ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ NİTROZO R TUZU KULLANILARAK BAZI METAL KATYONLARININ SPEKTROFOTOMETRİK OLARAK BİRLİKTE TAYİNİNE KEMOMETRİK YÖNTEMLERİN UYGULANMASI Tuğba GÜVEN KİMYA ANABİLİM DALI ANKARA 2011 Her hakkı saklıdır
ÖZET Yüksek Lisans Tezi NİTROZO R TUZU KULLANILARAK BAZI METAL KATYONLARININ SPEKTROFOTOMETRİK OLARAK BİRLİKTE TAYİNİNE KEMOMETRİK YÖNTEMLERİN UYGULANMASI Tuğba GÜVEN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Adnan KENAR Bu çalışmada Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ metal katyonlarının çözeltilerinin birarada birlikte tayini için kemometrik yöntemler uygulanmıştır. Bu çözeltiler Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ metal katyonlarının Nitrozo R tuzu ile komplekslerini içerir. Bu dört bileşeni içeren bir karışım tasarımı kullanılarak 25 çözelti ile deneysel kalibrasyon seti hazırlanmıştır. Her bir dalga boyu için elde edilen absorbans değerleri kemometrik olarak değerlendirilmiştir. Çok değişkenli kalibrasyon yöntemlerinden CLS, PCR ve PLS yöntemleri uygulanmıştır. Dört metal katyonunun bir arada tayininde kullanılacak en iyi tekniğin PCR olduğuna karar verilmiştir. Yöntem gerçek numuneye de uygulanmıştır. Numunedeki geri kazanımlar Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ için sırasıyla %99,2; %71,05; %97,87; %61,81 olarak bulunmuştur. Ağustos 2011, 74 sayfa Anahtar Kelimeler: Çok değişkenli kalibrasyon, Nitrozo R tuzu, Kemometri, Demir, Nikel, Kobalt, Bakır
ABSTRACT Master Thesis THE APPLICATION OF CHEMOMETRIC METHODS TO THE SIMULTANEOUS SPECTROPHOTOMETRIC DETERMINATION OF SOME METAL CATIOS BY USING NITROZO R SALT Tuğba GÜVEN Ankara University Graduate School of Natural and Institute of Science Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Adnan KENAR In this study, chemometric methods are applied for simultaneous spectrophotometric determination of Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ metal cations solutions. That solutions include Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ metal cations complex of with Nitrozo R salt. The experimental calibration set was composed with 25 sample solutions usıng a mixture design for four component mixtures. Absorbance values obtained for each wavelength were evaluated as a Chemometric. CLS, PCR and PLS methods of multivariate calibration methods have been applied. Four metal cation used in the determination of a combination of PCR were chosen as the best technique. The method was applied in real sample. Recoveries were found respectively %99,2; %71,05; %97,87; %61,81 for Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ August 2011, 74 pages Key Words: Multivariate Calibration, Nitrozo R Salt, Chemometrics, Iron, Nickel, Cobalt, Copper ii
TEŞEKKÜR Çalışmalarım sırasında beni yönlendiren, araştırmalarımın her aşamasında yardım ve desteğini esirgemeyen değerli hocam Prof. Dr. Adnan KENAR a (Ankara Üniversitesi Kimya bölümü öğretim görevlisi) en içten duygularımla teşekkür ederim. Deney sürecimde her türlü fikir alışverişinde bulunduğum ve birlikte çalıştığım sevgili arkadaşım Nilüfer KAYA ya çok teşekkür ederim. Tez yazım sürecimde yanımda olan ve desteğini benden esirgemeyen Düzen Laboratuvarları grubu Özel Kimya birimdeki iş arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım. Her zaman yanımda olup manevi desteğini esirgemeyen sevgili aileme ve değerli arkadaşım Erhan ÖZER e sonsuz sevgi ve teşekkürlerimi sunarım. Tuğba GÜVEN Ankara, Ağustos 2011 iii
İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii İÇİNDEKİLER... iv KISALTMALAR DİZİNİ... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ... ix 1. GİRİŞ... 1 1.1 Araştırmanın Amacı ve Kapsamı... 1 1.2 Araştırmanın Önemi... 2 2. KAYNAK ÖZETLERİ... 3 3. KURAMSAL TEMELLER... 6 3.1 Kemometri... 6 3.1.1 Kemometri`nin tanımı ve analitik kimyada önemi... 6 3.1.2 Kemometri tarihi... 7 3.2 Matrisler... 8 3.3 Kalibrasyon... 8 3.3.1 Tek değişkenli kalibrasyon... 9 3.3.2 Çok değişkenli kalibrasyon... 10 3.3.3 Temel bileşen analizi (Principal component analysis - PCA)... 11 3.4. Çok Değişkenli Kalibrasyon Teknikleri... 14 3.4.1 CLS (Klasik en küçük kareler yöntemi- Classical least squares)... 15 3.4.2 PCR (Temel bileşen regresyonu-principal component regression)... 19 3.4.3 PLS (Kısmi en küçük kareler-partial least squares)... 22 3.5 Deneysel Tasarım... 24 3.5.1 Beş seviyeli tasarım... 25 3.6 Nitrozo R Tuzu... 27 3.7 Ultraviyole (Morötesi) Görünür Bölge Moleküler Absorbsiyon Spektroskopisi... 28 4. MATERYAL VE YÖNTEM... 35 4.1 Kullanılan Cihazlar... 35 4.2 Kullanılan Kimyasal Maddeler... 35 iv
4.3 Kullanılan Çözeltiler... 35 4.3.1 NRS çözeltisi (1000 ppm)... 35 4.3.2 Metal katyonlarının stok çözeltileri (10 ppm)... 36 4.3.3 Amonyum Asetat tampon çözeltisi (1 M )... 36 4.3.4 Standart referans maddeler... 36 4.3.5 Kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanması... 37 4.4 Yöntem... 39 4.4.1 Kompleks oluşumu... 40 4.4.2 Optimum ph belirlenmesi... 40 4.4.3 Maksimum absorpsiyon dalga boyunun belirlenmesi... 40 4.4.4 Kompleks oluşum süresinin belirlenmesi... 40 4.4.5 Seviye değerlerinin belirlenmesi... 40 4.5 Kompleks Oluşumuna Bozucu Metal Katyonlarının Etkisinin Belirlenmesi... 41 5.BULGULAR... 42 5.1 Kompleks Oluşumunda Optimum Şartların Belirlenmesi... 42 5.1.1 Kompleks oluşumu... 42 5.1.3 Optimum ph belirlenmesi... 43 5.1.2 Maksimum absorpsiyon dalga boyunun belirlenmesi... 44 5.1.4 Kompleks oluşum süresinin belirlenmesi... 47 5.1.5 Seviye değerlerinin belirlenmesi... 47 5.2 Kalibrasyon... 49 5.3 Kompleks Oluşumuna Bozucu Metal Katyonlarının Etkisinin Belirlenmesi... 57 5.4 Alt Tayin Sınırı... 58 5.4.1 Seviye değerlerini düşürme metoduyla... 58 5.3.2 CLS ve PCR metotlarında sırasıyla tanımlanan b ve K eğim değerlerini kullanarak... 63 5.5 Yöntemin Sandart Referans Maddeye Uygulanması... 66 6.TARTIŞMA VE SONUÇ... 68 KAYNAKLAR... 71 ÖZGEÇMİŞ... 74 v
KISALTMALAR DİZİNİ NRS UV-GB CLS ILS PCA PCR PLS PRESS RMSEPs MEF HPLC MLR CV Nitrozo-R tuzu Ultraviyole-Görünür Bölge Klasik En Küçük Kareler Ters En Küçük Kareler Temel Bileşen Analizi Temel Bileşen Regresyonu Kısmî En Küçük Kareler Tahmini Artık Hata Kareler Toplamı Tahmini Hataların Karelerinin Karekökü Mefanamik Asit Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi Çoklu Lineer Regresyon Çapraz Doğrulama (cross-validasyon) vi
ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1 Nitrozo R tuzu nun açık formulü..1 Şekil 3.1 PCA nın temeli.12 Şekil 3.2 PLS nin temeli..22 Şekil 3.3 Nitrozo R tuzunun açık formulü...27 Şekil 3.4 Nitrozo R tuzunun Fe(III) iyonuyla yaptığı kompleks yapı.27 Şekil 3.5 Yansıma ve saçılma kayıpları...28 Şekil 3.6 Tek ışın kaynaklı UV-GB spektrofotometresinin çalışma prensibi.30 Şekil 3.7 Çift ışın kaynaklı UV-GB spektrofotometresinin çalışma prensibi.30 Şekil 3.8 Spektrofotometride çalışma aralığı belirlemede maksimum absorbans seçiminin gösterimi.....32 Şekil 3.9 Moleküllerdeki elektronik geçişler...32 Şekil 5.1 Bazı metal katyonlarının Nitrozo R tuzu ile yaptığı komplekslerin birlikte spektrumu 42 Şekil 5.2 Farklı ph larda hazırlanmış kompleks çözeltileri 43 Şekil 5.3 Ligandın spektrumu..45 Şekil 5. 4 ph=7 de Fe 3+ -NRS kompleksinin spektrumu 45 Şekil 5.5 ph=7 de Ni 2+ -NRS kompleksinin spektrumu..46 Şekil 5.6 ph=7 de Co 2+ -NRS kompleksinin spektrumu.46 Şekil 5.7 ph=7 de Cu 2+ -NRS kompleksinin spektrumu.46 Şekil 5.8 ph=7 de dört metal katyonunun-nrs komplekslerinin üst üste alınmış spekrumlarının bir arada gösterimi.47 Şekil 5.9 NRS komplekslerinin oluşumuna zamanın etkisi 47 Şekil 5.10 Farklı konsantrasyonlarda Fe 3+ -NRS kompleksi spektrumları...48 Şekil 5.11 Farklı konsantrasyonlarda Ni 2+ -NRS kompleksi spektrumları...48 Şekil 5.12 Farklı konsantrasyonlarda Co 2+ -NRS kompleksi spektrumları..49 Şekil 5.13 Farklı konsantrasyonlarda Cu 2+ -NRS kompleksi spektrumları..49 Şekil 5.14 Kalibrasyon çözeltilerinin spektrumu 50 Şekil 5.15 Fe 3+ için CLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği...51 Şekil 5.16 Ni 2+ için CLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği...51 Şekil 5.17 Co 2+ için CLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği..52 Şekil 5.18 Cu 2+ için CLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği..52 vii
Şekil 5.19 Fe 3+ için PCR yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği...53 Şekil 5.20 Ni 2+ için PCR yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği...53 Şekil 5.21 Co 2+ için PCR yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği..54 Şekil 5.22 Cu 2+ için PCR yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği..54 Şekil 5.23 Fe 3+ için PLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği...55 Şekil 5.24 Ni 2+ için PLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği...55 Şekil 5.25 Co 2+ için PLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği...56 Şekil 5.26 Cu 2+ için PLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği...56 Şekil 5.27 Seviye değerlerini düşürme yöntemiyle gözlenebilme sınırı tayini için 1.bilinen bulunan grafiği.....59 Şekil 5.28 Seviye değerlerini düşürme yöntemiyle gözlenebilme sınırı tayini için 2.bilinen bulunan grafiği...60 Şekil 5.29 Seviye değerlerini düşürme yöntemiyle gözlenebilme sınırı tayini için 3.bilinen bulunan grafiği.....61 Şekil 5.30 Seviye değerlerini düşürme yöntemiyle gözlenebilme sınırı tayini için tüm veriler bilinen bulunan grafiği.62 Şekil 5.31 Seviye değerlerini düşürme yöntemiyle bulunan alt tayin sınırı 63 Şekil 5.32 Tüm verilerin matris halinde gösterimi...64 Şekil 5.33 Seçilen verilerin matris halinde gösterimi..65 Şekil 5.34 Her dalga boyu için bulunan eğimlerin matris halinde gösterimi..65 viii
ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Beş seviyeli tasarım....26 Çizelge 4.1 Standart Referans Madde Bileşimleri.....37 Çizelge 4.2 Kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanmasında kullanılan seviye değerleri..37 Çizelge 4.3 Kalibrasyon çözeltilerinin (kalibrasyon setinin) derişimleri 38 Çizelge 4.4 Kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanmasında kullanılan çözeltilerin hacimleri...39 Çizelge 5.1 Metal komplekslerinin max. Dalga boylarında farklı ph`larda ki absorbans değerleri....47 Çizelge 5.2 Cu 2+, Ni 2+, Co 2+, Fe 3+ metal katyonları-nitrozo R tuzu komplekslerinin maksimum absorbans yaptıkları dalga boyları.....48 Çizelge 5.3 CLS, PCR ve PLS1 yöntemi ile bulunan PRESS, m ve kalibrasyon seti için geri kazanım değerleri.......57 Çizelge 5.4 Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ metal katyonlarının NRS komplekslerine diğer metal katyonlarının etkisi... 58 Çizelge 5.5 Seviye değerlerini düşürme yöntemiyle bulunan alt tayin sınırları..63 Çizelge 5.6 IUPAC yöntemi ile CLS ve PCR kalibrasyonları kullanılarak bulunan alt tayin sınırları.......66 Çizelge 5.7 Standart referans maddelerden hazırlanılan numunelerden elde edilen sonuçların PCR yöntemi ile değerlendirilmesi.67 ix
1. GİRİŞ 1.1 Araştırmanın Amacı ve Kapsamı Kompleksleştiriciler kullanılarak metal katyonlarının birlikte tayini bu çalışmanın amacıdır. Metal katyonlarının tayinleri ile ilgili pek çok spektrofotometrik metot geliştirilmiş ve bu konuda da oldukça fazla sayıda literatür bulunmaktadır. Ancak bu çalışmaların neredeyse tamamına yakını her bir katyonun ayrı ayrı tayin edilmesi veya bir arada tayin edilecekse, bozucu etkilerinin giderilmesi üzerine çalışılmıştır. Bu çalışmada ise metal katyonlarından özellikle Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2 metal katyonlarının dördünün bir arada bulunduğu ortamlarda herhangi bir önlem alınmaksızın tayinleri planlanmıştır. Bu metallerle kararlı ve renkli kompleksler oluşturabilen nitrozo R tuzu (3 hidroksi-4-nitrozo-2,7-naftalin disülfonik asit di sodyum tuzu) reaktifi kullanılmıştır. Şekil 1.1 Nitrozo R tuzu nun açık formulü Bu tez çalışması için planlanan yöntemlerin en önemli özelliği4 metal katyonunun bir arada ve farklı konsantrasyonlar da iken bir tek ligand yardımıyla spektrofotometrik olarak tayinine olanak veren bir yöntem geliştirmesi olacaktır. Spektrofotometrik olarak elde edilen verilerin değerlendirilmesinde kemometrik olarak çok değişkenli kalibrasyon tekniklerii kullanılacaktır. 1
1.2 Araştırmanın Önemi Metal katyonlarının tayini kimyada her zaman önemli bir yer tutmuştur. Metal katyonları içeren numune analizlerinde metal katyonlarının cinsine ve miktarına bağlı olarak uygun bir analiz yönteminin seçilmesi zorunludur. Genellikle analizlenecek numunede analit, analite bozucu etki yapan bir matriks ortamında bulunur. Numunenin analiz edilmeden önce bu bozucu etki yapan türlerin ortamdan uzaklaştırılması veya bulunduğu ortamda maskelenmesi gerekir. Bu işlem analiz işleminde en fazla hatanın yapıldığı kısımdır. Ayırma ve maskeleme sırasında ortamdan bir miktar analitte uzaklaştırılabilir. Her iki durumda da hata kaçınılmazdır (Zarei, 2005). Genellikle numunede tayin edilecek madde tek değildir. Birden fazla katyonun analiz edilmesi gerekebilir. Böyle bir numunede genellikle metal katyonları uygun ayırma teknikleri kullanılarak her bir katyonun ayrı ayrı tayin edilmesi gerekebilir. Bütün bu olumsuzlukların numunede tayin edilecek türlerin mümkün olduğunca ortamdan uzaklaştırılmadan birlikte tayin edilmesiyle ilgili yöntemleri ön plana çıkartmaktadır. Kimyada özellikle analitik kimyada karmaşık numunelerin analizinde hızlı, doğru, kesin ve güvenilir sonuçlara ulaşmak önemlidir. Bir kimyacı bir gün içerisinde yaptığı deneylerden onlarca veri elde edebilir. Bu verilerin değerlendirilmesi için istatistikçiye gerek duymaması zamandan kazanmasına yardımcı olur. Bu sebeple bir kimyacının ölçme ve değerlendirme bilimlerinden kemometriyi biliyor ve uygulayabiliyor olması gerekir. Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ gibi bir çok metal iyonlarıda gerçek örnekte bir arada bulunur. Dolayısıyla farklı örneklerdeki bu iyonların birlikte tayini için UV-GB, x ışınları floresansı, atomik floresans spektrofotometri, polarografi, kromatografi ve atomik absorpsiyon spekrometri gibi teknikler kullanılmaktadır. Bunlar arasında en yaygın olanı UV-GB spektrofotometridir (Rodrigez, 1998). Ancak klasik spektrofotometrik teknikler kullanılarak bu iyonların birlikte tayini zordur, çünkü genellikle absorpsiyon spektrumları belli bir bölgede çakışır ve üst üste binen eğriler nicel değerlendirme için uygun değildir. Son zamanlarda kantitatif spektrofotometri CLS, PCR, PLS gibi çok değişkenli istatistiksel yöntemlerin kullanılmasıyla gelişmiştir (Ghasemi, 2003). 2
2. KAYNAK ÖZETLERİ Nitrozo R tuzu kullanılarak karışımlarda PLS ile Co, Cu ve Ni`in birlikte spektrofotometrik tayini isimli çalışmada Co, Cu ve Ni sırasıyla 0,4-2,6 ppm; 0,6-3,4 ppm; 0,5-5,5 ppm konsantrasyonlarında çalışılmıştır. Ghasemi ve arkadaşlarının bu çalışması bir çok yönden çalışmamıza benzer ayrıldığı noktalar vardır. Absorpsiyon spektrumu 470-600 nm arasında kaydedilmiştir, optimum ph 7,8 olarak belirlenmiştir, 4 değil 3 metal katyonu birarada tayin edilmiştir ve çok değişkenli kalibrasyonu PCR ile değil PLS verileri kullanılarak yapılmıştır. Değişik bozuculara karşı tolerans araştırılmış, bunun için çeşitli anyon ve katyonlar içerisinde Co 2+, Cu 2+ ve Ni 2+ ìn tayini yapılmış, katyonların konsantrasyonu üzerine bozucuların ±%5 den fazla değişikliğe yol açmadığı belirlenmiştir. PLS kullanılarak RMSD değerleri Co 2+ için 0,0192, Cu 2+ için 0,0263, Ni 2+ için 0,0446 ppm olarak bulunmuştur. Çeşitli katyon ve anyonların etkileri incelenmiştir. CONİFE ve CONİCO olarak bilinen iki karışım numunesine bu metot uygulanmıştır (Ghasemi vd. 2003). UV-GB spektrofotometrik olarak çok değişkenli kalibrasyon ile Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2 `ın birlikte tayini isimli çalışmalarında bu metallerin 1,5-bis(di-2-piridil metilen) tiyokarbonohidrazid (DPTH) ile kompleksleri oluşturulmuştur. Bu metal iyonlarının dörtlü karışımlarının kararlılığı kemometrik yaklaşımlarla sağlanmıştır. Bu koşullarda Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ iyonlarını içeren karşımın absorbansının 30 dakika sonra sabit kaldığı görülmüştür. ph= 4` te sabitlenmiştir. Konsantrasyon aralığı Co 2+, Ni 2+, Fe 3+ ve Cu 2+ için sırasıyla 0,2-1,3 µg/ml ;0,1-1,2 µg/ml ;0,1-1,1 µg/ml ve 0,2-1,2 µg/ml dir. PCR ve PLS kullanılarak karışımdaki iyonların birlikte tayininden elde edilen sonuçlar hesaplanmıştır. En iyi geri kazanım PLS-2 metodu ile elde edilmiştir (Rodriguez vd. 1998). PLS kullanarak katı faz ekstasyonu ile eser miktardaki Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ `ın birlikte spektrofotometrik tayini ile ilgili bir çalışma yapmışlardır. Bu metallerin 1-(2- pridilazo)-2-naftol (PAN) ile kompleksleri kullanılmıştır. 400-700 nm arası dalga boyları kullanılmış ve PLS için 21 adet kalibrasyon çözeltileri sırasıyla Co, Ni, Cu için 5,90-41,25 ng/ml, 0,30-29,35 ng/ml, 0.64-41.30 ng/ml aralığında hazırlanmıştır. 3
Optimum ph 5,5 için asetik asit/sodyum asetat tamponu kullanılmıştır. Bileşenleri sayısını seçmek için çapraz doğrulama yöntemi kullanılmıştır. Tahmini hataların karelerinin karekökü (RMSEPs) 0,48-1,37 ng/ml arasındadır (Hejazi vd. 2004). Fe(III), Al(III), ve Cu(II) nin spektrofotomektik olarak birlikte tayini için Alizarin-Red tuzunu bu üç katyon için şelatlayıcı olarak kullanmıştır. Optimum ph 5 olarak tespit edilmiştir. Bu üç metal katyonunun birlikte tayini için çok değişkenli kalibrasyon metotlarından PLS (partial least squares) kullanılmıştır. 400-800 nm aralığında alınan spektrumlar matlab programında uygun bir yazılımla değerlendirilmiştir. 18 adet üçlü karışımı içeren standart çözeltilerle kalibrasyon yapılmıştır. Sentetik karışımlara uygulandığında toplam bağıl standart hata % 5 den daha küçük olduğu hesaplanmıştır (Safavi vd. 2006). Fe(II), Ni(II) ve Co(II) nin 1-(2-pridilazo)-2- naftol (PAN) ile komplekslerini oluşturularak spektrofotometrik olarak birlikte tayini amaçlanmıştır. Fe(II), Ni(II) ve Co(II) ın reaktif ile kompleksleri spektral çakışma gösterir. Bu metal katyonları PLS ile birlikte ya da ayrı olarak Direkt ortagonal sinyal doğrulama (direct orthogonal signal correction, DOSC) kullanılarak birlikte tayin edilebilmiştir. Sonuçlar PLS ve DOSC- PLS istatistik hesaplarından elde edilmiştir. Önerilen bu metot sentetik örnekler içerisinde Fe(II), Ni(II) ve Co(II) ın tayini için tatmin edici bir uygulama önerilmiştir. Fe(II), Ni(II) ve Co(II) nın PAN kompleksleri su içerisinde çözülmediğinden TritonX- 100 kullanarak suda çözülmeleri sağlanmıştır. Fe(II), Ni(II) ve Co(II) ı ayırmak için sıcaklığın ve iyonik güçlerin etkisi araştırılmıştır. 10 C- 40 C aralığındaki absorbanslar da sıcaklığın etkisi optimize koşulları bozmadığı görülmüştür. Bu aralıkta absorbanslar değişmemektedir. Bu yüzden deneyler oda sıcaklığında yapılmıştır. Co(1,20), Fe(2,55), Ni(0,70µg/ml) olan sentetik numunedeki bu metalleri DOSC-PLS metodu kullanarak sırasıyla Co(1,20±0,04), Fe(2,5±0,09), Ni(0,70±0,04) olarak bulunmuştur (Zarei vd. 2005). PLS yöntemiyle bir kromojenik reaktif yardımıyla farmasötiklerdeki Fe(II) ve Fe(III)`ün birlikte tayini ile ilgili bir çalışma yapmıştır. ph=4,5 ta demir iyonlarının ve reaktif olan 1,10-fenantrolin ve 5-sülfosalisilik asit arasındaki reaksiyona dayanmaktadır. Optimum çalışma koşulları belirlenmiştir. Reaktif konsantrasyonu 4
