TÜRKĐYE DE Y KROMOZOMUNA ÖZGÜ 12 STR LOKUSU POLĐMORFĐZMĐ ĐNCELENMESĐ VE HAPLOTĐP SIKLIĞININ BELĐRLENMESĐ

Transkript

1 TÜRKĐYE CÜMHURĐYETĐ ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ TÜRKĐYE DE Y KROMOZOMUNA ÖZGÜ 12 STR LOKUSU POLĐMORFĐZMĐ ĐNCELENMESĐ VE HAPLOTĐP SIKLIĞININ BELĐRLENMESĐ Aydın RUSTAMOV TIBBĐ BĐYOLOJĐ ANABĐLĐM DALI DOKTORA TEZĐ DANIŞMAN Prof.Dr. Işık BÖKESOY 2006-ANKARA

2 TÜRKĐYE CÜMHURĐYETĐ ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ TÜRKĐYE DE Y KROMOZOMUNA ÖZGÜ 12 STR LOKUSU POLĐMORFĐZMĐ ĐNCELENMESĐ VE HAPLOTĐP SIKLIĞININ BELĐRLENMESĐ Aydın RUSTAMOV TIBBĐ BĐYOLOJĐ ANABĐLĐM DALI DOKTORA TEZĐ DANIŞMAN Prof.Dr. Işık BÖKESOY Bu tez, Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Müdürlüğü tarafından HDP proje numarası ile desteklenmiştir ANKARA

3 HAKKINI HĐÇBĐR ZAMAN ÖDEYEMEYECEĞĐM BABAM RÜSTEM RÜSTEMOV UN AZĐZ HATIRASINA...!

4 Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Biyoloji Doktora Programı Çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma, aşağıdaki jüri tarafmdan Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir. Tez savunma Tarihi : 25/07/2006 Prof. Dr. Şükriye AYTER Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Jüri Başkanı Prof. Dr. Işık BÖKESOY Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Raportör Prof. Dr. Asuman SUNGUROĞLU Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Prof. Dr. Çigdem GÜNGÖR Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi. Dr. Şefik GÜRAN Gülhane Askeri Tıp Akademisi

5 ĐÇĐNDEKĐLER KABUL ve ONAY... 4 ĐÇĐNDEKĐLER... 5 ÖNSÖZ... 7 KISALTMALAR... 8 ŞEKĐL ve GRAFĐKLER ÇĐZELGELER GĐRĐŞ Polimorfizm Mikrosatellitler Y Kromozomu ve Mikrosatellit Polimorfizmi GEREÇ VE YÖNTEM Đncelenen lokuslar DYS DYS385a/b DYS DYS389I/II DYS DYS DYS DYS YCAII Çalışma Grubu DNA Đzolasyonu ve Kantitasyonu Polimeraz Zincir Reaksiyonu Alel Polimorfizminin Yüksek Voltaj Poliakrilamid Jel Elektroforeziyle Tayini Đstatistiksel Değerlendirme BULGULAR DYS

6 3.2 DYS385a/b DYS DYS389I DYS389II DYS DYS DYS DYS YCAII TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERĐLER. 62 ÖZET. 65 SUMMARY KAYNAKLAR EK ÖZGEÇMĐŞ

7 ÖNSÖZ Bu tez çalışması sırasında değerli fikirlerinden yararlandığım ve her konuda desteğini gördüğüm Danışmanım Sayın Prof. Dr. Işık BÖKESOY a teşekkür ederim. Çalışmaların yapılabilmesi için laboratuar olanakları ve diğer tüm konularda yardımlarını esirgemeyen Tıbbi Biyoloji Bölüm Başkanı Sayın Prof. Dr. Asuman SUNGUROĞLU na, değerli fikirleri ve katkılarından dolayı Sayın Prof.Dr. Ahmet KADIKIRAN a, örnek toplanması sırasında Serpil Akdağ Kan Merkezi nin olanaklarından yararlanmama olanak sağlayan Sayın Prof.Dr. Sabri KEMAHLI ve Sayın Dr. N. Nuri SOLAZ a teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca tüm tez süresince hiçbir yardımlarını esirgemeyen Sayın Öğr. Gör. Dr. Halil Gürhan KARABULUT, Sayın Arş. Gör. Bio. Güvem GÜMÜŞ AKAY, Sayın Aynur KARADAĞ, Sayın Sibel ARAT a, Tıbbi Biyoloji ve Tıbbi Genetik Anabilim Dalları tüm akademik ve idari personeline teşekkürlerimi bir borç bilirim. 7

8 KISALTMALAR AgNO3: bç: BSA: datp: dctp: dgtp: dttp: dh2o: ddh2o: DNA: dntp: EDTA: HCl: KCl: KHCO3: MgCl2: mtdna: MVR-PCR: NaCl: Na2CO3: Na2S2O3: NH4Cl: Gümüş nitrat Baz çifti Bovine serum albumin Deoksiadenozin trifosfat Deokisitidin trifosfat Deoksiguanozin trifosfat Deoksitimidin trifosfat Distile su Deiyonize distile su Deoksiribonükleik asit Deoksinükleotit trifosfat Etilen diamin tetra asetik asit Hidroklorik asit Potasyum klorür Potasyum bikarbonat Magnezyum klorür Mitokondrial DNA Minisatellit variant repeat PCR Sodyum klorür Sodyum karbonat Sodyum tiosülfat Amonyum klorür p: Kromozom kısa kolu 8

9 PAGE: Elektroforezi) PAR: PCR: PFGE: Polyacrilamide Gel Electrophoresis (Poliakrilamid Jel Pseudoautosomal region (Pseudootozomal bölge) Polimerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) Pulse filed gel electrophoresis RFLP: Restriction fragment length polymorphism (Restriksiyon fragman uzunluk polimorfizmi) rpm: Revolutions per minute q: Kromozom uzun kolu SDS: SSLP: STR: Tel: UV: Y-STR: Sodyum dodesil sülfat (Sodyum lauril sülfat) Simple sequense length polymorphism Short tandem repeat Telomer Ultraviyole Y kromozomuna özgü STR 9

10 ŞEKĐL ve GRAFĐKLER Şekil 1.1. X vey kromozomlarının karşılaştırılması... 5 Şekil 1.2 Bilinen bazı Y-STR lokuslarının Y kromozomu üzerindeki yerleşimleri... 7 Şekil örneğe ait PCR ürününün jeldeki görüntüsü Grafik 3.2. DYS19 alellerinin polimorfik sıklıkları Grafik 3.3. DYS385 alellerinin polimorfik sıklıkları Grafik 3.4. DYS388 alellerinin polimorfik sıklıkları Grafik 3.5. DYS389I alellerinin polimorfik sıklıkları Grafik 3.6. DYS389II alellerinin polimorfik sıklıkları Grafik 3.7. DYS390 alellerinin polimorfik sıklıkları Grafik 3.8. DYS391 alellerinin polimorfik sıklıkları Grafik 3.9. DYS392 alellerinin polimorfik sıklıkları Grafik 3.10 Grafik3.11 DYS393 alellerinin polimorfik sıklıkları 33 YCAII alellerinin plimorfik ıklıkları

11 ÇĐZELGELER Çizelge 1.1. Y polimorfizm örnekleri... 8 Çizelde 2.1. DYS19 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması Çizelge 2.2. DYS385a/b lokusu alellerinin genel sınıflandırılması Çizelge 2.3. DYS388 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması Çizelge 2.4. DYS389I lokusu alellerinin genel sınıflandırılması Çizelge 2.5. DYS389II lokusu alellerinin genel sınıflandırılması Çizelge 2.6. DYS390 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması Çizelge 2.7. DYS391 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması Çizelge 2.8. DYS392 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması Çizelge 2.9. DYS393 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması Çizelge YCAII lokusu alellerinin genel sınıflandırılması...18 Çizelge Bilinen 8 STR lokusunun primer dizinleri Çizelge 3.1. DYS19 alellerinin polimorfik sıklıkları...25 Çizelge 3.2. DYS385a/b alellerinin polimorfik sıklıkları.. 26 Çizelge 3.3. DYS388 alellerinin polimorfik sıklıkları Çizelge 3.4. DYS389I alellerinin polimorfik sıklıkları Çizelge 3.5. DYS389II alellerinin polimorfik sıklıkları Çizelge 3.6. DYS390 alellerinin polimorfik sıklıkları Çizelge 3.7. DYS391 alellerinin polimorfik sıklıkları Çizelge 3.8. DYS392 alellerinin polimorfik sıklıkları Çizelge 3.9. DYS393 alellerinin polimorfik sıklıkları Çizelge YCAIIa/b alellerinin polimorfik sıklıkları. 34 Çizelge Đncelenen 12 Y-STR lokusu için gözlenen haplotipler

