ÖNSÖZ Tez çalışmam süresince, bilgi ve yardımlarını esirgemeyen, bana her konuda yardımcı olan ve daima yol gösteren değerli hocalarım, Sayın Prof. Dr. Güldem Üstün e ve Sayın Prof. Dr. H.Ayşe Aksoy a, tüm çalışmam boyunca büyük yardım ve desteğini gördüğüm Arş. Gör. Dr. Sevil Yücel e teşekkürü bir borç bilirim. Yaşamım boyunca her zaman olduğu gibi bu çalışmam sırasında da yanımda olan ve bana destek olan aileme teşekkürlerimi sunarım. Mayıs, 2006 İnan Bektaş ii
İÇİNDEKİLER KISALTMALAR TABLO LİSTESİ ŞEKİL LİSTESİ ÖZET SUMMARY v vi vii viii ix 1. GİRİŞ 1 2. LİTERATÜR VE TEORİ 3 2.1. Yağ İkame Maddeleri 3 2.1.1. Yağ ikame maddelerinin genel özellikleri 3 2.1.2. Protein kaynaklı yağ ikame maddeleri 4 2.1.2.1. Mikropartiküle edilmiş protein 4 2.1.2.2. Modifiye edilmiş peynir altı suyu proteini 5 2.1.2.3. Diğer protein kaynaklı yağ ikameleri 5 2.1.3. Karbonhidrat kaynaklı yağ ikame maddeleri 5 2.1.3.1. Selüloz 5 2.1.3.2. Dekstrinler 5 2.1.3.3. Maltodekstrinler 6 2.1.3.4. Lif 6 2.1.3.5. Gumlar 6 2.1.3.6. Nişasta ve modifiye nişastalı yağ ikameleri 6 2.1.4. Yağ kaynaklı yağ ikame maddeleri 6 2.2. Yapılandırılmış Lipidler 7 2.2.1. Yapılandırılmış yağların sentezi 8 2.2.1.1. Esterleşme reaksiyonları 8 2.2.1.2. Transesterleşme reaksiyonları 9 2.2.2. Enzimatik proseslerde ürün verimini etkileyen faktörler 11 2.2.2.1. Lipaz seçiminin etkisi 11 2.2.2.2. Su miktarının etkisi 11 2.2.2.3. Sıcaklığın etkisi 11 2.2.2.4. Sürenin etkisi 12 2.2.2.5. Substrat-molar oranının etkisi 12 2.2.3. Lipid modifikasyonunda kullanılan lipazlar 12 2.2.4. Yapılandırılmış lipid sentezi için yağ asidi kaynakları 13 iii
2.2.4.1. Kısa zincirli yağ asitleri 13 2.2.4.2. Orta zincirli yağ asitleri 13 2.2.4.3. Uzun zincirli yağ asitleri 14 2.2.5. Yapılandırılmış yağların sindirimi ve absorpsiyonu 15 2.2.6. Yapılandırılmış lipidlerin uygulamaları 15 2.2.6.1. Bebek mamaları 16 2.2.6.2. Enteral ve parenteral beslenme için gıdalar 16 2.2.6.3. Düşük kalorili yapılandırılmış yağlar 17 2.2.6.4. Kakao yağı ikameleri 18 2.2.6.5. Medikal alanda kullanılan yapılandırılmış yağlar 19 2.3. Tripalmitin ve kaprik asitle yapılan çalışmalarla ilgili literatür çalışması 19 2.4. Tepki-yüzey metodolojisi 21 2.4.1. Merkezi bileşik deney tasarımları 22 2.4.2. Varyans analizi (ANOVA) 23 2.4.3. Regresyon analizi 24 2.4.4. Kalanların toplamı 24 2.4.5. Korelasyon katsayısı 25 3. DENEYSEL ÇALIŞMA 26 3.1. Kullanılan Hammaddeler 26 3.2. Çalışma Yöntemi 26 3.2.1. Kullanılan hammaddelerin karakterizasyonu 26 3.2.2. Tripalmitin ile kaprik asidin asidolizinde uygulanan yöntem 26 3.2.3. Asidoliz ürünlerinin analizi 27 3.2.4. Deneysel tasarımda kullanılacak değişkenlerin ve değişken seviye değerlerinin belirlenmesi 28 3.2.5. Deneysel tasarım ve reaksiyon koşullarının optimizasyonu 29 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 30 4.1. Substratların Yağ Asitleri Bileşimleri 30 4.2. Tepki Yüzey Metodolojisi ne Göre Deneysel Tasarım ve Reaksiyon Parametrelerinin Optimizasyonu 31 4.3. Farklı Reaksiyon Koşullarının Tripalmitin ile Kaprik Asitin Asidoliz Reaksiyonuna Etkilerinin İstatiksel Açıdan Değerlendirilmesi 34 4.4. Tepki-Yüzey ve İzdüşüm Grafiklerinin Yorumlanması 37 5. GENEL SONUÇLAR VE ÖNERİLER 42 KAYNAKLAR 43 ÖZGEÇMİŞ 48 iv
