XXXVII. Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Kongresi, Antalya, 17-20 Kasım 2016HIV- AIDS Bilgilendirme Eğitimi 1
Abakavir Aşırı Duyarlılık Riskinin Araştırılmasında HLA-B*57:01 Testini Nasıl Kullanıyoruz? Dr. Tülin DEMİR
HLA molekülü yapısı, görevleri HLA-B*57:01- ABC aşırı duyarlılık ilişkisi Sunum Tularemia in İçeriği Turkey Epidemiyoloji-Klinik Abakavir aşırı duyarlılık tanı metotları 3
Human Leukocyte Antigen (HLA) genom yapısı MHC molekülleri olarak da tanımlanır 6. kromozomun kısa kolunda lokalize Oldukça pleomorfik gilikoprotein kompleksi Yaklaşık 200 genden oluşur 3 sınıfa ayrılır: MHC Sınıf 1: HLA-A, HLA-B, HLA-C MHC Sınıf 2: HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ MHC Sınıf 3: Çözünebilir komponentler, C2,C4 kompleman proteinleri, faktor B, non-mhc genlerini taşır
HLA molekülleri görevleri HLA Sınıf 1 molekülleri antijenleri sitotoksik T lenfositlere sunar İmmuniteyi indükler İmmun sistemde virüs ve bakteri gibi yapıların tanınmaları ve bu yapılara karşı cevap vermelerine yardım eder Bu sınıftaki bazı allotipler allerjik tip reaksiyonları indükler Günümüze dek 1500 kadar farklı HLA-B aleli tanımlanmıştır HLA-B*57:01 genotipi abakavire allerjik reaksiyon gelişiminden sorumlu
HLA Adlandırma Gen Spesifik HLA proteini HLA-B*57:01:01:01N Ekspresyondaki değişimleri gösteren son ek Ön ek Allel grup Non-coding bölgedeki polimorfizm Coding bölge ile sinonim DNA içerdiğini gösterir/sessiz mutasyon Torres, Margareth Afonso, & Moraes, Maria Elisa Hue. (2011). Nomenclature for factors of the HLA system. Einstein (São Paulo), 9(2), 249-251. https://dx.doi.org/10.1590/s1679-45082011md1914
ABAKAVİR (ABC) Guanozin analogu, reverse transkriptaz inhibitörü (NRTI) Genellikle iyi tolere edilen bir ilaçtır Çoğu NRTI grubu ilaca göre karaciğere uzun dönem toksik etkileri daha düşüktür İmmun aracılı aşırı duyarlılık reaksiyonuna neden olur HIV tedavisinde 1998 yılında lisans almıştır HLA-B*57:01 varlığı ile ABC aşırı duyarlılığı arasındaki ilişki ilk kez 2001 de tespit edilmiştir
Sıklık coğrafik bölge, ırk ve etnik gruba göre değişmekte (%8-57) Avrupa da %6-7, Afrika kökenli Amerikalılarda daha nadir Güneybatı Asya %20
Klinik-1 Sıklıkla ilk 6 hafta içinde oluşur (Ortalama 11 gün) Semptomlar ani başlar ve her dozda daha da şiddetlenir Graft versus host benzeri reaksiyon oluşturur Semptomlar: Makülopapüler- ürtiker tarzı döküntü, kaşıntı, ateş, iştahsızlık, bulantı, kusma, ishal, baş ağrısı, halsizlik, myalji, artralji, hipotansiyon, dispne, öksürük, farenjit Lökopeni, lenfopeni, trombositopeni, ALT, AST, CK, Cr artışı
Klinik-2 İlacın kesilmesiyle semptomlarda 2-3 gün içinde gerileme Döküntülerin kaybolması daha uzun sürer Fatal olabilir. İlacın hemen bırakılmasını gerektirir. ABC tedavisi başlanmadan HLA-B*57:01 allel taranması önerilir.
HLA genomunda en polimorfik gen HLA-B. Farklı DNA sekansları aynı alleli kodlayabilir. HLA veritabanında HLA-B*57:01 allelini kodlayan 16 farklı sekans tanımlanmıştır. Diğer sınıf 1 HLA genlerine benzer olarak en çok genetik değişkenlik HLA sınıf 1 moleküllerinin peptit bağlayan domain bölgelerini kodlayan exon 2 ve exon 3 sekanslarında izlenir. Bu sekanslardaki benzerlikler nedeniyle Sınıf 1 allelin tanımlanmasında altın standart DNA sekans temelli tiplendirmedir.