12 Çizelge YCC nin önerdiği ve 11 Y-STR lokusunun oluşturduğu Genişletilmiş haplotiplere göre elde edilen sonuçlar.38 Çizelge YCC nin önerdiği ve 9 Y-STR lokusunun oluşturduğu Minimal haplotiplere göre elde edilen sonuçlar.42 Çizelge 4.1. Çalışma kapsamındaki lokusların özgün ayırma güçleri (Gene diversity)...47 Çizelge 4.2. Elde edilen haplotiplerin özgün ayırma güçleri (Gene diversity) ve lokus başına düşen ortalama ayırma güçleri

13 1. GĐRĐŞ 1.1. POLĐMORFĐZM Đnsanlar her zaman kökenleri hakkında bilgi sahibi olmak istemişlerdir. Geçmişten günümüze tarihçiler, arkeologlar ve paleontologlar günümüz insan populasyolarının kökeni hakkında yapmış oldukları araştırmalar sonucu çeşitli kanıtlar elde etmişlerdir. Daha sonra dilbilimciler ve günümüzde de gelişen teknolojik gelişmelerle birlikte moleküler biyologlar giderek artan bir şekilde insanın kökeni ile ilgilenmeye başlamışlardır. Bunun nedeni sahip olduğumuz DNAların bize atalarımızdan geçmesi, başlangıçtan bu yana mutasyonların birikmesi ve sonuçta günümüz insanlarının DNAları arasında farklılıkların saptanmasıdır. Bu farklılıklar, o insanın genetik geçmişinin tarihi ve akrabalıklarına ışık tutacak kayıtları içermektedir. Moleküler teknikler bu kayıtları değerlendirmeye olanak sağlamakta ve yol göstermektedir. Bu da insanların genetik farklılıklarının evriminin öğrenilmesine yönelik ilgide ve bu amaçla yapılan çalışmalarda hızlı artışa neden olmuştur (Jobling and Tyler-Smith,1995). Bir toplumun genetik yapısındaki varyasyonların (farklılıkların) varlığı ve birden fazlasının birlikteliği genetik polimorfizm olarak adlandırılır. Bir lokusun polimorfik olarak adlandırılması için toplum içinde o lokusla ilgili iki veya daha fazla alelin bulunması gerekmektedir. Çoklu (multipl) alellerdeki farklılıklar alel kopyaları düzeyindeki genetik polimorfizmin örnekleri olarak tanımlanır. Polimorfizmin ortaya çıkabilmesi için genomun belli bölgesindeki baz çiftleri dizinindeki varyasyonların olması, bu değişikliklerin o populasyonda kalıcı olması ve sıklığının %1'den fazla olması gerekmektedir (Dib,1996). Genomdaki değişiklikler yapısal gen bölgesinde olabileceği gibi yapısal olmayan bölgelerde de yer alabilmektedirler. Yapısal gen bölgesinde olabilecek değişiklikler gen ürününün işlevsel bozukluğuna neden olursa, bu değişiklikleri taşıyan bireylerin toplumdan ayıklanması ile sonuçlanabilmektedir. Dolayısıyla, yapısal gen bölgelerinde gözlenen polimorfizm genellikle populasyonda bir süreç içinde meydana gelen değişiklikleri tam olarak yansıtmayacağından filogenetik çalışmalarda yeterince informatif (bilgilendirici) değildir. Buna karşılık, yapısal olmayan bölgelerdeki polimorfik değişiklikler çoğunlukla ayıklanmaya neden 13

14 olmayacağından (nötral etkili) populasyon içinde korunarak varlıklarını sürdürebilmektedirler. Bu nedenle yapısal olmayan bölgelerdeki polimorfizm populasyonlardaki bireylere yansıyacağından izlem ve değerlendirilmesi daha kolay ve bilgilendirici olacaktır. Bu nedenlerden dolayı yapısal olmayan ve yüksek düzeyde polimorfizm gösteren DNA bölgelerinden biri olan mikrosatellit bölgeleri özel bir öneme sahiptirler (Perez-Lezaun et al.1997,a; Roewer et al.1996) MĐKROSATELLĐTLER Yapısal olmayan DNA bölgelerinde, özellikle farklı uzunluklarda nükleotid dizilerinin değişik sayıda, ard arda tekrarlanmasıyla oluşan ve satellit olarak adlandırılan diziler polimorfizm açısından açıdan çok büyük önem taşımaktadır. Çünkü satellitler tüm kromozomlarda bulunmakta ve yüksek düzeyde polimorfizm göstermektedirler. Satellitler, tekrar biriminin uzunluğuna bağlı olarak uzun tekrarlar (makrosatellitler), kısa tekrarlar (minisatellitler) ve çok kısa tekrarlar (mikrosatellitler) olmak üzere üç gruba ayrılırlar. Bu bölgelerden biri olan mikrosatellit bölgeler, tekrar biriminin daha kısa olması nedeniyle daha fazla polimorfizm içermeleri bakımından özel bir önem taşımaktadırlar. Zira tekrar birimi daha kısa olan bölgelerde, satellit lokusları için temelde etken mutasyon mekanizması olan replikasyon kayması (Replication Slippage) diğer lokuslara nazaran daha fazla meydana gelmektedir (Perez-Lezaun et al.1997,a; Roewer et al.1996). Mikrosatellitler, 2-6 baz çifti(bç) uzunluğundaki tipik kısa dizinlerin ardarda tekrarlanmasından oluşurlar (Short Tandem Repeats-STRs). Mikrosatellit lokuslarındaki tekrar sayısındaki değişiklikler sonucu oluşan uzunluk farklılıklarının sıklıkla gözlendiği bilinmektedir. Yapısal olmayan polimorfik bölgelere ait alellerin mutasyonları biriktirebilme özellikleri evrilme hızının hesaplanması ve gen göçünün izlemi için daha tutarlı bilgi oluşturacağından STR gibi bölgeler filogenetik çalışmalarda ve insan yayılım modellerinin oluşturulmasında bilgi kaynağı olarak tercih edilirler (Gomolka et al.1994). 14

15 Mikrosatellitlerin incelenmesi genellikle populasyon genetiği (Perez-Lezaun et al.1997,a; Perez-Lezaun et al.1997,c; Zerjal et al.1997; Roewer et al.1996) ve adli tıpta (Jobling et al.1997; Kayser et al. 1997; de Knijff et al.1997) kullanılmak amacıyla yapılmıştır. Genetik haritalamada marker (belirteç) olarak da kullanılan bu bölgelerin araştırılması, farklı bölgelerde yaşayan insanlar arasındaki farklılıkların (Perez-Lezaun et al.1997,a; Perez-Lezaun et al.1997,b; Perez-Lezaun et al.1997,c; Gomolka et al.1994; Müller et al.1994; Kayser et al.1997; de Knijff et al.1997; Brinkmann et al.1999; Zerjal et al.1997) ve oluşturdukları haplotiplerin belirlenmesine (Cagila et al.1997; Pestoni et al. 1998; Cooper et al.1996; Sasaki et al.1999; Horst et al. 1999; Csete et al.1999; Brinkmann et al.1999; Zerjal et al.1997) yönelik yapılmıştır Y KROMOZOMU VE MĐKROSATELLĐT POLĐMORFĐZMĐ Đnsan diploid bir canlıdır. Bu bakımdan alel çiftleri halinde bulunan lokuslara göre tek kopya halinde bulunan lokusların incelenmesi belirtilen amaca daha uygun olacaktır. Çünkü alel çiftleri söz konusu olduğunda olası yeniden düzenlenmeler (rekombinasyonlar) belirtilen yönde yapılacak karşılaştırmalarda dezavantaj oluşturarak sağlıklı bilgi edinmesini engelleyecektir. Bu nedenle tek kopya halinde bulunan alellerin amaca daha uygun olacağı açıktır. Đnsan genomu içerisinde tek kopya halinde sadece mitokondri DNA sı (mtdna) ve Y kromozomunun non-homolog (eşlik göstermeyen) bölgesi bulunmaktadır (Zhivotovsky et.al.2003). X kromozomu ve otozomal kromozomlar nesilden nesile aktarıldıklarında rekombinasyona uğrayabilirler ve bu bakımdan direkt olarak ebeveynleri yansıtmazlar. Ancak Y kromozomu sadece babasal ataya, mitokondri DNAsı ise genellikle sadece anasal ataya sahiptir. Bu iki tip kromozom genellikle mayoz sırasında rekombinasyona uğramaz ve bilgi olduğu gibi aktarılır. Bunlardan Y kromozomunun çok küçük bir kısmını teşkil eden psödootozomal bölgesi (Pseudoautosomal Region-PAR) bunun dışında kalmaktadır. Bu küçük bölge dışındaki Y kromozomu Y ye özgün ve çoğunlukla yapısal dizileri içerir (Cooper et al.1996; Jobling and Tyler-Smith,1995). 15