KISALTMALAR TAG DAG MAG TP KA TYM USFDA SCT MCT LCT SCFA MCFA LCFA EFA EPA DHA PUFA HDL LDL VLDL CLA RES YA : Triaçilgliserol : Diaçilgliserol : Monoaçilgliserol : Tripalmitin : Kaprik Asit : Tepki Yüzey Metodolojisi : Birleşik Devletler Gıda ve İlaç Yönetimi : Kısa Zincirli Triaçilgliserol : Orta Zincirli Triaçilgliserol : Uzun Zincirli Triaçilgliserol : Kısa Zincirli Yağ Asidi : Orta Zincirli Yağ Asidi : Uzun Zincirli Yağ Asidi : Elzem Yağ Asitleri : Eikosapentaenoik Asit : Dokosahekzaenoik asit : Çoklu Doymamış Yağ Asidi : Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein : Düşük Yoğunluklu Lipoprotein : Çok Düşük Yoğunluklu Lipoprotein : Konjuge Linoleik Asit : Retiküloendotelyal Sistemi : Yağ Asitleri v
TABLO LİSTESİ Sayfa No Tablo 2.1. Üç faktör için yüzey merkezli merkezi bileşik tasarım, 2 merkez nokta, 16 deney, merkez noktalar. 24 Tablo 3.1. Gaz kromatografisi analiz koşulları... 28 Tablo 4.1. Kaprik asidin ve tripalmitinin yağ asitleri bileşimi 31 Tablo 4.2. Yüzey merkezli küp tasarımında kullanılan bağımsız değişkenler ve bu değişkenler için kodlanan seviyeler... 32 Tablo 4.3. Yüzey merkezli küp deney tasarımında belirlenen deney tasarım noktaları. 33 Tablo 4.4. Tripalmitin ile kaprik asidin asidolizinde elde edilen TAG ürünlerin yağ asitleri bileşimleri 33 Tablo 4.5. Tripalmitin ile kaprik asidin asidolizinde elde edilen TAG ürünlerin yağ asitleri bileşimleri... 34 Tablo 4.6. Tripalmitin ile kaprik asidin asidolizinde elde edilen TAG ürünlerin yağ asitleri bileşimleri... 34 Tablo 4.7. Tripalmitin ile kaprik asidin asidolizinde elde edilen TAG ürünlerin yağ asitleri bileşimleri... 34 Tablo 4.8. Yüzey merkezli küp tasarımına göre yürütülmüş asidoliz reaksiyonlarından elde edilen tepkiler (ürün TAG larındaki kaprik asit yüzdeleri)... 35 Tablo 4.9. Bağımsız değişkenler ile bağımlı değişkenler arasındaki ilişkiye bağlı olarak lineer ve kuadratik modellerde etkilerin tahminleri ve katsayıları... 36 Tablo 4.10. Varyans analizi sonuçları... 37 Tablo 4.11. Bağımsız değişkenlerin kritik değerleri. 38 vi
ŞEKİL LİSTESİ Şekil 2.1 Şekil 2.2 Şekil 2.3 Şekil 2.4 Şekil 2.5 Şekil 2.6 Şekil 2.7 Şekil 2.8 Şekil 4.2.a Şekil 4.2.b Şekil 4.3.a Şekil 4.3.b Şekil 4.4.a Şekil 4.4.b : Orta ve uzun zincirli trigliseridlerin fiziksel karışımları ile gelişigüzel gliserid yapısına esterifiye olmuş orta ve uzun zincirli yağ asitlerini içeren yapılandırılmış yağların farkı... : Esterleşme reaksiyonu.. : İki TAG arasında gerçekleşen iç esterleşme reaksiyonu.. : Alkoliz reaksiyonu : Asidoliz reaksiyonu.. : Cevap Yüzeyi ve izdüşümlerin gösterilmesi... : Merkezi Bileşik Tasarımda deney noktaları örneği.. : Üç faktör için Yüzey Merkezli Merkezi Bileşik Tasarım, 2 merkez noktası, 16 deney, merkez noktalar.. : Ürünün kaprik asit içeriğinin (%KA), mol oranı ve enzim miktarı ile değişimini gösteren izdüşüm grafiği : Ürünün kaprik asit içeriğinin (%KA), mol oranı ve enzim miktarı ile değişimini gösteren tepki yüzey grafiği... : Ürünün kaprik asit içeriğinin (%KA), enzim miktarı ve süre ile değişimini gösteren izdüşüm grafiği : Ürünün kaprik asit içeriğinin (%KA), enzim miktarı ve süre ile değişimini gösteren tepki yüzey grafiği... : Ürünün kaprik asit içeriğinin (%KA), mol oranı ve reaksiyon süresi ile değişimini gösteren izdüşüm grafiği. : Ürünün kaprik asit içeriğinin (%KA), mol oranı ve reaksiyon süresi ile değişimini gösteren tepki yüzey grafiği. Sayfa No 8 9 10 10 11 23 23 23 39 40 41 41 42 42 vii
