taraması ve kalıtım testi için kullanılmıştır. Analiz edilen 30

40 70 RAPD primerinden bir tanesi (OPA-12) dayanım ile bağlantılı bulunmuştur. OPA- 12 ürünü klonlanmış ve bir SCAR markörüne dönüştürülmüştür. Dayanıklı bitki seleksiyonundan 30 tanesi arazi performansı ve virüs dejenerasyonuna dayanımı değerlendirmek amacıyla 7 denemeye alınmıştır. X. index e dayanımı açısından normal olmayan açılım oranları gözlenmesine rağmen F 1 bitkilerin sitogenetik incelemesi, 38 kromozom taşıdıklarını göstermiştir. Hibritler umulmadık şekilde verimli çıkmıştır ve araştırıcılar tarafından dayanıklı x dayanıklı, dayanıklı x duyarlı, her iki ebeveyne geri melezleme ve dayanıklı bitkilerin kendilenmesi ile F 2 generasyonu elde edilmiştir den fazla haritalama hibriti, X. index e dayanım için test edilmiş ve normal Mendel oranları gözlenmiştir. Kendilenmiş grup dışında bütün sonuçlar, dayanımın tek bir dominant gen tarafından kontrol edildiğini düşündürmüştür. 350 bireyden oluşan dayanıklı x duyarlı melezleme populasyonu genetik haritalama analizinde kullanılmıştır. Tesadüfi seçilen 116 hibritte AFLP markörleri kullanılarak dayanıma bağlı markör bulma çalışması yapılmıştır. Açılım gösteren 500 ün üzerinde AFLP markörü her iki ebeveynde 19 bağlantı grubu oluşturmuştur. Araştırıcılar bu haritanın Muscadinia dan Vitis e bir çok önemli dayanım karakterlerinin aktarılması için temel oluşturacağını ifade etmişlerdir. Lahogue et al. (1998) tarafından bulunan sdi genine bağlı RAPD markörleri, Sultana kökenli kısmen çekirdeksiz iki genotipin melezlenmesi ile elde edilen populasyonda BSA yöntemi ile araştırılmıştır (Adam-Blondon et al. 2001). İki RAPD markörü (OPC- 08 ve OPP-18) sadece çekirdeksiz genotiplerde bulunmuş ve bu karakter ile bağlantılı bir majör lokusun varlığı gösterilmiştir. OPC-08 RAPD markörü SCAR markörüne (SCC8) dönüştürülmüştür. Georgiady et al. (2001) asmada ekonomik anlamda öneme sahip bir çok özelliğin birden fazla gen grubu tarafından kontrol edildiğini ifade etmiştir. Bu poligenik karakterlerin doğasını daha iyi anlamak için Vitis e ait bir genomik harita çıkartılması ve önemli özelliklerin düzenlenmesinde rol alan genetik faktörlerin haritalanması amacıyla bir adet F 1 in kendilenmesi ile oluşturulan 1000 bireylik F 2 populasyonu oluşturmuştur. Yaklaşık 700 AFLP ve bazı SSR markörleri haritalama için halen 31

41 kullanılmaktadır. Populasyondan seçilen ve vegetatif olarak çoğaltılan 300 birey hastalığa dayanım, genel bitki gelişmesi ve şekli ile meyve verimi ve kalitesi gibi kantitatif karakterlerin haritalanmasında kullanılmaktadır. Bu QTL haritalama populasyonu, çevrenin karakterler üzerine etkilerini araştırmak amacıyla coğrafik ve iklimsel yönden farklı alanlarda yetiştirilmektedir. Pauquet et al. (2001) ın yaptıkları çalışmada, Muscadinia rotundifolia türünden Vitis vinifera ya yalancı geri melezleme (V. vinifera çeşidi her bir geri melezlemede değişmiştir) ile aktarılan Run1 (Uncinula necator dayanım geni) geni etrafında AFLP markörleri ile bölgesel bir harita oluşturmak ve markör aracılığıyla seleksiyonda kullanım olanaklarını araştırmak amaçlanmıştır. Cabernet Sauvignon çeşidinin duyarlı kontrol çeşidi olarak kullanıldığı araştırmada, melezleme ile elde edilen bütün bireylere ait fidanlar, serada yapay olarak patojen ile inoküle edilmiş ve patojenite durumları tespit edilmiştir. 157 bireyden oluşan BC 5 populasyonu üzerinde 13 AFLP markörü 22 adet Run1 taşıyan genotip ile 16 duyarlı genotip üzerinde daha da ileri düzeyde araştırılmıştır. 3 markör sadece dayanıklı genotiplerde bulunmuştur. Daha önceden gen ile birlikte açılım gösteren markörler arasında rekombinasyonun görülmesi bu bölgede rekombinasyonun mümkün olabileceğini ve bu nedenle daha büyük populasyonlarda araştırılması gerekliliğini ortaya koymuştur. Ageoerges et al. (2002) tarafından yapılan kapsamlı bir araştırmanın parçası olarak Syrah, Grenache ve küllemeye kısmen dayanıklı bir interspesifik hibrit arasında yapılan melezleme populasyonlarında küllemeye dayanım ile ilgili QTL araştırılmıştır. Syrah ve Grenache arasında yapılan melezleme ile elde edilen populasyonda da tane gelişimi ve olgunlaşmasında görev alan genlerin saptanmasına yönelik olarak çalışmalara devam edilmektedir. Araştırıcılar ilk sonuçların 3 yıl içerisinde alınabileceğini ifade etmiştir. M. rotundifolia çok sayıda asma zararlılarına karşı çok güçlü dayanıma sahiptir. Genellikle Vitis türleri ile uyuşmaz olmasına rağmen V. rupestris ile verimli döller oluşturmaktadır. Bu hibritler dayanım genlerinin kültür asmasına geçişi için eşsiz bir genetik köprü olmaktadır. V. rupestris A. de Serres (2n=38) x M. rotundifolia 32

42 Cowart (2n=40) hibridine ait genetik bağlantı haritası yalancı melezleme stratejisi kullanılarak çıkartılmıştır (Callahan et al. 2002). 418 AFLP, 32 ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats), 23 RAPD markörü ile 18 mikrosatelit kullanılmıştır. Ebeveynler için oluşturulan haritalarda 19 bağlantı grubu tespit edilmiştir. Xiphinema index e dayanım ile bağlantılı bir lokus harita üzerinde belirlenmiştir. İki kısmen çekirdeksiz genotipin melezlenmesinden elde edilen 139 bireylik F 1 populasyonu üzerinde genetik haritalama yapılmıştır (Doligez et al. 2002). 301 markörün (250 AFLP, 44 SSR, 3 izoenzim, 2 RAPD, 1 SCAR ve 1 fenotipik markörtane rengi) kullanılmasıyla 20 bağlantı grubu haritalanmış ve 1002 cm lık alan kapsanmıştır. Tane rengi için majör gen, hem babaya ait haritada hem de birleştirilmiş haritada tespit edilmiştir. Çekirdeksizliğin kantitatif alt karakterlerine ait QTL araştırması 3 yıl süreyle ebeveynlere ait haritalarda analiz edilmştir: tane ağırlığı, çekirdek sayısı, çekirdek toplam kuru ve taze ağırlığı, çekirdek kuru madde yüzdesi ve çekirdek ortalama taze ve kuru ağırlıkları. Bütün karakterlerde aynı bölgede yıllar için tek bir bağlantı grubunda yüksek etkili QTL ler saptanmıştır. Bazı sonuçlar ikinci bir majör QTL in bazı karakterler için varlığını göstermiştir. Bu majör QTL ler için ebeveynlerin kısmi etkilerinde farklılıklar gözlenmiştir. Diğer 3 bağlantı grubu üzerinde tane ağırlığı ve çekirdek sayısı için bir adet, çekirdek kuru madde miktarı için iki farklı yılda küçük etkilere sahip 3 ayrı QTL saptanmıştır. Donald et al. (2002) tarafından yapılan çalışmada daha önceden klonlanmış patojen dayanım genleri içerisinde korunmuş bölgelere yönelik dizayn edilen dejenere primerler (belli bir protein dizisini kodlayan DNA ile hibridize olan tek iplikçikli sentetik oligonükleotid) asmada dayanım gen analogları (Resistance Gene Analogs, RGA) nı çoğaltmak için kullanılmıştır. 28 adet asma RGA dizileri tanımlanmış ve %70 veya daha fazla nükleik asit, dizi özelliğine dayanarak 22 alt gruba bölünmüştür. Her grubun temsilcilerine ait RFLP ve AFLP markörleri run-1 lokusuna bağlantı açısından taranmıştır. 3 RGA ve 13 AFLP markörü bu lokusa sıkı şekilde bağlantılı bulunmuştur. Bu markörlerden 2 RGA (GLP1-12 ve MDH145) ve 10 AFLP markörü dayanıklı genotipte aynı anda açılım göstermiştir. 22 run-1 taşıyan dayanıklı genotip ile 16 33

43 duyarlı genotip 13 AFLP markörü kullanılarak analiz edilmiştir. 3 markörün sadece dayanıklı genotiplerde bulunmuş olması, küllemeye dayanıklı asma çeşitlerinin markör aracılığıyla seleksiyonu için bir olanak sağlayabilir. Araştırıcılar, gen ile birlikte açılım gösterdiği tespit edilen markörler arasında rekombinasyonun görülmesini bu bölgede rekombinasyonun mümkün olabileceği ve daha büyük populasyonlarda araştırılmasının gerekeceği şeklinde ifade etmişlerdir. Bir Çin yabani asma türü olan Vitis quinquangularis ( ) ile Vitis vinifera L. (Muscat Rose) arasındaki melezleme ile oluşturulan F 1 hibrit populasyonunda 280 RAPD primeri ile yapılan ön çalışmalar sonucunda 39 primerin polimorfik bant deseni verdiği tespit edilmiştir (Luo et al. 2002). 80 bireylik F 1 populasyonunda bu primerler ile DNA çoğaltımı gerçekleştirilmiştir. 1:1 veya 3:1 oranında açılım gösteren 90 adet RAPD markörünün ebeveynelere ait bağlantı haritalarının çıkartılmasında kullanılabileceği bildirilmiştir. Halen devam eden çalışmalarında araştırıcılar, tane ve meyve suyu rengi, tane şekli ve büyüklüğü, cinsiyet, iyonik antosiyanin kapsamı, fenolojik aşamalar, külleme ve antraknoza dayanım gibi bir çok önemli morfolojik karakterleri kontrol eden majör veya tek gene bağlı markörleri gruplandırılmış açılım analizi tekniği kullanarak tespit etmeye çalışmaktadır. Zavala et al. (2002) tarafından Şili de sofralık üzüm ıslah programlarına yardımcı olmak amacıyla dominant ve kodominant markörlere dayalı bir bağlantı haritası hazırlanmıştır. Bu amaçla Ruby Seedless x Thompson Seedless melezi 127 bireylik bir populasyonda 50 SSR, 150 AFLP ve 30 RAPD polimorfik markör tanımlanmıştır. Az sayıda markör nedeniyle ebeveynlere ait sadece sırasıyla 13 ve 11 bağlantı grubu oluşturulmuştur. Bu çalışmanın ikinci kısmında çekirdeksizliğe bağlı markörler tanımlanmıştır. 4 adet çekirdekli veya çekirdeksiz fenotip grubu (5 er genotip) gruplandırılmış açılım analizi yaklaşımıyla kullanılmıştır. 350 RAPD primer testinden sonra 10 adet aday markör tespit edilmiş, ancak sadece 5 bant iki grubun bütün genotiplerinde bulunmuş veya bulunmamıştır. Bu bantların klonlanması ve dizilerinin belirlenmesi ile araştırıcılar, döllerde çekirdeksizlik karakterini izlemede faydalı yeni SCAR markörlerini geliştirmeyi ummaktadır. 34

44 Lemberger ve Regent çeşitlerinin melezlenmesiyle elde edilen populasyonda AFLP ve CAPS markörlerinin de eklenmesiyle zenginleştirilen haritalama çalışmaları ile fungal hastalıklara (Uncinula necator ve Plasmopara viticola) ve bazı karakterlere yönelik QTL analizi yapılmıştır (Zyprian et al. 2002). Araştırıcılar harita tabanlı klonlama yaklaşımını kullanarak ilgili genlerin izole edilmesi için çalışmaktadır. Doligez et al. (2003) iki kısmen çekirdeksiz genotip (Dattier de Beyrouth x 75 Pirovano) x (Alphonse Lavallée x Thompson Seedless) arasındaki melezleme sonucunda elde edilmiş tam akraba döllerde bazı kalite ile ilişkili özelliklere yönelik QTL leri araştırmıştır. 300 den fazla AFLP lokusu ile 182 SSR lokusun genotipi çıkarılmıştır. Moscato bianco (Vitis vinifera L.) ve bir Vitis riparia bitkisi arasında yapılan melezleme sonucu elde edilen 81 F 1 bitkisi ile yapılan çalışma sonucunda 2 bağlantı haritası elde edilmiştir (Grando et al. 2003). Üç moleküler markör tipinin kullanıldığı çalışmada çift yönlü yalancı melezleme stratejisi izlenmiştir. Diğer Vitis haritalarında bağlantı gruplarına yerleşen SSR ların etkinliği ve doygun haritalardaki AFLP lerin yarayışlılıkları değerlendirilmiştir. Ana ebeveyne ait haritada 20 bağlantı grubuna 338 markör yerleşirken (1.639 cm), baba ebeveynde ise 19 bağlantı grubuna 429 lokus yerleşmiştir (1.518 cm). 14 adet homolog bağlantı grubu bulunmuştur. SSR lokuslarının yerlerinin diğer haritalarla paralel olduğu belirtilmiştir. Kozma Jr. and Dula (2003), iki hibrit ailesinde (Muscadinia x V. vinifera BC 4 x Franco-American hibrit x V. vinifera x V. amurensis ve Muscadinia x V. vinifera BC 4 x (V. amurensis x V. vinifera) BC 2 ) külleme dayanımının değişkenliğini çalışmıştır. Bitkiler serada yetiştirilmiş ve yapay olarak inoküle edilmiştir. Çalışma sonuçları, Muscadinia dan gelen külleme dayanımından sorumlu Run1 geninin mildiyö dayanımı ile bağlantılı olduğunu göstermiştir. Araştırıcılar ebeveynlerinden daha fazla mildiyöye dayanıklı hibritler elde etmiştir. 35