16 Mitokondri genomu nükleer genoma nazaran çok daha küçüktür ve deneysel çalışma yapılabilmesi daha kolaydır. Ayrıca memelilerde mitokondri genomunun yüksek düzeyde mutasyon riskine sahip olması organellerin evrimine ilgiyi artırmaktadır. Đnsan mitokondrisi, baz çifti uzunlukta halkasal DNA ya (mtdna) sahiptir. mtdna dizisinin büyük bir kısmı yapısal genleri içerir. Aralarda az miktarda kodlanmayan(ori) DNA dizileri de bulunmaktadır. Mitokondri DNA sı, çekirdek DNA sına göre 10 kat daha fazla nokta mutasyonları içermektedir. Bunun nedeni mitokondri DNA Polimeraz enziminin (Polimeraz γ) nükleer DNA Polimeraz enzimine (Polimeraz α) nazaran daha fazla sentez hatası yapması, tamir mekanizmasının olmaması ve organelin fonksiyonu sonucu mitokondri içinde oluşan değişik O - radikalleri gibi mutajenlerin etkisine maruz kalmasıdır. Mitokondri DNAsının yapısının basitliği onun detaylı şekilde öğrenilmesine neden olmuştur. Çünkü mtdnayı teknik olarak incelemek daha kolaydır. Zira uzunluğu daha kısa olup, intron içermemektedir. Đnsan Y kromozomunun, Y nin farklılaşmış bölgesinde bulunan 20 Y-spesifik gen dahil birkaç yüz gen içerdiği düşünülmektedir. Y kromozomunun büyük bir bölümü fonksiyonel olmayan tekrer dizileri ve pseudogenlerden oluşmuştur. Evrimsel olarak X ve Y kromozomları yaklaşık milyon yıl önce, memelilerin kuşlardan ayrımı sırasında farklılaşmaya başlamıştır. Zamanla, uçlarda yer alan ve X kromozomu ile holmoloji gösteren PAR bölgeleri hariç, erkek cinsiyetiyle ilgili genlerin dışındaki dizilerin birçoğunu kaybetmiştir (Şekil 1.1) (Delbridge and Marshall Graves, 1999; Bökesoy I, 2000). Y kromozomu, testislerin erken embriyogenezde gelişiminden sorumlu genleri içerir. Y kromozomu erkeklere özgüdür ve tek kopya halinde bulunduğundan, sahip olduğu non-homolog bölgedeki haplotip değişmeden bir sonraki nesile: babadan oğula holandrik olarak kalıtılır (Cooper et al.1996; Jobling and Tyler-Smith,1995). Bu bakımdan Y kromozomunun incelenmesiyle değişik polimorfizmlerin (RFLP, Alu, SSLP vb) saptama ve karşılaştırmalı olarak değerlendirilmesi yapılabilmektedir. Elde edilen bilgiler, filogenetik çalışmalarda, genetik haritalama ve adli tıp çalışmalarında kullanıldığı gibi gen göçünün takibi amacıyla da başarıyla kullanılabileceği bilinmektedir (Jakubiczka et al.1989; Cooper et al.1996; Roewer et al.1992; Roewer et al.1996; Hammer and Horai,1995; Muller et al.1994). 16

17 Şekil 1.1. X ve Y kromozomlarının genel karşılaştırlması yıl önce insan Y kromozomu polimorfik içerikten yoksun bilinirdi. Ancak son yıllarda gösterilmiş polimorfik varyasyonlar; tek baz değişimleri, insersiyon/delesyonlar ve mikrosatellitler bu görüşü değiştirmiştir. Günümüzde Y 17

18 kromozom polimorfizmi varyasyon içeriği bakımından insan evrimi modellerinin yeniden oluşturulmasında tek başına bir kanıt oluşturma özelliği taşımaktadır. Bu nedenle önemli bir genetik kanıt olarak nükleotit değişimleri ve Alu insersiyonları, insan populasyonları oluşumlarının erken aşamalarının adreslerinin gösterilmesinde idealdir. Bununla beraber, mikrosatellitler daha az stabil olduklarından, mevcut alel havuzuna göre geriye doğru eski mutasyonel olayları belirlemenin zorluğu da bilinmektedir. Bununla birlikte, atasal kalıtım ve yüksek düzeyde erkek-bağımlı genetik açılımın meydana çıkması, otozomal haplotip kombinasyonuna nazaran Y- STR polimorfizmin avantajını öne çıkarmaktadır. Bundan dolayı, sınırlı sayıda ve erkeğe özgü STR lokusları, populasyonlar arası farklılıkları aynı sayıda otozomal lokuslara nazaran daha iyi gösterilebilmektedir. Sonuç olarak, Y-spesifik lokuslar yüksek mutasyon sıklığıyla mikroevrimsel olayların yeniden sınıflandırılmasına olanak sağlamaktadır (Cagila et al,1997). Y kromozomu, insan evriminde erkek soyağacının çıkarılmasında, kadın ve erkek DNA larının karıştığı olaylarda ve babalık tayininde adli tıpta kullanılmaktadır. Babadan oğula aktarım sırasında Y kromozomu rekombinasyona uğramadığından (NRY bölgesi- nonrecombining Y) buradaki polimorfik belirteçler (markerler) kromozomal ayrımda kullanılmaktadır. Son yıllarda NRY de 250 polimorfik lokus tanımlanmıştır. Bu polimorfik bölgeler üç grupta sınıflandırılmaktadır (de Knijff, 2000; YCC, 2001): 1) Düşük mutasyonlu bialelik belirteçler (markerler). Bunlar insan evriminde ender mutasyon olaylarıyla (UMEs- unique mutation events) tanımlanan tek baz değişiklikleri (SNP- single nucleotide polymophism), Alu insersiyon/delesyon polimorfizmleri veya LINE insersiyon polimorfizmleridir. 2) Mikrosatellitler veya ardışık tekrar dizileri (STR). Bazı STR lokuslarının Y kromozomu üzerindeki dağılımı Şekil 1 de gösterilmiştir. Bunların mutasyon hızının jenerasyon başına % 0,2x ,3x10-3 arasında değiştiği çalışmalarla gösterilmiştir. 3) Yüksek değişkenlik gösteren lokuslar. Bu lokuslar çok yüksek mutasyon hızına sahiptirler. Örneğin, MSY1 minisatellit lokusunun mutasyon hızı jenerasyon başına %6-11 arasında bulunmuştur. Bunların içinde STR ler çalışma kolaylığı, mutasyon sıklığının çok fazla olmaması (baba-oğul aktarımında aleldeki olabilecek değişiklik güvenilirliği azaltır) ve 18