TRİPALMİTİNİN KAPRİK ASİT İLE ENZİMATİK ASİDOLİZİ: TEPKİ YÜZEY METODOLOJİSİ İLE REAKSİYON KOŞULLARININ OPTİMİZASYONU ÖZET Obezite problemi bilincinin gelişmesi ile, dünyada düşük kalorili yağların ve yağ ikame maddelerinin pazarı hızlı bir büyüme göstermektedir. Günümüzde karbonhidrat ve protein bazlı yağ ikame maddeleri, bazı gıda maddelerinde kullanılmaktadır. Ancak bu ikame maddeleri ısıl işleme dayanıklı değillerdir. Bu yüzden, pişirme ve kızartma işlemleri gerektiren gıda maddelerinin üretiminde, ısıl dayanıklı ve doğal bir yağın özelliklerini gösteren lipid bazlı yağ ikame maddelerinin kullanımı tek seçenek olmaktadır. Düşük kalorili yağlar ve yağ ikame maddeleri, esas olarak lipidlerin yeniden yapılandırılmalarıyla üretilebilmektedir. Düşük kalorili yapılandırılmış lipidler, 1,3-pozisyonlarında orta zincirli yağ asitleri (C8-C12) ve 2- pozisyonunda uzun zincirli yağ asitleri (C16-C22) bulunan triaçilgliserollerdir. Bu çalışmada, tripalmitinden (TP) düşük kalorili yağların üretiminde kullanılabilecek, hızlı metabolize olan kaprik asit (C10:0) ile zenginleştirilmiş triaçilgliserollerin enzimatik olarak eldesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, tripalmitinin kaprik asit (KA) ile Thermomyces lanuginosa lipazı (Lipozyme TL IM) varlığında asidoliz reaksiyonu sistematik olarak incelenmiştir. Tepki Yüzey Metodolojisi uygulanarak, reaksiyon parametrelerinin (substrat oranı, enzim miktarı ve sürenin) tripalmitine katılan kaprik asit yüzdesi üzerine olan etkileri araştırılmış ve reaksiyon koşulları optimize edilmiştir. Optimizasyon için kullanılan Tepki-Yüzey Metodolojisi yöntemine göre 50 C de yapılan seri deneyler sonucunda, tripalmitine en fazla %35,01 kaprik asit katılabileceği belirlenmiştir. Bu istatistiksel analiz yöntemine göre optimum reaksiyon koşulları ise 8,9 saat reaksiyon süresi, %11,6 enzim miktarı ve 1/6,5 TP:KA mol oranıdır. TP:KA mol oranı, reaksiyon süresi ve enzim miktarının kaprik asit yüzdesine etkisini göstermek için varyans analizinden yararlanarak 2. dereceden polinom olan bir model denklem oluşturulmuştur. Elde edilen model denklemin regresyon katsayısı (R 2 ) 0,99 olarak bulunmuştur. Bu da model denklemin güvenilir olduğunu göstermektedir. viii
ENZYMATIC ACIDOLYSIS OF TRIPALMITIN WITH CAPRIC ACID: OPTIMIZATION OF REACTION CONDITIONS BY RESPONCE SURFACE METHODOLOGY SUMMARY With increasing awareness of the risks associated with obesity, a market for reduced calorie fats and fat replacers has opened up. Carbohydrate and protein-based fat replacers are currently available, but cannot be exposed to high temperatures. Therefore, lipid-based fat substitutes are the only option for use in cooking and frying applications and for mimicking all the attributes of a natural fat. Low calorie fats and fat replacers can be produced by restructuring lipids. In general, these structured lipids contain medium chain fatty acids (C8-C12) in the 1,3-positions and long chain fatty acids (C16-C22) in the 2-position of triacylglycerols. The aim of this project is the production of triacylglycerols enriched with capric acid (CA) to be used in the formulation of low calorie fats. For this purpose, the acidolysis reaction of tripalmitin (TP) with capric acid in the presence of Thermomyces lanuginosa lipase (Lipozyme TL IM) was studied in detail. The effects of reaction parameters (substrate ratio, amount of enzyme amd time) on the percentage of incorporated capric acid into tripalmitin were investigated and reaction conditions were optimized using Response Surface Methodology. Maximal incorporation of 35,01% capric acid into tripalmitin was predicted by Responce Surface Methodology when a substrate molar ratio of 1:6,5 of TP/CA, 11,6% enzyme amount and incubation time of 8,9 h were used. A second-order model was obtained to predict conversions as a function of time, enzyme percent and TP:CA mol ratio. The analysis of variance indicated that the second-order model was highly significant and adequate to represent the actual relationship between the response (CA content, %) and the significant variables with a satisfactory regression coefficient (R 2 ) found as 0,99. ix