45 Madini et al. (2003) tarafından hastalığa dayanım ve kalite amaçlı ıslah çalışmalarında kullanılmak üzere QTL bilgilerinin üretimine yönelik olarak V. vinifera L. ve V. riparia Michx. a ait iki bağlantı haritası oluşturulmuştur. 350 AFLP ve mikrosatelit markörüne dayalı olarak her iki harita yaklaşık 1150 cm ı kapsamıştır. Bitki savunmasında görev alan aday genler mildiyöye karşı kantitatif dayanım ile ilişkisi açısından analiz edilmiştir. Dayanım özelliği açılım gösteren populasyonda mildiyö ile doğal enfeksiyon ve yapay inokülasyondan sonra değerlendirme yapılmıştır. Çelikler serada, kontrollü koşullarda yapay inokülasyondan sonra sporulasyon, kloroz ve nekroz için de değerlendirilmiştir. Tanede aroma oluşumu analiz edilmiştir. Yapay inokülasyondan sonra mildiyö simptomları ve tanede serbest aroma formlarının kapsamına ilişkin QTL ler tanımlanmıştır. Marino et al. (2003) Vitis vinifera Muscato bianco x V. riparia populasyonunda belirlenen 2 moleküler bağlantı haritasında kodominant markörler kullanarak yapraklarda mildiyöye dayanım ve tanede aroma bileşikleri için QTL analizi yapmıştır. Ana ebeveyn haritası 403 SSR ve AFLP markörleri ile 21 bağlantı grubundan (1128 cm) ve baba ebeveyn haritası 502 SSR ve AFLP markörleri ile 20 bağlantı grubundan (1143 cm) oluşmuştur. Mildiyöye dayanımın belirlenmesi için doğal enfeksiyon ve yapay inokülasyon sonrası değerlendirme yapılmıştır. Yapay inokülasyon sonrası mildiyö semptomları ve serbest aroma bileşikleri ile ilgili QTL rapor edilmiştir. Çekirdeksizlik ile ilişkili bir SCAR markör geliştirmek amacıyla, çekirdekli ve çekirdeksiz fenotipleri temsil eden iki grup arasında (BSA) RAPD markörleri kullanılmıştır (Mejia and Hinrichsen 2003). 127 bireylik Ruby Seedless x Sultanina F 1 populasyonunda 336 adet RAPD primeri test edilmiştir. Sadece çekirdeksiz genotiplerde bulunan, WF adı verilen bir RAPD markörü klonlanmış, dizisi belirlenmiş ve bir SCAR markörüne dönüştürülmüştür. SCF27 adı verilen bu markörün 127 bireyde yapılan analizi, 3:1 açılım gösterdiğini ortaya çıkararak ebeveylerin heterozigot olduklarını göstermiştir. Markörün çekirdekli hibritlerde incelenmesi sonucunda %82 lik bir korelasyon gözlenmiştir. Araştırıcılar bu marköre dayalı 36

46 seleksiyonun populasyonda incelenecek birey sayısını azaltmada faydalı olabileceğini ifade etmiştir. Muskadinya üzümlerine mildiyö dayanımı kazandıran gene bağlı moleküler markörleri tanımlamak amacıyla BSA metodunu kullanan Merdinoğlu et al. (2003) açılım gösteren BC2 populasyonunda dayanım düzeyini, bitkideki tüm yaprakların patojen ile inokülasyonundan sonra görsel olarak değerlendirmiştir. 151 RAPD primeri, 13 ISSR primeri ve 208 SSR lokusu ile ortaya çıkarılan polimorfizm 6 şar bireyden oluşan 2 DNA havuzunda (dayanıklı x duyarlı) incelenmiştir. Varyans analizi sonucunda 1 RAPD, 4 ISSR ve 8 SSR ın dayanım üzerine önemli etkide bulunduğu gösterilmiştir. Bunlardan 12 adedi aynı bağlantı grubunda 45 cm lık bir bölge içine yerleşmiştir. Dayanım QTL in varlığı aralık (interval) haritalama ile doğrulanmıştır. Bu QTL gözlenen varyansın %73 ünü ve genetik varyansın %83 ünü açıklamaktadır. Bu sonuçlar; Rpv1 (Plasmopara viticola dayanım geni) olarak isimlendirilen bu QTL in muskadinia üzümlerinde dayanım sağlayan tek bir eşsiz gen olduğunu düşündürmüştür. Rpv1, ayrıca külleme dayanım geni Run1 e yakından bağlantılı bulunmuştur. Külleme ve mildiyöye tolerans açısından açılım gösteren, 70 bireylik bir Welschriesling x Sirius (KI.K1977) populasyonu 160 SSR ve 190 RAPD markörü kullanılarak araştırılmıştır (Regner et al. 2003). RAPM markörlerinin %65 ten fazlasının polimorfik olduğu bu populasyonda araştırıcılar, 7 RAPD markörünün küllemeye dayanımla önemli derecede bağlantılı olduğunu bulmuştur. Tek bir markörün etkisinin yüksek olmaması, dayanımın birden fazla allele dayalı olduğunu doğrulamıştır. Bu populasyonda elde edilen markörler başka bir populasyonda (Gr. Veltliner x Seyyal=KI.K1979) incelenmiş, ancak RAPD markörleri arasında herhangi bir ortaklık sağlanamamıştır. Araştırıcılar elde edilen ilk haritadan yola çıkarak,populasyondaki birey sayısı ile markör sayısının arttırılmasının gerekli olduğu sonucuna ulaşmıştır. Zyprian et al. (2003) fungusa dayanıklı iki hattın (Gf.Ga ve Villard blanc) melezlenmesi ile elde ettikleri populasyonu külleme ve mildiyö hastalıklarına karşı moleküler markörleri kullanarak analiz etmişlerdir. Daha önce kullandıkları Regent x 37

47 Lemberger populasyonuna ait harita kadar doygun olmamakla birlikte Gf.Ga x Villard blanc genetik haritasının, fenotipik karakterlere ait QTL lerin genetik bölgelerinin korelasyonu çalışmasında kullanılabileceği görüşünde olan araştırıcılar her iki haritayı kullanarak fungal patojenlere dayanımla ilgili genetik faktörlerin karşılaştırmasını yapmışlardır. 346 adet SSR markörünün Syrah ve Grenache melezi olan populasyonda test edilmesi sonucunda 177 adet markör Syrah ta 19 bağlantı grubu oluşturmuş ve toplam cm lık alan kapsanmıştır (Adam-Blondon et al. 2004). Grenache haritasında ise 178 markör 18 bağlantı grubuna yerleşmiş ve cm lık alan kapsanmıştır. Bağlantı grubu başına ortalama 6.5 yeni markör bulunmuştur. Araştırıcılar bu haritanın; dağılımı iyi olan markörlerin diğer haritalara transferi ile QTL saptanması, belli bölgelerdeki markörlerin kullanımıyla gen veya QTL lerin detaylı haritalanması veya markörler aracılığıyla seleksiyon için markör seçilmesinde büyük bir potansiyele sahip olduğunu belirtmiştir. Zyprian ve ekibi tarafından çok değişik markör tipleri kullanılarak Regent x Lemberger populasyonunda 153 adet F 1 bitkisi ile oluşturulan genetik haritada 16 nolu bağlantı grubunda yerleşen küllemeye dayanım ile bağlantılı 7 adet RAPD markörü SCAR markörlerine dönüştürülmüştür (Akkurt 2004). Bu SCAR markörlerinin tekrarlanabilirliği test edilmiş ve 4 tanesi daha önceden oluşturulan haritaya geri bağlanmıştır. ScORA7 adı verilen SCAR markörü yapılan bütün testlerde sadece dayanıklı tür ve çeşitlerde bant verdiğinden MAS ta kullanılabilir olduğu tespit edilmiştir. Doucleff et al. (2004) Vitis rupestris x V. arizonica melezlenmesinden elde edilen 116 bireylik populasyonda yalancı melezleme stratejisi kullanarak bir genetik harita çıkarmıştır. 475 adet DNA markörü (410 AFLP, 24 ISSR, 32 RAPD, 9 SSR) kullanarak ebeveynlere ait haritayı oluşturmuştur. Ana ebeveyne ait haritada 17 bağlantı grubu (756 cm), baba ebeveynde ise 19 bağlantı grubu (1.082 cm) bulunmuştur. 138 adet 3:1 açılan heterozigot markör ise haritaları birleştirmede kullanılmıştır. Orta derecede 38

48 doygun olan bu haritanın kamalı nematoda (Xiphinema index) ve asma vebasının (Pierce s disease) taşıyıcısı olan Xylella fastidiosa ya dayanım genlerinin veya QTL lerin tespitinde başlangıç oluşturabileceği ifade edilmiştir. Fischer et al. (2004) 153 bireylik Regent x Lemberger populasyonunda fungal hastalıklara dayanıma yönelik yaptıkları araştırmada, 185 AFLP, 137 RAPD, 85 SSR ve 22 SCAR veya CAPS markörünü haritalamıştır. Ana ebeveynde küllemeye dayanım için 1 adet QTL ve mildiyöye dayanım için birden fazla QTL saptanmıştır. Olgunlaşma zamanı, tane büyüklüğü ve koltuk sürgünü büyümesine yönelik başka QTL ler bulunmuştur. Riesling x Cabernet Sauvignon populasyonunda 153 bitki üzerinde mikrosatelit markörleri kullanılarak bir çerçeve haritası çıkaran Riaz et al. (2004) 20 bağlantı grubu bulmuştur. Markörler arası ortalama 11.0 cm uzaklıkla toplam cm lık bir kısım kapsanmıştır. Bu harita Uluslarası Asma Genomu Programı tarafından referans harita olarak kabul edilmiştir. Tane aromasını belirleyen ana bileşiklerin (terpenler) genetik kontrolu araştırma amacıyla, yoğun bir aromaya sahip V. Vinifera cv. Moscato bianco ile önemli fungal hastalıklara dayanıklı V.riparia arasında yapılan melezleme ile elde edilen bir populasyona ait 81 bireyde, serbest ve glikozid bağlı terpenlerin miktarları saptanmış ve markör (SSR, AFLP ve SSCP) - karakter analizi MapQTL 4.0 yazılım programı ile belirlenmiştir (Sevini et al. 2004). Terpenoid biyosentezinde görevli aday genler polimorfizm ve açılım açısında incelenmiştir. Monoterpenlerin tanedeki miktarlarına yönelik ilk QTL ler tanımlanmıştır. Araştırıcılar bu populasyonda konuya yönelik çalışmalarına devam etmektedir. Zyprian et al. (2005) Gf.Ga ve Villard blanc arasında yaptıkları melezleme ile elde ettikleri populasyonda fungal hastalıklara dayanım ve tat bileşiklerine yönelik çalışmalar yapmıştır. Elde edilen sonuçları, Regent çeşidine ait genetik bilginin QTL ilişkisi ile karşılaştırmıştır. Regent te bulunan külleme hastalığına dayanım markörleri 39

49 yeni bir melezlemede test edilmiştir. Dayanımın yanında tat bileşiklerinin Gf.Ga ıslah hattından elde edildiğini ve Villard blanc ın daha natürel beyaz şarap verdiğini ifade etmiştir. Yapılan araştırmaların asmada genetik ilerlemeye büyük fayda sağladığı ve hız kazandırdığı göz önüne alındığında, ülkemizde de bu alanda öncü ve ileri çalışmaların gerekliliği ortaya çıkmaktadır. 40

50 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bu çalışma T.C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü serası ile Tarım Biyoteknolojisi Bahçe Bitkileri Birimi Laboratuvarında gerçekleştirilmiştir Materyal Bu araştırma ile asma ıslahında karşılaşılan sorunların çözümüne yönelik olarak, Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü nde yürütülen Melezleme Yoluyla Külleme ve Mildiyö ye Dayanıklı ve Standart Özelliklere Sahip Yeni Üzüm Çeşitlerinin Elde Edilmesi konulu projede (Proje Kod No: Tagem/IY/96/06/04/013) yılında Italia ve Mercan üzüm çeşitlerinin melezlenmesi yoluyla geliştirilen F 1 populasyonu kullanılarak asmanın genom haritasının çıkarılması amaçlanmıştır. Italia üzüm çeşidi 1911 yılında İtalya da Bicane x Muscat Hamburg melezi olarak elde edilmiş (Çelik 2002) iri ve konik piramit şeklinde salkımlara sahip beyaz, orta geççi ve sofralık bir çeşittir. Taneleri oval ve iridir. Misket kokusuna sahip olup Marmara, Ege, İç ve Güneydoğu Anadolu da yetiştirilmektedir (Şekil 3.1.). Mercan üzüm çeşidi ise konik salkımlı, yuvarlak ve beyaz taneli, tatlı, sulu, Eylül ortasına olgunlaşan şıralık bir çeşit olup Amasya da yöresel olarak yetiştirilmektedir (Odabaş vd. 2002) (Şekil 3.2.). 41

51 Şekil 3.1. Italia üzüm çeşidi (Ana) Şekil 3.2. Mercan üzüm çeşidi (Baba) 42

52 Araştırmada kullanılan Italia x Mercan kombinasyonuna ait 60 adet F 1 bitkisinde vegetatif, generatif (çiçek, salkım ve meyve) ve hastalıklara dayanım özelliklerini içeren toplam 38 adet karakter incelenerek, bu özellikler ile asmanın genomik haritasını çıkarmak suretiyle ilişkilendirilmesi amaçlanmıştır. Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü nde bu çalışma kapsamında incelenen vegetatif, generatif ve hastalıklara dayanımla ilgili 38 adet karakter aşağıda sunulmuştur. A. Vegetatif Özellikler 1. Sürgün ucunda antosiyan yoğunluğu (OIV 003, UPOV 5) (Anonymous 1983) 0 Yok 1 Çok zayıf 3 Zayıf 5 Orta 7 Yoğun 9 Çok yoğun Bu özellik çiçeklenmeden önce 10 adet sürgün ucunda gözlemlenmiştir. 2. Dinlenme halindeki kışlık gözlerin soğuğa dayanımları (Anonymous 1983, Anonymous 1995) 1 % 0-25 ölü (Sürmeyen göz) - Dayanıklı 2 % Yarı Dayanıklı 3 % Yarı Hassas 4 % 76 - Çok Hassas Bu özellik vejetasyon döneminde incelenmiştir. 43

53 3. Gözlerin patladığı dönem (OIV 301, UPOV 1) (Anonymous 1983) 1. Çok erken 3. Erken 5. Orta 7. Geç 9. Çok geç Bu özellik gözlerin %50 sinde koruyucu tüylerin göründüğü dönemde incelenmiştir. 4. Genç yaprak üst yüzey rengi (OIV-051-1, UPOV-24) (Anonymous 1983) 1. Yeşil-Sarı 2. Kahverengi-Yeşil 3. Bakır kırmızısı Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde sürgün ucundaki ilk üç yaprakta gözlemlenmiştir. 5. Genç yaprak üst yüzey tüylülüğü (Galet 1979) 1. Tüysüz 2. Tüylü 3. Örümcek ağı gibi tüylü 4. Kalın ve diken gibi tüylü 5. İnce hav (yün) gibi tüylü Bu özellik çiçeklenmeden önce 10 sürgünde incelenmiştir. 44

54 6. Genç yaprak alt yüzey rengi (OIV-051-1) (Anonymous 1983) 1. Yeşil-Sarı 2. Kahverengi-Yeşil 3. Bakır kırmızısı Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde sürgün ucundaki ilk üç yaprakta gözlemlenmiştir. 7. Yaprak alt yüzey tüylülüğü (Galet 1979) 1. Tüysüz 2. Tüylü 3. Örümcek ağı gibi tüylü 4. Kalın ve diken gibi tüylü 5. İnce hav (yün) gibi tüylü Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde sürgün ucundaki ilk üç yaprakta gözlemlenmiştir. 8. Yaprak üst yüzey görünümü (Anonymous 1995) 1. Yağımsı 2. Parlak 3. Mat Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde 4-6. boğumlardaki olgun yapraklarda incelenmiştir. 45

55 9. Yaprak formu (Galet 1979) 1. Düz 2. İç bükey 3. Dış bükey Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde 4-6. Boğumlardaki olgun yapraklarda incelenmiştir. 10. Yaprak şekli (Galet 1979) 1. Yürek şekilli 2. Beşgen şekilli 3. Üçgen şekilli 4. Yuvarlak şekilli 5. Böbrek şekilli 6. Yuıvarlağımsı böbrek şekilli 7. Yuvarlağımsı konik şekilli Bu özellik olgun yaprakta 10 sürgünde sürgünün 1/3 nün uç kısmından alınan yapraklar dikkate alınarak çiçeklenme öncesi incelenmiştir. 11. Yaprak üst yüzeyinin yapısı (Galet 1979) 1. Kabarık 2. Düz 3. Kıvrımlı (dalgalı) Bu özellik olgun yaprakta 10 sürgünde sürgünün 1/3 uç kısmından alınan yapraklar dikkate alınarak çiçeklenme öncesi incelenmiştir. 46

