BÖCEK HÜCRE KÜLTÜRÜ YÜKSEK LİSANS SEMİNERİ. Ceyhun KÜÇÜK. Danışman : Prof. Dr. Kemal BÜYÜKGÜZEL. Eş Danışman: Doç. Dr.

Transkript

1 BÖCEK HÜCRE KÜLTÜRÜ YÜKSEK LİSANS SEMİNERİ Ceyhun KÜÇÜK Danışman : Prof. Dr. Kemal BÜYÜKGÜZEL Eş Danışman: Doç. Dr. Ender BÜYÜKGÜZEL

2 HÜCRE KÜLTÜRÜ TEKNİĞİ Hücre kültürü, canlı hücrelerin ait oldukları organizma dışında laboratuar ortamında yapay olarak (in vitro) kültüre edilmesi işlemidir. Hücre kültürü tekniğinde, hücreler ait oldukları organizma dışında olmalarına karşın sanki o ortamdaymış gibi doğal yaşam şartlarının sağlanması gerekmektedir. Bu şartlar her canlı tipi için farklılık göstermektedir. Örnek verecek olursak; böcek hücreleri 28ºC de yaşarken, memeli hücreleri ise 37 ºC de yaşamaktadır.

3 Kültür ortamı hücrelerin besinsel ihtiyaçlarını karşılayacak bir ortam olmalı ve bu ortamda oksijenle birlikte gerekli ise karbondioksit de bulunmalıdır. Memeli hücreleri için %5 karbondioksit gereklidir. Ayrıca in vitro hücre kültür ortamında besinsel değerlerin yanı sıra hücrelerin büyümesi için gerekli büyüme faktörleri de kullanılmalıdır.

4 Kültür besiyerinde olması gerekenler 1. Besinler : amino asitler, glikoz, vitaminler, tuzlar 2. Fetal Bovine Serum (FBS): Büyüme Faktörleri 3. Oksijen Karbondioksit(memeli hücreleri) 4. Penisilin, streptomisin antibiyotikleri 5. Besiyeri sıcaklığı ve ph ıda hücrelerin ihtiyacına uygun olmalıdır.

5 Hücre kültürü 3 farklı şekilde oluşturulmaktadır. Primer kültür: Canlılardan alınan hücreler tarafından oluşturulan hücre kültürleridir. Hücre Soyu (strain): Primer kültürdeki hücrelerin pasajlanması sonucu oluşan kültürlerdir ve belli bir çoğalma kapasitesine sahiptirler. Hücre serisi (line): Hücre soyundaki hücrelerin tranformasyona uğratılması ya da hücrelerin ölümsüz olma ve sınırsız çoğalma kapasitelerine sahip olması sonucu oluşan hücre kültürleridir. Bu hücre serisine verilebilecek en iyi örnek HeLA hücreleridir.

6 Ayrıca hücre kültürleri yapışan hücre kültürü ve süspanse hücre kültürü şeklinde, yüzeye tutunma ihtiyaçlarına göre de ikiye ayrılmaktadır. Yapışan hücre kültürlerinde; hücreler bulundukları yüzeye tutunma bağımlılığı sayesinde flakslarda yapışmalarını sağlayan yüzeylere yapışarak tek tabaka şeklinde büyür ve çoğalırlar. Bu hürceler pasajlama sırasında yüzeyden bir enzim ya da mekanik bir kuvvet aracılığı ile koparılarak yeni flakslara aktarılırlar. Yapışan hücre kültürlerine örnek verecek olursak; bağ doku hücreleri ve fibroblast hücreler söylenebilir.

7 Süspanse hücre kültürleri ise bulundukları ortamda yüzeye tutunma bağımlılıkları olmadığından besiyeri içinde kültür flaksına yapışmadan büyür ve çoğalırlar. Örnek olarak kan hücreleri verilebilir.