3.10-3 mol/dm 3 olarak seçilmiş ve ph 2,0-6,0 aralığında çalışılmış ve en uygun ph= 4,5 seçilmiştir. Oluşan komplekslerin absorpsiyon spektrumları reaktifler karıştırıldıktan sonra 5-10 dakika kararlıdır. Kalibrasyon Fe(II) ve Fe(III) sırasıyla 0,1-7,0 µg/ml ve 0,5-14,0 µg/ml içeren 34 farklı kalibrasyon seti ve 400-600 nm dalga boyu aralığında absorbans ölçümlerinden hesaplanmıştır. Önerilen metot farmasötik numunelerdeki Fe(II) ve Fe(III) iyonlarının tayinine başarıyla uygulanmıştır (Niazi, A. 2006). Analitik kimyacılar için kemometrinin ne olduğunu çok değişkenli kalibrasyonu anlattığı bir makaledir. Kemometri 30 yılı aşkın süredir kullanılan fakat hala potansiyel yararları istenilen genişlikteki kitleye ulaşmamıştır. Çalışmasında analitik kimyanın aslında kemometrik yaklaşımı içermelidir ve bunu yapmanın avantajları vardır iddialarını ileri surer. Kemometrik yöntemlerin en önemli yararları küçük, interferans işlenmesi, keşif yönü ve olası uç kontrolü. Ayrıca kemometri içindeki bazı yeni gelişmeler açıklanmıştır. Çok değişkenli veri analiz araçlarının bazı özellikleri çalışmada madde madde verilmiştir (Rasmus Bro, 2003). Demir, titanyum ve alüminyumun Triton-X varlığında morin (3,5,7,2,4 -penta hidroksi flavon) ile komplekslerini oluşturarak spektrofotometrik olarak birlikte tayinlerini yapmışlardır. Demir, titanium ve alüminyum üçlü karışımına PLS uygulanmış ve başarılı sonuçlar elde edilmiştir. Fe(III), Ti(IV) ve Al(III)`ün tayin sınırları sırasıyla 0,03; 0,04 ve 0,02 ppm bulunmuştur. 20 sentetik örneğe bu yöntem uygulanmış derişim aralıkları sırasıyla 0,04-1,5 ppm, 0,06-1,6 ppm ve 0,03-1,0 ppm, bağıl standart sapma %5 bulunmuştur (Safavi, 2003). 5
3. KURAMSAL TEMELLER 3.1 Kemometri 3.1.1 Kemometri`nin tanımı ve analitik kimyada önemi Numerik yöntemler olarak da adlandırılan kemometrik yöntemler son yıllarda spektrumlardan elde edilen ölçüm değerlerinin bilgisayar destekli programlar ile lineer denklem sistemlerinin çözümüne dayalı kalibrasyonların ve ölçüm değerlerinin karışımlarını içeren algoritmalar kullanılarak kalibrasyonların kurulduğu matematiksel yöntemlerdir (Kramer, R. 1998). Günümüzde kemometrik yöntemlerin gelişmesiyle birden fazla etken madde içeren farmasötik ürünlerin kantitatif analizi hiçbir kimyasal ön ayırma işlemi ve hiçbir maskeleme işlemi gerektirmeksizin hızlı, doğru ve hassas olarak gerçekleştirilmektedir. Kemometrik hesap yöntemlerini spektrofotometrik, elektrokimyasal ve kromatografik ölçüm cihazlarından elde edilen verilere uygulamak mümkündür (Dinç vd, 2007). Birden fazla etken madde içeren ürünlerin içerisindeki bu etken maddelerin aynı bölgede absorbans vermeleri sonucunda spektral girişimleri nedeniyle doğrudan kantitatif analizleri mümkün olmadığı için bir ayırma işleminin ardından ancak analizleri yapılabilir. Bu durum uzun yıllar analizlerde UV-görünür alan spektrofotometrilerin kullanımını kısıtlamış, pahalı ve kompleks cihazlar olan HPLC kullanımını gerektirmiştir. Ancak günümüzde karışım analizlerinde UV-görünür alan spektrofotometrisi, kemometrik yöntemlerin kullanımıyla tekrar güncellik kazanmıştır. Kemometrik yöntemlerle bir maddenin kantitatif analizi, maddenin UV-görünür alan spektrumundaki birden fazla dalga boyundaki absorbans ölçümleri kullanılarak, daha hassas bir şekilde gerçekleştirilebilmektedir. Son yıllarda CLS, PCR ve PLS gibi kemometrik yöntemler analitik kimyacıların sık sık kullandıkları yöntemler olmuştur. Kompleks karışımların kantitatif analizinde kemometrik yöntemler, spektrumlardan ölçülen absorbans değerleri ile konsantrasyonlar arasındaki kalibrasyon algoritmalarına göre kalibrasyonlar hazırlanır ve bu kalibrasyonlarda çok sayıda dalga boyunun 6
ölçümlerde kullanılması sonucunda ortalama nedeniyle gürültü piklerinin etkisi ya tamamen ortadan kaldırılır ya da azaltılır (Haaland ve Thomas, 1990). Kemometri günümüzde lineer cebir matematiğine dayalı olarak bilgisayar destekli kalibrasyonlar kurularak kantitatif analizlerin yapılmasına olanak sağlayan analitik kimyanın bir koludur (Dinç, 2007). Kemometrik uygulamaların çoğu kompleks hesaplamalar içerir. Bu hesaplamaları elle veya hesap makinesi ile yapmak mümkün olmadığı için bilgisayar programlarına ihtiyaç vardır. Genellikle EXCEL, MATLAB ve diğer paket programlar kullanılır (Dinç, 2007). Kemometri içerik olarak; tanımlayıcı ve açıklayıcı istatistik (descriptive and inference statistics), sinyal işleme (signal processing), deneysel tasarım (experimental design), modelleme (modelling), kalibrasyon (calibration), optimizasyon (optimization), yapı tanıma (pattern recognition), sınıflandırma (classification), yapay akıl yöntemleri (artificial intelligence methods), resim işleme (image processing), bilgi ve sistem kuramı (information and system theory), gibi kavram ve uygulamaları kemometrinin konularını oluşturmaktadır (Dinç, 2007). 3.1.2 Kemometri tarihi Kemometri kelimesi ilk olarak 1970 li yılların ortalarında İsveçli organik kimyacı Svante Wold tarafından kullanılmaya başlanmış bir kelimedir. Bu kelime, bilgisayar teknolojisinin gelişmesi ile birlikte gelişmeye başlayan ve İngilizcede Computational Chemistry olarak adlandırılan ve bilgisayar destekli kimya olarak adlandırılabilen bilim dalındaki gelişmelerin sonucu ortaya çıkan bir kelimedir. Bu kelime İngilizcede kimya ve ölçme kelimelerinin bir araya gelmesinden meydana gelmiştir ve kimyada uygulanan çeşitli ölçme ve değerlendirme işlemlerine bilimsel bir yaklaşımı ifade etmekte ve içermektedir. 1974 yılında uluslararası kemometri derneği tarafından bu disiplinin ilk resmi açıklaması yapılmıştır (Research Group for Chemometrics, Umeå University). 7
3.2 Matrisler Basitçe bir matris kolon ve satırlardan oluşmuş bir skalar seti olarak düşünülebilir. Örneğin bir A matrisi: 2 5 0 A= 3 1 8 veya A=[2 5 0 ; 3 1 8] Bu bir 2x3 matrisidir. 2 satır ve 3 kolondan oluşmuştur. Matrisler pozitif veya negatif değerler içerebilir. (Kemometride karşılaşılan birçok matrisler sadece pozitif değerler içerir.) A nın her bir elementi simgelerle gösterilir. A ij A nın i. satır j. kolonundaki elementi gösterir. 3.3 Kalibrasyon Kalibrasyon, bir cihazın ya da deneysel bir sonucun doğruluğundan emin olmak için doğruluğu bilinen bir değerle karşılaştırma işlemidir. Gravimetri ve kulometri hariç bütün analitik yöntemler için kalibrasyon gerekir. Yöntemin kalibrasyonu ölçülen analitik sinyal ile analit derişimi arasındaki ilişkinin belirlenmesidir. Bu işlem analit derişimi kesin olarak bilinen birkaç standart çözelti cihaza verilerek sinyal ölçülür. Analit derişimine karşı sinyal grafiğe geçirilir. Kalibrasyon grafiğinin başarısı standart çözeltilerin ortamının analitik çözeltisinin ortamına benzemesine bağlıdır (Kılıç ve Köseoğlu, 1994 ). 8
3.3.1 Tek değişkenli kalibrasyon Tek değişkenli kalibrasyon iki değişken arasındaki ilişkiyi içerir. Bu kalibrasyona lineer regresyon da denir. Bu kalibrasyon, tek bir spektroskopik dalga boyundaki absorbansı kullanarak bir bileşiğin derişimini tayin etmek için uygulanır. Matematiksel olarak, derişimler ile absorbanslar arasında, aşağıdaki şekilde bir eşitlik yazılabilir. X=C.S (3.1) Bu eşitlikte X örneklerin tek bir dalga boyundaki absorbanslarından oluşan bir vektörü, C ise örneklerin derişimlerinden oluşan vektörü göstermektedir. Her iki vektörün de uzunluğu, I, örneklerin sayısına eşittir. S skaları ise, bu iki parametre arasındaki ilişkiyi verir ve aşağıdaki eşitlikten bulunur.... İ İ İ. İ İ İ İ (3.2) Yeni ve bilinmeyen bir örneğin derişimi ise, (3.3) Tahmin edilen derişimin hata kareleri ortalaması kökü, E, aşağıdaki eşitlikten hesaplanabilir. İ İ İ İ (3.4) Bu eşitlikte d=i-1 (3.5) dir (Martens, 1989). 9
3.3.2 Çok değişkenli kalibrasyon Çok değişkenli kalibrasyona çoklu lineer regresyonda (MLR) denir. Bu kalibrasyon birden fazla absorbans kullanıldığında uygulanır. Bunun iki önemli sebebi vardır. Birincisi, bir karışımda bir bileşenden daha fazla bileşen bulunabilir. Böyle durumlarda, bir absorbans değerinden daha fazlası kullanılmalıdır. İkincisi, her dalga boyundaki absorbans ilave ve genellikle tamamlayıcı bilgi içerir. Ayrıca, bir spektrumdaki bazı dalga boyları gürültü veya bilinmeyen, girişim yapıcı maddeler tarafından etkilenebilir. Kalibrasyon eşitlikleri aşağıdaki şekilde bulunabilir. X veri matrisi ile C derişim ve S spektral matrisleri arasında aşağıdaki ilişki yazılabilir.. (3.6) S matrisi aşağıdaki eşitlikten tahmin edilebilir... (3.7) Derişimler ise aşağıdaki eşitlik kullanılarak tahmin edilebilir.... (3.8) Bilinmeyen bir spektrumdaki derişimler aşağıdaki eşitlikten tahmin edilebilir..... (3.9) Tahmin edilen derişimin hata kareleri ortalaması kökü, E, aşağıdaki eşitlikten hesaplanabilir. İ İ İ İ (3.10) Bu eşitlikte, (3.11) dir. Burada, P modeldeki bileşiklerin sayısıdır (Martens, 1989). 10
3.3.3 Temel bileşen analizi (Principal component analysis - PCA) Çoklu lineer regresyonu esas alan yöntemlerin dezavantajı, karışımdaki tüm önemli bileşenlerin bilinmesi gerektiğini kabul etmeleridir. Bu kabul doğru ise, iyi sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntemler, bilinmeyen ve girişim yapıcı bileşenlerin bulunduğu karışımlara uygulandığında, önemli tahmin hatalarına sebep olabilirler. Temel bileşenler analizini esas alan yöntemler bir karışımdaki tüm bileşiklerin spektrumları veya derişimleri hakkında ayrıntılı bilgilere ihtiyaç duymamalarına rağmen, bir karışımı oluşturan önemli bileşenlerin sayısını duyarlı bir şekilde tahmin etmek, hataları azaltmak için önemlidir. Eşitlik 7 aşağıdaki şekilde yeniden yazılabilir.. (3.12) Burada, E hata matrisidir. X matrisi deneysel olarak bulunur ise, C ve S matrisleri de tahmin edilebilir ve eşitlik aşağıdaki şekilde yazılabilir.. (3.13) İdeal durumda, tahmin edilen spektrumlar gerçek spektrumlara yakındır. Fakat, gerçekte, deneysel verilerde her zaman ölçüm hatası yapılır. Temel bileşenler analizi, veri matrisinin, X, aşağıdaki soyut matematiksel dönüşümüyle yapılır. X=T.P+E (3.14) Bu eşitlikte, T skorlar (scores), P yüklemeler (loadings) demektir (Martens, 1989). Her skor matrisi sütun vektörlerinden ve her yükleme matrisi de satır vektörlerinden oluşur. Bu vektörler t a ve p a ile gösterilir. Burada, α temel bileşen sayısıdır (1,2,3, A). T ve P matrisleri bu vektörlerden oluşur. Bu vektörlerin her biri bir temel bileşene aittir. Birinci skor ve birinci yükleme vektörlerine genellikle birinci ana bileşenin özvektörleri denir. Her bileşen bir öz vektör çifti ile tanımlanır. 11