56 12. Yaprak sap cebinin şekli (OIV 080, UPOV-42) (Anonymous 1983, Anonymous 1995) 1. U- Şekilli 2. V- Şekilli 3. Birbiri üstüne binmiş Bu özellikte tane tutumundan ben düşmeye kadar ki dönemde 10 sürgünde, sürgünün 1/3 kısmından alınan yapraklarda incelenmiştir. 13. Olgun yaprakta cep genişliği (Galet 1979) 1. Geniş 2. Orta geniş 3. Kapalı Bu özellikte tane tutumundan ben düşmeye kadarki dönemde 10 sürgünde sürgünün 1/3 uç kısmından alınan yapraklarda incelenmiştir. 14. Olgun yaprakta dişlilik durumu (OIV 079, UPOV 40) (Anonymous 1989) 1. Sivri 2. Dış bükey 3. İç bükey 4. Orak şeklinde Bu özellik 10 sürgünde salkımın üzerindeki sürgünün 1/3 uç kısmından alınan yapraklardan incelenmiştir. 47

57 15. Yaprak sapı rengi (Anonymous 1995) 1. Yeşil 2. Kahverengi-Yeşil 3. Kırmızı Bu özellik 10 sürgünde salkımın üzerindeki sürgünün 1/3 uç kısmından alınan yapraklardan incelenmiştir. 16. Yaprak sapı tüylülük durumu (Galet 1979) 1. Tüysüz 2. Tüylü 3. Örümcek ağı gibi tüylü Bu özellik 10 sürgünde salkımın üzerindeki sürgünün 1/3 uç kısmından alınan yapraklardan incelenmiştir. 17. Sürgün (1 yıllık dal) rengi (OIV 103, UPOV-18) (Anonymous 1983) 1. Sarı 2. Sarı-Kahverengi 3. Koyu kahverengi 4. Kırmızımsı kahverengi 5. Mor Bu özellik dinlenme döneminde yapraklar döküldükten sonra ortalama 10 boğum arasında sürgünlerin ortasında gözlem yapılmıştır. 48

58 B. Generatif (Çiçek, Salkım ve Meyve) Özellikler 1. Çiçek tipi (OIV 151, UPOV 56) 1. Hermafrodit 2. Morfolojik erdişi fizyolojik erkek 3. Morfolojik erdişi fizyolojik dişi 4. Erkek 5. Dişi Çiçeklenme döneminde incelenmiştir. 2. Çiçeklenme zamanı (Anonymous 1995) 1. Erkenci 2. Orta erkenci 3. Orta mevsim 4. Orta geç 5. Geççi Çiçeklerin %50 nin açtığı dönem, çiçeklenme dönemi olarak kabul edilmiştir. 3. Sürgün başına düşen salkım sayısı (OIV 201) (Anonymous 1983) Bu özellik meyve olgunlaşma zamanında incelenmiştir. 4. Meyvenin olgunlaşma zamanı (Anonymous 1995). % 18 Kuru maddeye ilk ulaşanlar Erkenci % Kuru madde Orta mevsim % 12 Kuru madde Geçci 49

59 Bu özellik 10 sürgün üzerindeki tüm salkımlarda ortalama her salkımdan 5 tane alınarak refraktometre yardımıyla belirlenmiştir. 5. Salkımdaki tane sayısı (OIV 205) (Anonymous 1983) Bu özellik 10 sürgünde, olgunluk zamanında tüm salkımlarda gözlemlenmiştir. 6. Tane şekli (UPOV 64, OIV 223) (Anonymous 1983) 1. Basık 6. Küt- kalın yumurta 2. Hafif basık 7. Ters yumurta 3. Yuvarlak 8. Silindirik 4. Kısa eliptik 9. Orak şekilli 5. Yumurta şeklinde Bu özellik olgunluk zamanında 10 adet salkımda salkım ortasından alınan 10 tanede gözlemlenmiştir. 7. Tek tane ağırlığı (OIV 503) (Anonymous 1983) Bu özellik 5 salkımdaki tüm tanelerin ortalama ağırlığı şeklinde hesaplanmıştır. 8. Tane etinin yapısı (OIV 234, 235 ve UPOV 72) (Anonymous 1983) 1. Çok yumuşak 2. Yumuşak 3. Orta 4. Sert 5. Çok sert Bu özellik 10 salkımda ve her salkımın orta kısmından alınan 10 tanede incelenmiştir. 50

60 9. Tane kabuğunun yapısı (Anonymous 1995) 1. Yumuşak 2. Yarı yumuşak 3. Gevrek 4. Yarı sert 5. Sert Bu özellik olgun tanelerde 10 adet salkımda ve her salkımın ortasından alınan 10 tanede gözlemlenmiştir. 10. Salkım uzunluğu (OIV 203) (Anonymous 1983). 1. Çok kısa <11.0 cm 2. Kısa cm 3. Orta cm 4. Uzun cm 5. Çok uzun > 30 cm. Bu özellik olgunluk döneminde 10 sürgünde bulunan tüm salkımlarda incelenmiştir. 11. Salkım ağırlığı (g) (Anonymous 1995) 1. Çok küçük <50 g 2. Küçük g 3. Orta küçük g 4. Orta iri g 5. İri g 6. Çok iri >1000 g Bu özellik olgunluk döneminde 10 sürgünde bulunan tüm salkımlarda incelenmiştir. 51

61 12. Salkım sıklığı (OIV 204, UPOV 59) (Anonymous 1983) 1. Çok gevşek 2. Gevşek 3. Orta 4. Sık 5. Çok sık Bu özellik olgunluk döneminde 10 sürgünde bulunan tüm salkımlarda incelenmiştir. 13. Salkım sapı rengi (OIV 207, UPOV 51) (Anonymous 1983). (Salkım sapında kahverengileşme) 1. Zayıf 2. Orta 3. Kuvvetli Bu özellik olgunluk döneminde 10 sürgündeki tüm salkımlarda gözlemlenmiştir. 14. Tane etinin sululuğu (OIV 232, UPOV-73). (Anonymous 1983). 1. Sulu değil 2. Sulu Bu özellik olgunlukta 10 salkımdan alınan 10 adet tanede belirlenmiştir. 52

62 15. Salkım şekli (Galet 1979) 1. Silindirik 2. Silindirik-Kanatlı 3. Konik 4. Konik-kanatlı 5. Kanatlı 6. Omuzlu Bu özellik olgunlukta 10 sürgün üzerindeki tüm salkımlarda gözlemlenmiştir. 16. Tane etinin kabuktan ayrılma durumu (OIV 237) (Anonymous 1983) 1. Ayrılıyor 2. Ayrılmıyor 17. Tanedeki aroma (koku) (OIV 237) (Anonymous 1983) 1. Yok (Nötr) 2. Az 3. Orta 4. Çok Bu özellik olgunlukta 10 salkımın ortasından alınan 10 tanede gözlemlenmiştir. 18.Tane şeklinin bir örnekliği (OIV 222, UPOV 63) (Anonymous 1983) 1. Bir örnek 2. Bir örnek değil Bu özellikte olgunlukta 10 salkımın ortasından alınan 10 tanede incelenmiştir. 53

63 C. HASTALIK VE ZARARLILARA DAYANIM ÖZELLİKLERİ 1. Külleme (Uncinula necator ) ye dayanım (Eibach 1994) 1. Enfeksiyon yok 3. Küçük noktalar şeklinde nekrozlar; hastalıklı alanlar sınırlı 5. Nekrozların çapı 2-5 cm e ulaşmış, hastalıklı alanlar tamamen sınırlı 7. Geniş ve yoğun şekildeki hastalıklı alanlar;bu alanların bir kısmının sınırları halen belirli 9. Sınırsız ve çok yoğun hastalıklı alanlar; yaprağın tamamı hastalıklı Bu özellik 20 yapraktan elde edilen değerlerin ortalaması şeklinde belirlenmiştir. 2. Kurşuni küf (Botrytis cinerea Pers.) e dayanım (Anonymous 1995). 1. Salkımda %10 zararlanmış taneler -dayanıklı 2. Salkımda %11-20 zararlanmış taneler -kısmen dayanıklı 3. Salkımda %21-30 zararlanmış taneler -kısmen duyarlı 4. Salkımda %31-40 zararlanmış taneler -duyarlı 5. Salkımda >%40 zararlanmış taneler -çok duyarlı Bu özellik hasat döneminde tüm salkımlarda gözlemlenmiştir. 54

64 3. Mildiyö ye (Plasmopara viticola) dayanım (OIV 452) (Anonymous 1983) 1. Çok düşük - Belirti yok yada çok küçük nokta şeklinde nekrotik lekeler 2. Düşük - 1 cm den küçük çaplı lekeler 3. Orta cm çaplı küçük lekeler, etmenin sporları ve düzensiz misel oluşumu 4. Yüksek - Geniş lekeler ve yoğun bir spor oluşumu ve misel oluşumunun gözlemlenmesi, yaprak dökümü 5. Çok yüksek - Çok geniş lekelerin oluşumu, tüm yaprak alanının etmenle kaplanmış olması, yoğun bir spor oluşumu ve misel gelişimi, çok erken yaprak dökümü. Bu özellik 20 yapraktan elde edilen değerlerin ortalaması şeklinde belirlenmiştir Yöntem Araştırmada Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü nde 1986 yılından itibaren yürütülen Melezleme Yoluyla Külleme ve Mildiyö ye Dayanıklı ve Standart Özelliklere Sahip Yeni Üzüm Çeşitlerinin Elde Edilmesi konulu uygulama projesi kapsamında yılında Italia x Mercan üzüm çeşitlerinin melezlenmesinden elde edilen F 1 populasyonu kullanılmıştır. Italia x Mercan kombinasyonundan elde edilen ve 1997 yılından itibaren her türlü kalitatif ve kantitatif özellikler yönünden değerlendirilebilecek düzeyde olan toplam 331 adet F 1 bitkisinin oluşturduğu populasyondan vegetatif, generatif ve hastalıklara dayanım yönünden yapılan gözlem ve analizler sonucunda bu projede incelenmesi öngörülen özelliklere göre açılım gösteren 60 adet F 1 ile ana ve baba ebeveynler asmanın genom haritasının çıkarılması için kullanılmıştır. 55

65 Asmanın yukarıda açıklanan kalitatif ve kantitatif özelliklerini içeren genom haritasının çıkarılmasında yararlanılabilecek RAPD markörlerin eldesi amacıyla kullanılan DNA ekstraksiyon yöntemi, PCR uygulamaları, agaroz jel elekroforezi tekniği, moleküler bağlantı analizi ile kantitatif karakter lokusu analizi ile ilgili yöntemler aşağıda verilmiştir DNA ekstraksiyonu DNA ekstraksiyonu için Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü ndeki denemeye alınan 2 ebeveyn ve 60 adet F 1 e ait omcalardan alınan çelikler, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü serasında toprak:perlit:turba (1:1:1) karışımı içerisinde yetiştirilmiş ve süren sürgün ucundaki yarı açılmış genç yapraklar kullanılarak Lodhi et al. (1994) nin geliştirdiği yönteme göre DNA ekstraksiyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Bu yönteme göre; 0.5 g genç yaprak alınarak havan içerisine konulup üzerine sıvı azot ilavesinden sonra havan eli ile ezilir, 6 ml ekstraksiyon tampon çözeltisi ilave edilir, Homojen hale getirilen çözeltiye 50 mg PVPP (Polyvinylpyroprrolidone) (Sigma P6755) ilave edilir, Çözelti 15 ml lik konik tüpe aktarılır, Tüpler 60 0 C deki su banyosunda 25 dakika bekletilir ve daha sonra su banyosundan çıkarılarak oda sıcaklığına kadar soğuması sağlanır, 6 ml kloroform: oktanol (24:1) çözeltisi ilave edilerek hafifçe defa sallanır, 6000 rpm de 15 dakika oda sıcaklığında santrifüj edilir, Üstteki sıvı kısım yeni bir 15 ml lik tüpe alındıktan sonra, üzerine hacminin yarısı kadar 5 M NaCl çözeltisi eklenerek iyice çalkalanır, Toplam hacmin 2 katı kadar %95 lik soğuk etanol (-20 0 C) ilave edilir ve tüpler buz dolabına yerleştirilerek dakika bekletilir, 56

66 DNA sarmalları görüldüğünde, steril bir plastik çubuk (lup) yardımı ile alınarak, içinde %76 lık soğuk etanol bulunan 1.5 ml lik eppendorf tüplere aktarılır, DNA nın çöktürülmesi amacıyla sırası ile 3000 ve 5000 rpm de 3 dakika santrifüj yapılır, Tüpler ters çevrilerek dakika tüplerin ağzı açık bırakılarak kurutulur ve etanolün tamamen DNA dan uzaklaşması sağlanır, DNA, µl TE tampon çözeltisi içerisinde çözülür, Her 100 μl için 1 μl RNAase-A ilave edildikten sonra 37 0 C de 15 dakika süreyle etüvde bekletilir ve RNA uzaklaştırılır. Çözeltiler: Ekstraksiyon çözeltisi: 20 mm sodyum EDTA (Etilen Diamine Tetra Asetik Asit) ve 100 mm Tris-HCl (ph 8.0), 1.4 M NaCl ve %2 lik (ağırlık/hacim) CTAB (Hekzadesil Trimetil-Amonyum Bromür) şeklinde hazırlanan çözeltiye %0.2 β-mercaptoethanol kullanım öncesi ilave edilir. Kloroform: Oktanol: 24:1 (hacim:hacim) NaCl: 5 M TE çözeltisi : 10 mm Tris-HCl ve 1 mm EDTA karışımı (ph 8.0) RNase A (Sigma R6513): 10 mg/ml PCR uygulaması Yukarıda açıklanan protokole göre izole edilen DNA ya uygun çoğaltma ve PCR döngü koşullarını belirlemek için ön denemeler yapılmıştır. Bu amaçla; Ye et al. (1995), This et al. (1997) ve Ergül vd. (2002) e ait çoğaltma ve döngü koşulları denenmiştir. Çizelge 3.1 de denenen çoğaltma ve döngü koşulları verilmiştir. Bütün denemelerde toplam hacim 25 μl olarak belirlenmiştir. 57

67 Çizelge 3.1. Ön deneme çalışmalarında kullanılan çoğaltma ve döngü koşulları Çoğaltma Öğeleri PCR Döngü Koşulları DNA (ng) Primer dntp (toplam) MgCl 2 Enzim Ön denatürasyon Denatürasyon Primer bağlanma Yeni iplikçik yazılımı ,4 μm 480 μm 2 mm 0,5-1,0-1,5 ünite - 94ºC -30 sn 35ºC-1 dk 72ºC 1 dk 45 sn ng 800 μm 1,5 mm 0,4 ünite 94ºC -4 dk 94ºC -1 dk 38ºC-1 dk 72ºC 1 dk ng 2.5 mm 2,5-3,5 mm 0,5-1, ºC -30 sn 35ºC-1 dk 72ºC 200 1,5 ünite 1 dk 45 sn Son Toplam yazılım döngü sayısı 72ºC-8 dk 35 72ºC-6 dk 36 72ºC-8 dk 35 Referans Ye et al. (1995) This et al. (1997) Ergül vd. (2002). 58