19 güvenilirliğin göreceli yüksek düzeyde tutabilecek kadar polimorfik olması bakımından üzerinde en çok çalışılan lokuslardır. Mutasyon hızı bazı lokuslara göre (minisatellit veya otozomal lokuslar) düşük olsa da, tekrar dizileri içermelerine bağlı olarak mutasyon hızı diğer bölgelerden göreceli olarak daha yüksek kabul edilir (Dupuy et.al.2004; Gill et. al.2001). Y KROMOZOMU ÜZERĐNDEKĐ Y-STR lerin YERLEŞĐMLERĐ Şekil 1.2 Bilinen bazı Y-STR lokuslarının Y kromozomu üzerindeki yerleşimleri Farklı Y kromozomlarında UME temelinde gözlenen farklılıklar haplogrup, STR lerde gözlenen farklılıklar haplotip, UME ve STR lerin kombinasyonu ile değerlendirilen Y kromozomları ise soyağacı (lineages) olarak tanımlanmaktadır (de Knijff, 2000). Son yıllarda Y kromozomunun NRY bölgesi ile ilgili verilerdeki artış, gösterilmiş birçok polimorfik lokusun bu bölgede yer almasındandır. Bu da insan populasyonunun erkek soyağacının evrimi ile ilgili araştırmalara yönelimi arttırmıştır. Elde edilen bilgiler son yıllarda adli tıp, soyağacının oluşturulması, tıbbi genetik ve insan evrimi araştırılmalarında daha sık kullanılmaya başlanmıştır. 19

20 Dünyadaki Y kromozomu ile ilgili çalışmaların bir merkezde toplanması ve uygun sınıflandırma yapılabilmesi amacıyla 1995 yılında Y Kromozomu Konsorsiyum u- YCC kurulmuştur (Jobling and Tyler-Smith,1995). Bu Konsorsiyum, insan Y kromozomundaki genetik varyasyonları belirlemeye yönelik çalışmalar yapmaktadır. Konsorsiyum, amaçlarını aşağıdaki üç madde ile sıralamıştır: 1. Bir bölgeye özgü kişilerden elde edilen periferik kandan DNA izole etmek, 2. Kandan izole edilmiş DNA örneklerinde Y kromozomu polimorfizmini araştırmak. 3. Elde edilen sonuçlarla Y-spesifik polimorfik bölgeler için bir bilgi bankası oluşturmak (Jobling and Tyler-Smith,1995). Bu Konsorsiyum un araştırmaları sonucu Y kromozomuna spesifik bazı polimorfizm örnekleri Çizelge1.1. de sunulmuştur: Tip Baz değişimleri Duplikasyon ve delesyonlar Bulunuşu ve karakteristiği Çizelge 1.1. Y polimorfizm örnekleri RFLP araştırmaları, sadece tek enzimli kesimleme; sekanslama(dizi analizi) Fragman boyutlarında, değişimler birden fazla enzimle kesimleme Đnsersiyon Fragman boyutlarında, değişimler birden fazla enzimle kesimleme; sekanslama(dizi analizi) Ardışık tekrar dizinler Uzun tekrarlar (makrosatellitler) Kısa tekrarlar (minisatellitler) Çok kısa tekrarlar (mikrosatellitler) Geniş çok değişken (hypervariable) dizinler, bazıları polimorfik restriksiyon kesimleme dizinleri içerir bç uzunluğunda çok değişken (hypervariable) tekrar dizinleri 2-5 bç uzunluğunda tekrar dizinleri içerir ve uzunluk farklılıkları gösterir Örnekler 47z(DXYS5Y)/StuI 92R7/HindIII sy81(dys271)/nlaiii (A G transisyon) 12f2(DYS11)/TaqI veya EcoRI 50f2(DYS7/C)/EcoRI YAP(DYS287)/TaqI veya EcoRV YαI (DYZ3)/BglII MYS1 (DYF1555S1) 27H39LR (DYS19) Bulunma yöntemi Filtre hibridizasyonu, PCR-RFLP Filtre hibridizasyonu, PCR Filtre hibridizasyonu, PCR uzunluk polimorfizmi PFGEden sonar Filtre hibridizasyonu MVR-PCR PCR PFGE - pulse-filed gel electrophoresis, RFLP - restriction fragment length polymorphism, MVR-PCR minisatellite variant repeat PCR 20

21 YCC nin elde ettiği veriler Y-STR Haplotip Referans Veritabanı (YHRD-Y-STR Hapolotype Reference Database) içinde toplanmıştır ( Bu Konsorsiyumun önerdiği ve en iyi sonuç alınan 9 lokusun oluşturduğu haplotip (DYS19, DYS385a/b, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392 ve DYS393) minimal haplotip olarak tanımlanmıştır. Tanımlanan ve önerilen diğer bir haplotip ise genişletilmiş (expanded) haplotip olarak adlandırılmıştır. Bu haplotip, minimal haplotip lokuslarına ilaveten YCAIIa/b lokusları eklenmiş 11 lokusun oluşturduğu haplotiptir. Y kromozomu ile ilgili özellikle 90 ların ikinci yarısından sonra birçok çalışma yapılmıştır. Değişik ülke, halk, topluluk veya coğrafik bölgelerle ilgili çok sayıda çalışma literatürde yayınlanmıştır. Yapılan çalışmalar tek lokusla ilgili olduğu gibi birden fazla lokusla da ilgili olabilmektedir. Yapılan çalışmalarla alelik polimorfizmler, buna bağlı olarak haplotipik polimorfik dağılımlar ve bu lokusların mutasyon sıklıkları belirlenmeye çalışılmıştır, toplumlararası bağlantı ve akrabalık dereceleri, insan evimi ve göç yolları araştırılmıştır (Alves C et al, 2003; Dupuy B M et al,2004; Gilla P et al, 2001; Gusmao L et al, 2003; Jin H-J et al, 2003; Kayser M et al, 2003; Zhivotovsky L A et al, 2003). Özetleyecek olursak, Y kromozomu polimorfizminin incelenmesi özellikle aşağıdaki dört konu bakımından önem kazanmaktadır: 1. Đnsan evrimi ve insan evriminin genel çıkış noktası 2. Adli tıp 3. Babalık tayinleri ( erkek çocuklar için ) 4. Göç Yolları Y kromozomu adli tıpta ve babalık tayininde kullanılabilen spesifik potansiyel özelliklere sahiptir. Örneğin, şiddet olaylarının çoğunluğunun erkekler tarafından gerçekleştirildiği belirtilmektedir; yapılan araştırmalara göre Đngiltere de kişilere karşı şiddet olaylarının %93 nün, cinsel suçların %99 nun erkekler tarafından gerçekleştirildiği gösterilmiştir. Bu bakımdan suçluların bulunmasında Y spesifik işaret genlerin (belirteçlerin/markerlerin) geliştirilmesi daha pratik fayda sağlamaktadır. Özellikle saldırganın erkek, kurbanın kadın olması durumlarında; örneğin, çoklu tecavüz olaylarının aydınlatılmasında, karışık DNA örneklerinde Y kromozomunun incelenmesi bilgilendirici olmaktadır. Ayrıca erkek çocukların 21