Şekil 3.1 PCA`nın temeli Tüm skor ve yükleme vektörleri aşağıdaki özelliklere sahiptir.. 0 ve. 0 (3.15) Burada a b dir ve t ve p ilgili özvektörlerinin elemanlarını göstermektedir. Her yükleme vektörü için 1 (3.16) Eşitliği yazılabilir. Orijinal veriler temel bileşenler kullanılarak yeniden elde edilebilirler. A sayıda temel bileşen kullanarak, X matrisinin her elemanı için aşağıdaki eşitlik yazılabilir. (3.17) Temel bileşen analizinden sonra, her bileşenin büyüklüğü özdeğeri (eigenvalue) hesaplanarak bulunabilir. Daha önemli bileşenler daha büyük özdeğerlere sahiptir. Özdeğer skorlarının kareleri toplamına eşittir. (3.18) Burada g a, a`nıncı özdeğerdir. Bir veri matrisinde sıfır olmayan tüm özdeğerlerin toplamı tüm veri matrisinin kareleri toplamına eşittir. 12
(3.19) Özdeğerler yüzde olarak aşağıdaki şekilde ifade edilebilir. 100. İ (3.20) Ard arda gelen özdeğerler daha küçük yüzdelere sahiptir. Birikimli yüzde özdeğer, ana bileşenler analizini kullanarak, verilerin hangi oranda modellendiğini tayin etmek için kullanılır ve α ga ile verilir. Artık kareler toplamı (Residual sum of squares,rss) aşağıdaki eşitlikten bulunabilir. İ (3.21) Artık aşağıdaki eşitlik ile verilir. (3.22) Bu eşitliklerden, İ İ (3.23) bulunur. Önemli bileşenlerin (faktörlerin) sayısını tayin etmek için kullanılan yöntemlerin önemli bir kısmı çapraz-doğrulamayı (cross validation -CV) esas almaktadır. Çapraz-doğrulama yöntemi aşağıdaki şekilde uygulanır. Birinci örnek 1(=i) veri setinden çıkarılır. Geri kalan I-1 örneğe temel bileşenler analizi uygulanır. T skorları ve P yüklemeleri elde edilir. i örneği için skorlar bulunur.. (3.24) i örneği ve α sayıda temel bileşen için model tayin edilir.,. (3.25) 13
Daha sonra, diğer bir örnek veri setinden çıkarılır ve 2. Basamaktan itibaren işlemler tekrarlanır. Bu işlemlere tüm örnekler veri setinden birer defa çıkarılıncaya kadar devam edilir. Tahmin edilen artık hata kareler toplamı (predicted residual error sum of squares, (PRESS) hesaplanır. İ, (3.26) PRESS hataları, artık kareler toplamı, RSS, hataları ile karşılaştırılır. İ (3.27) (Martens, 1989) 3.4. Çok Değişkenli Kalibrasyon Teknikleri Çok değişkenli kalibrasyon tarihsel olarak kemometrinin en büyük köşe taşı olmuştur. Çok değişkenli kalibrasyon metotlarının uygun olduğu birçok durum vardır. Buradaki zorluk kapsamlı bir veri seti oluşturmaktır, bazı durumlar için analitik teknikler çok fazla kaynak ve zaman yatırımı alır, bu nedenle bilimin bazı alanlarında çok değişkenli kalibrasyon uygulamaları diğerlerinden daha az kullanılır (Brereton 1992). Bu çalışmada CLS, PCR ve PLS kullanılmıştır. 1) CLS (Klasik En Küçük Kareler Yöntem- Classical Least Squares) 2) PCR (Temel Bileşen Regresyonu-Principal Componenet Regression) 3) PLS (Kısmi En Küçük Kareler-Partial Least Squares 4) ILS (Ters En Küçük Kareler Yöntemi-Inverse Least Squares) 14
3.4.1 CLS (Klasik en küçük kareler yöntemi- Classical least squares) CLS kalibrasyon yöntemi spektroskopide lineer denklemler sisteminin Beer-Lambert yasasına uygulamasıdır. CLS, K matris kalibrasyonu olarak da bilinir. A =C.K (Lambert- Beer yasasına göredir.) (1) Bu denklem lineer denklem sistemleri ile ifade edilecek olursa; Burada, A= ölçülen sinyal K= seçilen noktalardaki katsayılar C= konsantrasyon dur. Klasik en küçük kareleri kullanarak kalibrasyon yapmak için, bilinen konsantrasyon örnekleri için bir A, absorpsiyon matrisi ve C, konsantrasyon matrisini içeren bir training set ile başlanır. Daha sonra K matrisi çözümlenir. K nın her kolonu için saf bileşenlerin birinin spektrumu ele alınır. C ve A daki veriler gürültü içerdiğinden, genelde denklem 1 için tam doğru bir çözelti olmayacaktır. Böylece denklem 1 için en iyi en küçük kareler çözeltisini bulmak gerekir. Başka bir deyişle, K nın bulunması zorunludur. Öyle ki, hataların kareler toplamı azaltılsın. Hatalar C ve K nın çarpılması ile hesaplanan spektrum ve ölçülen spektrum, A, arasındaki farktır. Hatalar= C.K A (2) 15
K yı çözümlemek için önce denklemin her iki tarafı konsantrasyon matrisinin transpozu, C T, ile çarpılır. C T.A= C T.C.K (3) Sonra denklem 3 ün sağ tarafından [C.C T ] niceliği yok edilir. Bu denklemin her iki tarafı [C.C T ] matrisinin tersi [C.C T ] -1 ile çarpılarak yapılır. [C T.C] -1.C T.A=[C T.C] -1.[C T.C].K (4) Matris ve tersinin çarpımı birim matris olduğundan [C T.C] -1.[C T.C] denklem 4 ün sağ tarafından kaybolur. [C T.C] -1.C T.A=K (5) [C T.C] nin tersinin olması için C en az satırlar kadar kolonlara sahip olmalıdır. C, her bir örnek için kolon ve her bir bileşen için bir satıra sahip olursa, bunun anlamı şu ki; denklem 5 i hesaplayabilmek için en az bileşen kadar örnek olmalıdır. Bu kesinlikle mantıklı bir sınırlamadır (Dinç,2006). Bilinmeyenlerin Tahmini K hesaplandıktan sonra, bunu ölçülen spektrumundan bilinmeyen bir örnekteki konsantrasyonları tahmin etmek için kullanılır. İlk olarak, spektrumlar yeni bir absorbans matrisine, A bil, yerleştirilir. Şimdi denklem 1 bilinmeyen örnek için tahmini konsantrasyon değerlerini içeren, yeni konsantrasyon matrisini, C bil, vermesi için kullanılabilir (Brereton, 1992). A bil =C bil.k (6) C bil i çözmek için denklemin her iki tarafı K T ile çarpılır. A bil.k T =C bil.k.k T (7) 16
Sonra denklem 7 nin sağ tarafından [K.K T ] niceliği yok edilir. Bu denklemin her iki tarafını [K.K T ] matrisinin tersi [K.K T ] -1 ile çarparak yapılır. A bil.k T.[ K.K T ] -1 =C bil.[k.k T ].[K.K T ] -1 (8) Matris ve tersini çarpımı birim matris olduğundan [K.K T ].[K.K T ] -1 denklem 8 in sağından kaybolur, kalan A bil.k T.[K.K T ] -1 =C bil (9) [K.K T ] nın tersinin olması için, K en az satırlar kadar kolonlara sahip olmalıdır. K her bir bileşen için bir kolon ve her bir dalga boyu için bir satıra sahip olursa, bunun anlamı şu ki, denklem 9 u hesaplayabilmek için en az bileşen kadar dalga boyu olması gerekir. Bu sınırlama mantıklıdır. Matris çarpımının birleşme özelliğinin bir avantajı olarak kalibrasyon sırasında K T.[K.K T ] -1 niceliği hesaplanabilir. K kal =K T.[K.K T ] -1 (10) K kal regresyon matrisi veya kalibrasyon matrisi olarak adlandırılır. Bu spektrumundan bir bilinmeyenin konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılan regresyon veya kalibrasyon katsayılarının içerir. K kal tahmin edilen her bir bileşen için katsayıların bir satırını içerir. Her bir satır bir spektral dalga boyu için bir katsayıya sahip olmalıdır. Böylece, K kal var olan dalga boyları kadar kolonlara sahip olacaktır. Denklem 10 u denklem 9 da yerine konulursa, A bil.k bil =C bil (11) denklemini verir. Böylece, bilinmeyen spektrum ile konsantrasyon matrisinin çarpımı basit bir matris ile bir bilinmeyendeki konsantrasyonlar tahmin edilebilir. 17
Daha önceden de bahsedildiği gibi CLS en az var olan bileşenler kadar dalga boyları ve örnekler gerektirir. Bu sınırlama tamamen makul görülür. Fakat CLS kullanıldığı zaman, ilgili sebepler veren diğer gereklerde tatmin edilmelidir. Bu gerekler denklem 12 incelendiği zaman açık hale gelir. A 1 =C 1 K 11 +C 2 K 12 + +C C K 1C A 2 = C 1 K 21 +C 2 K 22 + +C C K 2C A 3 = C 1 K 31 +C 2 K 32 + +C C K 3C.............. A W = C 1 K W1 +C 2 K W2 + +C C K WC (12) Denklem 12 her bir dalga boyunda A, absorbansının tamamen yeniden yapılandırıldığını gösterir. Başka bir deyişle, örnekte var olan bileşenlerin konsantrasyonları açısından her bir dalga boyundaki bütün absorbansın dikkate alınmasını ifade eder. Bunun anlamı şu ki, CLS kullanıldığı zaman örnekteki bütün bileşenler için doğru konsantrasyon değerlerini sağladığımızı düşünürüz. Denklem 12 deki herhangi bir bileşen için K çözümlendiğinde, bütün bileşenlerin konsantrasyonunu içeren bir ifade elde edilmiş olur. Örnekteki bütün bileşenleri kantitatif tayin etmek imkansız değildir, fakat zordur. Bu özellikle bileşen kelimesinin anlamını geniş bir mantıkla düşünüldüğünde doğrudur. Örnekteki bütün maddelerin doğru değerlerine sahip olunsa bile, cihaz kayması, operatör etkisi, cihaz yaşı, örnek hücresi düzenlemesi, vs. yüzünden spektral absorbansa olan katkılar nasıl tayin edilir? Basitçe cevap şu ki genellikle yapılamaz. Örnekteki bütün bileşenlerin konsantrasyonları sağlanamadığı için CLS ile problem olduğu görülür (Brereton 1992). 18
Yöntemin Avantajları: Hesaplamalar hızlıdır. Kalibrasyonlarda dalga boyu seçimi gerektirmez. Dalga boyların sayısı bileşenlerden fazla olsa da kullanılabilir. Geniş bir spektral alanda çok sayıda dalga boyunun absorbans ölçümleri kalibrasyonda kullanılabilir. PCR ve PLS ye göre daha basit bir mekaniğe sahiptir. Yöntemin Dezavantajları: Bu kalibrasyonda kalibrasyon karışımlarının her bileşen için tam olarak bileşiminin bilinmesi gerekir. Spektrofotometride grafik yöntemlerin uygulanmasında olduğu gibi CLS kalibrasyon içinde birbiriyle etkileşen bileşenlerin bulunduğu karışımların analizi için uygun değildir (Dinç,2006). 3.4.2 PCR (Temel bileşen regresyonu-principal component regression) Kemometrik kalibrasyon yöntemlerden birisi olan temel bileşen regresyon yöntemi, konsantrasyon seti için ölçülen absorbans verilerinin dekomposizyonu ile birbirine dik (ortogonal) doğrular elde edilmesi esasına dayanır. Bu elde edilen doğrular kurulacak kalibrasyonun koordinat sistemidir. Burada açıklanan PCR algoritması Martens ve Naes (1984) tarafından verilen şemaya göre açıklanmaktadır. PCR kalibrasyonu kurulmasındaki basamaklar aşağıdaki biçimdedir. Analiz edilecek maddenin konsantrasyon ve absorbans verilerinin varyans-kovaryansı bulunur. Varyans-kovaryans saçılma matriksinin öz vektörleri ve öz değerleri hesaplanır. Seçilen öz değere (eigen value) karşılık gelen öz vektör (eigen vector) kalibrasyonun lineer bileşenidir. 19