68 Yapılan ön denemeler sonucunda en iyi sonucu, yapılan modifikasyonlarla Ergül vd. (2002) nin çoğaltma ve PCR döngü protokolü vermiştir. Buna göre; RAPD uygulamaları 25μl lik miktarda ve her bir reaksiyon karışımında 200 ng genomik DNA, 2.5 μl 10x reaksiyon tampon çözeltisi, 3.5 μl 25 mm MgCl 2, 2 μl 2.5 mm dntp (Promega, Wis., ABD), 200 ng primer ve 1.5 ünite Taq-Polimeraz (Promega, Wis., ABD) bulunacak şekilde yapılmıştır. Ayrıca her örneğe 1 damla mineral yağ (Amresco J217, Ohio, ABD) damlatılmıştır. DNA çoğaltımı için örnekler 35 er devir olacak şekilde 30 sn 94ºC de, 1 dakika 35ºC de ve 1 dk 45 sn 72ºC de ve bunu takiben 8 dakika 72ºC de tutulmuştur. DNA çoğaltımı PTC-100 MJ Research Type Thermocycler da gerçekleştirilmiştir. RAPD Markörlerinin Geliştirilmesinde Kullanılan Primerler Primerlerin seçiminde asmada değişik araştırıcılar tarafından denenmiş olanlar ve tamamen tesadüfi olarak belirlenenler kullanılmıştır. Araştırmada kullanılan 300 primer OPERON (Alameda, CA, ABD), Research Genetics (Huntsville, AL, ABD) ve IDT (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, ABD) firmalarından temin edilmiştir (EK 1) Agaroz jel elektroforezi RAPD-PCR tekniği ile elde edilen çoğaltma ürünleri % 2 lik agaroz jelde (%1 agaroz + %1 Nusieve GTG agarose FMC) elektroforezinde 1x TBE (Tris, Borik asit, EDTA) (Sambrook et al. 1989) tampon çözeltisi içerisinde 100V da yaklaşık 4 saat koşturulduktan sonra, etidium bromid (0.01 mg/ml) ile boyanarak ve UV altında (λ=302 nm) Polaroid 65 tip negatifli film kullanılarak fotoğrafları çekilmiş ve 62 adet bireyde, 300 adet primerin kullanılmasıyla elde edilen çoğaltma ürünleri (bantlar) genom haritasının çıkarılması amacıyla negatif film üzerinde görsel olarak polimorfizm 59

69 var (1), ya da yok (0) şeklinde değerlendirilmiş ve veriler Microsoft Excel Programına girilmiştir Moleküler bağlantı analizi ve kantitatif karakter lokus (QTL) haritalama Microsoft Excel Programın girilen veriler, bağlantı analizlerinin yapılması amacıyla MAPMAKER/EXP 3.0 (Lander et al. 1987) paket programında kullanılmıştır. Bağlantı gruplarının ve markörler arası uzaklıkların belirlenmesinde LOD 2, 3, 4 ve 5 değerleri ile 25 cm maksimum uzaklık değerleri kullanılmıştır. Genetik bağlantı analizi ile bağlantı çıkarıldıktan sonra bu harita üzerindeki markörlerle kantitatif karakterler arasındaki ilişkileri belirlemek amacı ile QTL haritalama çalışmaları yapılmıştır Kantitatif karakter analizi Bağlantı analizi sonucunda ana ve baba ebeveynde bağlantı gruplarına yerleşen markör lokusları üzerinde regresyon ve tek yönlü Anova istatistiki analizleri yapılarak markör karakter bağlantısı ortaya çıkarılmıştır. 60

70 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1. Fenotipik Analiz Italia x Mercan melezlemesi ile oluşturulan F 1 populasyonunda Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü tarafından yapılan morfolojik analizlerin sonuçları EK 2 de verilmiştir. Elde edilen veriler daha sonra QTL analizinin yapılmasında kullanılmıştır. Morfolojik analizlerin sonucuna göre; populasyonun dinlenme halindeki kışlık gözlerin soğuğa dayanımı (A2), genç yaprak üst yüzey tüylülüğü (A5), genç yaprak alt yüzey rengi (A6), yaprak üst yüzey tüylülüğü (A7), yaprak üst yüzey görünümü (A8), yaprak üst yüzey yapısı (A11), yaprak sapı cebinin şekli (A12), olgun yaprakta dişlilik durumu (A14), çiçek tipi (B1), salkım sapı rengi (B13) ve tane etinin kabuktan ayrılma durumu (B16) özellikleri açısından açılım göstermediği anlaşılmaktadır. Sürgün başına düşen salkım sayısı (B3) ve salkımdaki tane sayısı (B5) hakkında bilgi alınamamıştır. Gözlerin patladığı dönem (A3) karakteri, tarih olması nedeniyle değerlendirmeye alınmamıştır. Geri kalan 24 morfolojik ve hastalığa dayanım karakterlerinde açılım gösteren populasyon üzerinde QTL analizi yapılmıştır. Populasyonda incelenen 24 adet morfolojik ve hastalıklara dayanım özelliklerine yönelik istatistiksel değerlendirmeler Çizelge 4.1 de verilmiştir. Bu değerlendirme, populasyonun incelenen karakterler açısından nasıl davrandığını görmek açısından önemlidir. Çizelgeden izlenebileceği gibi generatif özelliklere ait değerler, populasyonun ancak üçte birlik bir kısmından temin edilmiştir. Bu genişlikteki veri kaybı, markör-karakter bağlantısının kurulmasında büyük engel teşkil etmektedir. 61

71 Çizelge 4.1. Italia x Mercan populasyonunda incelenen fenotipik özelliklere ait istatistiksel değerlendirmeler Kodu Karakter Gözlem sayısı Ort.± S.S. Minimum Değer Maksimum Değer A1 Sürgün ucunda ± antosiyanin yoğunluğu A4 Genç yaprak üst yüzey ± rengi A9 Yaprak formu ± A10 Yaprak şekli ± A13 Olgun yaprakta cep ± genişliği A15 Yaprak sapı rengi ± A16 Yaprak sapı tüylülük ± durumu A17 1 yıllık dal rengi ± B2 Çiçeklenme zamanı ± B4 Meyvenin olgunlaşma ± zamanı B6 Tane şekli ± B7 Tek tane ağırlığı ± B8 Tane etinin yapısı ± B9 Tane kabuğunun yapısı ± B10 Salkım uzunluğu ± B11 Salkım ağırlığı ± B12 Salkım sıklığı ± B14 Tane etinin sululuğu ± B15 Salkım şekli ± B17 Tanede aroma ± B18 Tane şeklinin ± birörnekliği C1 Küllemeye dayanım ± C2 Kurşuni küfe dayanım ± C3 Mildiyöye dayanım ± İncelen karakterlerde değerlendirme skalalarına bakıldığında populasyonun genellikle dar sınırlar içerisinde dağılım gösterdiği görülmektedir. Örneğin sürgün ucunda antosiyanin yoğunluğu, yaprak şekli, sürgün rengi, tane şekli gibi karakterler oldukça dar alanlarda farklılık göstermektedir. 62

72 Kantitatif karakterlerin tipik bir özelliği karakterlere ait değerlerin normal bir dağılım göstermesi beklenir. Populasyonda incelenen 24 karakterin normal dağılıma uygunlukları ise Kolmogorov-Smirnov testi (Minitab 13.1, p 0.05) ile analiz edilmiştir (EK 3). Buna göre sadece hastalıklara dayanım karakterleri normal dağılıma uygunluk göstermiştir Moleküler Analiz DNA izolasyonu Lodhi et al. (1994) te belirtilen yönteme göre elde edilen Italia, Mercan ve Italia x Mercan F 1 lerine ait DNA ların saflık ve miktar değerleri NanoDrop ND1000 ile belirlenmiştir (EK 4). Moleküler düzeyde yapılan çalışmalarda DNA nın saflığının arasında olması istenen bir durumdur. EK 4 ten de anlaşılacağı üzere elde edilen DNA ların saflıkları arasında değişmiştir. Ekstrakte edilmiş olan DNA ların ayrıca görsel olarak da agaroz jel (%1.5) üzerinde görüntüleri saptanmıştır (Şekil 4.1). Şekil 4.1. Italia x Mercan populasyonunda elde edilen DNA ların agaroz jel (%1.5) üzerindeki görüntüleri 63

73 PCR Uygulamaları Araştırmada kullanılan toplam 300 adet RAPD primerinden sadece 113 adedi polimorfizm göstermiştir. Test edilen primerlerden bazılarına ait DNA bant desenleri EK 5 te verilmiştir. Polimorfik olduğu tespit edilen primerlerden elde edilen bantlardan ise toplam 219 adedinin populasyonda polimorfizm gösterdiği belirlenmiştir. Bu lokusların polimorfik primer başına oranı 1.94 seviyesinde kalmıştır. Lokusların her bir bireyde var (1), yok (0) ya da çoğaltımın bireyde olmaması nedeniyle tespit edilemediği (-) şeklinde değerlendirmesi yapılarak sonuçlar Microsoft Excel çalışma sayfasına girilmiştir. Lokusların varlığı/yokluğu durumlarının Mendel dağılımlarına uyumlarını test etmek amacıyla χ 2 testi (p 0.05) yapılarak elde edilen lokuslardaki 1 ve 0 sayılarının 1:1 veya 3:1 dağılımlarına uygunluğu belirlenmiştir. Buna göre; 219 adet lokustan 59 adedi ana ebeveynde (Italia) 1:1 açılım gösterirken baba ebeveynde (Mercan) bu sayı 55 olmuştur. 3:1 dağılım gösteren heterozigotik lokus sayısı ise 16 adet olarak tespit edilmiştir. 89 adet lokus ise Mendel dağılımına uygun açılım göstermemiş ve bu nedenle bağlantı analizi dışında tutulmuştur. Analiz sonucunda elde edilen bilgilerin toplu sunumu Çizelge 4.2 te verilmiştir. Çizelge 4.2. Açılım gösteren RAPD lokusları hakkında bilgi 62 Bireyde Test Edilen Toplam Primer Sayısı 300 En Az Bir Potansiyel Polimorfik Lokus Gösteren Primer Sayısı 113 Polimorfik Primerlerin Test Edilen Toplam Primerlere Oranı 37.7 (%) Toplam Polimorfik Lokus Sayısı 219 Polimorfik Primer Başına Düşen Polimorfik Lokus Sayısı :1 Açılım Gösteren Lokus Sayısı 114 1:1 Açılım Gösteren Lokusların Polimorfik Primer Başına 1.03 Oranı Açılım Gösteren Lokusların Toplam Primer Başına Oranı

74 4.3. Genetik Bağlantı Analizi RAPD analizi sonucunda elde edilen veriler 3 ebeveynsel veri dosyası haline çevrilmiştir: 1) 1:1 açılan bantlar, Italia da var Mercan da yok, 2) 1:1 açılan bantlar, Mercan da var Italia da yok, ve 3) her iki ebeveynde olan bantlar (dölde 3:1 açılım gösteren bantlar). Bir bantın çoğaltımı o lokusun bir bireyde heterozigot diğerinde homozigot resesif olduğu anlamına gelmektedir. Bantın her iki ebeveynde olması ve dölde açılım göstermesi ise ebeveynlerde heterozigotluğu göstermektedir. Her iki ebeveynde heterozigot olan bantlar ilk bağlantı analizinde kullanılmamıştır. Markörlerin isimlendirilmesinde primer ismi ve bunu izleyen harf sistemi kullanılmıştır. Harfler alfabetik sıraya göre ve en büyük bant büyüklüğünden en küçük bant büyüklüğüne doğru isimlendirilmiştir. Bağlantı gruplarının tespiti ve markörlerin yerlerinin belirlenmesi amacıyla MAPMAKER/EXP 3.0 (Lander et al. 1987) paket programında markörler arası maksimum uzaklık 25 cm ve LOD 2.0, 3.0, 4.0 ve 5.0 ve Haldane (1919) haritalama fonksiyonu kullanılarak yapılmıştır. Kosambi (1944) haritalama fonksiyonu kullanılarak yapılan haritalama sonuçları parantez içerisinde verilmiştir. LOD 3.0 değerine göre elde edilen harita temel harita olarak kabul edilmiş ve takip eden QTL analizi bu harita üzerinde yapılmıştır. LOD 2.0, 4.0 ve 5.0 değerleri ile elde edilen harita ve QTL analiz sonuçları EK 6-10 da bilgi için ayrıca verilmiştir. Yalancı melezleme (pseudotestcross) populasyonlarında bağlantı fazı (coupling veya repulsion) bilinmediğinden her bir açılım gösteren lokus bir sessiz lokus (dummy locus) ile eşleştirilmiştir. Örneğin Lokus 1 AAHAAAHHHHAHHAAAHH Lokus 1d HHAHHHAAAAHAAHHHAA 65

75 A homozigot resesif (- / -) ve H heterozigot (+ / -) genotipleri göstermektedir. Her harf her bir F 1 in genotipini temsil etmektedir. Lokus 1d lokus 1 in tam zıttıdır. Bu düzenleme her bir ebeveyne ait coupling ve repulsion fazı ile karışık halde 2 bağlantı haritası vermiştir. Sadece bir tanesi daha ileri analizler için rastgele seçilmiştir. Bağlantı gruplarının tespitine yönelik analiz sonucunda Italia çeşidi 8 (maternal harita) ve Mercan çeşidi (paternal harita) ise 6 bağlantı grubu vermiştir. Italia da açılım gösteren 59 adet lokustan sadece 19 tanesi bağlantı grupları üzerine yerleşmiştir (Şekil 4.2). Mercan çeşidinde ise 1:1 açılım gösteren 55 adet lokustan 13 adedi 6 bağlantı grubuna yerleşmiştir (Şekil 4.3). 66

76 B389c 17.3 OPO12c 25.5 P166d 26.8 OPI4c 5.0 OPI4d OPA11b OPF1b Bağlantı grubu 1 Bağlantı grubu 2 Bağlantı grubu 3 OPC20 OPB12a OPI15d OPC13c OPM10d OPC16a B391b OPM9 Bağlantı grubu 4 Bağlantı grubu 5 Bağlantı grubu OPI15e 9.2 OPD3a OPD4a OPN13a Bağlantı grubu 7 Bağlantı grubu 8 Şekil 4.2. Italia üzüm çeşidine (ana ebeveyn) ait bağlantı grupları 67

77 OPB7c OPI15a gt04a OPU16a OPN15 OPK19c Bağlantı grubu 1 Bağlantı grubu 2 Bağlantı grubu 3 Sc1082b OPK10c OPN OPM2a 25.3 OPK10a 21.3 OPN12 OPI9a Bağlantı grubu 4 Bağlantı grubu 5 Bağlantı grubu 6 Şekil 4.3. Mercan üzüm çeşidine (baba ebeveyn) ait bağlantı grupları Bağlantı gruplarının incelenmesi sonucunda Italia da elde edilen 8 bağlantı grubu üzerinde 19 adet markör lokusu yerleşirken, 6 bağlantı grubundan oluşan Mercan bağlantı haritası ise sadece 13 adet markör lokusu içermiştir. Analiz sonucunda Italia x Mercan populasyonunda elde edilen genetik haritaların bir karşılaştırması Çizelge 4.3 te verilmiştir. 68

78 Çizelge 4.3. Italia x Mercan a ait genetik haritaların karşılaştırılması Toplam Italia (ana) Mercan (baba) Kapsanan toplam uzaklık (cm) Haritalanan markör sayısı Markörler arası ortalama uzaklık (cm) Bağlantı grubu sayısı En geniş bağlantı grubu (cm) En geniş bağlantı grubundaki markör sayısı 3 3 Ana ebeveyne ait genetik haritada bulunan 19 lokus arasında ortalama 11.5 cm lık bir uzaklık bulunmuştur. Bu değer Mercan genetik haritası için 11.1 cm olarak saptanmıştır. En geniş bağlantı grubu Italia da üzerine 3 lokusun yerleştiği 39.6 cm lık 5. grup olurken Mercan da ise 28 cm lık en geniş bağlantı grubu olan 4. grupta 3 markör lokusu yerleşmiştir. Ebeveyn olarak kullanılan Italia ve Mercan çeşitlerinde bireysel bağlantı gruplarının analiz sonuçları Çizelge 4.4 ve 4.5 te verilmiştir. 69