22 babalık davalarında baba ve çocuğa ait Y kromozomlarının uygun polimorfik alellerin analizi, sonucun netleştirilmesi bakımından önemlidir (Jobling et al ). Türkiye toplumu ele alındığında, henüz tam anlamıyla Y-STR lokusları ile ilgili dağılımı ve sıklığı gösterecek, buna bağlı olarak da haplotip verilerini oluşturacak çalışma olmadığı gözlenmektedir. Özellikle Y Kromozomu Konsorsiyumunun önerdiği mnimal ve genişletilmiş haplotipleri oluşturacak tüm lokusları içeren çalışma yapılmamıştır. Literatür taraması yaptığımız zaman son yıllarda Türkiye ile ilgisi olan dört çalışma özellikle öne çıkmaktadır; Nasidze I. et al (2003), Aşicioglu F. et al(2003), Cinnioğlu C. et al(2004) ve Rustamov A. et al(2004). Bu yayınların yanı sıra, Henke J ve arkadaşları tarafından Almanya da yaşayan 281 Türkü kapsayan, dokuz Y-STR lokusunu içeren başka bir araştırma da yürtülmüştür (Henke et al., 2001). Đlk yayında Türkiye den 39 kişi ile ilgili 9 Y-STR lokusu (minimal haplotip) çalışılmıştır. Max Plank Enstitüsünden (Almanya) üç araştırmacı tarafından, Kafkaslar, Đran ve Türkiye yi içine alan bu çalışmada, Türkiye ile ilgili DNA ların Ankara bölgesinden toplandığı bildirilmiştir. Bu çalışma yerel oluşu ve örnek sayısının azlığı nedeniyle Türkiye genelini göstermekten uzaktır. Đkinci çalışma, Adliye Bakanlığı, Đstanbul Adli Tıp kurumu Başkanlığından dört araştırmacı tarafından yapılmıştır. Araştırmacılar Y-Plex 6 lı kit ile (DYS19, DYS385, DYS389II, DYS390, DYS391 ve DYS393) yasal babalık testi uygulanmış 200 erkek ile ilgili elde edilen verileri yayınlamışlardır. Bu çalışma YCC nin önerdiği Minimal ve Genişletilmiş haplotipi oluşturacak lokusların tamamını içermemektedir. Üçüncü çalışma diğerlerine nazaran daha geniş kapsamlı olup haplogrup çalışması ile bazı topluluklarla yakınlık dereceleri araştırılmıştır. Đstanbul Üniversitesi (Türkiye), Stanford Üniversitesi (ABD), Stanford Genom Teknoloji Merkezi (ABD), Tartu Üniversitesi (Estonya) ve Pavia Üniversitesinden (Đtalya) araştırmacıların gerçekleştirdiği bu çalışmada 523 erkekten elde edilmiş DNA larla dokuz Y-STR lokusu (DYS19, DYS388, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS439 ve DYSA7.2(DYS461)) ve 89 bialelik lokus incelenmiştir. Ancak bu çalışma da YCC nin önerdiği kriterlere cevap 22

23 vermemektedir. YCC nin önerdiği haplotipler içinde yer alan DYS385a/b ve YCAIIa/b lokusları bu çalışma kapsamında yer almamıştır. Dördüncü çalışma grubumuz tarafından, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Laboratuarında, Đç Anadolu populasyonundan rasgele seçilmiş, akraba olmayan ve en az üç nesil aynı bölgede yaşamış 59 kişi üzerinde 8 Y-STR (DYS19, DYS388, DYS 389I/II, DYS 390, DYS 391, DYS 392 ve DYS393) lokusu ile ilgili yapılmıştır. Çalışmamız sürecinde Türkiye ile ilgili herhangi bir çalışma raporu yoktu. Bu araştırma başlatılırken planlı bir çalışma düşünülmüş ve pilot bölge olarak Đç Anadolu seçilmişti. Sonuçlar alındıktan sonra araştırmanın genişletilip, tüm Türkiye geneli ile ilgili veriler elde edilmesi ve Türkiye Y-STR haplotip profilinin çıkarılması planlanmıştır (Rustamov A, 2001). Bu çalışmanın amacı başlatılan pilot çalışmanın geniş uygulamasıyla, Türkiye için Y-STR lokuslarının alel sıklıklarını ve ayırtedici lokusları belirlemek, buna bağlı olarak da sağlıklı haplotip profilinin çıkarılmasını sağlamaktır. Đlk çalışmadan bu yana dünyada elde edilen gelişmelerin ışığında yapılması planlanan çalışmada değişikliğe gidilmiş, minimal ve genişletilmiş haplotip verilerini oluşturmak için DYS385a/b ve YCAIIa/b lokusları çalışmaya dahil edilmiştir. Böylece, hem YCC nin oluşturduğu kriterlere uygun olarak Türkiye geneli için sağlıklı haplotip profili oluşturulacak, hem de diğer toplumlarla Türkiye toplumunun karşılaştırılmasının yapılabileceği uygun veriler elde edilecektir. Bu amaçla; Türkiye nin çeşitli bölgelerinden, belrili bazı kriterler göz önünde bulundurularak, rasgele seçilmiş 250 sağlıklı erkek birey üzerinde 12 Y-STR lokusunun (DYS 19, DYS 385a/b, DYS 388, DYS 389I/II, DYS 390, DYS 391, DYS 392, DYS 393 VE YCAIIa/b) alelik sıklıklarının belirlenmesi ve buna göre Türkiye için bu lokusların ayırtediciliğinin gösterilmesi planlandı. Ayrıca kişilerin haplotipleri çıkarılarak Türkiye için minimal ve genişletilmiş haplotip dağılımları belirlenmesi planlandı. 23

24 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. ĐNCELENEN LOKUSLAR Bu çalışmada Y-spesifik 12 STR lokusunun incelenmesi amaçlanmıştır. Bu lokuslar DYS19, DYS385a,DYS385b, DYS388, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, YCAIIa ve YCAIIb dir. Đncelenen lokuslardan ikisi (YCAIIa ve YCAIIb) dinükleotit tekrar, ikisi (DYS388 ve DYS392) trinükleotit tekrar, diğer sekizi (DYS19, DYS385a, DYS385b, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391 ve DYS393) tetranükleotit tekrar içermektedir DYS19: 5'..CTACTGAGTTTCTGTTATAGTGTTTTTTAATATATATATAGTATTATA TATATAGTGTTATATATATATAGTGTTTTAGATAGATAGATAGGTAGATAG ATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATAGTGACACTCTCCTT AACCCAGATGGACTC CTTGTCCTCACTACATGCCAT..3' Bu lokus gata tekrarları ile tanımlanmaktadır. Tekrar sayısı 10 ile 19 arasında, uzunluk ise tekrar sayısına paralel olarak bç arasında değişmektedir. Ancak en sık görülen aleller tekrar sayısı 13-17, uzunlukları bç arasında olan alellerdir. Tekrar birimi, tekrar sayısı değişmeyecek şekilde 5 ucuna doğru bir bç kayma ile agat, iki bç kayma ile taga şeklini almaktadır. Tekrarlar lokus içinde iki parçadan oluşmaktadır. Birinci parça 3 tekrar biriminden oluşmuştur. Đkinci parça ise lokusun uzunluğuna göre değişik sayıda tekrar birimi içermektedir. Yukarıda verilen 24

25 dizi örneği 13 tekrarlı (3+10) 186 bç uzunluğundaki alele aittir. Çizelge 2.1 de ise DYS 19 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması verilmektedir. Çizelge DYS19 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması DYS19 alelleri Uzunluk (bç) DYS385a/b 5..AGCATGGGTGACAGAGCTAGACACCATGCCAAACAACAACAAAGAA AAGAAATGAAATTCAGAAAGGAAGGAAGGAAGGAGAAAGAAAGTAAAA AAGAAAGAAAGAGAAAAAGAGAAAAAGAAAGAAAGAGAAGAAAGAGA AAGAGGAAAGAGAAAGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGGAAAGA AAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAGAAAAAGAAAGGA GGACTATGTAATTGG..3 Bu lokus Y kromozomu üzerinde duplike şekilde iki kopya halinde bunmaktadır. Bu yüzden iki farklı lokus olarak (DYS385a ve DYS385b) değerlendirilmektedirler. Kopyalar aynı genomik dizi içerdiklerinden kullanılan primerler her iki kopyaya da bağlanırlar ve PCR sonucunda otozomal STR lokuslarına benzer sonuç elde edilmektedir. DYS385 lokusu gaaa tetranükleotit tekrarları içermektedir. Yukarıda örnek olarak 10 tekrar içeren 254 bazlık dizi verilmiştir. Bu lokusun alellerinin genel sınıflandırılması Çizelge 2.1 de verilmektedir. Çizelge 2.2. DYS385 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması DYS385 alelleri Uzunluk DYS385 alelleri (devamı) Uzunluk (devamı)