1. GİRİŞ Günümüz dünyasında baş döndürücü bir hızla gelişen bilim ve teknoloji, iletişim alanında ulaşılan inanılmaz aşama ile toplumların yeni bilimsel verilere çok kısa sürede erişmesini sağlamıştır. Yaşanan bu değişimin sonucu olarak, toplumların aldıkları mal ve hizmetlerin çeşit ve nitelikleri konusundaki istekleri ve beklentileri de çeşitlenerek sürekli yenilenmektedir. Sağlıklı bir yaşamın gereği olarak tüketilen gıda maddelerine olan ilgi, bu beklentilerin neticesinde, her geçen gün yeni gıda maddelerinin ortaya çıkmasına sebep olmuştur. Obezite, kalp ve damar hastalıkları gibi rahatsızlıklar son yıllarda insanların en büyük sorunlarından biri olmuştur. Bunların en büyük nedeni olan aşırı kilo, besinlerden alınan yağlardan kaynaklanmaktadır. Obezitenin bir problem olduğu bilincinin gelişimiyle, dünyada düşük kalorili yağların ve yağ ikame maddelerinin pazarı hızla büyümektedir. Günümüzde karbonhidrat ve protein bazlı yağ ikame maddeleri salata sosları, tatlılar gibi bazı gıda maddelerinde kullanılmaktadır. Ancak bu ikame maddeleri ısıl işleme dayanıklı değillerdir. Bu yüzden, pişirme ve kızartma işlemleri gerektiren gıda maddelerinin üretiminde, ısıl dayanıklılığı olan ve doğal bir yağın tüm özelliklerini gösteren lipid bazlı yağ ikame maddelerinin kullanımı tek seçenek olmaktadır. Lipid bazlı yağ ikame maddeleri esas olarak yapılandırılmış lipidlerdir. Yapılandırılmış lipidler, triaçilgliserol (TAG) içerisindeki yağ asidi kompozisyonunun veya dağılımının modifiye edilmesi ile elde edilir. TAG ın yapısındaki yağ asitlerinin pozisyonlarının değişmesi ya da yapıya yeni yağ asitlerinin katılması, modifiye edilmiş yağa tüketici tarafından tercih sebebi sayılan geliştirilmiş özellikler katar. Sahip oldukları bu fonksiyonel özellikler, yapılandırılmış yağların gıda ve sağlık alanında geniş uygulama alanları bulmasını sağlamıştır. Yapılandırılmış lipidlerin ortaya çıkmasından önce, sindirim sorunu çeken bazı hastalara orta zincirli TAG ve uzun zincirli TAG karışımları verilmekteydi. Karışımda yer alan orta zincirli TAG lar çok çabuk metabolizmaya katılarak hızla enerjiye dönüşmektedir. Günümüzde ise daha çok yapısında yavaş metabolize olan 1
uzun zincirli yağ asitleri ile hızlı metabolize olan yağ asitlerini aynı anda bulunduran yapılandırılmış yağlar kullanılmaktadır. Gün geçtikçe bu sektöre artan ilginin sonucu, belirli amaçlar doğrultusunda hazırlanan yapılandırılmış yağlar, kazandıkları gelişmiş fonksiyonlar sayesinde gıda sektöründe ve medikal sektörde bazı spesifik hastalıklarla mücadelede önemli bir yer almaya başlamıştır. Fonksiyonel yağların üretilmesi için birkaç yöntem vardır. Bu yöntemlerden en önemlisi, kimyasal olarak veya lipaz katalizörlüğünde gerçekleşen iç esterleşme ve asidoliz reaksiyonlarıdır. Diğer bir üretim yöntemi ise yağlı tohumların genetik olarak değiştirilmesi ile istenen yağ asidi bileşimine sahip yağların üretilmesidir. Ancak şu anda en çok kullanılan yöntem iç esterleşme reaksiyonlarıdır. Çünkü bu yöntemle daha etkin biçimde, içerisinde trans yağ asidi bulundurmayan margarin, kakaoya özdeş yağ ve kalorisi düşürülmüş yağ üretilebilir. Literatürde spesifik lipaz enzimlerinin kullanıldığı yapılandırılmış lipidlerin enzimatik üretimi üzerine çok sayıda çalışma yer almaktadır. Bu çalışmalarda orta zincir uzunluğunda yağ asitleri ile