79 Çizelge 4.4. Italia çeşidinde bağlantı gruplarına yerleşen markörler ve uzaklıkları Markör Uzaklık cm Bağlantı Grubu No OPF1b B389c OPO12c OPI4c OPI4d P166d OPA11b OPC20 OPC13c B391b OPB12a OPM10d OPM9 OPI15d OPC16a OPI15e OPN13a OPD3a OPD4a 70

80 Çizelge 4.5. Mercan çeşidinde bağlantı gruplarına yerleşen markörler Markör Uzaklık cm Bağlantı Grubu No OPB7c OPU16a OPI15a OPN15 gt04a OPK19c sc1082b OPM2a OPI9a OPK10c OPM10a OPN12d OPN Italia bağlantı haritasında en geniş aralık OPI-15e ile OPN-13a arasında (28 cm), en dar aralık ise OPI-4c ile OPI-4d arasında (5.0 cm) olarak belirlenmiştir. Mercan da ise bu değerler, sırasıyla, 26.3 cm (gt04a OPK19c arasında) ve 13.3 cm (sc1082b ve OPM2a arasında) şeklinde olmuştur. 71

81 Italia ve Mercan çeşitlerinde bağlantı analizi sonuçların toplu gösterimi ise Çizelge 4.6 da verilmiştir. Çizelge 4.6. Italia ve Mercan çeşitlerinde bağlantı analizi sonuçları Italia Mercan Bağlantı grubu Toplam uzaklık Markör sayısı Toplam uzaklık Markör sayısı (cm) (cm) I II III IV V VI VII VIII TOPLAM Çizelge 4.6 incelendiğinde, ana ebeveyne (Italia) ait genetik haritanın baba ebeveyne (Mercan) göre daha büyük olduğu görülmektedir Kantitatif Karakter Analizi Açılım gösteren 24 adet morfolojik ve hastalığa dayanım karakterine ait veriler kantitatif karakter lokusu (QTL) analizi için kullanılmıştır. Bağlantı gruplarına yerleşen markörlerin karakterlere olan bağlılık durumlarını tespit etmek amacıyla istatistiki analizler gerçekleştirilmiştir. Tek nokta analizi, normal dağılım göstermeyen karakterlerde Binary Lojistik Regresyon (p 0.05) ve normal dağılıma uygun olan karakterlerde ise ANOVA testi (p 0.05) yöntemlerinin kullanılması ile uygulanmıştır. Her iki analiz Minitab 13.1 paket programında gerçekleştirilmiştir. Bu analiz yöntemlerinin seçilme nedeni, çalışma sonucunda yeteri kadar doygun bir moleküler 72

82 genetik haritanın henüz elde edilememiş olması ve dolayısıyla buna bağlı olarak QTL haritalama çalışmalarında bilim adamlarının hizmetine sunulmuş olan paket programlarından yararlanılamamasıdır. Binary lojistik regresyon yöntemine göre 9 adet markör lokusu 6 adet morfolojik karakter ile bağlantılı bulunmuştur (Çizelge 4.7). Çizelge 4.7. Binary lojistik regresyon analizi sonuçları Markör Karakter P ( 0.05) Grup Ort ± S.S. 1 Bağlantı Grubu *IOPA11b Yaprak sapı ± rengi ±0.507 IOPC13c Çiçeklenme zamanı ± ± IOPM10d Sürgün ucunda ± antosiyanin yoğunluğu ±1.128 IOPB12a Yaprak formu ± ±0.776 IOPB12a Tanede aroma ± ±0.378 IOPI15e Çiçeklenme ± zamanı ±0.869 IOPD3a Yaprak formu ± ± **MOPK19c Tane şekli birörnekliği ± ± MOPN6 Çiçeklenme ± zamanı 0 MOPN12 Çiçeklenme zamanı 0 *Italia moleküler bağlantı haritasında yer almaktadır. ** Mercan moleküler bağlantı haritasında yer almaktadır 1 Ortalama ± Standart Sapma 2.050± ± ±0.873 Çizelge 4.7 den anlaşıldığı üzere sürgün ucunda antosiyanin yoğunluğu (A1) 1 lokus, yaprak formu (A9) 2 lokus, yaprak sapı rengi (A15) 1 lokus, çiçeklenme zamanı (B2) 4 lokus, tanede aroma (B17) 1 lokus ve tane şeklinin birörnekliği (B18) ise 1 lokus tarafından kontrol edildiği ortaya çıkmaktadır. Yaprak formunu kontrol eden OPB12a 73

83 lokusunun aynı zamanda tanede aroma karakterini kontrol ettiği de tespit edilmiştir. OPN12 markörü çiçeklenme zamanı ile yakından ilişkili bulunmuştur (p=0.009). bulunan bu ilişkilerin istatistik önem dereceleri çok yüksek olmamıştır. ANOVA testinin yapıldığı hastalığa dayanım karakterlerinin analiz sonuçları Çizelge 4.8 de verilmiştir. Çizelge 4.8. Hastalığa dayanım karakterleri üzerinde ANOVA testi sonuçları Markör IOPI4c IOPI4d Karakter Küllemeye dayanım Küllemeye dayanım P ( 0.05) Grup Ort ± S.S ± ± ± ±2.854 %Açıkladığı fenotipik varyans Bağlantı grubu ve uzeklık cm 2 5 cm Üzerinde tek yönlü ANOVA testinin yapıldığı hastalığa dayanım karakterleri (küllemeye dayanım (C1), kurşuni küfe dayanım (C2) ve mildiyöye dayanım (C3)) incelendiğinde kurşuni küf ve mildiyöye dayanıma bağlı hiçbir markör tespit edilememiştir. Buna karşılık küllemeye dayanımın kontrolü ile ilgili markörlerin Italia çeşidinde 2 nolu bağlantı grubunda bulunan 2 lokus olduğu tespit edilmiştir. Lokuslar fenotipik varyansın %66 sını açıklamaktadır. 74

84 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Moleküler markörler genetik ve bitki islahında yepyeni bir çığır açmıştır. Bu markörler doygun moleküler genetik haritaların geliştirilmesi, bitki genomlarının genetik yapısının araştırılması, kantitatif karakter lokuslarını (QTL) da kapsayan tarımsal açıdan önemli genlerin haritalanması, bitki gen havuzunda ve patojen populasyonunda genetik çeşitliliğin saptanması, yabancı genlerin en doğru şekilde takibi ve evrimsel ilişkilerin analizinde önemli ve güçlü araçlar olmaktadır. Denenen farklı DNA izolasyon yöntemlerinde en başarılı sonucun elde edildiği Ergül vd. (2002) e ait modifiye edilmiş protokol, hem uygulama kolaylığı hem DNA saflığının istenilen sınırlar içerisinde olması ve hem de DNA nın uzun süre bozulmadan saklanabilmesi nedeniyle oldukça kullanışlı olmuştur. RAPD primerlerinin populasyonda yer alan genotiplerin üzerinde test edilmesi sonucunda Mendel dağılımına (1:1 ve 3:1) uygun olan markörler Mapmaker/Exp 3.0 (Lander et al. 1987) paket programı kullanılarak değişik LOD (2.0, 3.0, 4.0 ve 5.0) değerlerinde bağlantı gruplarının oluşturulması gerçekleştirilmiştir. Italia ve Mercan çeşidine ait elde edilen haritalarda (LOD 3.0) sırasıyla 8 ve 6 adet bağlantı grubu üzerinde sayıları 2-3 arasında değişen markör bulunmuştur. Uygun istatistik programlarının kullanılması suretiyle bu markörlerin incelenen morfolojik ve hastalığa dayanım karakterleri ile olan muhtemel bağlantıları ortaya çıkarılmıştır. Italia x Mercan populasyonunda incelenen toplam 38 adet karakterin polimorfizm durumlarına bakıldığında; ana ve baba bireyin 11 adet karakter açısından aynı oldukları ve döl populasyonunun da 11 karakter bakımından açılım göstermediği anlaşılmaktadır. Genel bir genetik haritalama çıkarılması amaçlandığında haritalama populasyonunu oluşturacak ana ve baba bireyin mümkün olduğunca çok sayıda morfolojik karakterler açısından farklılık göstermesi istenmektedir. Bu şekilde, döl populasyonlarında yüksek düzeyde açılım gözlemek mümkün olmaktadır. İncelenen karakterlerle ilgili lokusları 75

85 dar kromozomal bölgelere yerleştirmek analizin güvenilirliğini ve doğruluğunu arttıracaktır. Bu nedenle deneme şekli, açılım populasyonunun tipi, büyüklüğü, birey sayısı ve DNA markörü tipi çok önemli olmaktadır. Asmada kendileme depresyonu ve uzun generasyon süresi vb. nedenlerle F 2 ve ileri populasyonların eldesi çok zor olmaktadır. Ayrıca asmanın süregelen klonal veya vegetatif olarak çoğaltımı da genetik yapısında bir durağanlığa neden olmaktadır. Ancak bir avantaj olarak, her bir asma bitkisinin/çeşidinin yüksek düzeyde heterozigot olması tek bir melezleme yapılmasını yeterli kılmaktadır. Açılım oranının en yüksek düzeyde gerçekleşebilmesi için ana ve baba bireylerin incelenen karakter/karakterler açısından birbirinden farklı olması yani polimorfizm göstermesi önem arzetmektedir. Araştırmada Italia x Mercan F 1 populasyonunda incelenen karakterlerin 1/3 lük kısmında polimorfizm göstermemesi yukarıda sıralanan olumsuzlukların bir göstergesidir. Bu dezavantajın ortadan kaldırılmabilmesi için ana ve baba bireyin seçiminde daha fazla özen gösterilmesi gerekir. Kompleks genetik yapıya sahip bireylerle veya arasında yapılabilecek melezlemeler sonucunda daha fazla polimorfizm elde edileceği açıktır. İlk haritalama çalışmaları bireylik populasyonlarda (Lodhi et al. 1995, Dalbó et al. 2000, Grando et al. 2000) Cayuga White ve Aurore gibi Amerikan genotiplerle, Çin in yabani türleri (Luo et al. 2001) veya çekirdeksizlik üzerine yoğunlaşan çeşitler ile (Doligez et al. 2002) başlamıştır. Bazı araştırmalar Vitis türlerinde dayanımla ilişkili faktörler yönelik olmuştur (Luo et al. 2001, Di Gaspero and Cipriani 2002, Marino et al. 2000). Bu araştırmalarda kullanılan bireylerin genetik yapısındaki komplekslik veya incelenen karakter açısından iki zıt uçta yer almaları (dayanıklı x duyarlı, çekirdekli x çekirdeksiz vb.) polimorfizmi arttırmıştır. Sonuçlar incelendiğinde; kullanılan populasyonun ve polimorfik markör sayısı ile markörlerin polimorfikliğinin düşük olması elde edilen haritanın doygunluğunun düşük olmasına neden olmuştur. Hem ana hem de baba ebeveynde arzu edilen haploid kromozom sayısı (n=19) kadar bağlantı grubu yerine sadece sırasıyla 8 ve 6 bağlantı grubunun elde edilmesi ve bu bağlantı grupları üzerine yerleşen yalnızca 2-3 markörün bulunması çalışmanın amacı kısmında belirtilen hedeflere ulaşılmasını bu aşamada güçleştirmiştir. Bunda incelenen populasyonda incelenen birey sayısının çok düşük 76

86 olmasının da payı vardır. Bu dezavantaj yüksek sayıda RAPD primeri kullanılarak giderilmeye çalışıldıysa da düşük markör polimorfizmi bu amaca ulaşmayı engellemiştir. Bununla beraber eldeki haritanın doygunluğu ve QTL lerin haritalanması yönünde bu materyalle veya yeni oluşturulacak populasyonlarla ileride yapılacak çalışmalara ışık tutacak çok önemli sonuçlar elde edilmiştir. Örneğin, moleküler markörün (RAPD) polimorfizmindeki düşüklük ve fenotipik karakterlerin sayısının fazlalığı ve polimorfikliğinin durumları, bunların kalıtımı ve haritadaki konumları üzerine önemli bilgiler sağlanmıştır. Italia x Mercan populasyonunda test edilen RAPD primerleri çok düşük oranda polimorfiklik (%37) göstermiştir. χ 2 testi (p 0.05) sonucunda 1:1 ve 3:1 dağılım gösteren markör sayısı sırasıyla 114 ve 16 olmuştur. Düşük açılım oranı bağlantı gruplarının ve bu bağlantı gruplarına yerleşen markör sayısının arzu edilenden düşük olmasına neden olmuştur. Literatürde genel olarak kabul edilen prensibe göre; aralarında 10 cm dan fazla bir mesafenin bulunduğu iki markörün birbirleriyle bağlantılı olmadıkları düşünülmektedir. Bu prensipten hareketle Italia ve Mercan da elde edilen bağlantı grupları incelendiğinde; Italia çeşidinde sadece OPI4c ve OPI4d arasında (5.0 cm) ve OPD3a ve OPD4a arasında (9.2 cm) gerçek bir bağlantı olduğundan söz edilebilir. Mercan çeşidinde ise sc1082b ile OPM2a arasında (6.8) arasında bir bağlantı söz konusudur. Daha fazla sayıda ve daha fazla bilgi verici primerlerle yapılacak ileri analizlerle diğer bağlantı gruplarının daha detaylı tespit edilmesi gerekmektedir. Aynı çerçevede, QTL analizlerinde elde edilen QTL-markör ilişkilerinin gerçek oldukları tartışılabilir. Gerek regresyon ve gerekse anova testlerinde önem eşik değerinin (p) 0.05 olarak ele alınmasıyla daha fazla sayıda markör-qtl bağlantısının araştırılması amaçlanmıştır. Ancak bu eşik değerinin gerçek ve güvenilir anlamda ve her zaman markör-qtl bağlantısını ortaya çıkaramayacağı da bilinmelidir. Özellikle, hastalığa dayanımla ilgili lokusların açıkladığı fenotipik varyans yüzdelerinin çok 77

87 yüksek olması bu kuşkuyu güçlendirmektedir. Fischer et al. (2004) 3-4 yıllık gözlem sonucunda külleme ve mildiyö hastalıklarına dayanım açısından bitkilerin yaprak ve salkım/tane dayanım durumları konusunda yıllar arası korelasyonu hesapladıklarında bu değerlerin mildiyöde yaprak ve salkım/tanede sırasıyla 0.52 ve 0.37 olduğunu belirtirken külleme için hem yaprak hem de salkım/tane dayanımı için 0.49 olduğunu rapor etmiştir. Aynı araştırıcılar Regent x Lemberger populasyonunda yaprakta küllemeye dayanım QTL inin oranında, tanede ise oranında fenotipik varyansı açıkladığını bulmuştur. Mildiyöye dayanım QTL inin ise yaprakta , tanede arasında fenotipik varyansı açıkladığı tespit edilmiştir. Merdinoğlu et al. (2003) BSA yöntemiyle BC 2 de yaprıkları çalışmada mildiyöye dayanım ile ilgli QTL in gözlenen varyansın 0.73 ünü, genetik varyansın ise 0.83 ünü açıkladıklarını ifade etmiştir. Bu çalışmaların yüksek sayıda birey içeren etkin bir populasyonda ve etkin bir markör ile yapıldığını göz önüne almak gerekir. Italia çeşidinde 8 markör lokusu 6 karakterden sorumlu bulunmuştur. Mercan çeşidinde ise 3 lokus 2 karakteri idare etmektedir. Toplamda ise 11 markör lokusu 7 karakter ile bağlantılı bulunmuştur. Yaprak formu ve çiçeklenme zamanı birden fazla lokus tarafından idare edilmeleri sebebiyle poligenik karakterdirler. Mercan çeşidine ait bağlantı gruplarına yerleşen OPN12 markörü çiçeklenme zamanı ile önemli derecede (p=0.009) bağlantılı bulunmuştur. Yaprak formu ile ilişkili olduğu tespit edilen lokuslardan OPB12a daha önemli (p=0.013) olmuştur. Mercan da, küllemeye daha dayanıklı olmasına rağmen bir QTL bulunamaması sürpriz gibi görünse de bunun nedeni açılım populasyonundaki genel polimorfizmin ve birey sayısının düşük olmasıdır. Markör varlığı (1) veya yokluğu (0) değerlerinin fenotip üzerine regresyonunda ortalama ve standart sapma değerleri incelendiğinde; sürgün ucunda antosiyanin yoğunluğu, yaprak formu ve tane şekli birörnekliği karakterleri üzerine ilgili tüm markör lokuslarının varlığının olumlu, tanede aroma üzerine ise OPB12a lokusunun olumsuz etkide bulunduğu söylenebilir. Ancak tane şekli birörnekliği ve tanede aroma karakterlerinde gözlem sayısının düşük olmasının (sırasıyla 17 ve 15) buna yol açması mümkündür. 78