8 Hücre Kültürünün Avantajları 1. Canlı hücrelerin sıcaklık, ph, ozmotik basınç, oksijen ve karbondioksit konsantrasyonu gibi fizikokimyasal özellikleri ve büyüme faktörleri ile besin konsantrasyonları gibi fizyolojik çevre şartları araştırmacılar tarafından kontrol altında tutulabilmektedir. 2. Ayrıca canlının bir bütün olarak incelenmesi zor olduğundan, canlının bütünü değil sadece canlıda incelenmek istenen organizmanın çalışılmasında kolaylık sağlamaktadır. 3. Hayvan ve insan deneyleri için canlının kendisi kullanılmadığından etik kurul izni almaya gerek yoktur ve bütün bir organizma için deneylerde kullanılacak kimyasal ve diğer malzemelerin miktarı hücresel düzeyde çalışmalarda daha az ve tekrar sayıları daha fazla olacağından bu yöntem ekonomiktir.

9 4. Devam ettirilen hücre kültürleri aynı tip hücreleri içerdiğininden pasajlama sonralarında elde edilen hücrelerde birebir birbirinin aynısı olduklarından çalışmalarda homojenite sağlanmaktadır.

10 Hücre Kültürünün Dezavantajları 1. Kontaminasyona hassasiyet 2. Donanımlı personel gerekliliği 3. Ürün anlamında çok fazla hücre gereksinimi 4. Hücrelerin farklılaşması ve kararsızlığı olarak sıralanabilir.

11 BÖCEK HÜCRE KÜLTÜRÜ

12 Day ve Grace 1959 da böcek hücre kültürü tarihini 3 aşamada özetlediler. 1. İlk aşama; hemolenf ve basit tuz solüsyonlarında kültüre edilmiş dokular ile gametogenesis üzerine yapılan temel çalışmalardır. Bu çalışmalarda mitoz bölünmeler nadiren belirlenebilmiştir ve oluşturulan kültürler genellikle birkaç hafta boyunca hayatta kalabilmiştirler (Glaser 1917). 2. İkinci aşama; kültür besiyerinin geliştirilmesi. Çalışmalar genellikle omurgalı doku bileşenleri içeren besiyerleri ile yapılmaktaydı. Oluşturulan hücre kültürleri 3 aydan fazla yaşayamıyordu ancak virüslerin yayılma sürecini takip etmek mümkündü. Bu nedenle besiyeri geliştirilmesi ve çeşitliliğinin artırılması oldukça önemliydi (Trager 1953).

13 3. Son aşama; Böcek doku kimyasına bağlı olarak besiyeri geliştirilmesi ve üzerine yapılan atılımlar olarak düşünülmelidir (Grace 1962).

14 Böcek Hücre Kültürü Tarihi Kronolojik Sıralama 1. Ross Harrison (1907): Hayvan Hücre Kültürü 2. Richard Goldschmidt (1915): Hyalophora cercopia hemolenfinden 3. Glaser (1917): Hücre kültürü besiyeri; Hemolenf ve tuz solüsyonu 4. Frew (1928): Farklı hemolenflere sahip sineklerin bacak imajinal disklerinden hücre kültürü oluşturmuş.

15 5. Wyatt (1956): İpek böceğinin hemolenfinin biyokimyası temel alınarak ovaryum hücrelerinin çoğalması için kendi besiyerini oluşturmuş (Wyatt s Medium) 6. Shangyin Gao (1958): İpek böceği Bombix mori nin hücre hattını oluşturmuş. Chinese Science Bulletin dergisinde böcek hücre hattı üzerine ilk yayın olarak basılmış. 7. Thomas D. C. Grace (1962) : Çeşitli vitaminler ekleyerek Wyatt ın besiyerini modifiye etti ve ilk ticari olarak Grace böcek hücre kültürü besiyerini hazırladı.

16 de ilk böcek hücre hattı Antherea eucalipty nin pupa dokusundan oluşturuldu. 9. Grace (1966): Dünyada ilk Aedes aegypti (Sarı humma sivrisineği) hücre hattını oluşturdu. 10. KRP Singh (1967): Mitsuhashi maramorosch besiyerinde larval dokularda hücre hattı elde etti (Smagghe et al. 2009).