HLA Tiplendirme 1950 : HLA sisteminin tanımlanması 1960 : Serolojik tiplendirme 1980 : İlk HLA geni klonlanması ve sekans analizi 1990: Tüm MHC genomunun sekans analizi 2000: HLA allel database oluşturulması 2000 : Sekans bazlı tiplendirme, SSO
Tanı Serolojik: Kompleman bağımlı sitotoksite testi Moleküler: PCR-SSO PCR-SSP qpcr Sanger sekanslama Next generation sekans analizi Flow sitometri Mikroarray
Serotiplendirme Lenfositler HLA spesifik alloab ile test edilir. Her serum mikroplak godesine eklenir. Kısa inkübasyon sonrasında kompleman kaynağı olarak tavşan serumu eklenir Alloab ile bağlanan hücreler lize olur ve florokrom etidyum bromide karşı geçirgenlik kazanır. Lize hücreleri içeren godeler mikroskop ile ayırtedilir. +Maliyeti düşük +Hızlı -Tiplendirmede hatalar olabilir - Çözünürlük düşük
PCR-SSP & PCR-SSO Test süresini kısaltmak ve özgüllük-duyarlılık düzeylerinde azalmaya neden olmadan maliyetleri düşürmek için altın standart sekans analizine alternatif testler de geliştirilmiştir. Bu metotların çoğu sekans spesifik primer veya oligonükleotid prob bazlıdır. En sık kullanılan metot PCR ürünlerinin sekans spesifik oligonükleotitlerle (SSO) hibridizasyonu ve sonrasında HLA-B*57 allelinin tespiti için sekans spesifik primerler ile (SSP) high resolution PCR testidir. Kısıtlılık: HLA-B nin yüksek düzeyde polimorfik doğası gereğiyle devamlı olarak sekans güncellenmesi gerekmesidir. Farklı alleller arasındaki yüksek düzeydeki homoloji nedeniyle PCR koşullarında veya kullanılan reajenlerde en ufak bir değişiklik ile de teknik sorunlar da izlenebilir.
PCR-SSO Sekans-spesifik oligonükleotid problar kullanılır PCR ve sekans-spesifik oligonükleotid problarla hibridizasyonun kombinasyonu Amplifiye edilen DNA katı faza bağlanır (genellikle nitroselüloz membrana ) Sekans spesifik oligonükleotid problarla hibridizasyon basamağı gerçekleşir Problar florokromla işaretlidir, kemilluminesans yöntem ile tespitini sağlar Alternatif olarak; SSO probları katı fazda sabitlenir ve işaretli PCR ürünü ile hibridize edilir (reverse hibriizasyon). Prob sayısı ne kadar fazlaysa çözünürlük o kadar yüksektir. Orta/ yüksek düzey çözünürlük için genellikle 50-100 prob kullanılır. Amplifiye olan hedef sekans dizisi ile tamamen uyumlu olan prob ile hibridize olur ve pozitif sinyal oluşturur.
PCR-SSP Sekans spesifik primerler kullanılarak DNA amplifiye edilir. Kullanılan primer kombinasyonuna bağlı olarak düşük yada yüksek çözünürlüklü tiplendirme yapılabilir.
qpcr Son zamanlarda qpcr bazlı metotlar da geliştirilmiştir. Bu metotlar primer özgüllüğünü SYBR Green qpcr aracılığı ile Cq değerlerinin belirlenmesi veya allel spesifik PCR ın HRM ile analizini sağlamaktadır. Bu testler hem ucuz hem de test sonuçlandırma süresi kısadır.
SNP (Single nucleotide polymorphism)-1 Populasyonun %1 inden fazlasında DNA sekansında tek bir baz değişimidir. Allel spesifik PCR veya melting curve analizi de ticari olarak kullanıma sunulmuştur.