88 Küllemeye dayanım üzerine etkili olduğu tespit edilen lokuslardan sadece OPI4c nin hastalığa duyarlı bireylerin ortalamasını yükseltirken OPI4d hastalığa daha dayanıklı bireylerin ortalamasını yükseltmektedir. OPI4c ve OPI4d lokuslarının önem derecesinin daha yüksek olması (p=0.013) ve birbirinden sadece 5 cm uzaklıkta yerleşen bu iki markörün külleme ile bağlantısı olduğunun tespiti önemli bir sonuçtur. Ek 6, 7, 8, 9 ve 10 incelendiğinde OPI4c lokusunun külleme ile olan ilişkisinin değişik LOD değerlerinde sürekli olarak tespit edildiği ortaya çıkmaktadır. Külleme hastalığına duyarlı olduğu tespit edilen Italia da bu lokusun varlığı hastalıkla ilişkilendirilebilr. Daha doygun bir harita elde edilmesi ile birlikte bu lokusların külleme ile ilgili bağlantısının daha detaylı tespiti mümkün olacaktır. Bu çalışmada incelenen karakterlerin bazılarında, örneğin sürgün ucunda antosiyanin yoğunluğu, yaprak şekli ve formu, yaprak sapı tüylülük durumu, çiçeklenme zamanı, tane etinin ve kabuğunun yapısı ve salkım uzunluğu gibi, transgresif (ebevenynlerin döllere göre daha düşük değerler vermesi) davranış gözlenmiştir. Bu durum ebeveyn fenotiplerinin farklı allelerin kombinasyonunun bir sonucu olduğunun göstergesi olabilir ve özellikle bu durumun tür içi melezlemelerde fazlaca karşılaşılabilen bir durum olduğu ifade edilmiştir (Mansur et al. 1993, Tanskley 1993). Markör-QTL bağlantısı tespitinde kullanılan regresyon ve tek yönlü anova testlerinin dezavantajı veri kaybını dikkate almamasıdır. Bu konuda aralık haritalamanın (interval mapping) etkisi çok daha güçlüdür ancak sadece 60 bireyden oluşan Italia x Mercan populasyonu bu analizin yapılması için uygun değildir. Van Ooijen (1992) 200 den daha az bireyden oluşan populasyonlarda küçük eklemeli etkilere sahip QTL lerin saptanmasının zor olacağını ve sadece büyük etkiye sahip genlerin tespit edilebileceğini ifade etmiştir. Bu çalışmanın ülkemizde asmada ilk kez yapılıyor olması önem arzetmesine rağmen haritalama populasyonu olarak kullanılan Italia x Mercan populasyonun bir haritalama populasyonundan incelenen karakterler açısından beklenen polimorfizmi göstermemesi 79

89 amaçlanan hedeflere ulaşılmasında ve bir başka ifade ile markör-qtl ilişkisini açıklamak için yeterli olmamıştır. Bunu takip edecek ileri çalışmalarda aynı populasyon üzerinde birey sayısının arttırılması ve/veya değişik markörlerin (daha fazla RAPD, AFLP, SSR ve RFLP gibi) kullanılması ve hali hazırda bu çalışma ile elde edilmiş markörler ile yeniden değerlendirilmesi suretiyle yukarıda belirtilen amaçlara ulaşmak mümkün olabilecektir. Bu şekilde, çalışma sonucunda elde edilen haritaların doygunluğu arttırılabilecek ve QTL bilgilerinin detaylandırılması ve daha güvenilir hale getirilmesi sağlanabilecektir. 80

90 KAYNAKLAR Adam-Blondon, A. -F, Lahogue-Esnault, F., Bouquet, A., Boursiquot, J.M. and This, P Usefulness of two SCAR markers for marker-assisted selection of seedless grapevine cultivars. Vitis, 40(3); Adam-Blondon, A.-F., Roux, C., Claux, D., Butterlin, G., Merdinoğlu, D. and This, P Mapping 245 SSR markers on the Vitis vinifera genome: a tool for grape genetics. Theor.Appl. Genet., 109(5); Ageoerges, A., Albagnac, G., Doligez, A., Dosba, F., Nottenghem, J., Peros, J.P., Terries, N., Tesniere, C., This, J. P. and Torregrosa, L Towards a better understanding of berry quality and powdery mildew resistance in grapevine. Genetic determinism and pathways. Plant Animal & Microbe Genome X Conference Abst Ocak 2002, San Diego, CA, ABD. Ağaoğlu, Y.S Bilimsel ve uygulamalı bağcılık (Asma biyolojisi). Kavaklıdere Eğitim Yayınları, No: s, Ankara. Akkurt, M Entwichlung molekularer marker für Oidium (Uncinula necator)- resistenz bei der Weinrebe. PhD Diss. Karlsruhe T.H. Deutschland. 117 s. Anonymous Descriptors for grape. International Board for Plant Genetic Sources. Secretariat, 93 p, Rome. Anonymous Minimal Descriptor List for Grapevine Varieties. 49 p. Anonymous Genetic analysis in Vitis using molecular markers. BARD project No: US , 150 p. Anonymous FAO üzüm istatistikleri. Web sitesi Erişim Tarihi: Arumuganathan, K. and Earle, E.D Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Molecular Biology Reporter, 9(3); Asins, M.J Present and future of quantitative trait locus analysis in plant breeding. Plant Breeding, 121; Bernatzky, R. and Tanksley, S.D Restriction fragments as molecular markers for germplasm analysis and utilization. in: Brown A.D.H., Marshall, D.R., Frankel, O.H. Williams J. T (eds). The Use of Plant Genetic Resources, Cambridge University Press, pp , Cambridge. 81

91 Boubals, D Etude des causesde la resistance des vitacees a l oidium de la vigne (Uncinula necator Burr.) et de leur mode de transmission hereditaire. Ann Amélior Plantes, 11: Bouquet, A. and Danglot, Y Inheritance of seedlessness in grapevine (Vitis vinifera L.). Vitis, 35; Brar, D.S Molecular marker assisted breeding. In: Jain, S.M., Brar, D.S. and Ahloowalia, B.S. (eds.) Molecular techniques in crop improvement. Kluwer Academic Publishers. 616 p. Buck, S, and Zyprian, E First approaches of molecular mapping in a model population derived from the crossing of the grapevine varieties Regent x Lemberger. Proc. of VII. International Symp. on Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem. 1998, Vol 2, Acta Horticulturae, No:528; Burr, B., Burr, F.A., Thompson, K.H., Albertsen, M.C. and Stuber, C.W Gene mapping with recombinant inbreds in maize. Genetics, 118; Callahan, M., Jin, Y., Gao, F. and Walker, M.A A genetic map of Vitis rupestris x Muscadinia rotundifolia locating resistance to Xiphinema index, the dagger nematod. Plant Animal & Microbe Genome X Conference Abst Ocak 2002, San Diego, CA, ABD. Çelik, H Üzüm Çeşit Kataloğu. Sun Fidan A.Ş. Mesleki Kitaplar Serisi: s. Dalbó, M.A Genetic mapping, QTL analysis and marker-assisted selection for disease resistance loci in grapes. Ph.D. Thesis, Cornell Univ., Ithaca, NY. Dalbó, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F., Steinkellner, H., Sefc, K.M. and Reisch, B.I A gene controlling sex in grapevines placed on a molcular marker-based genetic map. Genome, 43; Dalbó, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F., Wilcox, W.F. and Reisch, B.I Markerassisted selection for powdery mildew resistance in grapes. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126(1); Doligez, A., Bouquet, A., Danglot, Y., Lahogue, F., Riaz, S., Meredith, C.P., Edwards, K.J. and This, P Genetic mapping of grapevine (Vitis vinifera L.) applied to the detection of QTLs for seedlessness and berry weight. Theor. Appl. Genet. 105;

92 Doligez, A., Bouquet, A., Ballester, J., Farnos, M., Danglot, Y., Adam-Blondon, A., -F Roux, C., Domergue, P. and This, P QTLs for quality-related traits in table grapes. Plant Animal & Microbe Genome X Conference Abst Ocak 2002, San Diego, CA, ABD. Donald, T., Pauquet, J., Pellerone, F., Adam-Blondon, A. -F, Bouquet, A., Thomas, M. and Dry, L Identification and local mapping of resistance gene analogs linked to a powdery mildew resistance locus in grapevine. Plant Animal & Microbe Genome X Conference Abst Ocak 2002, San Diego, CA, ABD. Doucleff, M., Jin, Y., Gao, F., Riaz, S., Krivanek, A.F. and Walker, M.A A genetic linkage map of grape, utilizing Vitis rupestris and Vitis arizonica. Theor. Appl. Genet., 109; Echt, C.S., Knapp, S. and Liu, B.H Genome mapping with non-inbred crosses using GMendel 2.0. Maize Genet. Coop. Nwsl. 66, Eibach, R Investigations about the genetic resources of grapes with regard to resistance characteristics to powdery mildew (Oidium tuckeri). Vitis, 33; Ergül, A., Marasalı, B. and Ağaoğlu, Y. S Molecular discrimination and identification of some Turkish grape cultivars (Vitis vinifera L.) by RAPD markers. Vitis, 41(3); Fischer, B.M., Slakhutdinov, I., Akkurt, M., Eibach, R., Edwards, K.J., Töpher, R. and Zyprian, E.M Quantitative trait locus analysis of fungal disease resistance factors on a molecular map of grapevine. Theor. Appl. Genet., 108; Galet, P A Practical Ampelography. Cornell Univ. Press, Ithaca, NY. 248 p. Galet, P Cépages et vignobles de France, Tome 1. Les vignes Américaines (2 nd ed). Imprimerie Charles Déhan,Montpellier, France, p.56. Geldermann, H Investigations on inheritance of quantitative characters in animals by gene markers. I. Methods. Theor.Appl. Genet., 46; Georgiady, M., DeScenzo, R., Cain, D.W. and Irelan, N Linkage mapping and QTL mapping in grape. Plant and Animal Genome IX Conference Abst Ocak 2001, San Diego, CA, ABD. Grando, M.S., Frisinghelli, C. and Stefanini, M Polymorhism and distribution of molecular markers in a segregating population derived from the cross Moscato Bianco x Vitis riparia. Proc. of VII. International Symp. on 83

93 Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem. 1998, Vol 2, Acta Horticulturae. No: 528, Grando, M.S., Bellin, D. Edwards, K.J., Pozzi, C., Stefanini, M. and Velasco, R Molecular linkage maps of Vitis vinifera L. and Vitis riparia Mchx. Theor. Appl. Genet., 106 (7); Grant, D. and Shoemaker, R.C Plant gene techniques. Encyclopedia of Life Sciences. p Grattapaglia, D., Chapparro J., Wilcox, P., McCord, S., Werner, D., Amerson, H, McKeand, S., Bridgewater, F., Whetten, R., O'Malley, D, and Sederoff, R Mapping in woody plants with RAPD markers. In: Application of RAPD technology and plant breeding. Plant Sci. Soc. of Am. Madison, WI, p Gupta, M., Chyi, Y.S., Romero-Severson, J. and Owen, J Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simplesequence repeats. Thoer.Appl.Genet., 89; Haldane, J.B.S The combination of linkage values, and the calculation of distance between the loci of linked markers. J. Genet., 8; Haley, S.D., Afanador, L.K. and Kelly, J.D Selection for monogenic resistance traits with coupling- and repulsion- phase RAPD markers. Crop Sci., 34; Hemmat, M., Weeden, N.F., Manganaris, A.G. and Lawson, D.M Molecular marker linkage map for apple. J. Hered., 85; Hyne, V. and Kearsey, M.J QTL analysis: Further uses of marker regression. Theor. Appl. Genet., 91; Jiang, C. and Zeng, Z Multiple trait analysis of genetic mapping for quantitative trait loci. Genetics, 140; Kelly, J.D Use of random amplified polymorphic DNA markers in breeding for major gene resistance to plant pathogens. Hortscience, 30(3); Kosambi, D.D The estimation of map distance from recombination values. Ann. Eugenics, 12; Kozma Jr, P Winegrape Breeding for Fungus Disease Resistance. Proc. of VII. International Symp. on Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem. 1998, Acta Horticulturae, Vol 2, No

94 Kozma Jr, P. and Dula, T Inheritance of resistance to downy mildew and powdery mildew of hybrid familiy Muscadinia x V. vinifera x V. amurensis x Franco-American hybrid. Proc. VIII th Int l. Congress on Grape. Acta Hort. 603, Lahogue, F., This, P., Adam-Blondon, A-F. and Bouquet, A Identification of markers linked to the seedlessness character in grapevine. Plant and Animal Genome VI Conference Abst Ocak 2003, San Diego, CA, ABD. Lander, E.S., Green, P., Abrahamson, J., Barlow, Daly, M.J., Lincoln, S.E. and Newberg, L MAPMAKER, An interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations. Genomics, 1; Lander, E.S. and Botstein, D Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics, 121; Lodhi, M.A Genetic mapping and genome analysis of grape (Vitis sp.). Ph.D. Thesis, Cornell University, 233 p., New York. Lodhi, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F. and Reisch, B.I A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars and Vitis species. Plant Mol. Biol. Reptr., 12; Lodhi, M.A., Daly, M. A., Weeden, N.F. and Reisch, B.L A molecular marker based linkage map of Vitis. Genome, 38; Luo, S., He, P.C, Zhou, P., and Zheng, XQ Identification of molecular genetic markers tightly linked to downy mildew resistant genes in grape. Acta Genet. Sin., 28; Luo, S., He, P., Zheng, X. and Zhou, P Inheritance of RAPD markers in an interspesifıc F 1 hybrid of grape between Vitis quinquangularis ve V. vinifera. Scientia Horticulturae, 93; Madini, A., Marino, R., Sevini, F., Di Gaspero, G., Velasco, R. and Grando, M.S Mapping defense-related genes and QTLs in Vitis. Plant and Animal Genome XI Conference Abst Ocak 2003, San Diego, CA, ABD. Malyshev, S.V. and Kartel, N.A Molecular markers in mapping plant genomes, Molecular Biology, 31(2);