17 Böcek hücre kültürü pupa ovaryum dokusundan bir hücre hattının başarılı bir şekilde kurulmasıyla başladı. Bu alan günümüzde 500 ün üstünde 75 türden böcek hücre hattı ile sayısız böcek sınıfı ve birçok farklı doku kaynağından kurulmuş durumda olup gelişerek de büyümeye devam etmektedir (Lynn 2007). Lepidoptera, Diptera, Orthoptera, ve Coleoptera böcek takımlarından elde edilmiştir. Bu hücre hatları virolojide, böcek bağışıklık sistemini çalışmak için sinyal mekanizma araştırmalarında, hemosit taşınması, ve gen ifadeleri hakkında hipotezleri test etmek ve yeni insektisit kimyasalları keşfetmek için tarama programlarının keşfedilmesinde araştırma aletleri olarak kullanılmaktadır (Clem 2007; Condreay and Kost 2007; Elias et al. 2007; Lynn 2007).

18 Viroloji araştırmaları, virüs-konak hücre etkileşimleri hakkında temel olarak yeni bilgiler ortaya koymaktadır ve böcek hücre hatları virüsle alakalı çalışmalarda önemli deneysel araçlar olarak virüs konak hücre etkileşimi çalışmalarında kullanılmaktadır. (Li and Bonning 2007; Lynn 2007 Gundersen- Rindal and Dougherty 2000; Mudiganti et al. 2006; Schütz and Sarnow 2006; Lennan et al.2007). Böcek bağışıklık sistemini çalışmak için sinyal iletim yolakları araştırmalarında. Gen ifadelerindeki çalışmalarda Bir kaç hücre hattı da biyomedikal öneme sahip proteinlerin üretiminde (Smagghe et al. 2009). Yeni insektisit kimyasallarının keşfinde kullanılmaktadır. İlerleyen süreçte böcek hücre kültürü; bağışıklık, endokrinoloji, toksikoloji, biyokimya ve evrim gibi biyolojinin çeşitli alanlarında araştırmalarda da çok fazla kullanılacaktır (Smagghe et al. 2008).

19 Oluşturulmuş Omurgalı Hücre Hattı Sayıları İçin Gözlenen Artış Miktarı (Lynn 2001)

20 Kendi çalışmalarımızda Kullandığımız Biyokimyasal Yapısı Belli Olan Besiyeri ( Prof. Dr. Şevki Yazgan ) Yazgan, S., A meridic diet and quantitative effects of Tween 80, fatty acid mixtures and inorganic salts on development and survival of the endoparasitoid Pimpla turionellael. Zeitschrift fur Angewandte Entomologie 91,

21 Pimpla turionellae larvalarını laboratuvar şartlarında doğal konak kullanmadan yetiştirmek için kullanılan kimyasal yapısı bilinen besinin bileşimi (Yazgan 1981 tarafından geliştirilen besin). Besin bileşenleri mg/100 ml besin Besin bileşenleri mg/100 ml besin L-Amino asit karışımı Lipid karışımı Alanin Kolesterol Arjinin-HCl Linoleik asit Aspartik asit Linolenik asit Fenilalanin Oleik asit Glisin Palmitik asit Glutamik asit Stearik asit Hidroksiprolin Tween Histidin-HCl İzolösin Suda çözünen vitaminler Lizin Askorbik asit Lösin Biyotin Metiyonin Folik asit Prolin Inozitol Serin Ca-Pantotenat Sistin-HCl Kolin klorür Tirozin Nikotinik asit Treonin Pridoksin-HCl Triptofan Riboflavin Valin Tiamin-HCl İnorganik tuz karışımı Diğerleri CaCl Agar CoCl 2.6H 2 O 3.01 Glukoz CuSO 4.5H 2 O 3.50 Ribonükleik asit FeCl 3.6H 2 O Potasyum hidroksit (2N)