PCR algoritmasında genel lineer regresyon denklemi aşağıdaki biçimde yazılabilir: C=a+b.A (1) Burada C analiz edilecek maddenin konsantrasyonudur, a sabit sayı, b ise temel bileşenlerin ve C loading matriksinin (q) çarpımından elde edilir: b=p.q (2) Burada P öz vektörlerin matriksidir. Öz vektörler kolon matriksi en uygun öz değere (faktöre) ya da öz değerlere (faktörlere) karşılık gelmektedir. Burada q vektörü C loadings olarak adlandırılır ve T (sayı matriksi) üzerinden C nin regresyonu ile tayin edilir: q=d.t T.Yo (3) Burada D diagonal matriks olup herbir öz değerin tersine eşittir. t 1 sayı matriksi aşağıdaki eşitlikten elde edilebilir: t 1 =Ao.P 1 (4) Ortalanmış absorbans ve konsantrasyon, Ao ve Co ile gösterilebilir. Burada a sabiti genel lineer regresyon denklemi kullanılarak aşağıdaki eşitlikten hesaplanabilir: a=co A T o.b (5) Her bir aşamada elde edilen değerler C=P.A denkleminde yerine konarak numunede bilinmeyen konsantrasyonu hesaplanabilir (Haaland and Thomas,1990). 20
Yöntemin Avantajları Dalga boyu seçimi gerektirmez, genellikle bütün spektral alan ya da bu spektral alanın geniş bir bölgesi kullanılabilir, Çok bileşen analiz için kullanılabilir, PCR data işlemleri için ve kalibrasyondaki katsayılarının hesaplanmasında ILS regresyon işleminin kullanılmasına olanak tanır. Analiz edilecek bileşenlerin bilinmesi şartıyla çok kompleks karışımlar için kullanılabilir, bazen orijinal kalibrasyon karışımlarında bulunan fakat numunede bulunmayan bileşenli numunelerin miktar tayininde kullanılabilir, Kalibrasyon için ölçülen absorbansların dekomposizyon işleminden sonra uygun öz vektörlere karşılık seçilen öz değerlerin deneysel ortamdan ve ölçüm aletlerinden gelen gürültünün eliminasyonuna olanak tanır. Yöntemin Dezavantajları Hesaplamalar klasik yöntemlere göre daha yavaştır, Yöntemin optimizasyonu temel kalibrasyon komponentlerinin bazılarının bilinmesini gerektirir (anlaşılması ve yorumlanması çok kompleks modeller için), Kalibrasyon için temel alınan vektörler analiz edilecek bileşenlere karşılık gelmeyebilir, Genellikle çok sayıda kalibrasyon numunesinin kullanılması doğru bir kalibrasyon için gereklidir, Kalibrasyon numunelerinin hazırlanması bileşenlerin konsantrasyonları ile doğrusallıktan uzaklaşmaları nedeniyle zordur (Dinç, 2006). Temel bileşenler soyut faktörler olarak da adlandırılırlar. Çok değişkenli kalibrasyonlardaki amaç bunları bileşen konsantrasyonlarına dönüştürmektir. PCR, temel bileşen skorlarını konsantrasyonlara dönüştürmek için regresyon kullanılır (bazı durumlarda bunlara transformation ya da rotation denir). Bu işlem genel olarak faktör analizi olarak adlandırılır, ancak terminoloji yazara veya otoritelere göre değişebilir (Brereton 1992). 21
3.4.3 PLS (Kısmi en küçük kareler-partial least squares) Kemometrik kalibrasyonlardan en yaygın ve en popüler olanı PLS yöntemidir. PLS yönteminde kalibrasyonun kurulması için kullanılan PLS algoritmalarına göre, ortogonalize edilmiş PLS algoritması ve ortogonalize olmayan PLS gibi şekilleri vardır. Ortogonalize PLS ve ortogonalize olmayan PLS algoritması arasındaki temel fark X den faktörlerin çıkarılmasındadır. PLS kalibrasyonunun PLS1 ve PLS2 şeklinde iki tipi söz konusudur. PLS1`de bir bileşik model içerisinde iken; PLS2 de bütün bileşikler modele dahil edilmektedir. Wold ve Martens tarafından verilen PLS algoritması en genel olanlardandır. PLS kalibrasyonu, sayı vektörleri vasıtasıyla X- ve Y-blokları arasındaki ilişkiye dayanır. PLS algoritmasına göre sıfır etrafında merkezileştirilmiş X- değişkeninin matrisi ve sıfır etrafında merkezileştirilmiş Y-değişkeninin parçalanması aşağıdaki biçimde verilir. Şekil 3.2 PLS`nin temeli X= T P T + E Y= U Q T + F Y= X B + F B = W (P T W) -1 Q T 22
Burada X=bağımlı değişken (örneğin absorbans verileri), Y=bağımsız değişken (örneğin konsantrasyon), T=X için sayı matrisi, U=Y için sayı matrisi, P=X için yük matrisi Q=Y için yük matrisi, E=X-kalıntı matrisi, F=Y-kalıntı matrisi, W=max(kovaryans(E,F)) PCR algoritmasında olduğu gibi bu katsayılar (B) linear regresyon denkleminde yerine konursa analiz edilecek numunenin absorbans değerleri bu eşitlikte yerine yazılarak hesaplanır (Brereton 1992). Yöntemin Avantajları PLS kalibrasyon işlemi CLS ve ILS hesap tekniklerini kapsamaktadır, Tek aşamalı bir dekomposizyon ve regresyon işlemi gerektirir, kalibrasyonda kullanılan öz vektörler analiz edilen bileşenler ile en geniş ortak spektral değişimin olduğu bölgede doğrudan ilişkilidir, Kalibrasyonlar genellikle kalibrasyon setinin bilinmeyen numunelerden beklenen değişik konsantrasyonlarını yansıtması daha fazla güvenirlik sağlayacaktır, Yalnızca analiz edilecek bileşenlerin bilinmesi şartıyla kompleks karışımlar için kullanılabilir, Bazı durumlarda orijinal kalibrasyon karışımlarında bulunan fakat numunede olmayan bileşenli numunelerin miktar tayininde kullanılabilir, Bu tekniklerin hepsi spektral kantitatif analiz için uygulanırken literatürdeki sebepler genellikle PLS nin tahmin gücünün yüksek olduğunu göstermektedir.birçok durumda PLS metodları PCR den daha iyi sonuçlar verir. 23
Yöntemin Dezavantajları PLS hesaplamaları klasik metodlardan daha yavaştır, PLS modellerin anlaşılması ve yorumlanması zor olup son derece soyuttur, iii) genellikle çok sayıda numune için doğru bir kalibrasyon gereklidir, Kalibrasyon numunelerinin hazırlanması bileşenlerin konsantrasyonları ile doğrusallıktan uzaklaşmaları nedeniyle zordur (Dinç, 2006). 3.5 Deneysel Tasarım Kemometrik (CLS, ILS, PCR, PLS) kalibrasyonlar için kalibrasyon seti ya rastgele (randomly) ya da analizi yapılacak numunede yer alan maddelerin konsantrasyonlarını içerecek şekilde kalibrasyon (konsantrasyon) setinin tasarımı yapılır. Simetrik kalibrasyon setinin planlanmasında analiz edilecek maddelerin konsantrasyonları, kalibrasyon setinin içinde ana kümenin permütasyonları şeklinde alt kümeler oluşturmalıdır. Kemometrik çalışmalarda rastgele kalibrasyon setinin hazırlanmasından ziyade, analiz edilecek maddelerin konsantrayonlarına göre simetrik bir kalibrasyon setinin hazırlanması, elde edilecek sonuçların doğruluğu ve hataların minimize edilmesi açısından tercih edilecek bir durumdur. Çalışma konsantrasyon seti hazırlanmasında, çeşitli tasarım şekilleri verilmekle birlikte rastgele hazırlanan konsantrasyon setlerinde kullanılmaktadır (Dinç, 2006). Yüksek verimli deneysel çalışmalar, deneysel tasarım ve kantitatif değerlendirme yöntemlerine dayanır. Deneysel tasarım ve kantitatif değerlendirmeler matematiksel modeller veya tasarımlar vasıtasıyla başarılabilir. Deneysel tasarım ve optimizasyon konusunda çok sayıda teknik bilgi notu ve kitap istatistikçiler tarafından yazılmıştır. Bu konuda ilk uygulamalı kitaplardan biri Cornell tarafından yazılmıştır (Dinç, 2006). Deney sonuçlarına çok sayıda değişken (faktör) etki eder. Bu değişkenlerin etkisini tahmin edebilmek deneysel çalışmaların en zorlu kısmıdır. Bunların etkisini tahmin edebilmek için değişik yöntemler kullanılmaktadır. Bu yöntemler ele alınan bütün faktörler içerisinden her seferinde bir değişkenin seviyesinin değiştirilmesi ve 24
diğerlerinin tamamının seviyesinin sabit bırakılması yoluyla deneylerin tekrar edilmesi ve sonuçların yorumlanmasını içermektedir (Wang, 2008). Bir faktör için farklı değerler seviye olarak adlandırılır. Örneğin bir faktör sıcaklıksa deneye etkiyen 2 seviye ise 210 o C ve 240 o C olabilir. Her seferinde bir değişkenin seviyesinin değiştirilmesi yöntemi algılanması ve uygulanması en kolay yöntemdir. Ancak bu yöntemde, faktörlerin etkisi, diğer faktörlerin belli seviyelerinde belirlendiği için, diğer faktörlerin farklı seviyelerinde incelediğimiz faktörün etkisinin ne olacağı konusunda yeterli fikir vermemekte veya diğer faktörlerin farklı seviyeleri için etki değerleri tahmin edilmek istendiğinde çok fazla sayıda deney yapılmak zorunda kalınmakta ve bu deneylerin sonuçları arasındaki bağlantıyı kurmak zorlaşmaktadır. Bu zorlukları aşmak için deneysel tasarım teknikleri geliştirilmiştir. Deneysel tasarım teknikleri, bütün faktörleri birlikte ele alır ve bu faktörlerin farklı seviyelerinin değişik kombinasyonları oluşturularak deneyler yapıldığında faktörlerin etkileri, diğer faktörlerin farklı seviyelerdeki etkilerini de içinde barındıracak şekilde elde edebilmektedir. N sayıda faktör K farklı seviyede çalışılacaksa, bu faktörlerin her bir seviyesinin karşılıklı kombinasyonları oluşturulduğunda yapılacak deney sayısı K N `dir. Bu deneylerin sonucuna göre K N -1 farklı etkiyi tahmin etmek mümkündür (Araujo, 1996). 3.5.1 Beş seviyeli tasarım Çok değişkenli kalibrasyon metotlarının çoğunda, uygun bir model elde etmek için çeşitli derişim seviyeleri gereklidir. 10 bileşen içeren bir karışım için 5 seviye çalışılacaksa, seviyelerin bütün kombinasyonlarını elde etmek için 5 10 deney yapmak gerekir. Bu imkansızdır. Bu nedenle uygulanacak deney sayısının azaltılması gereklidir. Ancak deney sayısının azaltılması esnasında bazı anahtar özelliklerin tasarımda muhafaza edilmesi gereklidir. Tasarımda kalibrasyon işleminde kullanılacak olan veri seti (training set) analizlerin başarısı için oldukça önemlidir. Örneğin 10 bileşen 5 seviyede çalışılacaksa beş seviyeli bir tasarım kullanılarak 5 2 =25 deneyle faktörlerin etkisi çalışılabilir. Çizelge 3.1 de 25