95 Manly, K.F. and Elliot, R.W MapManager, a microcomputer program for analysis of data from recombinant inbred strains. Mammalian Genome, 1; Mansur, L.M., Orf, J., and Lark, K.G Determining the linkage of quantitative trait loci for reproductive, morphological, and seed traits of soybean (Glycine max L.). Theor. Appl. Genet., 86; Marino, R., Sevini, F., Madini, A., Vecchione, A., Perlot, I, Della Serra, A., Versini, G., Velasco, R., and Grando, M.S QTL mapping for disease resistance and fruit quality in grape. ISHS VIII International Conference on Grape Genetics and Breeding. Acta Horticulturae, 603; Mauro, M.-C, Strefeler, M., Weeden, N.F. and Reisch B.L Genetic analysis of restriction fragment length polymorphisms in Vitis. Journal of Heredity, 83; Mejia, N. and Hinrichsen, P A new, highly assertive scar marker potentially useful to assist selection for seddlessness in table grape breeding. Proc. VIII th Int l. Congress on Grape. Acta Hort. 603; Merdinoğlu, D., Wiedeman-Merdinoğlu, S., Coste, P., Dumas, V., Haetty, S., Butterlin, G. and Greif, C Genetic analysis of downy mildew resistance derived from Muscadinia rotundifolia. ISHS Acta: VIII International Conference on Grape Genetics and Breeding. Horticulturae, 603; Milutinovic, M., Nikolic, D., Avramov, L. and Rakonjac, V Recombination of some characteristics in F 1 generation of grapevine. Proc. of VII. International Symp. on Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem. 1998, Vol 2, Acta Horticulturae, 528; Naqvi, N. I., Bonman, J. M., Mackill, D. J., Nelson, R. J. and Chattoo, B. B Identification of RAPD markers linked to a major gene for blast resistance in rice. Molecular Breeding, 1; Odabaş, F., Köse, B. ve Çelik, H Amasya ili Merzifon ilçesinde yetiştirilen bazı üzüm çeşitlerinin ampelografik özelliklerinin belirlenmesi üzerine bir araştırma, Türkiye V. Bağcılık ve Şarapçılık Sempozyumu 5-9 Ekim, Nevşehir. 86

96 Paran, I. and Michelmore, R.W Development of reliable PCR based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet., 85; Paterson, A.H., Damon, S, Hewitt, J.D., Zamir, D., Rabinowitch, H.D., Lincoln, S.E. and Lander, E.S Mendelian factors underlying quantitative traits in tomato: Comparison across species, generations, environments. Genetics, 127; Pauquet, L, Bouquet, A., This, P. and Adam-Blondon, A.-F Establishment of a local map of AFLP markers around the powdery mildew resistance gene Runl in grapevine and assessment of their usefulness for marker assisted selection. Theor. Appl. Genet., 103; Rafalski, J.A. and Tingey, S.V Genetic diagnostics in plant breeding, RAPDs, microsatellites and machines. TIG, 9(8); Regner, F., Fradossi, A., Eisenheld, C., Stierschneider, I. and Haas, M Genetic analysis of a segregating population derived by a cross of Welschriesling x Sirius. Proc. VIII th Int l. Congress on Grape. Acta Hort., 603; Reisch, B.L, Einset, J. and Pratt, C Grapes. In: Janick, J., Moore, J.N. Eds. Advances in Fruit Breeding. Purdue Univ. Press, West Lafayette, USA. Reiter, R.S., Williams, J.G.K., Feldman, K.A., Rafalski, A., Tingey, S.V. and Scolnik, P.A Global and local genome mapping in Arabidopsis thaliana by using recombinant inbred lines and random amplified polymorphic DNAs. Proc.Natl.Acad.Sci., USA 89, Ren, Z., Lamikanra, O. and Lu, J Identification of a RAPD marker closely linked to the fruit color in muscadine grapes (Vitis rotundifolia). Proc. of VII. International Symp. on Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem. 1998, Vol 2., Acta Horticulturae, 528; Riaz, S., Dnagl, G.S., Edwards, K.J. and Meredith, C.P A microsatellite marker based framework linkage map of Vitis vinifera L. Theor. Appl. Genet., 108; Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T Synthesis of uniformly labeled DNA probes using random oligonucleotide primers. In: Molecular cloning. 2 nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. pp

97 Sevini, F., Marino, R. and Grando, M.S Mapping candidate genes and QTLs For aroma content in grape. Proc. I st Int l. Symp. on Grapevine. Acta Hort., 652; Soller, M., Brody, T. and Genizi, A On the power of experimental designs for the detection of linkage between marker loci and quantitative loci in crosses between inbred lines. Theor.Appl.Genet., 47; Stam, P Construction of integrated genetic linkage maps by means of a new computer package, JoinMap. Plant J., 3; Staub, J.E., Serquen, F,C. and Gupta, M Genetic markers, map construction, and their application in plant breeding. Hortscience, 31(5); Staub, J.E., Kuhns, L.J., May, B. and Grun, P Stability of potato tuber isozymes under different storage regimes. J. Amer. Hort. Sci., 107; Stuber, C.W., Lincoln, S.E., Wolf, D.W., Helentjaris, T. and Lander, E Identification of genetic factors contributing to heterosis in a hybrid from an elite maize inbred lines using molecular markers. Genetics, 132; Southern, E.M Detection of spesific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 98; Striem, M.J., Ben-Hayyim, G. and Spiegel-Roy, P Identifying molecular genetic markers associated with seedlessness in grape. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 121 (5); Suiter, K.A., Wendel, J.F. and Case, J.S Linkage-1, A pascal computer program for the detection and analysis of genetic linkage. J. Hered., 74; Tanksley, S.D Mapping Polygenes. Annu. Rev. Gent., 27; This, P., Cuisset, C. and Boursiquot, J.M Development of stable RAPD markers for the identification of grapevine rootstocks and the analysis of genetic relationships. Am.J. Enol. Vitic., 48(4); Thormann, C.E., Ferreira, M.E., Camargo, L.E. Tivang, J.G. and Osborn, T.C Comparison of RFLP and RAPD markers to estimating genetic relationships within and among cruciferous species. Theor. Appl. Genet., 88; Tulsieram, L. K., Glaubitz, J. C., Kiss, G. and Carlson, J. E Single tree genetic linkage mapping in conifers using haploid DNA from megagametophytes. Bio/Tech., 10;

98 Van Ooijen, J.W Segregation of isozyme markers and cold tolerance in an interspesific backcross of tomato. Theor. Appl. Genet., 66; Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. and Zabeau, M AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23 (21); Walker, M.A. and Jin, Y Breeding Vitis rupestris x Muscadinia rotundifolia rootstocks to control Xiphinema index and fanleaf degeneration. Proc. of VII. International Symp. On Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem. 1998, Vol 2. Acta Horticulturae, 528; Weeden, N.F., Reisch, B.L and Martens, M.E Genetic analysis of isozyme polymorphism in grape. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 113(5); Weeden, N.F., Hemmat, M, Lawson, D.M., Lodhi, M., Bell, R.L., Manganaris, A.G., Reisch, B.I., Brown, S.K. and Ye, G.-N Development and application of molecular linkage maps in woody fruit crops. Euphytica, 77; Weising, K., Nybom, H., Wolff, K. and Meyer, W DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Pres, Inc. 322 p. Williams, J.G.K., Rubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. and Tingey, S.V DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acid Research, 18(22); Ye, G.N., Lodhi, M.A., Weeden, N.F. and Reisch, B.I A RAPD linkage map for grape and identification of major QTL for powdery mildew resistance. BARD Project. Final BARD Report, US pp Yoshimura, S., A., Yoshimura, S.R., McCouch, M.R., Baraoidan, T.W., Mew, N. and Nelson, R.J Tagging and combining bacterial blight resistance genes in rice using RAPD and RFLP markers. Molecular Breeding, 1; Zavala, K., Mejia, N., Sagredo, B. and Hinrichsen, P Consruction of a linkage map for apirenic table grapes and identification of markers linked to seedlessness. Plant Animal & Microbe Genome X Conference Abst Ocak 2002, San Diego, C A, ABD. 89

99 Zyprian, E., Salakhutdinov, L., Fischer, B., Akkurt, M. and Töpfer, R Molecular mapping of grapevine and QTL analysis of fungal disease resistances. Plant and Animal & Microbe Genome x Conference Abst Ocak 2002, San Diego, C A, ABD. Zyprian, E., Eibach, R. and Töpfer, R Comparative molecular mapping of fungal disease resistance and agronomic traits in segregating populations of grapevine. Plant and Animal Genome XI Conference Abst Ocak 2003, San Diego, CA, ABD. Zyprian, E., Eibach, R., Akkurt, M. and Töpfer, R Genetic mapping of SSR Markers in grapevine for the analysis of disease resistance and flavor compounds. Plant and Animal Genome XIII Conference Abst Ocak 2005, San Diego, CA, ABD. 90

100 EKLER EK 1. RAPD analizi ile analiz edilen iki ebeveyn ve 60 F 1 bitkisinde taranan primerlere ait baz dizilişleri Ek 2. Italia x Mercan populasyonunda yapılan morfolojik ve hastalıklara dayanım özeliklerine yönelik analiz sonuçları EK 3. İncelenen karakterlerin normal dağılıma uygunluk grafikleri EK 4. Italia, Mercan ve Italia x Mercan F 1 lerine ait DNA ların saflık ve miktar değerleri EK 5. Bazı primerlere ait PCR bant desenleri EK 6. LOD 2.0 ve 25 cm maksimum uzaklık değerlerine göre oluşan bağlantı grupları 1 EK 7. Italia çeşidinde LOD 4 ve 5 ve 25 cm maksimum uzaklık değerlerine göre oluşan bağlantı grupları EK 8. Mercan üzüm çeşidinde LOD 4 ve 25 cm maksimum uzaklık değerlerinde oluşan bağlantı grupları EK 9. LOD 2, 4 ve 5 değerlerine göre Italia ve Mercan haritalarının karşılaştırılması EK 10. LOD 2 değerine göre bağlantı gruplarına yerleşen markörlerde yapılan Binary lojistik regresyon ve tek faktörlü Anova analiz sonuçları 91

101 EK 1. RAPD analizi ile analiz edilen iki ebeveyn ve 60 F 1 bitkisinde taranan primerlere ait baz dizilişleri İsim OPA-1 OPA-2 OPA-03 OPA-04 OPA-05 OPA-06 OPA-07 OPA-08 OPA-09 OPA-10 OPA-11 OPA-12 OPA-13 OPA-14 OPA-15 OPA-16 OPA-17 OPA-18 OPA-19 OPA-20 OPB-01 OPB-02 OPB-03 OPB-04 OPB-05 OPB-06 OPB-07 OPB-08 OPB-09 OP B-10 OPB-11 OPB-12 OPB-13 OPB-14 Dizi CAGGCCCTTC TGCCGAGCTG AGTCAGCCAC AATCGGGCTG AGGGGTCTTG GGTCCCTGAC GAAACGGGTG GTGACGTAGG GGGTAACGCC GTGATCGCAG CAATCGCCGT TCGGCGATAG CAGCACCCAC TCTGTGCTGG TTCCGAACCC AGCCAGCGAA GACCGCTTGT AGGTGACCGT CAAACGTCGG GTTGCGATCC GTTTCGCTCC TGATCCCTGG CATCCCCCTG GGACTGGAGT TGCGCCCTTC TGCTCTGCCC GGTGACGCAG GTCCACACGG TGGGGGACTC CTGCTGGGAC GTAGACCCGT CCTTGACGCA TTCCCCCGCT TCCGCTCTGG 92

102 93 OPB-15 GGAGGGTGTT OPB-16 TTTGCCCGGA OPB-17 AGGGAACGAG OPB-18 CCACAGCAGT OPB-19 ACCCCCGAAG OPB-20 GGACCCTTAC OPC-01 TTCGAGCCAG OPC-02 GTGAGGCGTC OPC-03 GGGGGTCTTT OPC-04 CCGCATCTAC OPC-05 GATGACCGCC OPC-06 GAACGGACTC OPC-07 GTCCCGACGA OPC-08 TGGACCGGTG OPC-09 CTCACCGTCC OPC-10 TGTCTGGGTG OPC-11 AAAGCTGCGG OPC-12 TGTCATCCCC OPC-13 AAGCCTCGTC OPC-14 TGCGTGCTTG OPC-15 GACGGATCAG OPC-16 CACACTCCAG OPC-17 TTCCCCCCAG OPC-18 TGAGTGGGTG OPC-19 GTTGCCAGCC OPC-20 ACTTCGCCAC OPD-01 ACCGCGAAGG OPD-02 GGACCCAACC OPD-03 GTCGCCGTCA OPD-04 TCTGGTGAGG OPD-05 TGAGCGGACA OPD-06 ACCTGAACGG OPD-07 TTGGCACGGG OPD-08 GTGTGCCCCA OPD-09 CTCTGGAGAC OPD-10 GGTCTACACC OPD-11 AGCGCCATTG

103 94 OPD-12 CACCGTATCC OPD-13 GGGGTGACGA OPD-14 CTTCCCCAAG OPD-15 CATCCGTGCT OPD-16 AGGGCGTAAG OPD-17 TTTCCCACGG OPD-18 GAGAGCCAAC OPD-19 CTGGGGACTT OPD-20 ACCCGGTCAC OPE-01 CCCAAGGTCC OPE-02 GGTGCGGGAA OPE-03 CCAGATGCAC OPE-04 GTGACATGCC OPE-05 TCAGGGAGGT OPE-06 AAGACCCCTC OPE-07 AGATGCAGCC OPE-08 TCACCACGGT OPE-09 CTTCACCCGA OPE-10 CACCAGGTGA OPE-11 GAGTCTCAGG OPE-12 TTATCGCCCC OPE-13 CCCGATTCGG OPE-14 TGCGGCTGAG OPE-15 ACGCACAACC OPE-16 GGTGACTGTG OPE-17 CTACTGCCGT OPE-18 GGACTGCAGA OPE-19 ACGGCGTATG OPE-20 AACGGTGACC OPF-01 ACGGATCCTG OPF-02 GAGGATCCCT OPF-03 CCTGATCACC OPF-04 GGTGATCAGG OPF-05 CCGAATTCCC OPF-06 GGGAATTCGG OPF-07 CCGATATCCC OPF-08 GGGATATCGG

104 OPF-09 OPF-10 OP F-11 OPF-12 OPF-13 OPF-14 OPF-15 OPF-16 OPF-17 OPF-18 OPF-19 OPF-20 OPH-01 OP H-02 OPH-03 OP H-04 OP H-05 OP H-06 OP H-07 OP H-08 OP H-09 OP H-10 OP H-11 OP H-12 OP H-13 OP H-14 OP H-15 OP H-16 OP H-17 OP H-18 OP H-19 OP H-20 OPI-01 OPI-02 OPI-03 OPI-04 OPI-05 CCAAGCTTCC GGAAGCTTGG TTGGTACCCC ACGGTACCAG GGCTGCAGAA TGCTGCAGGT CCAGTACTCC GGAGTACTGG AACCCGGGAA TTCCCGGGTT CCTCTAGACC GGTCTAGAGG GGTCGGAGAA TCGGACGTGA AGACGTCCAC GGAAGTCGCC AGTCGTCCCC ACGCATCGCA CTGCATCGTG GAAACACCCC TGTAGCTGGG CCTACGTCAG CTTCCGCAGT ACGCGCATGT GACGCCACAC ACCAGGTTGG AATGGCGCAG TCTCAGCTGG CACTCTCCTC GAATCGGCCA CTGACCAGCC GGGAGACATC ACCTGGACAC GGAGGAGAGG CAGAAGCCCA CCGCCTAGTC TGTTCCACGG 95