22

23

24 Böcek Hücre Kültürü Tekniği

25 Böcek Hücre Kültürü Gelişiminde Kullanılan Dokular (Lynn 2001)

26 Hücre Kültüründe Kullanılan Dokular Ovaryum: 1960 ve 1970 lerde özellikle Lepidoptera takımına ait böceklerin ovaryumu kullanıldı. Embriyo: En yaygın kullanılan hücre kaynağıdır. Hemosit: Toplaması kolaydır fakat melanizasyondan dolayı hücreleri artırmak oldukça zordur. İmajinal disk: Toplaması oldukça zordur ve belirleyici özelliği olmayan hücrelerden oluşur

27 5. Fat body: Önemli fizyolojik bir dokudur. 6. Midgut: Microbial kontaminasyon, enzim aktiviteleri ve böcek biyolojisinde önemli bir dokudur. 7. Kutikül, sinir sistemi, endokrin sistem ve kas sistemi: nadir oluşturulan hücre hatlarıdır (Lynn 2001).

28 Hücre Kültürü Besiyeri Kültür Besini 1. IPL TC MM Medium 4. TNM-FH 5. GRACE-TCM 6. SF-900 (Serum-Free) 7. Insect-Xpress Tm 8. SFX-Insect Tm Katkı Maddeleri 1. Organik Asit 2. İnorganik Tuzlar 3. Karbohidratlar 4. Amino asitler 5. Vitaminler Destekleyici 1. Antibiyotik 2. Fetal Bovin Serum

29 Temel Hücre Kültürü Oluşturma (Sudeep 2005)

30 Böcek Hücre Hattı Kurmak İçin Temel Protokol Böcek Yüzeyinin Sterilizasyonu 1. % 1 Triton X-100 ile hazırlanmış olan % 70 lik etanolde 3 dakika bekletilir. 2. % 0,05 ya da % 0,1 sodyum hipoklorit içerisinde 3 dakika bekletilir (etken bileşeni çamaşırsuyu)

31 µg/ml amfoteresin B, 0,2 mg/ml streptomisin ve 200 U/ml penisilin içeren PBS ile 1-2 dakika böcekler durulanır.

32 1. Hemositler için: Böcek dokularına bağlı prosedürler; Melanizasyonu önlemek için; buz üzerinde duran 15 ml lik steril bir tüp içine 0,7 mg/ml glutatyon ve antibiyotik içeren besiyeri içine hemolenf toplanır. +4 C de 800 x g de 10 dk santrifüj edilir.

33 Süpernatant kısım pipet yardımıyla uzaklaştırılır ve tüpün içine antibiyotik içeren besiyerinden 5 ml eklenir.

34 Besiyeri ile hücreler süspanse edildikten sonra T 25 kültür flaksın içine aktarılır.

35

36 2. Böcek yumurtası ve tüm vücut dokusu için: Küçük petri kabında, antibiyotik içeren besiyeri içinde plastik homojenizatör yada sterilize edilmiş mikro makas/neşter(bistüri) ile nazik bir şekilde homojenize edilir. Besiyeri, 15 ml lik steril tüp içine aktarılır. 4 C de 800 x g de 10 dk santrifüj edilir. Süpernatant kısım pipet yardımıyla uzaklaştırılır ve tüpün içine antibiyotik içeren besiyerinden 5 ml eklenir. Besiyeri ile hücreler süspanse edildikten sonra T 25 kültür flaksın içine aktarılır.

37 3. Ovaryum ve testisler için : Pupa yada ergini, sterilize edilmiş diseksiyon kabında ventral kısım yukarı gelecek şekilde iğne ile tuttururuz. Uzunlamasına bir kesik açıp toraks ve abdomeni tuttururuz. Antibiyotikleri içeren PBS ile açık kısım yıkanarak temizlenir. Dokular küçük bir petri kabında ya da 6-12 lik doku kültür pleytlerinde nazikçe toplanır. Siterilize edilmiş mikro makas ile parçalara ayrılır.