modifiye edilmiş TAG ların üretiminde daha çok C8 ve C10 asitlerinin kullanıldığı gözlenmiştir. Bu çalışmalarda çeşitli yağ ve TAG lar kullanılmıştır. Ancak tripalmitine kaprik asit (C10:0) bağlayarak, sn-1,3 pozisyonlarında kaprik asit ve orta pozisyonunda palmitik asit barındıran yapılandırılmış TAG üreten bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu nedenle bu çalışmada, tripalmitinin kaprik asit ile asidolizinin detaylı olarak incelenmesi ve Tepki Yüzey Metodolojisi (Responce Surface Methodology) kullanılarak reaksiyon parametrelerinin optimize edilmesi hedeflenmiştir. 2
2. LİTERATÜR VE TEORİ 2.1 Yağ İkame Maddeleri Yağ ikame maddeleri, yağın insan sağlığı için neden olduğu olumsuz özellikleri sınırlandıran veya ortadan kaldıran, gıdanın yağdan kaynaklanan kalori değerinin azalmasını sağlayan, gıdalarda yağ yerine kullanılarak yağın gıdaya kazandırdığı olumsuz özellikleri tamamen veya kısmen ortadan kaldıran katkı maddeleridir. Yağ ikame maddeleri genel olarak; karbonhidrat kaynaklı, protein kaynaklı ve yağ kaynaklıdır [1]. Protein kaynaklı yağ ikame maddeleri, genellikle mikropartikülasyon işlemi ile gıdalarda yağın yerini alırlar. Mikropartikülasyon, proteinlerin birbirlerinin üzerlerinden kolayca kaymalarını sağlayacak şekilde mikroskobik yuvarlak tanecikler şekline getirilme işlemidir. Protein partikülleri gıdanın içinde yayılarak ürünün normalde olduğu gibi yağlı şekilde algılanmasını sağlarlar. Karbonhidrat kaynaklı yağ ikame maddeleri, son üründe yüksek oranda su tutulmasını sağlayarak ürünün normalde olduğu gibi yağlı algılanmasını sağlarlar. Son grup olan lipid bazlı yağ ikame maddeleri ise yapılandırılmış lipidlerden oluşur [1,2]. 2.1.1 Yağ ikame maddelerinin genel özellikleri Gelişmiş ülkelerde tüketicilerin büyük kısmı, yağların neden olduğu olumsuz hastalıkların bilincinde oldukları için, yağ ikame maddelerini içeren gıdalara olan talep artmıştır. Buna bağlı olarak bu tür ürünlerin önemi ve pazarı zamanla büyümektedir. Fiziksel ve kimyasal özelliklerinin yanı sıra duyusal olarak yağın ağızda bıraktığı his ve tat; kıvam, yağlayıcılık, ağzı kaplama hissi, yapışkanlık gibi birçok parametre ile belirlenebilmektedir. Bir gıdada kullanılan yağ ikame maddesi, normalde gıdanın sahip olduğu yağın gıdaya sağladığı tüm olumlu özellikleri ikame edebilmektedir [2]. Yağlı gıdalar yerine kullanılan ikame maddeleri, kanserojen olmamalı ve insan sağlığı açısından herhangi bir yan etki göstermemelidir. Yağ ikame maddeleri; 3
Hacim arttırıcı Jelleştirici Su tutucu Ağız hissi iyileştirici Stabilize edici Dokuyu iyileştirici Kalınlaştırıcı Sağlık açısından güvenilir Fizyolojik olarak inert maddelerdir [3]. 2.1.2 Protein kaynaklı yağ ikame maddeleri Bu yağ ikame maddeleri, ağızda karbonhidrat bazlı yağ ikame maddelerine göre daha iyi bir his bırakmakta ve bazı pişirilmiş gıdalarda kullanılabilmektedir. Fakat bu maddeler kızartma için uygun değildir [3-4]. Endüstriyel olarak üretilen çeşitleri aşağıdaki bölümlerde incelenmiştir. 2.1.2.1 Mikropartiküle edilmiş protein Simplesse adlı ürün, yumurta beyazı veya peynir altı suyu proteinleri gibi ufak granüllü süt proteinlerinin ısıtılıp soğutulması anlamına gelen mikropartikülasyon prosesi ile elde edilir. Bu işlem sırasında protein, su ile karıştırılarak akışkan bir hal alır. Bu nedenle gıda içerisinde sis bulutuna benzer şekilde yayılan proteinler yağ benzeri his ve tat verir. İlk kez 1988 de Nutra- Sweet firması tarafından üretilmiştir [4]. Simplesse, vücutta protein gibi sindirilir ve absorbe edilir. Gram başına 1-2 kalori enerji verir ve kolesterol içermez. Simplesse nin kullanımında, 1 gram yağ 1 gram mikropartiküle protein ile yer değiştirir [3]. Simplesse, piyasada en yaygın kullanılan protein kaynaklı yağ ikamelerinden birisidir ve süt ürünleri (dondurma, tereyağı, ekşikrema, peynir, yoğurt), margarin ve mayonez tipi ürünler, soslar, çorbalar ve salata sosları en çok kullanılan uygulama alanlarıdır [3,5]. 4