gösterildiği gibi faktörlerin beş seviyeli olduğu bir çalışmada, herhangi bir uygulamada kullanılacak faktörlerin seviyelerini (+) ve (-) işaretleri ile göstermek mümkündür. Kantitatif faktör için bu işaretler artan ve azalan seviyeleri göstermek için 5 seviyeli tasarım için -2, -1, 0, 1, 2 ile temsil edilmektedir. Ancak burada (+) ve (-) işaretleri sadece etiket anlamındadır. Kantitatif bir değer taşımaz. Çizelge 3.1 Beş seviyeli tasarım 26
3.6 Nitrozo R Tuzu Şekil 3.3 Nitrozo R tuzunun açık formulü Nitrozo R tuzu ; Fe 2+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+, Hg 2+, Mn 2+, Zn 2+, Pb 2+, Cr 3+, Al 3+ gibi metal katyonlarıyla renkli kompleks vermektedir. Nitrozo R tuzu ligand olarak kullanılarak kompleksleştirilerek ölçümler Ultraviyole-Görünür bölge (UV-VIS) Spektrofotometresiylee yapılacaktır. Şekil 3.4 Nitrozo R tuzu`nun Fe(III) iyonuyla yaptığı kompleks yapı 27
Nitrozo R tuzu metal katyonlarıyla şekil 3.4 de görüldüğü gibi azot ve oksijen üzerinden bağlanarak kompleks yapı oluşturur. Bu tez çalışması için planlanan yöntemin en önemli özelliği en az 3 veya 4 metal katyonunu bir arada ve farklı konsantrasyonlarda iken Nitrozo R tuzu yardımıyla spektrofotometrik olarak tayinine olanak veren bir yöntem geliştirilmesi olacaktır. 3.7 Ultraviyole (Morötesi) Görünür Bölge Moleküler Absorbsiyon Spektroskopisi Moleküler maddelerin morötesi dayanan spektroskopi şeklidir. ve görünür bölge ışınlarını absorplaması esasına Bir çözeltiye P 0 şiddetinde bir ışın demeti gönderilirse, bu ışının bir kısmı absorplanır, bir kısmı yansır, bir kısmıda saçılır. Içinde su bulunan bir cam kaptan sarı ışın demeti geçerken %8,5`unun yansımalarla kaybedilir (Skoog, 1998). Gelen ışığın absorplanmadan, saçılmadan geriye kalan kısmıda geldiği doğrultuda şiddeti azalmış olarak çözeltiyi terk eder. Absorplanan kısım, çözeltide bulunan moleküler türlerin uyarılmasında kullanılır. Bu ışının dalga boyunda bir değişiklik olmaz. Şekilde de görüldüğü gibi sadece çözelti içerisindeki hareketlerde dalga boyu değişebilir. Şekil 3.5 Yansıma ve saçılma kayıpları 28
Işın şiddetinde, büyük moleküllerin ışın saçmaları ve bazen kap yüzeyinin absorpsiyonu nedeniyle de azalma olabilir. Bu etkileri düzeltmek için, analit çözeltiden geçen ışın gücü(p), genellikle içinde yalnız çözücü bulunan eşlenik bir hücreden geçen ışın gücü(p 0 ) ile kıyaslanır. Gerçek geçirgenlik(t) ve absorbansa(a) çok yakın deneysel geçirgenlik ve absorbans eğeri şu şekilde bulunur: çö çö ü ü çö ~ çö ü ü P 0 ve P arasındaki ilişki bugün Lambert-Beer yasası olarak bilinir. ε.. ε, molar absorplanma katsayısı, absorpsiyon yapan maddeye özgü bir sabit değerdir. ( 1.. l, çözeltinin kalınlığı (cm) C, çözeltinin derişimi (M) ) Beer yasası birden çok absorplayıcı madde içeren karışımlar için de geçerlidir. Türlerin birbirini etkilememesi koşuluyla, çok değişkenli bir sistemin toplam absorbansı; Burada 1,2,3 n absorpsiyon yapan bileşenleri gösterir (Kılıç ve Köseoğlu, 1998). 29
Beer yasasının sınırlaması Beer yasası oldukça düşük derişimde analit içeren ortamların absorpsiyonları ile ilgili davranışlarını başarılı bir şekilde ifade eder. Bu bakımdan Beer yasası, sınırlayıcı bir yasadır. Yüksek derişimlerde (genellikle> 0,01 M) absorpsiyon yapan moleküller arasındaki uzaklık çok azalır ve moleküller, komşularının yük dağılımını etkiler. Bu etkileşim sonucu moleküllerin absorplama özelliği değişir. Etkileşim düzeyi derişime bağlı olduğu için, bu olayın oluşumu derişimle absorbans arasındaki doğrusal ilişkiden sapmalara neden olur. Bazen benzer etki düşük derişimlerde absorplayıcı ve yüksek derişimlerde diğer türleri, özellikle elektrolitleri içeren çözeltilerde de görülür. Absorplayıcının yakın çevresindeki iyonlar elektrostatik etki ile absorplayıcının molar absorbivitesini değiştirir; bu etki seyrelme ile azalır(skoog, 1998). UV-GB Cihazları Şekil 3.6 Tek ışın kaynaklı UV-GB spektrofotometresinin çalışma prensibi Şekil 3.7 Çift ışın kaynaklı UV-GB spektrofotometresinin çalışma prensibi Tek ışın kaynaklı cihazlarda çözücü-çözelti arasındaki fark maddenin absorbansıdır. 30
Çift ışın kaynaklı çihazlarda monokromatorlardan gelen ışın, ışın bölücü adı verilen bir ayna ile sürekli kısa bir sure çözücüden,kısa bir sure çözeltiden geçirilir. Her iki ışın şiddeti eş zamanlı olarak kaydedilir. İki şiddet arasındaki fark doğrudan göstergeden okunur. Yani çift ışın kaynaklı cihazlarda okunan değer maddenin absorbansıdır. Bir maddenin spektrumu alınırken yani maddeye ait dalga boyu-absorbans grafiği çizilirken çift ışın kaynaklı cihazları kullanmak zaman kazandırıcıdır. UV-GB spektrofotometre cihazlarında, atomic absorpsiyon spektrofotometresindeki gibi çok kısa dalga boyu aralığında yoğun ışık veren ışık kaynaklarına gereksinim yoktur. Görünür bölgede çalışırken wolfram (tungsten) lambası, morötesi bölgede çalışırken döteryum lambası yeterlidir. Spektrum bölgesi Işık kaynağı Numunenin konulacağı hücrenin yapısı UV Döteryum lambası Kuartz Görünür Tungsten lambası Cam (veya kuartz) Lambert-Beer yasasına göre, çalışma yaparken şeçilen bant aralığı (silit arlığından geçen ışınların en yüksek ve en küçük dalga boylu ışınları arasındaki fark) önemlidir. Spektrumun görünüşüne ve çalışma grafiğine etki eder. Genellikle seçilen bant aralığı maksimum absorpsiyonun olduğu bölgelerde olmalıdır. Çalışma grafiği elde edilirken herhangi bir absorpsiyon olayında maksimum absorpsiyonun olduğu bölgedeki verilerle çalışma grafiği çıkarılması istenir. Maddenin en yüksek absorpsiyon yaptığı dala boyuna λ max denir. Madde için spesifiktir. 31
Şekil 3.8 Spektrofotometride çalışma aralığı belirlemede maksimum absorbans seçiminin gösterimi UV-GB Absorpsiyonunun kuramsal sebebi UV-GB absorpsiyonu bir moleküler absorpsiyondur. Yani atomlar arsında kimyasal bağ oluştuğu durumlarda gözlenir. Moleküllerde 2 çeşit bağ bulunur: sigma (σ) ve pi (π) bağı. Moleküllerde bağ yapmamış orbitallere vardır. Bu orbitallerin elektronlarına da n e - ları denir. Şekil 3.9 Moleküllerdeki elektronik geçişler UV ışık valens elektronlarını etkiler. Şekil 3.9 daki σ-σ*, π-π*, n-σ*, n-π* elektronik geçişleridir. UV ışınları σ-σ bağını koparabilir. σ-σ* elektronik geçişleri 160-90 nm 32
arasında gerçekleşir. Ve σ bağının kopması demek molekülün bozunması demektir. Bu sebepten σ-σ* geçişleri uv-gb spektrofotometresinde kullanılmaz. π bağı kopunca molekül parçalanmayacağından dolayı uv-gb spektrofotometresinde π- π* geçişleri kullanılabilir. Aynı şekilde n-σ* ve n-π* geçişleri de kullanılabilir. Bu geçişler absorpsiyonun sebebidir. π-π* geçişleri ε>10000 ve λ=160-900nm arasında gözlenebilen elektronik geçişlerdir. n-σ* geçişleri ε>1000 ve λ=160-250nm arasında gözlenebilen elektronik geçişlerdir. n-π* geçişleri ε>1000-10000 ve λ=200-700nm arasında gözlenebilen elektronik geçişlerdir Spektrofotometri: a) Tanıma b) Miktar tayini c) Yapı aydınlatılması d) Reaksiyon mekanizması tayini e) pka tayini gibi amaçlar için kullanılır (Dinç, 2006). UV-görünür alan absorbsiyon spektroskopisi, kantitatif amaçlarla en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir. Hem organik hem de inorganik maddelerin tayininde kullanılabilmesi, son zamanlardaki gelişmelerle 10-6 -10-7 M civarına kadar duyarlı olması bu yöntemi çekici hale getirmektedir. Yine bu yöntemle iyi bir kesinlik ve doğruluk sağlamak mümkündür. Zira yöntemin bağıl doğruluktan sapmasının %1-3 arasında olduğu, bazı tedbirler alınarak bu belirsizliğin çok daha aşağı düşürülebildiği belirtilmiştir. Bunlardan başka yöntemin kolay veri elde etmede fark edilir bir üstünlüğünün olduğunu belirtmek gerekir. Hangi spektrum bölgesinde olursa olsun belli bir dalga boyundaki ışığın absorpsiyonu enerjiyi absorbe etme kapasitesine sahip bir yapının varlığının göstergesidir. Bu belli 33
dalga boyundaki bir ışığın bir maddenin üzerine düşürülmesinden sonra, ışığın geçmeden önce ve geçtikten sonraki şiddetinin ölçülmesi ile belirlenir. absorpsiyonun olduğu veya ışığın geçtiği dalga boyları kaydedilir. Absorpsiyon miktarının dalga boyunun bir fonksiyonu olarak kaydedilmesi sonucunda absorpsiyon spektrumu elde edilir. Manuel kullanılan spektrofotometreler de verileri saklamak mümkün değilken günümüzde bilgisayar bağlantılı UV-GB cihazlarından, dalga boyuna karşı elde edilen absorbans değerlerini depolamak ve verileri toplu halde kullanabilmek mümkündür. Bu çalışmada depolanan bu verilerin matrisler halinde düzenlenmesi hesaplamaların kemometrik olarak yapılmasına olanak sağlanmıştır. 34
4. MATERYAL VE YÖNTEM 4.1 Kullanılan Cihazlar ph metre: Thermo Orion 720A Spektrofotometre (UV-GB): Schimadzu U-2800 Atomik Absorpsiyon Spektrofotometresi: GBC Avanta Analitik terazi: Chyo JL-200 Çift damıtık(bidistile) su cihazı: RodWel 4.2 Kullanılan Kimyasal Maddeler Cu 2+, Fe 2+, Ni 2+, Co 2+, Cd 2+, Zn 2+, Al 3+, Ca 2+, Pb 2+, Na 2+, Sr 2+, Mn 2+, Hg 2+ 1000 ppm`lik standart çözeltileri (%99)- MERCK 3-Hidroksi-4-Nitrozo-2,7-naftalin disulfonik asitin disodyum tuzu [nitrozo R tuzu (NRS)]- THE BRITISH DRUG HOUSES LTD. LABORATUVAR KİMYASALLARI Sodyum hidroksit (%99)- MERCK Potasyum hidrojen ftalat (%99.9) ANALAR Sodyum tetra borat.10 su (%99)- HORASAN KİMYA Asetik Asit- MERCK 4.3 Kullanılan Çözeltiler 4.3.1 NRS çözeltisi (1000 ppm) 100 mg Nitrozo R sodyum tuzu bi destile su ile çözülüp hacmi çift damıtık su ile 100 ml`ye tamamlandı. 35
4.3.2 Metal katyonlarının stok çözeltileri (10 ppm) Cu 2+, Fe 2+, Ni 2+, Co 2+ metal katyonlarının 1000 ppm`lik standart çözeltilerinden 1`er ml alınıp her biri 100`er ml`ye seyreltilerek 10`ar ppm`lik stok çözeltileri hazırlandı. 4.3.3 Amonyum Asetat tampon çözeltisi (1 M ) 7,7 g NH 4 CH 3 COO tuzu bi destile su ile çözülüp hacmi çift damıtık su ile 100 ml`ye tamamlandı. (MA NH4CH3COO=77 gmol -1 ) (ph=7,0) 4.3.4 Standart referans maddeler Geliştirilen yöntemin gerçek numunelere uygulanıp uygulanmayacağını araştırmak için Dr. Hopneffer firmasına ait sertifikalı bir numune çalışılmıştır. Bu standart referans maddelerin içerikleri metal yüzdeleri olarak Çizelge 4.1 de verilmiştir. Numune toz haline getirilip Nickel-kobalt-erz-V`den 0,2067 gram, Neusilber-IV `den 0,2152 gram tartılarak nitrik asitte çözülüp hacimleri 100 ml`ye çift damıtık ile tamamlandı. Nickelkobalt-erz-V`den 1/50 oranında, Neusilber-IV `den 1/10 oranında seyreltilerek kullanılmıştır. 36