26 DYS388: 5'..GTGAGTTAGCCGTTTAGCGATATATACATATTATGAAACATTATTATT ATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTTGAGACGGACT CTCGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGCGCAGTGGTTGCGATCTG..3' Bu lokus att üçlü tekrarı ile tanımlanmaktadır. Tekrar sayısı 11 ila 17 arasında değişmekte, uzunluk ise buna paralel olarak bç arasında değişmektedir. Yukarıda örnek olarak verilen dizi 17 tekrarlı 143 bç uzunluğundaki alele aittir. DYS388 STR lokusundaki alellerin genel sınıflandırılması Çizelge 2.2 de verilmektedir. Çizelge 2.3. DYS388 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması DYS388 alelleri Uzunluk (bç) DYS389(I/II): 5'..CCAACTCTCATCTGTATTATCTATGTGTGTGTCTGTCTGTCTGTCTGT CTGTCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATC ATTATACCTACTTCTGTATCCAACTCTCATCTGTATTATCTATGTATCTG TCTGTCTGTCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTAT CCCTCCCTCTATCAATCTATCTATTTATCTAGCAGTCCATCATCTATCTAT GACATTCTTCTGCTACTCAGGGATAATTGTGTTCCCAAGTAACACTTGGC AATGTCTGGAAACAATTTTGGCAGTTGCACTGGGATGGGTGTTCTCGCAT CTGGTGGGTGGAGATAAGA..3' Bu lokustaki STR alelleri dörtlü tekrarlar içerirler. Bu tekrar bölgeleri dört parçadan oluşmuştur. Birinci ve üçüncü parça tctg, ikinci ve dördüncü parça tcta tekrarlarından oluşmaktadır. Đkinci ve üçüncü tekrar parçası arasında, 5 ucu primer dizisinin benzeri dizi bulunmaktadır. Bundan dolayı DYS389 STR bölgesinin PCR ile çoğaltılması sonucu biri büyük (dört tekrar parçasını da içerir), diğeri küçük 26

27 (üçüncü ve dördüncü tekrar parçasını içerir) iki ürün elde edilir. Böyle bir özelliği nedeniyle DYS389 lokusu DYS389I (kısa ürün) ve DYS389II (uzun ürün) olmak üzere iki ayrı lokus olarak değerlendirilmektedir. Yukarıda örnek olarak verilen dizi 31 tekrarlı, 375 bç uzunluğundaki DYS389II aleli ve 14 tekrarlı 255 bç uzunluğundaki DYS389I alellerine aittir. Çizelge 2.3 ve 2.4 de bu lokusların genel sınıflandırılması verilmektedir. Çizelge 2.4. DYS389I lokusu alellerinin genel sınıflandırılması DYS389 I alelleri Uzunluk(bç) Çizelge 2.5. DYS389II lokusu alellerinin genel sınıflandırılması DYS389 II alelleri Uzunluk(bç) DYS390: 5'..TATATTTTACACATTTTTGGGCCCTGCATTTTGGTACCCCATAATATA TTCTATCTATCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTATCTATCT ATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTGTCTA TCTATCTATCTATCATCTATCTATCTTTCCTTGTTTCTGAGTATACACATTGC AATGTGTTCATTTTACTGTCA..3' DYS390, dörtlü tekrarlı Y-spesifik STR lokusu olup, tekrar birimleri heterojendir. Tekrar bölgesinde tcta ve tctg tekrar birimleri değişik sayıda sıralanmakta ve bölgenin sonunda tekrar birimleri tca-tcta-tcta veya tcat-ctat-ctat şekline dönüşmektedir (italik, altı çizgili). Ancak bu kısım tekrar bölgesi içinde kabul edilmez ve tekrar sayısı içinde yer almaz. Yukarıda örneği verilen DYS390 aleline ait dizi 27 tekrarlı ( ) ve 227 bç uzunluğundadır. Çizelge 2.5 de lokusun tüm alellerinin genel sınıflandırılması verilmektedir. 27

28 Çizelge 2.6. DYS390 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması DYS390 alelleri Uzunluk(bç) DYS391: 5'..CTATTCATTCAATCATACACCCATATCTGTCTGTCTGTCTATCTATCTA TCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTGCCTATCTGCCTGCCTACCTATCCC TCTATGGCAATTGCTTGCAACCAGGGAGATTTTATTCCCAGGAGATATTT GGCTATGTGTGACAACAATTTTTTTGGTTGTCACAAATGGGATGAATGTT ACTGGCATCTGGTGGGTGGAGCCCAGAGATGCTGCTCAACACCCTACAGT GCACAAGACAGACCCACCACAAAGAATC..3' Bu lokustaki tekrar bölgesi tctg-tcta-tctg tekrar yapısı içermektedir. Bu yapıdaki tctg blokları değişken olmadıklarından tekrar sayısında dikkate alınmazlar. Bu iki tekrar bloku arasındaki tcta değişken tekrar bölgesi dikkate alınmaktadır. Yukarıda verilen dizi örneği 9 tekrarlı 279 bç uzunluğundaki DYS391 aleline aittir. Çizelge 2.6 da toplu şekilde DYS391 alellerinin sınıflandırılması verilmektedir. Çizelge 2.7. DYS391 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması DYS391 alelleri Uzunluk(bç) DYS392: 5'..TCATTAATCTAGCTTTTAAAAACAACTAATTTGATTTCAAGTGTTTGT TATTTAAAAGCCAAGAAGGAAAACAAATTTTTTTCTTGTATCACCATTTA TTTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTTAC TAAGGAATGGGATTGGTAGGTTTAATGATCCCTCTGTTTTGACTTCTTTGA GATATTTCCAGACTACTTTCCACTTTGACTGTAGGAATTTACATTGCATC AACTGGGTCT..3' 28

29 Bu STR bölgesi tat trinükleotit tekrarları içermektedir. Yukarıda dizi örneği verilen DYS3392 alelli 16 tekrar birimli 263 bç uzunluğundadır. Çizelge 2.7 de ise DYS392 STR lokusunun tüm alellerinin özellikleri verilmektedir. Çizelge 2.8. DYS392 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması DYS392 alelleri Uzunluk(bç) DYS393: 5'..GTGGTCTTCTACTTGTGTCAATACAGATAGATAGATAGATAGATAGA TAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATGTATGTCTTTTC TATGAGACATACCTCATTTTTTGGACTTGAGTT..3' DYS393 lokusu gata tetranükleotit tekrarlarını içermektedir. Eğer 5 ucuna doğru bir baz kayma ile okunursa agat tekrar birimleri gözlenmiş olur. Yukarıda 15 tekrarlı ve 131 bç lik DYS393 alelinin dizisi örnek olarak verilmektedir. Çizelge 2.8 de ise DYS393 lokusunun tüm alellerinin genel sınıflandırılması verilmektedir. Çizelge 2.9. DYS393 lokusu alellerinin genel sınıflandırılması DYS393 alelleri Uzunluk (bç) YCAII a/b: 5..TATATTAAATAGAAGTAGTGAAAACAGGCATCCTTGTTTTTGCTCTT AGAGTAAAATCTGTCAGTCTTTCACCATAAGGTTAGCTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCATTTTTTAATATAACATTACATCG ATA..3 Bu lokus da DYS385 e benzer şekilde Y kromozomu üzerinde duplike şekilde iki kopya halindedir. Bu yüzden iki farklı lokus olarak (YCAIIa ve YCAIIb) değerlendirilmektedirler. Kopyalar aynı genomik dizi içerdiklerinden kullanılan 29

30 primerler her iki kopyaya da bağlanırlar ve PCR sonucunda otozomal STR lokuslarına benzer sonuç elde edilmektedir. YCAII lokusu tg dinükleotit tekrarları içermektedir. Yukarıda örneği verilen dizi 19 tekrarlı 150 bç uzunluğundaki alele aittir. Çizelge 2.10 da YCAII lokusunun tüm alellerinin genel sınıflandırılması verilmiştir Çizelge YCAII lokusu alellerinin genel sınıflandırılması YCAII a/b alelleri Uzunluk Lokuslarla ilgili bilgilerde kaynak olarak Genom Bilgi Bankası (Genomic Database- GDB) kullanılmıştır. 2.2 ÇALIŞMA GRUBU Bu çalışma kapsamında, geneli temsil etmesi maksadıyla değişik bölgelerde en az üç nesil yaşamış kişiler incelenmeye alınmıştır. Ayrıca bu kişilerin akraba olmamasına dikkat edilmiştir. Çalışmanın amacına uygun olarak 250 örnek incelenmesi öngörülmüştür. Çalışma süresi içerisinde lokus bazında en az 197 (YCAII), en çok 241 (DYS390 ve DYS393) örnekten sonuç elde edilmişitir. Yukarıda söylenen kriterlere uyan kan örnekleri alınan kişiler çalışmanın amacı ve yöntemi hakkında bilgilendirilmiş, ayrıca yeterince bilgilendirildikleri ve kendi iradeleriyle bu çalışmaya katıldıklarını gösteren bir onam formu kişiler tarafından imzalanmıştır. Onam formu örneği Ek te sunulmaktadır. 2.3 DNA ĐZOLASYONU VE KANTĐTASYONU DNA izolasyonu, 5ml periferik kandan aşağıda tanımlanan standart fenol-kloroform yöntemiyle yapılmıştır. EDTA (100 µl, 0,5 M) lı tüpe 5 ml periferik kan alınır. 30