2.1.2.2 Modifiye edilmiş peynir altı suyu proteini Dairy-Lo adlı ürünün kullanımı ilk kez 1979 yılında USFDA (Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Yönetimi) tarafından kabul edilmiştir. Tatlı peynir altı suyundan kontrollü sıcaklıkla denatürasyon sonucunda üretilen doğal yağ benzeri özellikteki fonksiyonel bir üründür. Özellikle süt ürünleri, pişirilmiş ürünler, salata sosları ve mayonez tipi ürünlerde kullanılır [6]. 2.1.2.3 Diğer protein kaynaklı yağ ikameleri Endüstriyel olarak üretilen protein bazlı yağ ikame maddelerine örnek olarak Blazer, Ultra-Bak, Ultra-Freeze ve Lita gibi ürünlerde verilebilir. Bu ürünler mikropartiküle edilmiş yağ ikamelerine benzerler fakat farklı proseslerden elde edilirler. Ayrıca mısır proteininden elde edilmiş düşük kalorili yağ ikameleri vardır. Bu grup yağ ikameleri daha çok dondurulmuş tatlılarda ve pişirilmiş ürünlerde kullanılırlar [4,7]. 2.1.3 Karbonhidrat kaynaklı yağ ikame maddeleri Bu maddeler yağın kıvamlılık özelliğini karşılar, fakat yağın pişirme özelliklerini karşılamazlar [3]. Karbonhidrat bazlı yağ ikame maddeleri doğal yağa göre daha düşük kaloriye sahip olmalarına rağmen, ısıya karşı dayanıksızlıklarından dolayı doğal yağ yerine kullanımları sınırlıdır [4]. Bu ürünlere örnek olarak selüloz, dekstrinler, maltodekstrinler, modifiye gıda nişastaları ve çeşitli zamklar verilebilir [8]. 2.1.3.1 Selüloz Ticari olarak üretilen yağ ikamesi selülozlar, Avicel Selüloz Jel, Methocel ve Solka- F Loc dur. Asit hidrolizi ile hazırlanan mikrokristalize selülozdan üretilirler. Ağızda yağlılık hissi verirler ve akış özellikleri yağla aynıdır. Süt ürünleri, donmuş ürünler ve salata sosları kullanım alanlarından bir kaçıdır [8]. 2.1.3.2 Dekstrinler Amylum ve N-011 ticari olarak üretilen yağ ikamesi dekstrinlerdendir. Bu ürünler topioca nişastasının enzim hidrolizi ile elde edilen, tatsız ve 4 kal/gr kalori değerine sahip yağ ikameleridir. Salata sosları, puding ve süt ürünlerinde kullanılırlar [8,9]. 5
2.1.3.3 Maltodekstrinler Crystebleaz, Corelite ve Maltrin endüstriyel olarak üretilen yağ ikamesi maltodekstrinlerdir. Mısır, un, patates ve tapioca nişastasından enzim hidrolizi ile elde edilir ve yağ ikamesi olarak kullanılırlar. Pişmiş ürünler, süt ürünleri, salata sosları, sos, kremşanti, et ürünleri ve donmuş tatlılar kullanım alanlarından bir kaçıdır [8,9]. 2.1.3.4 Lif Eptai Oat Fiber, Snowite, Ultracel ve Z-Trim ticari olarak üretilen yağ ikamesi liflerdir. Düşük yağlı gıdalarda yapı bütünlüğü, nem tutucu kapasite, raf ömrü stabilitesi ve yapışmazlık sağlayan yağ ikameleridir [8]. 2.1.3.5 Gumlar Kelcogel, Keltrol ve Selendid ticari olarak üretilen yağ ikamesi gumlardır. Yapılarında karbonhidrat içeren, uzun zincirli ve yüksek molekül ağırlıklı polimerler bulunur. Hidrofilik kolloidler veya hidrokolloidler olarak adlandırılırlar. Kıvam arttırıcı, emülsifiye edici, kayganlaştırıcı olarak kullanılırlar. Suda çözünür ve jel oluşumu sağlarlar. Düşük kalorili ürünlerde ve salata soslarında kullanılırlar [3]. 2.1.3.6 Nişasta ve modifiye nişastalı yağ ikameleri Amalean I &II, Fairney VA15 ve Instant Stellar ticari olarak üretilen yağ ikamesi nişastalardır. 