Çizelge 4.1 Standart Referans Madde Bileşimleri Nickel kobalt erz V Neusilber IV Fe % 1,76 Fe % 0,19 Ni % 5,32 Ni % 10,27 Co % 12,21 Cu % 57,15 Cu % 0,33 Pb % 1,96 SiO2 % 1,36 Mn % 0,09 Pb % 0,05 Zn % 30,30 Al2O3 % 0,6 As % 64,7 Zn % 0,05 CaO % 6,31 S % 0,45 4.3.5 Kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanması Kemometrik kalibrasyonlar için kalibrasyon seti rasgele ya da analizi yapılacak numunede yer alan maddelerin konsantrasyonlarına göre bu maddelerin konsantrasyonları çalışma aralığının içine düşecek şekilde bir kalibrasyon setinin dizaynı yapılır. Kemometrik çalışmalarda rasgele kalibrasyon setinin hazırlanması elde edilecek sonuçların doğruluğu ve hataların azaltılması açısından tercih edilecek bir durumdur. Çizelge 4.2 Kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanmasında kullanılan seviye değerleri Seviye değerleri Fe 3+ ppm Ni 2+ ppm Co 2+ ppm Cu 2+ ppm -2 0 0 0 0-1 0,2 0,2 0,2 0,2 0 0,4 0,4 0,4 0,4 1 0,8 0,8 0,8 0,8 2 1,6 1,6 1,6 1,6 Çizelge 4.3 Kalibrasyon çözeltilerinin (kalibrasyon setinin) derişimleri 37
Fe 2+ Ni 2+ Co 2+ Cu 2+ ppm ppm ppm ppm 1 0,4 0,4 0,4 0,4 2 0,4 0 0 1,6 3 0 0 1,6 0,2 4 0 1,6 0,2 1,6 5 1,6 0,2 1,6 0,4 6 0,2 1,6 0,4 0,2 7 1,6 0,4 0,2 0,2 8 0,4 0,2 0,2 0,8 9 0,2 0,2 0,8 1,6 10 0,2 0,8 1,6 0,8 11 0,8 1,6 0,8 0,4 12 1,6 0,8 0,4 1,6 13 0,8 0,4 1,6 1,6 14 0,4 1,6 1,6 0 15 1,6 1,6 0 0,8 16 1,6 0 0,8 0 17 0 0,8 0 0,4 18 0,8 0 0,4 0,8 19 0 0,4 0,8 0,8 20 0,4 0,8 0,8 0,2 21 0,8 0,8 0,2 0 22 0,8 0,2 0 0,2 23 0,2 0 0,2 0,4 24 0 0,2 0,4 0 25 0,2 0,4 0 0 Çizelge 4.4 Kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanmasında kullanılan çözeltilerin hacimleri 38
Fe 3+ Ni 2+ Co 2+ Cu 2+ Tampon Ligand Su (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) 1 0,12 0,12 0,12 0,12 1 0,5 1,02 2 0,12 0 0 0,48 1 0,5 0,9 3 0 0 0,48 0,06 1 0,5 0,96 4 0 0,48 0,06 0,48 1 0,5 0,48 5 0,48 0,06 0,48 0,12 1 0,5 0,36 6 0,06 0,48 0,12 0,06 1 0,5 0,78 7 0,48 0,12 0,06 0,06 1 0,5 0,78 8 0,12 0,06 0,06 0,24 1 0,5 1,02 9 0,06 0,06 0,24 0,48 1 0,5 0,66 10 0,06 0,24 0,48 0,24 1 0,5 0,48 11 0,24 0,48 0,24 0,12 1 0,5 0,42 12 0,48 0,24 0,12 0,48 1 0,5 0,18 13 0,24 0,12 0,48 0,48 1 0,5 0,18 14 0,12 0,48 0,48 0 1 0,5 0,42 15 0,48 0,48 0 0,24 1 0,5 0,3 16 0,48 0 0,24 0 1 0,5 0,78 17 0 0,24 0 0,12 1 0,5 1,14 18 0,24 0 0,12 0,24 1 0,5 0,9 19 0 0,12 0,24 0,24 1 0,5 0,9 20 0,12 0,24 0,24 0,06 1 0,5 0,84 21 0,24 0,24 0,06 0 1 0,5 0,96 22 0,24 0,06 0 0,06 1 0,5 1,14 23 0,06 0 0,06 0,12 1 0,5 1,26 24 0 0,06 0,12 0 1 0,5 1,32 25 0,06 0,12 0 0 1 0,5 1,32 Not: Metal katyonlarının çizelgedeki hacimleri, metal katyonlarının 1000 ppm`lik stok çözeltilerden seyreltilerek hazırlanılmış olan 10 ppm`lik çözeltilerinden alınmıştır. 4.4 Yöntem 39
4.4.1 Kompleks oluşumu Nitrozo R tuzunun hangi metal katyonlarıyla renkli kompleks oluşturduğunu belirlemek amacıyla 15 metal katyonuyla her biri 2 ppm olacak şekilde çözeltiler hazırlandı. Bu 2 ppm`lik çözeltiler, 10 ppm`lik metal katyon stoklarından 1 ml alınıp 5 ml`ye su ile tamamlanarak hazırlanmıştır. 4.4.2 Optimum ph belirlenmesi Cu 2+, Ni 2+, Co 2+, Fe 3+ metal katyonlarının nitrozo R tuzu komplekslerinin 2 ppm`lik çözeltileri hazırlandı. Her bir metal kompleksi için ph 3,5; 4,5; 5,5; 6,0; 7,0; 8,0; 9,5; 10,0 olacak şekilde hazırlanan çözeltilerin absorpsiyon spektrumu çıkarıldı. Çözeltileri asidik ph`larda sabitlemek için asetat tamponu, bazik ph`larda sabitlemek için fosfat tamponu kullanıldı. 4.4.3 Maksimum absorpsiyon dalga boyunun belirlenmesi 300-900 nm dalga boyu aralığı incelenerek 2 ppm`lik Metal NRS komplekslerinin absorpsiyon taraması yapılarak absorbans değerleri dalga boyuna karşı grafiğe geçirildi. 4.4.4 Kompleks oluşum süresinin belirlenmesi Cu 2+, Ni 2+, Co 2+, Fe 3+ metal katyonlarından 0,4 ppm içeren çözeltiler hazırlamak için; metal katyonlarının her birinden120`şer µl, Nitrozo R tuzu çözeltisinden de 500 µl ve 1000 µl de tampon ilave edildikten sonra son hacim 3 ml`ye çift damıtık su ile tamamlanıp herbirinin maksimum dalgaboylarında 3 saat bu çözeltilerin tek tek spekrumu alınmıştır. 4.4.5 Seviye değerlerinin belirlenmesi Farklı konsantrasyonlarda metal katyonları için absorbans değerleri spektrofotometreden okundu. Her bir metal katyonu için en derişik olduğu durumdaki 40
absorbans değerleri belirlenip bu absorbans değerleri toplamda yaklaşık 1 olacak şekilde seviye değerleri belirlendi. 4.5 Kompleks Oluşumuna Bozucu Metal Katyonlarının Etkisinin Belirlenmesi Cu 2+, Ni 2+, Co 2+, Fe 3+ metal katyonu 0,4 ppm olarak sabitken bozucu olarak 0,2; 0,4; 0,8 ppm konsantrasyonlarında 11 metal katyonu ilave edildi. Miktar olarak değişmeleri durumundaki bozucu etkileri de incelenmiştir. Bozucu etkisi olması düşünülen 11 metal katyonu; Al 3+, Ca 2+, Cd 2+, Cr 3+, Hg 2+, Mg 2+, Mn 2+, Na +, Pb 2+, Sr 2+, Zn 2+ Bozucu metal katyonları ilave edildikten sonra 1 saat bekletilmiş ve spektrumlar alınmıştır. 41
5.BULGULAR 5.1 Kompleks Oluşumunda Optimum Şartların Belirlenmesi Optimum şartlar belirlenirken spektrumlar 300-900 nm arasında alınmıştır. Şekil 5.1 de görüldüğü üzere; 300-450 nm aralığında Nitrozo R tuzu nun yaptığı absorbsiyondaki kararsızlıktan dolayı çalışmanın değerlendirmeleri 450-800 nm aralığında yapılmıştır. 5.1.1 Kompleks oluşumu Bölüm 4.4.1 de anlatıldığı gibi hazırlanan Al 3+, Ca 2+, Cd 2+, Cr 3+, Hg 2+, Mg 2+, Mn 2+, Na +, Pb 2+, Sr 2+, Zn 2+, Cu 2+, Ni 2+, Co 2+, Fe 3+ metal katyonlarının 2 ppm`lik çözeltileri üzerine 500 µl ligand ve 1000 µl tampon ilave edilip bu katyonların NRS ile kompleksleri oluşması için 1 saat bekletildikten sonra 300-900 nm arasında spektrumları alınmıştır. Şekil 5.1 Bazı metal katyonlarının Nitrozo R tuzu ile yaptığı komplekslerin birlikte spektrumu Ligand ilavesiyle en çok renklenmenin gözlendiği 4 metal katyonu Cu 2+, Ni 2+, Co 2+, Fe 3+`nin spekrumda da 300-900 nm arasında en yüksek absorbanslara sahip olduğu görüldü. 42
5.1.3 Optimum ph belirlenmesi Şekil 5.2 Farklı ph larda hazırlanmış kompleks çözeltileri Bölüm 4.4.3`de anlatıldığı şekilde hazırlanan farklı ph`lardaki kompleks çözeltilerinin spekrumlarından okunan absorbans değerleri şu şekildedir: 43
Çizelge 5.1 Metal komplekslerinin max. Dalga boylarında farklı ph`larda ki absorbans değerleri ph Absorbans Fe (720 nm) Ni (483 nm) Co (436 nm) Cu (491 nm) 3,5 0,005-0,058 0,154 0,132 4,5 0,110-0,011 0,483 0,143 5,5 0,447 0,049 0,481 0,248 6,0 0,523 0,084 0,493 0,308 7,0 0,010 0,142 0,505 0,311 8,0 0,007 0,141 0,492 0,267 9,5 0,013 0,158 0,411 0,187 10,0 0,025 0,148 0,388 0,131 Kompleksin en kararlı olduğu ph`nın 7 olduğuna karar verildi. Demir kompleksi için ph 6,0`dad aha kararlıdır. Fakat demir diğer üç metal kompleksinden farklı bir dalga boyunda absorpsiyon yapar. Diğer üç metal kompleksinin spektrumları çakışır ve bunların kantitatif değerlendirmesi zordur. Bu yüzen bu üç metal kompleksinin daha kararlı olduğu ph seçilmiştir.ve çalışmalarda hazırlanan kompleks çözeltileri, 1 M amonyum asetat ile hazırlanmış asetat tampon çözeltisi ile ph=7,0`da sabitlendi. 5.1.2 Maksimum absorpsiyon dalga boyunun belirlenmesi Bölüm 4.4.2`de anlatıldığı şekilde grafiğe geçirilen absorbans değerleriyle 4 kompleksinde şekil 5.4-5.7`deki absorpsiyon spektrumları çıkartıldı. Bu spektrum incelenerek Lambert Beer eşitliğine uyulan ve maksimum absorbans veren dalga boyları şu şekilde şeçildi: 44
Çizelge 5.2 Cu 2+, Ni 2+, Co 2+, Fe 3+ metal katyonları-nitrozo R tuzu komplekslerinin maksimum absorbans yaptıkları dalga boyları 2 ppm Metal katyonu Maksimum Absorbans Dalga boyu Fe 0,600 ~650 nm Ni 0,283 ~480 nm Co 0,692 ~440 nm Cu 0,370 ~490 nm Ligandın da 350-450 nm dalga boyu aralığında absorpsiyon yaptığı belirlendi. Şekil 5.3 Ligandın spektrumu Şekil 5. 4 ph=7`de Fe 3+ -NRS kompleksinin spektrumu 45
Şekil 5.5 ph=7`de Ni 2+ -NRS kompleksinin spektrumu Şekil 5.6 ph=7`de Co 2+ -NRS kompleksinin spektrumu Şekil 5.7 ph=7`de Cu 2+ -NRS kompleksinin spektrumu 46
Şekil 5.8 ph=7 de dört metal katyonunun-nrs komplekslerinin üst üste alınmış spekrumlarının bir arada gösterimi 5.1.4 Kompleks oluşum süresinin belirlenmesi Şekil 5.9 NRS komplekslerinin oluşumuna zamanın etkisi Şekilde görüldüğü gibi yaklaşık 3600 s (1 saat) de tüm komplekslerin kararlılığa ulaştığı belirlendi. 5.1.5 Seviye değerlerinin belirlenmesi Fe, Ni, Co, Cu metal katyonlarının NRS ile oluşturduğu komplekslin 0-0,1-0,2-0,4-0,8-1,5-3,0-4,0 ppm lik çözeltileri spektrumları; 47
Şekil 5.10 Farklı konsantrasyonlarda Fe 3+ -NRS kompleksi spektrumları Şekil 5.11 Farklı konsantrasyonlarda Ni 2+ -NRS kompleksi spektrumları 48
Şekil 5.12 Farklı konsantrasyonlarda Co 2+ -NRS kompleksi spektrumları Şekil 5.13 Farklı konsantrasyonlarda Cu 2+ -NRS kompleksi spektrumları 1.6 ppm de 4 metal katyonunun absorbans değerleri Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ için sırasıyla ~0.5, ~0.25, ~0.4, ~0.25 dir. Aynı dalga boyu aralığında spektrumu gözlenen Ni, Co, Cu için toplamda 1 ì geçmediğinden Lambert Beer yasasından sapmanın en az düzeye indirildiği düşünüldü. 5.2 Kalibrasyon Bölüm 4.3.5`te anlatıldığı gibi kalibrasyon çözeltileri hazırlanılmış ve bu çözeltilerin 350-900 nm dalga boyu aralığında spektrumu alınmıştır (Değerlendirme 450-800 nm 49
aralığında yapılmıştır). Kalibrasyon setinden bir konsantrasyon matrisi ve onların spektrumlarından elde edilen bir absorpsiyon matrisi kullanılarak CLS, PCR ve PLS için kalibrasyonlar yapılmıştır. Kalibrasyon hesapları kalibrasyon seti ile absorbans değerleri arasındaki lineer ilişkiden hesaplanmıştır. Bu üç kalibrasyon yöntemi ile Fe 2+, Ni 2+, Co 2+ ve Cu 2+ için bilinen ve bulunan derişim değerleri grafiğe geçirilmiştir. Şekil 5.14 Kalibrasyon çözeltilerinin spektrumu 50