31 3500 rpm de 20 dakika santrifüj edilip serum uzaklaştırıldıktan sonra üzerine 10 ml lizis tamponu (0.154 M NH4Cl, M KHCO3, M EDTA) eklenir ve 1 saat buz üzerinde bekletilir rpm de 20 dakika santrifüj edilir. Süpernatan atılır, pelet üzerine 5 ml 1x STE (0.1 M NaCl, 0.01 M Tris ph=8,0, M EDTA) eklenir ve karıştırılır rpm de 20 dakika santrifüj edilir. Süpernatan atılıp pelet üzerine 4.5 ml 1x STE, 0.5 ml %10 SDS (Sodium Lauryl Sülfat) ve 50 µg/ml Proteinaz K eklenir, yavaşça karıştırılır ve bir gece 37 0 C de etüvde inkübe edilir. Ertesi gün solüsyon üzerine eşit hacimde doymuş fenol eklenip karıştırıldıktan sonra 3500 rpm de 20 dakika santrifüj edilir. Süpernatan temiz bir tüpe alınıp üzerine eşit hacimde kloroform:izoamil alkol karışımı (24:1) eklenir ve karıştırılır rpm de 20 dakika santrifüj edilir ve süpernatan temiz bir tüpe aktarılır. Solüsyon üzerine eşit hacimde saf etanol ilave edilir ve yavaşça karıştırılarak DNA'nın presipite olması beklenir. Presipite olan DNA mikropipet ile 1.5 ml lik mikrofüj tüpüne aktarılır. Bir kez saf etanol, bir kez de % 70 etanol ile 10 dakika rpm de santrifüj edilir, süpernatan atılır ve DNA kurumaya bırakılır. Kurutulan DNA 500 µl dh 2 O ile çözülür. Elde edilen DNA nın miktar ve saflığının tespit edilmesi için spektrofotometrik ölçüm aşağıdaki gibi yapılmıştır. Çözülmüş DNA örneğinden 20 µl alınıp quartz tüp içinde dh 2 O ile hacmi 2 ml ye tamamlanır, iyice karıştırılır. Spektrofotometrede OD260 ve OD280 değerleri ölçülür. 260 ve 280 nm deki optik dansite değerlerinin oranı hesaplanarak DNA nın saflığı belirlenir (OD260/ OD280 hesaplanarak). Aşağıdaki formül kullanılarak elde edilen DNA nın konsantrasyonu belirlenir. Konsantrasyon (µg/µl) = OD260 x 0.05 x 100 (sulandırma katsayısı) 31

32 2.4 POLĐMERAZ ZĐNCĐR REAKSĐYONU DNA örnekleri kullanılarak, Y kromozomu üzerinde olduğu bilinen 12 tipik STR lokuslarından (DYS19, DYS385a/b, DYS388, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, YCAIIa/b) her biri için uygun primerlerle aynı bölgelerin çok sayıda kopyaları elde edilmiştir (Perez-Lezaun et al.1997,b). Bu çalışma kapsamında, öngörülen 12 Y-STR lokusunun tamamı değişik sayıda örnek gruplarıyla çalışılmıştır. Bu lokuslar için uygun primerler (Tanı Medikal) kullanılarak dört değişik multipleks PCR (YCAIIa/b hariç) uygulanmıştır: Multipleks I Multipleks II MultipleksIII MultipleksIV DYS389I DYS392 DYS19 DYS385a/b DYS389II DYS393 DYS388 DYS391 DYS390 Herbir PCR uygulaması, 1Ü Taq Polimeraz (Sigma, D4545), 2.5 µl 10xPCR tamponu (100mM TrisHCI (ph 8,3), 500mM KCI [Sigma, P2317]), 1.5 mm MgCI 2 (Sigma, M8787), 0,1-0,8 µm her bir primer (Tanı Medikal), 200µM her bir dntp (Sigma, dntp-100), 5µg BSA ve ng genomik DNA içeren toplam 25µl reaksiyon karışımında thermocycler da (Biometra Personel Cycler TM, ) gerçekleştirilmiştir (Rustamov et al.2004, Rustamov A, 2001). DYS385a/b, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393 ve YCAIIa/b için kullanılan PCR protokolü, Başlangıç denatürasyonu 94 0 C, 2,5 dakika Denatürasyon 94 0 C, 60 saniye Annealing 54 0 C, 60 saniye 32 kez tekrar Extension 72 0 C, 60 saniye Son extension 72 0 C, 10 dakika 32

33 DYS19 ve DYS388 için kullanılan PCR protokolü ise, Başlangıç denatürasyonu 94 0 C, 2,5 dakika Denatürasyon 94 0 C, 60 saniye Annealing 55 0 C, 60 saniye 35 kez tekrar Extension 72 0 C, 60 saniye Son extension 72 0 C, 10 dakika gibidir. Her PCR işleminde kadın DNA'sı da kontrol amacı ile kullanılmıştır. PCR işlemi bittikten sonra ürünün varlığını kontrol etmek amacıyla %2 lik agaroz jelde elektroforez yapılmıştır. Jel, 1xTBE (0.089M Trizma base [Sigma, T8524], 0.089M Borik asit [Sigma, B6768], 0.002M EDTA) içinde 0.1 µg/µl Etidyum bromid (Sigma, E8751) içerecek şekilde hazırlanmıştır. PCR ürünlerinden 10 µl alınarak agaroz jelde 90 V da 1 saat yürütüldükten sonra (Biometra-Agagel Mini, ), UV-transilüminatör üzerinde reaksiyon sonuçları değerlendirilmiştir. Çizelge 211. Çalışılacak STR lokuslarına özgü primer dizinleri. Lokus Tekrar Tekrar Alel Motifi sayısı sayısı Alel uzunlukları (bp) DYS19 (GATA)n DYS389I (GATA)n (GACA)n DYS389II (GATA)n (GACA)n DYS389I PCR Primer Dizileri Primer A: CTACTG AGT TTC TGT TAT AGT Primer B: ATG GCA TGT AGT GAG GAC A Primer A:CCA ACT CTC ATC TGT ATT ATC TAT Primer B: TCT TAT CTC CAC CCA CCA GA DYS390 (GATA)n (GACA)n Primer A: TAT ATT TTA CAC ATT TTT GGG CC Primer B: TGA CAG TAA AAT GAA CAC ATT GC Primer A: CTA TTC ATT CAA TCATAC ACC CA DYS391 (GATA)n Primer B: GAT TCT TTG TGG TGG GTC TG Primer A: TCA TTA ATC TAG CTT TTA AAA ACA A DYS392 (ATT)n Primer B: AGA CCC AGT TGA TGC AAT GT Primer A: GTG GTC TTC TAC TTG TGT CAA TAC DYS393 (GATA)n Primer B: AAC TCA AGT CCA AAA AAT GAG G Primer A:AGC ATG GGT GAC AGA GCT A DYS385 (GAAA)n Primer B: CCA ATT ACA TAG TCC TCC TTC Primer A: TAT ATT AAA TAG AAG TAG TGA YCAII (TG)n Primer B: TAT CGA TGT AAT GTT ATA TTA 33