1 gramı 1-4 kalori değerine sahiptirler. Patates, mısır, yulaf, pirinç, un veya tapioca nişastasından elde edilirler. Emülsifiyerler, proteinler, gumlar ve diğer modifiye nişastalarla beraber kullanılabilirler. Et ürünleri, salata sosları, pişmiş gıdalar, çeşniler, pasta kreması, süt ürünleri bazı kullanım alanlarıdır [8,9]. 2.1.4 Yağ kaynaklı yağ ikame maddeleri Lipid bazlı yağ ikame maddelerinin çoğunluğu yapılandırılmış yağlardır. Bunların çeşitli üretim şekilleri ve kullanım alanları vardır. Yapılandırılmış yağ, lipid içerisinde yer alan yağ asitlerinin pozisyonlarını veya kompozisyonlarını değiştirerek elde edilen modifiye yağlar olarak tanımlanabilir. Lipidler, biyoteknoloji alanında gerçekleşen gelişmeler sayesinde, kolesterolü düşürmek, bağışıklık sistemini güçlendirmek, işlevselliği artırmak ve beyin gelişimine yardımcı olmak amacıyla yeniden yapılandırılabilirler [10]. Yapılandırılmış lipid uygulamalarına örnek olarak şunlar verilebilir: 6
Kakao yağı ikameleri Anne sütü yağı benzerleri Düşük kalorili yağlar Sağlık ve besi değeri yüksek bileşiklerin üretilmeleri ve Diğer uygulamalar [11]. 2.2 Yapılandırılmış Lipidler Yapılandırılmış yağlar triaçilgliserol (TAG) lerin kimyasal ya da enzimatik yollarla tekrar yapılandırılması veya modifiye edilmesi ile elde edilir. Böylece TAG ı oluşturan yağ asitlerinin yapı içerisindeki kompozisyonu ve dağılımı değiştirilir. Bu özel yağlar, çeşitli yararlı yağ asitlerinin TAG yapısı içerisinde yer alması için geliştirilmiştir [12,13]. Yapılandırılmış yağların insan metabolizması üzerinde birçok faydasının olduğu yapılan çalışmalar neticesinde anlaşılmıştır. Bağışıklık sisteminin geliştirilmesi, metabolizmadaki azot dengesini düzeltmesi ve kandaki kolesterol miktarının düşürülmesi yapılandırılmış yağların metabolizma üzerindeki faydalarından birkaçıdır [14]. Ayrıca yapılandırılmış lipidler, TAG ın erime sıcaklığı, katı yağ miktarı, iyot ve sabunlaşma değerleri gibi fiziksel ve kimyasal özelliklerinin değiştirilmesi amacıyla da üretilirler [12]. Yapılandırılmış yağlar genellikle nutraceutical diye adlandırılan sağlığı kuvvetlendirici yeni bir lipid çeşiti olarak tanınırlar [12]. Nutraceutical, beslenme etkisinin yanında sağlığa faydası da olan gıda maddelerinin tanımlanmasında kullanılan bir terimdir [14]. Bu ürünlerin normal bir gıdaya katılması, katıldığı gıdaya sağlık yönünden faydalı özellikler kazandırır. Bu özellikleri sayesinde fonksiyonel lipid ya da fonksiyonel gıda olarak sınıflandırılabilirler [15]. Yapılandırılmış lipidler, TAG karışımlarından serbest açil gruplarının hidrolizini takiben gerçekleşen esterleşme reaksiyonları ile hazırlanabilirler [11,12]. Bu katılım sürecinde, istenen metabolik etkiye bağlı olarak doymuş, kısmi doymuş ya da doymamış yağ asitleri kullanılabilir. Esterleşme ile farklı karaktere sahip yağ asitleri gliserid yapıya katılırlar. Üretilen bu yağlar hem yapısal hem de metabolik olarak, rasgele hazırlanmış orta zincirli TAG (MCT) ve uzun zincirli TAG (LCT) karışımlarından çok farklıdır [10]. Yapılandırılmış yağlar ile fiziksel yağ karışımları arasındaki fark Şekil 2.1 de görülmektedir. 7