105 96 OPI-06 AAGGCGGCAG OPI-07 CAGCGACAAG OPI-08 TTTGCCCGGT OPI-09 TGGAGAGCAG OPI-10 ACAACGCGAG OPI-11 ACATGCCGTG OPI-12 AGAGGGCACA OPI-13 CTGGGGCTGA OPI-14 TGACGGCGGT OPI-15 TCATCCGAGG OPI-16 TCTCCGCCCT OPK-01 CATTCGAGCC OPK-02 GTCTCCGCAA OPK-03 CCAGCTTAGG OPK-04 CCGCCCAAAC OPK-05 TCTGTCGAGG OPK-06 CACCTTTCCC OPK-07 AGCGAGCAAG OPK-08 GAACACTGGG OPK-09 CCCTACCGAC OPK-10 GTGCAACGTG OPK-11 AATGCCCCAG OPK-12 TGGCCCTCAC OPK-13 GGTTGTACCC OPK-14 CCCGCTACAC OPK-15 CTCCTGCCAA OPK-16 GAGCGTCGAA OPK-17 CCCAGCTGTG OPK-18 CCTAGTCGAG OPK-19 CACAGGCGGA OPK-20 GTGTCGCGAG OPM-01 GTTGGTGGCT OPM-02 ACAACGCCTC OPM-03 GGGGGATGAG OPM-04 GGCGGTTGTC OPM-05 GGGAACGTGT OPM-06 CTGGGCAACT

106 97 OPM-07 CCGTGACTCA OPM-08 TCTGTTCCCC OPM-09 GTCTTGCGGA OPM-10 TCTGGCGCAC OPM-11 GTCCACTGTG OPM-12 GGGACGTTGG OPM-13 GGTGGTCAAG OPM-14 AGGGTCGTTC OPM-15 GACCTACCAC OPM-16 GTAACCAGCC OPM-17 TCAGTCCGGG OPM-18 CACCATCCGT OPM-19 CCTTCAGGCA OPM-20 AGGTCTTGGG OPN-01 CTCACGTTGG OPN-02 ACCAGGGGCA OPN-03 GGTACTCCCC OPN-04 GACCGACCCA OPN-05 ACTGAACGCC OPN-06 GAGACGCACA OPN-07 CAGCCCAGAG OPN-08 ACCTCAGCTC OPN-09 TGCCGGCTTG OPN-10 ACAACTGGGG OPN-11 TCGCCGCAAA OPN-12 CACAGACACC OPN-13 AGCGTCACTC OPN-14 TCGTGCGGGT OPN-15 CAGCGACTGT OPN-16 AAGCGACCTG OPN-17 CATTGGGGAG OPN-18 GGTGAGGTCA OPN-19 GTCCGTACTG OPN-20 GGTGCTCCGT OPO-01 GGCACGTAAG OPO-02 ACGTAGCGTC OPO-03 CTGTTGCTAC

107 OPO-04 OPO-05 OPO-06 OPO-07 OPO-08 OPO-09 OPO-10 OPO-11 OPO-12 OPO-13 OPO-14 OPO-15 OPO-16 OPO-17 OPO-18 OPO-19 OPO-20 OPU-16 OPP-17 OP G-05 OP G-06 UBC 204 UBC 231 UBC 251 UBC 237 UBC 238 BC 302 BC 340 B 352 B 356 BC 374 B 379 B 388 B 389 B 391 AAGTCCGCTC CCCAGTCACT CCACGGGAAG CAGCACTGAC CCTCCAGTGT TCCCACGCAA TCAGAGCGCC GACAGGAGGT CAGTGCTGTG GTCAGAGTCC AGCATGGCTC TGGCGTCCTT TCGGCGGTTC GGCTTATGCC CTCGCTATCC GGTGCACGTT ACACACGCTG CTGCGCTGGA TGACCCGCCT CTGAGACGGA GTGCCTAACC TTCGGGCCGT ACACACGCTG CTTGACGGGG CGACCAGAGC CTCTCCAGCA CGGCCCACGT GAGAGGCACC CACAACGGGT GCGGCCCTCT GGTCAACCCT GGGCTAGGGT CGGTCGCGTC CGCCCGCAGT GCGAACCTCG 98

108 P 33 P 35 P 123 P 166 P 210 P 232 P 250 P 255 P 313 P 325 P 382 P 394 P 402 P 437 P 443 K 1 K 2 K 3 K 4 K 5 K 6 K 7 K 8 GTO 4 S 34 S 35 S 39 S 69 RAPD 1 RAPD 2 RAPD 3 RAPD 4 RAPD 5 RAPD 6 RAPD 7 RAPD 8 GTAAAACGACGGCCAGT TGCGCAACGTTGTTG' GGGATTCGAC GTGACGGACT AAATGCGGCA CCGCTTGTTG TGAGCTCCGT ACGTTTTCCC AAAGCCGTCC TACGTGCTGG GAACCGGATC CGACTCCAAC GCGTTGTCCA CGGATCGACA GCCGTGATAG GCGACCATGG CAGGCCATGG GCCATGGACG GATGGTACCG CGCAGGATGG CGATGACTGG' GGGATGGCTG CCCATGGGTG GTGGTTGCGA GATAGCCGAC AGTCGCTCAT TCGGCCTGCT CATCGAACCG CGCAGTACTC GTCCTCAACG CTGATCGTAC GTCCTACTCG CTACTACTCG TCCTCACTAG GTGCTTAGCG CAGGCCCTTC 99

109 RAPD 9 SC 1022 SC 1023 SC 1038 SC 1043 SC 1048 SC 1053 SC 1065 SC 1076 SC 1077 SC 1082 SC 1093 CTACACAGGC GTAGGCGTCG GGCTCGTACC GACCCCGGCA GCCTGGTTAC CTGGTATGCG CAGGGGACGA CAGGGGTGAT CGCAGACTTG AGATAGAGGG GCCGTGAAGT GCCTCCTACC 100

110 EK 2. Italia x Mercan populasyonunda yapılan morfolojik ve hastalıklara dayanım özeliklerine yönelik analiz sonuçları A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 B1 B2 B3 B4 İtalia Nis ,8 Mercan Nis , Nis Nis Nis Nis Nis Nis , Nis Nis Nis Nis , Nis Nis , Nis Nis , Nis Nis , Nis Nis Nis Nis Nis Nis Nis Nis Nis Nis , Nis Nis , Nis Nis Nis Nis Nis

111 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 B1 B2 B3 B Nis , Nis Nis Nis , Nis Nis Nis , Nis , Nis Nis , Nis , Nis , Nis Nis , Nis Nis Nis Nis Nis Nis Nis Nis , Nis , Nis Nis Nis

112 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 C1 C2 C3 İtalia 4 11, ,4 Mercan 3 2, , , , ,2 3 1, , ,2 1 0, , , , ,7 78 2,6 1,8 1 0, , , , ,4 4 1, , , , , , , ,9 1 0, , ,3 1 0, , ,1 1 0, , , , , , , , , , , , , ,5 103

113 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 C1 C2 C , ,2 1 0, , , , , , ,7 1 0, , , , , , , , , , , ,8 1 0, , , , , , , , , , , , ,5 3 0, , ,7 0, , ,

114 EK 3. İncelenen karakterlerin normal dağılıma uygunluk grafikleri Sürgün ucunda antosiyanin yogunlugu Genc yaprak üst yüzey rengi,999,999,99,99,95,95 Probability,80,50,20 Probability,80,50,20,05,05,01,01,001,001 Average: StDev: 4, A1 4 5 Kolmogorov-Smirnov Normality Test D+: 0,077 D-: 0,093 D : 0,093 Average: 1,61017 StDev: 0, A4 Kolmogorov-Smirnov Normality Test D+: 0,089 D-: 0,084 D : 0,089 N: 0, Approximate P-Value > 0.15 N: 59 Approximate P-Value > 0.15 Yaprak formu Yaprak sekli,999,999,99,99,95,95 Probability,80,50,20 Probability,80,50,20,05,05,01,01,001, A9 A10 Average: 1,74576 Kolmogorov-Smirnov Normality Test Average: 2,84746 Kolmogorov-Smirnov Normality Test StDev: 0, D+: 0,075 D-: 0,067 D : 0,075 StDev: 0, D+: 0,062 D-: 0,054 D : 0,062 N: 59 Approximate P-Value > 0.15 N: 59 Approximate P-Value > 0.15 Olgun yaprakta cep genisligi Yaprak sapi rengi,999,999,99,99,95,95 Probability,80,50,20 Probability,80,50,20,05,05,01,01,001, A13 A15 Average: 2,25424 Kolmogorov-Smirnov Normality Test Average: 2,18966 Kolmogorov-Smirnov Normality Test StDev: 0, D+: 0,084 D-: 0,085 D : 0,085 StDev: 0, D+: 0,081 D-: 0,080 D : 0,081 N: 59 Approximate P-Value > 0.15 N: 58 Approximate P-Value > 0.15 Yaprak sapi tüylülük durumu sürgün rengi,999,999,99,99,95,95 Probability,80,50,20 Probability,80,50,20,05,05,01,01,001, A16 A17 Average: 2,25424 Kolmogorov-Smirnov Normality Test Average: 2,35593 Kolmogorov-Smirnov Normality Test StDev: 0, D+: 0,044 D-: 0,069 D : 0,069 StDev: 0, D+: 0,085 D-: 0,088 D : 0,088 N: 59 Approximate P-Value > 0.15 N: 59 Approximate P-Value >

115 Çiçeklenme zamani Meyvenin olgunlasma zamani,999,999,99,99,95,95 Probability,80,50,20 Probability,80,50,20,05,05,01,01,001, ,5 17,5 18,5 19,5 20,5 21,5 22,5 23,5 B2 B4 Average: 2,42308 Kolmogorov-Smirnov Normality Test Average: 21,4429 Kolmogorov-Smirnov Normality Test StDev: 0, D+: 0,042 D-: 0,035 D : 0,042 StDev: 1,59580 D+: 0,099 D-: 0,201 D : 0,201 N: 52 Approximate P-Value > 0.15 N: 21 Approximate P-Value: 0,034 Tane sekli Tek tane agirligi,999,999,99,99,95,95 Probability,80,50,20 Probability,80,50,20,05,05,01,01,001,001 3,0 3,5 4, B6 B7 Average: 3,05556 Kolmogorov-Smirnov Normality Test Average: 3,235 Kolmogorov-Smirnov Normality Test StDev: 0, D+: 0,093 D-: 0,056 D : 0,093 StDev: 0, D+: 0,103 D-: 0,136 D : 0,136 N: 18 Approximate P-Value > 0.15 N: 20 Approximate P-Value > 0.15 Tane etinin yapisi Tane kabugunun yapisi,999,999,99,99,95,95 Probability,80,50,20 Probability,80,50,20,05,05,01,01,001, B8 B9 Average: 3,38889 Kolmogorov-Smirnov Normality Test Average: 3,94444 Kolmogorov-Smirnov Normality Test StDev: 0, D+: 0,102 D-: 0,109 D : 0,109 StDev: 0, D+: 0,055 D-: 0,069 D : 0,069 N: 18 Approximate P-Value > 0.15 N: 18 Approximate P-Value > 0.15 Salkim uzunlugu Salkim agirligi,999,999,99,99,95,95 Probability,80,50,20 Probability,80,50,20,05,05,01,01,001, ,0 2,5 3,0 B10 B11 Average: 2,125 Kolmogorov-Smirnov Normality Test Average: 2,375 Kolmogorov-Smirnov Normality Test StDev: 0,5 D+: 0,067 D-: 0,085 D : 0,085 StDev: 0,5 D+: 0,117 D-: 0,113 D : 0,117 N: 16 Approximate P-Value > 0.15 N: 16 Approximate P-Value > 0.15 Salkim sikligi Tane etinin sululugu,999,999,99,99,95,95 Probability,80,50,20 Probability,80,50,20,05,05,01,01,001, ,0 1,5 2,0 B12 B14 Average: 3,41176 Kolmogorov-Smirnov Normality Test Average: 1,70588 Kolmogorov-Smirnov Normality Test StDev: 0, D+: 0,065 D-: 0,074 D : 0,074 StDev: 0, D+: 0,110 D-: 0,117 D : 0,117 N: 17 Approximate P-Value > 0.15 N: 17 Approximate P-Value >

116 Salkim sekli Tanede aroma,999,999,99,99,95,95 Probability,80,50,20 Probability,80,50,20,05,05,01,01,001, B15 B17 Average: 2,58333 Kolmogorov-Smirnov Normality Test Average: 1,76471 Kolmogorov-Smirnov Normality Test StDev: 1,24011 D+: 0,107 D-: 0,132 D : 0,132 StDev: 0, D+: 0,095 D-: 0,091 D : 0,095 N: 12 Approximate P-Value > 0.15 N: 17 Approximate P-Value > 0.15 Tane seklinin birörnekligi Küllemeye dayanim,999,999,99,99,95,95 Probability,80,50,20 Probability,80,50,20,05,05,01,01,001,001 1,0 1,5 2, B18 C1 Average: 1,53333 Kolmogorov-Smirnov Normality Test Average: 6,53966 Kolmogorov-Smirnov Normality Test StDev: 0, D+: 0,116 D-: 0,117 D : 0,117 StDev: 2,87078 D+: 0,081 D-: 0,212 D : 0,212 N: 15 Approximate P-Value > 0.15 N: 58 Approximate P-Value < 0.01 Kursuni küfe dayanim Mildiyöye dayanim,999,99,999,95,99 Probability,80,50,20 Probability,95,80,50,20,05,05,01,01,001, C2 C3 Average: 1,46 Kolmogorov-Smirnov Normality Test Average: 0, Kolmogorov-Smirnov Normality Test StDev: 1,07305 D+: 0,147 D-: 0,061 D : 0,147 StDev: 0, D+: 0,151 D-: 0,092 D : 0,151 N: 50 Approximate P-Value < 0.01 N: 59 Approximate P-Value <

117 EK 4. Italia, Mercan ve Italia x Mercan F 1 lerine ait DNA ların saflık ve miktar değerleri Genotip DNA Miktarı (ng/ul) DNA saflığı (260/280) Italia 1824,41 1,87 Mercan 1378,06 1,89 F1 1134,47 1,86 F4 1289,36 1,92 F7 1469,24 1,9 F11 945,72 1,84 F ,04 1,87 F ,34 1,89 F47 19,41 1,83 F ,82 1,87 F71 950,3 1,79 F ,8 1,88 F ,44 1,93 F ,77 1,81 F ,56 1,84 F ,81 1,9 F ,94 1,9 F ,24 1,9 F ,81 1,91 F ,84 1,86 F ,71 1,85 F ,91 1,87 F ,69 1,99 F ,21 1,88 F ,49 1,91 F ,82 1,9 F ,49 1,86 F ,28 1,88 F ,58 1,9 F ,95 1,47 F ,53 1,89 108

118 F ,12 1,87 F ,32 1,87 F ,62 1,89 F ,34 0,99 F ,25 1,74 F ,36 2,19 F ,55 1,88 F ,33 1,81 F ,81 1,84 F ,15 1,92 F ,65 1,23 F ,99 1,9 F ,74 1,64 F ,59 1,86 F ,64 1,83 F ,51 1,85 F ,42 1,84 F ,65 2,77 F ,44 1,99 F ,94 1,89 F ,84 1,9 F ,4 1,91 F ,36 1,89 F ,52 1,86 F ,55 1,87 F ,81 1,9 F ,7 1,89 F ,87 F ,3 1,94 F ,99 1,91 F ,77 1,88 109

119 EK 5. Bazı primerlere ait PCR bant desenleri OPI-1 primerine ait DNA bant desenleri (I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ) OPN-13 primerine ait DNA desenleri (I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ) 110

120 OPI- 4 primerine ait DNA desenleri (I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ) OPB-11 primerine ait DNA desenleri (I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , L- DNA Ladder) 111

121 OPB-20 primerine ait DNA desenleri (I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ) OPC-5 primerine ait DNA desenleri (I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ) 112

122 OPC-9 primerine ait DNA desenleri (I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ) OPC-15 primerine ait DNA desenleri (I-Italia, M-mercan, 1-1, 2-4, 3-7, 4-11, 5-19, 6-46, 7-47, 8-69, 9-71, 10-78, 11-84, 12-89, 13-97, 14-98, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ) 113