38 Besiyeri, 15 ml lik steril tüp içine aktarılır. 4 C de 800 x g de 10 dk santrifüj edilir. Süpernatant kısım pipet yardımıyla uzaklaştırılır ve tüpün içine antibiyotik içeren besiyerinden 5 ml eklenir. Besiyeri ile hücreler süspanse edildikten sonra T 25 kültür flaksın içine aktarılır.

39 Takip Ertesi gün tüm kültürleri kontrol edilir. Eğer çok fazla yüzen cisim varsa, onları uzaklaştır ve yeni antibiyotikli besiyeri ekleriz. Eğer besiyeri melanizasyondan dolayı kararmışsa, besini tamamen değiştiririz ve sık sık gözlemleriz. 1 hafta sonra besiyerinde penisilin ve streptomisin konsantrasyonlarını yarıya indirir ve, amfoteresin B yi çıkarırız gün de bir besiyerinin yarısını yenileriz. Kültür aktif olarak çoğalmaya başlayıp flaksın% 75 ini kapladığında 1:2 oranında yeni flakslara böleriz.

40

41

42

43 Böcek Hücre Hattı İle Yapılan Çeşitli Çalışmalar

44

45

46

47

48 Kaynaklar Clem, R. J. Baculoviruses and apoptosis: a diversity of genes and responses. Curr. Drug Targets 8: ; Condreay, J. P.; Kost, T. A. Baculovirus expression vectors for insect and mammalian cells. Curr. Drug Targets 8: ; Elias, C. B.; Jardin, B.; Kamen, A. Recombinant protein production in large-scale agitated bioreactors using the baculovirus expression vector system. In: Murhammer D. W. (ed) Methods in molecular biology series. Baculovirus and insect cell expression protocols. Springer, New York, pp ; Glaser, R. W. The growth of insect blood cells in vitro. Psyche 24: 1 6; Grace, T. D. C. Establishment of four strains of cells from insect tissues grown in vitro. Nature (London) 195: ; Gundersen-Rindal, D.; Dougherty, E. M. Evidence for integration of Glyptapanteles indiensis polydnavirus DNA into the chromosome of Lymantria dispar in vitro. Virus Res 66: 27 37; Lennan, E.; Vandergaast, R.; Friesen, P. D. Baculovirus caspase inhibitors P49 and P35 block virus-induced apoptosis downstream of effector caspase DrICE activation in Drosophila melanogaster cells. J. Virol 81: ; Li, H.; Bonning, B. C. Evaluation of the insecticidal efficacy of wild type and recombinant baculoviruses. In: Murhammer D. W. (ed) Methods in molecular biology series. Baculovirus and insect cell expression protocols. Springer, New York, pp ; Lynn, D. E. Available lepidopteran insect cell lines. In: Murhammer D. W. (ed) Methods in molecular biology series. Baculovirus and insect cell expression protocols. Springer, New York, pp ; Lynn, D. Novel technicues to establish new insect cell lines. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal 37: Mudiganti, U.; Hernandez, R.; Ferreira, D.; Brown, D. T. Sindbis virus infection of two model insect cell systems: a comparative study. Virus Res 122: 28 34; Schütz, S.; Sarnow, P. Interaction of viruses with the mammalian RNA interference pathway. Virology 344: ; Smagghe, G. ; Goodman C. L.; StanleyD. Insect cell culture and applications to research and pest management. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal 45:93;2009 Smagghe, G.; Braeckman, B. P.; Huys, N.; Raes, H. Cultured mosquito cells Aedes albopictus C6/36 (Dip., Culicidae) responsive to 20-hydroxyecdysone and non-steroidal ecdysone agonist. J. Appl. Entomol 127: ; Sudeep, A. B..; Mourya D. P.; Mishra, A. C.; Insect cell culture in research: Indian Scenario. Indian J Med Res.: 121: Trager, W. J. Cultivation of virus grasserie in silkworm tissue. J. Exp. Med 61: ; 1953.

49 Teşekkürler