SNP (Single nucleotide polymorphism)-2 HLA-B*57:01 için tanımlayıcı: HLA kompleksindeki HCP5 bölgesindeki Rs2395029 (G) tespiti Testin duyarlılığının %100, özgüllüğünün %99.4 olduğu bildirilmiştir. SNP genotiplendirmesi teknik olarak daha kolay Test sonuçlandırma süresi kısa
Sekans analizi Altın standart metot 1/1000 bazda hata oranı Forward ve reverse tiplendirme yapılırsa hata oranı 1/1000000 e düşer
Dezavantajları: Pahalı olması Yoğun iş gücü gerekmesi Deneyimli personel gerektirmesi nedeniyle kısıtlı laboratuvarlarda yapılabilmektedir
NGS MHC bölgesindeki HLA genlerinin amplifikasyonunda long range PCR uygulanır ve deep sequencing yapılır Tüm genom sekansı yapılabilir Hızlı metot Veri analizi güç, özel ekipman gereksinimi
Mikroarray Direkt EDTA lı kan ya da genomik DNA kullanılabilir Floresan ile işaretli PCR ürününün oligonükleotid proba spesifik hibridizasyonu özel bir mikroarray tarayıcı ile tespit edilir. Hasta örneğinde HLA-B*57:01 alleli varsa HLA-B*57:01 noktasında floresan sinyal oluşur. Sekans analizi ile kıyaslandığında duyarlılık ve özgüllük %100 olarak bildirilmiştir. Hızlı Basit Bilinen tüm HLA-B*57:01 allelleri tespit edilebilir. Otomatik değerlendirme
Flow sitometri Taramada spesifik monoklonal antikorlar kullanılır HLA-B*57:01 için spesifik bir antikor tanımlanmamıştır Ancak son yıllarda HLA-B*57 ve HLA-B*58 e spesifik olarak bağlanan antikor tanımlanmıştır. Hastaların sadece %5-10 u bu monoklonal antikor ile pozitif saptanacağı için hastaların çoğu ayrıca genotipik HLA-B*57:01 testine alınmayacaktır. Bu yaklaşım ile maliyetler azalacak ve test sonuçlandırma süresi kısalacaktır.
HLA Tiplendirme metotları-moleküler Metot Özellik Avantaj Dezavantaj PCR-SSO (Sekans spesifik oligonükleotid hibridizasyonu (SSO) PCR-SSP (Sekans spesifik primer) Sanger sekanslama Tespit edilmek istenilen genlere spesifik oligonükleotidler kullanılır.hibridizasyonu kontrol etmek için hasta DNA sına hibridize edilir Sekans spesifik primerler kullanılır. Hedef bölgeye spesifik primerlerle DNA amplifiye edilir DNA saflaştırılır ve sekans analizine alınır Spesifik hedef bölge tespiti 10 saat içinde yüksek çözünürlüklü tiplendirme Aynı anda çok sayıda örnek çalışılabilir Her çalışmada kontrol kullanımı gerekli değil PCR-RFLP ve PCR-SSO dan daha hızlı PCR-SSP kadar doğru sonuç Diğer metotlardan daha ucuz En güvenilir ve spesifik Çözünürlük iyi Coverage 2x Yeni alleller de tespit edilebilir Allel sekansı bilinmeli Hibridizasyonda hatalar Olabilir (ısı uygun değilse yalancı negatiflik) Hedef sekansın bilinmesi gerekli Tüm alleller tespit edilemez Belirsiz sonuçlar izlenebilir Pahalı ekipman Align edilmesinde zorluk Next-generation sekans analizi MHC bölgesindeki HLA genlerinin amplifikasyonunda long range PCR uygulanır ve deep sequencing yapılır Total MHC coverage Deep coverage (1000x) Hızlı Doğru Etkili Veri analizi zor
PCR bazlı metotlarla HLA-B*57:01 tespiti PPD ve NPD %100 ve %97 olarak belirlenmiştir. Testin NPD yüksek olsa da; negatif test sonucu hipersensitivite gelişmeyeceği konusunda kesin bilgi vermez. Pozitif saptanan tüm bireylerde de aşırı duyarlılık reaksiyonu izlenmez. Heterolog kan transfüzyonu ve allojenik kan ve kemik iliği alan kişilerde test edildiğinde donör DNA sı bulunabilir. Bu durumda kişinin genotipi doğru bir şekilde belirlenemez. Nadir izlenen veya yeni varyantlar hatalı pozitif veya negatif sonuçlara neden olabilir.
Sonuç olarak HLA-B*57:01 testi hayat boyunca bir kez yapılır, bu nedenle sonuçların kayıtları tutulmalıdır. Testin özgüllüğü duyarlılığından daha düşüktür. Pozitif kişilerin %33-50 sinde aşırı duyarlılık reaksiyonu gelişmez. Negatif test sonucu da aşırı duyarlılık gelişmeyeceğinin garantisini vermez. Tarama mümkün olmadığında ABC tedavisinin başlanabileceği ancak uygun klinik değerlendirme ve aşırı duyarlılık için takip edilme gerekliliği unutulmamalıdır.
TEŞEKKÜRLER