2 Fe 1,8 1,6 y = 1,003x 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0-0,2 0 0,5 1 1,5 2 Şekil 5.15 Fe 3+ için CLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği 2,5 2 Ni 1,5 y = 1,017x 1 0,5 0-0,5 0 0,5 1 1,5 2-1 Şekil 5.16 Ni 2+ için CLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği 51
2 1,5 Co y = 1,002x 1 0,5 0-0,5 0 0,,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 Şekil 5.17 Co 2+ için CLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği 2,5 2 Cu C-bulunan (ppm) 1,5 1 0,5 y = 0,983x 0-0,5 0 0,5 1 1,5 C-bilinen (ppm) 2 Şekil 5.18 Cu 2+ için CLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği 52
1,8 1,6 1,4 Fe y = 1,003x C-bulunan (ppm) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,5 1 1,5 2 C- bilinen (ppm) Şekil 5.19 Fe 3+ için PCR yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği 1,8 1,6 1,4 Ni y = 0,999x C- bulunan(ppm) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0-0,2 0 0,5 1 1,5 2 C-bilinen (ppm) Şekil 5.20 Ni 2+ için PCR yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği 53
1,8 Co 1,6 y = 1,002x 1,4 C-bulunan (ppm) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0-0,2 0 0,5 1 1,5 2 C-bilinen (ppm) Şekil 5.21 Co 2+ için PCR yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği C-blunan(ppm) 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 Cu y = 0,997x 0-0,2 0 0,5 1 1,5 2 C-bilinen (ppm) Şekil 5.27 Cu 2+ için PCR yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği 54
1,8 1,6 1,4 Fe y = 1,002x C-bulunan ppm 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,5 1 1,5 2 C-bilinen ppm Şekil 5.23 Fe 3+ için PLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği 1,8 1,6 1,4 Ni y = 0,991x C-bulunan (ppm) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0-0,2 0 0,5 1 1,5 2 C-bilinen (ppm) Şekil 5.24 Ni 2+ için PLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği 55
1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0-0,2 0 Co y = 0,999x 0,5 1 1,5 2 Şekil 5.25 Co 2+ için PLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği 1,8 1,6 1,4 1,2 Cu y = 1,003x C-bulunan (ppm) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0-0,2 0 0,5 1 1,5 C-bilinen (ppm) 2 Şekil 5.26 Cu 2+ için PLS yönteminde Cross-Validasyon karşılaştırma grafiği 56
Çizelge 5.3 CLS, PCR ve PLS1 yöntemi ile bulunan PRESS, m ve kalibrasyon seti için geri kazanım değerleri CLS PRESS EĞİM (m) GERİ KAZANIM % Fe 3+ 2,170 1,0031 100,3 Ni 2+ 63,707 1,0171 101,7 Co 2+ 3,356 1,0025 100,3 Cu 2+ 58,572 0,9838 98,4 PCR PRESS EĞİM (m) GERİ KAZANIM % Fe 3+ 0,751 1,0032 100,3 Ni 2+ 1.132 0,9992 99,9 Co 2+ 1,373 1,0029 100,3 Cu 2+ 1,516 0,9976 99,8 PLS1 EĞİM (m) GERİ KAZANIM % Fe 3+ 0,766 1,0022 100,2 Ni 2+ 1,048 0,9919 99,2 Co 2+ 1,561 0,9994 99,9 Cu 2+ 0,565 1,003 100,3 Uygulanan üç yöntem arasından PCR ve PLS1 metotlarının ikiside çok iyi sonuçlar vermektedir. her ikiside küçük PRESS değerleri ve % geri kazanım değerlerine sahiptir. Bu çalışmada gerçek numuneye uygulandığında kalibrasyon tekniği olarak PCR seçilmiştir. 5.3 Kompleks Oluşumuna Bozucu Metal Katyonlarının Etkisinin Belirlenmesi Bölüm 4.5.5 de anlatıldığı şekilde hazırlanan Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ metal katyonlarından her birinden 0,4 ppm içeren karışımlara sırasıyla 0,2-0,4-0,8 ppm farklı metal katyonları ilave edilmiş ve spektrumdan okunan absorbans değerlerinden çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri kullanılarak hesaplanan konsantrasyon değerleri 0,4 ppm olması gerekirken bozucu ilavesiyle değişen sonuçlar değerlendirilmiş ve bozucu etkisi çizelge olarak aktarılmıştır. 57
Çizelge 5.4 Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ metal katyonlarının NRS komplekslerine diğer metal katyonlarının etkisi Fe 3+ Ni 2+ Co 2+ Cu 2+ Al 3+ - + > 0,2ppm - - Ca 2+ - + > 0,4ppm - - Cd 2+ - - - - Cr 3+ - - - - Hg 2+ - + > 0,4ppm - - Mg 2+ - - - - Mn 2+ - - - - Na + - - - - Pb 2+ - - - - Sr 2+ - - - - Zn 2+ - - - - (+ işaret metal komplekslerimiz üzerine bozucu etki yaptığını gösterir. > değer o konsantrasyonlardan sonar bozucu etkinin gözlendiğini gösterir.) 5.4 Alt Tayin Sınırı 5.4.1 Seviye değerlerini düşürme metoduyla Alt tayin sınırını bulma teorisi bu yöntemde, deney sonuçlarının doğrusallıktan saptığı seviyeye kadar inmeye dayanır. Deney sonucunu etkileyebilecek herhangi bir deneysel değişkenin (faktör) farklı değerleri seviye olarak adlandırılır. Derişim gibi kantitatif bir faktörün seviyesi herhangi bir sayı ile belirlenir. Fe 3+, Ni 2+, Co 2+, Cu 2+ metal kompleksi için yapılan bir deneysel tasarımda, derişim faktörü için seçilmiş 1,6; 0,8; 0,4; 0,2; 0 gibi 5 seviyeli bir tasarım için 25 çözeltiden oluşan deneysel set hazırlanır. Bu yöntemde derişim değerleri (seviye değerleri) sürekli düşürülerek tayin edilebilen en alt sınır bulunmaya çalışılmıştır. Co 2+ metal katyonu için yapılan çalışmaların bilinen bulunan grafikleri üzeriden inceleyecek olursak; 58
İlk seviye değerleri 0 ppm 0,2 ppm 0,4 ppm 0,8 ppm 1,6 ppm 1,8 1,6 1,4 1,2 C-bulunan (ppm) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0-0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 C-bilinen (ppm) Şekil 5.27 Seviye değerlerini düşürme yöntemiyle gözlenebilme sınırı tayini için 1.bilinen bulunan grafiği X ekseni bilinen seviyeler, y ekseni ise bulunan sonuçları temsil eder. Aslında çok değişkenli kalibrasyonla tahmin edilmiş seviyeleri ne kadar doğru bulunduğunu gösterir. Yukarıdaki grafikte de görüldüğü gibi tahmin edilen değerlerle bulunan sonuçlar birbirlerine gayet yakındır. Eğride doğrusallık mevcuttur. 59
İkinci seviye değerleri 0 ppm 0,02 ppm 0,04 ppm 0,08 ppm 0,16 ppm 0,18 0,16 0,14 0,12 C-bulunan (ppm) 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0-0,02 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 C-bilinen (ppm) Şekil 5.28 Seviye değerlerini düşürme yöntemiyle gözlenebilme sınırı tayini için 2.bilinen bulunan grafiği Bilinen bulunan değerlerinin grafiğinde doğrusallığı kıyasladığımızda noktaların doğru değerden sapmaya başladığını ancak lineerliğin 0,05 ppm seviyelerine kadar hala devam ettiği görülmektedir. Ancak 0,05 ppm in altınadaki noktalarda grafikteki noktaların doğrusallığı bozulmuştır. 60
Üçüncü seviye değerleri 0 ppm 0,002 ppm 0,004 ppm 0,008 ppm 0,016 ppm 0,014 0,012 0,01 C-bulunan (ppm) 0,008 0,006 0,004 0,002 0-0,002-0,004 0 0,005 0,01 0,015 0,02 C-bilinen (ppm) Şekil 5.29 Seviye değerlerini düşürme yöntemiyle gözlenebilme sınırı tayini için 3.bilinen bulunan grafiği Şekil 5.29 daki yığılmanın olduğu yere daha küçük aralıkta bakıldığında doğrusallıktan sapma daha net görülebilir.artık hem doğrusallık bozulmuş hem de bulunan sonuçların kesinliği çok azalmıştır. Lineerliğin bozulmaya başladığı yerle kesişen nokta alt tayin sınırı olarak belirlenir. 61
1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 Seri 1 Şekil 5.30 Seviye değerlerini düşürme yöntemiyle gözlenebilme sınırı tayini için tüm veriler bilinen bulunan grafiği Yığılmanın olduğu skalayı değerlendirirsek doğrusallığın bozulduğu tam noktayı buluruz. Bulduğumuz o nokta çalışmanın alt tayin sınırıdır. Bu çalışma için alt tayin sınırı yaklaşık 0,025 ppm dir. 62
Şekil 5.31 Seviye değerlerini düşürme yöntemiyle bulunan alt tayin sınırı Çizelge 5.5 Seviye değerlerini düşürme yöntemiyle bulunan alt tayin sınırları Fe Ni Co Cu ~0,020 ppm ~0,020 ppm ~0,025 ppm ~0,04 ppm 3,6.10-7 M 3,4.10-7 M 4,2.10-7 M 6,3.10-7 M 5.3.2 CLS ve PCR metotlarında sırasıyla tanımlanan b ve K eğim değerlerini kullanarak Alt tayin sınırı belirlemek için CLS de 3s/m (IUPAC yöntemi), PCR da 3s.m formülleri matrislere uygulanarak kullanılır (Ostra, 2007). Aynı deney için yalnızca demirin ya da yalnızca diğer katyonlarda herhangi birinin olduğu 5`er tekrarlı bir set hazırlanır; 800 450 nm arasında UV spektrofotometresinden alınan okumalar matlabda matrisler haline getirilerek değerlendirilir. Matlab bize daha önceden yaptığımız çoklu 63
kalibrasyon sonucunda her bir dalga boyunda yapılan ölçüm için bulunan eğimi (CLS için K matris, PCR için b matris) matris olarak verir. Şimdi basamak basamak bunları incelersek; 800-350 nm arası 351 tane okumamız olur. Böylece 23x351 lik bir numune matrisimiz olur. Aşağıdaki tabloda mesela yine Co üzerinden gidersek, içinde yalnızca kobaltın bulunduğu 5 deney için her bir dalga boyundaki absorbansların içinden 5x351 lik matrisle ifade edilir. Şekil 5.32 Tüm verilerin matris halinde gösterimi A_num => 23x351 lik matrisimizdi. Bunun içinde kobaltın olduğu deney setini matlabda A_num_Co olarak tanıtırız; 23`lük deney setinin şekil 5.2`de görüldüğü gibi 11. satır ile 15. satır aralığındaki tüm absorbanslar, yalnızca kobaltın bulunduğu çözeltilerin okumalarından elde edilen absorbaslardır. Matlab`da bu absorbans veri topluluğunda o kısım (satır:satır, sütun) 64
olarak ifade edilir. Tüm sütunları ifade etmek için ise iki nokta üstüste koymak yeterlidir. A_num_Co=A_num(11:15,:) Oluşan bu yeni matrisimiz 5X351lik bir matristir. Şekil 5.33 Seçilen verilerin matris halinde gösterimi Daha sonra her bir dalga boyu için bulunan değerlerinin standart sapması matlabda hesaplanır; std_co=std(a_num_co) Bulunan bu standart sapmalar matrisi 1X351 lik yeni bir matristir. Her bir metal katyonu için matlabda bulunan eğimler matriside 351x4 lük bir matristir. Şekil 5.28 Her dalga boyu için bulunan eğimlerin matris halinde gösterimi Bu matris içinden de Co için olan eğimler matrisini tanımlamamız gerekir. mco=b(:,3) Alt tayin hesaplama formülümüz PCR için 3xsxm di. Bu formülü Matlaba uyarlarsak; 65