34 2.5 ALEL POLĐMORFĐZMĐNĐN YÜKSEK VOLTAJ POLĐAKRĐLAMĐD JEL ELEKTROFOREZĐYLE TAYĐNĐ Agaroz jel elektroforeziyle varlığı tespit edilen PCR ürünleri 95 0 C de 3 dakika denatüre edildikten sonra %6 lık denatüre edici poliakrilamid jelde (20 gr üre [Sigma, U5378], 6 ml %40 akrilamid:bisakrilamid stok solüsyonu [38:2] [Sigma, A9099:Sigma, M2022], 4 ml 10xTBE ve 15.3 ml ddh2o) PCR büyüklüklerine uygun marker eşliğinde (Marker VIII, pucbm21/hpa II-Dra I ve Hind III kesimi [Boehringer Mannheim, ] ve puc 18/Hae III kesimi [Sigma, D6293]) 1500 V da 3 saat yürütülmüştür (Biometra DNA Sequencing Gel Apparatus, ). Her lokusla ilgili bazı örneklerin büyüklüklükleri belirlendikten sonra, bu örnekler marker amaçlı kullanılmıştır. Bantları görünür hale getirmek için aşağıda protokolü verilmiş gümüş boyama tekniği kullanılmıştır. PAGE den sonra jel; %10 etanol içeren fiksatif solüsyonunda 15 dakika muamele edilir %1 HNO 3 solüsyonunda 3 dakika muamele edilir ddh 2 O ile 1dakika yıkanır. % 0,2 AgNO3 ve % 0,1 formaldehit solüsyonunda 25 dakika muamele edilir. ddh 2 O ile hızlı şekilde 1dakika yıkanır. %3 NaCO3 (Merck, 6398) solüsyonu içerisinde %2 Na2S2O3 solüsyonundan 100µl/L olacak şekilde, taze hazırlanan developer solüsyonunda bantlar görülene kadar muamele edilir. Fiksatif solüsyonunda 2-3 dk bekletilir. ddh2o ile yıkama yapılır. PCR ve yüksek voltaj DNA poliakrilamid jel elektroforezi, her bir örnek için 3 kez yapılmıştır (Fabricio et al.1993; Muller et al.1994; Cooper et al.1996; Roewer et al.1996, Rustamov et al.2004). 34

35 2.6 ĐSTATĐSTĐKSEL DEĞERLENDĐRME Elde edilmiş sonuçların değerlendirilmesi Arlequin 3.0 programı kullanılarak yapılmıştır. Lokuslara göre alel sıklıkları belirlendikten sonra, gözlenen haplotipler ve sıklıkları belirlenmiştir. 35

36 3. BULGULAR DYS19, DYS385a/b, DYS388, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393 ve YCAIIa/b lokusları için elde edilen sonuçlar Çizelge 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 ve 3.10 da gösterilmiştir. Sonuçlar aynı zamanda Grafik 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 ve 3.10 da grafik halinde de sunulmuştur. Bu değerlendirmelere taban teşkil eden sonuçlarla ilgili olarak DYS389I, DYS389II ve DYS390 lokusları için 13 örneğe ait PCR ürününün jeldeki görüntüsü Resim 3.1 de gösterilmektedir. Bu jelde marker olarak, ticari markerler kullanılarak alel uzunlukları daha önce belirlenmiş örnek kullanılmıştır (Örnek No: No lu kuyucuk). Şekil örneğe ait PCR ürününün jeldeki görüntüsü sırası ile 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 181, 194 ve 195 nolu örneklere ait PCR ürünlerinin yüklendiği kuyuları göstermektedir. Üç lokusa ait PCR ürünleri sol tarafta ilgili lokus adı ile belirtilmiştir. Marker olarak bu lokuslarla ilgili alel uzunlukları bilinen 181 no lu örneğe (11 nolu kuyucuk) ait PCR ürünü kullanılmıştır. 36

37 3.1 DYS (13) 190(14) 194(15) 198(16) 202(17) 206(18) Grafik 3.1 DYS19 alellerinin sıklıkları (aleller, uzunluk ve parantez içerisinde tekrar sayısı olarak olarak gösterilmiştir, n=228) Çizelge 3.1 DYS19 alellerinin sıklıkları (n=228) DYS19 (n=234) ALEL SAYI (n) SIKLIK (%) 186(13) (14) (15) (16) (17) (18)

38 3.2 DYS385a/b (7) 245(8) 249(9) 253(10) 257(11) 261(12) 265(13) 269(14) 273(15) 277(16) 280(16.3) 281(17) 283(17.2) 284(17.3) 285(18) 288(19) 292(20) Grafik 3.2 DYS385a/b alellerinin sıklıkları (aleller, uzunluk ve parantez içerisinde tekrar sayısı olarak gösterilmiştir, n=454) Çizelge 3.2 DYS385a/b alellerinin sıklıkları (n=454) DYS385a/b (n=454) ALEL SAYI (n) SIKLIK (%) 241(7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (16.3) (17) (17.2) (17.3) (18) (19) (20) (21)

39 3.3 DYS (11) 128(12) 131(13) 134(14) 137(15) 140(16) 143(17) 146(18) 149(19) Grafik 3.3 DYS388 alellerinin sıklıkları (aleller uzunluk ve parantez içerisinde tekrar sayısı olarak olarak gösterilmiştir, n=234) Çizelge 3.3 DYS388 alellerinin sıklıkları (n=234) DYS388 (n=240) ALEL SAYI (n) SIKLIK (%) 125(11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19)

40 3.4 DYS389I (11) 247(12) 251(13) 255(14) 259(15) 263(16) Grafik 3.4 DYS389I alellerinin sıklıkları (aleller, uzunluk ve parantez içerisinde tekrar sayısı olarak olarak gösterilmiştir, n=239) Çizelge3.4 DYS389I alellerinin sıklıkları(n=239) DYS389I (n=239) ALEL SAYI (n) SIKLIK (%) 243(11) (12) (13) (14) (15) (16)

41 3.5 DYS389II (26) 359(27) 363(28) 367(29) 371(30) 375(31) 379(32) 383(33) Grafik 3.5 DYS389II alellerinin sıklıkları (aleller, uzunluk ve parantez içerisinde tekrar sayısı olarak olarak gösterilmiştir, n=234) Çizelge 3.5 DYS389II alellerinin sıklıkları(n=234) DYS389II (n=234) ALEL SAYI (n) SIKLIK (%) 355(26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33)

42 3.6 DYS (20) 203(21) 207(22) 211(23) 215(24) 219(25) 223(26) 227(27) Şekil 3.6 DYS390 alellerinin sıklıkları (aleller, uzunluk ve parantez içerisinde tekrar sayısı olarak olarak gösterilmiştir, n=241) Çizelge 3.6 DYS390 alellerinin sıklıkları (n=241) DYS390 (n=241) ALEL SAYI (n) SIKLIK (%) 199(20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27)

43 3.7 DYS (9) 283(10) 287(11) 291(12) 295(13) Grafik 3.7 DYS391 alellerinin sıklıkları (aleller uzunluk ve parantez içerisinde tekrar sayısı olarak olarak gösterilmiştir, n=224) Çizelge 3.7 DYS391 alellerinin sıklıkları (n=224) DYS391 (n=231) ALEL SAYI (n) SIKLIK (%) 279(9) (10) (11) (12) (13)

44 3.8 DYS (8) 242(9) 245(10) 248(11) 251(12) 254(13) 257(14) 260(15) 263(16) Grafik 3.8 DYS392 alellerinin sıklıkları (aleller, uzunluk ve parantez içerisinde tekrar sayısı olarak olarak gösterilmiştir, n=237) Çizelge 3.8 DYS392 alellerinin sıklıkları (n=237) DYS392 (n=237) ALEL SAYI (n) SIKLIK (%) 239(8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16)

45 3.9 DYS (9) 111(10) 115(11) 119(12) 123(13) 127(14) 131(15) Grafik 3.9 DYS393 alellerinin sıklıkları (aleller, uzunluk ve parantez içerisinde tekrar sayısı olarak olarak gösterilmiştir, n=241) Çizelge 3.9 DYS393 alellerinin sıklıkları (n=241) DYS393 (n=241) ALEL SAYI (n) SIKLIK (%) 107(9) (10) (11) (12) (13) (14) (15)