Şekil 2.1: Fiziksel karışımları yapılandırılmış yağların farkı [5] 2.2.1 Yapılandırılmış yağların sentezi Yapılandırılmış lipidlerin sentezi, kimyasal ya da enzimatik yolla gerçekleştirilen esterleşme, iç esterleşme, alkoliz ve asidoliz reaksiyonları sonucunda gerçekleşir [10]. Hangi metodun tercih edileceği kullanılan substratın uygunluğuna ve istenen son ürüne bağlıdır [12]. Çalışmamızda enzimatik yolu kullandığımızdan bundan sonraki bölümlerde yapılandırılmış lipidlerin enzimatik üretimine dair bilgi verilecektir. 2.2.1.1 Esterleşme reaksiyonları Esterleşme hidrolizin tam tersi olarak gerçekleşen bir reaksiyondur, yağ asitlerinin gliserid ile reaksiyonuyla gerçekleşir. Reaksiyon tersinirdir ve sadece ortamda suyun olmadığı durumlarda gerçekleşir [5,12]. Hidroliz ve esterleşme arasındaki denge, ortamdaki su miktarı ile kontrol edilir. Reaksiyon karışımında aşırı su olması durumunda denge hidroliz tarafındadır. Tam tersi şekilde, ortamda su miktarı sınırlıysa denge esterleşmeden yanadır [10]. Esterleşme esnasında ortaya çıkan suyun birikmesi sorun yaratır. Çünkü ortamda biriken su lipazın aktivesini inhibe ederek oluşan esterlerin hidrolizini arttırır. Bu sebepten dolayı esterleşme sonucu ortaya çıkan su, moleküler elekler kullanılarak düzenli olarak ortamdan çekilmelidir [12]. Enzimin aktivitesini koruyabilmesi için ortamda bir miktar su bırakılmalıdır [10-12]. Gliserid ile esterleşme sonucu ortamda monoaçilgliseroller (MAG), diaçilgliseroller (DAG) ve triaçilgliseroller (TAG) oluşur [6]. Esterleşme reaksiyonu ve oluşan ürünler aşağıda Şekil 2.2 de gösterilmiştir. Esterleşme reaksiyonlarının ürünleri, 8
genellikle MAG, DAG ve TAG karışımı ile değişen miktarlarda reaksiyona girmemiş gliseridden oluşur. Bu ürünlerin gıda, kozmetik, eczacılık gibi alanlarda birçok uygulaması vardır [5,6,10 12]. Şekil 2.2: Esterleşme reaksiyonu [6] 2.2.1.2 Transesterleşme reaksiyonları Transesterleşme, doğal yağların modifiye edilmesinde endüstride kullanılan temel reaksiyonlardan biridir. En basit anlamda transesterleşme, iki TAG arasından yağ asitlerinin yer değiştirerek yeni TAG oluşmasını sağlayan reaksiyondur. Transesterleşme ile oluşan yeni TAG başlangıç TAG larına kıyasla gelişmiş kimyasal ve fiziksel özelliklere sahiptir [19]. Örneğin kakao yağı ikameleri sn-1,3 spesifik lipaz katalizörlüğünde gerçekleşen transesterleşme reaksiyonu sonunda üretilir. Reaksiyon sonunda oluşan TAG ların çeşitleri kullanılan lipazın spesifikliğine bağlıdır [13,15]. Literatürde transesterleşme terimi birkaç reaksiyonu tanımlamakta kullanılır. Bunlardan biri olan asidoliz reaksiyonlarında bir ester ve bir asit arasında açil gruplarının değişimi gerçekleşir. Diğer bir transesterleşme reaksiyonu olan alkolizde ise bir ester ve alkol arasında açil gruplarının değişimi gerçekleşir. Ayrıca diğer bir transesterleşme reaksiyonu olan iç esterleşme de ise bir ester ile başka bir ester arasında açil grupları yer değiştirir. Bu reaksiyonların ayrıntılı açıklaması, sıradaki bölümlerde yapılmıştır [10-12,19]. İç esterleşme yağ endüstrisinde TAG ların fiziksel ve fonksiyonel özelliklerini modifiye etmek amacıyla kullanılan bir yöntemdir. İç esterleşme tek başına veya diğer yöntemlerle beraber kullanılarak, yemeklik yağları daha kullanışlı hale getirmekte ve bu yağların diğer gıda maddelerinde de geniş bir kullanım alanı bulmasını sağlamaktadır [20]. Kimyasal ve enzimatik olmak üzere iki tip iç esterleşme reaksiyonu vardır [5]. Enzimatik modifikasyonlarda spesifik olmayan ya da belirli spesifikliğe sahip (sn-1,3 veya sn-2 spesifik) lipaz enzimi kullanılır [11]. Enzimatik yolla gerçekleştirilen iç esterleşme Şekil 2.3 de gösterilmiştir. 9
Şekil 2.3: İki TAG arasında gerçekleşen iç esterleşme reaksiyonu [5] Lipaz katalizörlüğünde gerçekleştirilen iç esterleşme, kimyasal iç esterleşmeye ek olarak bazı avantajlar sunar. Bu avantajlar, ılımlı ortam koşullarında gerçekleşen reaksiyon ve spesifik lipaz kullanımı ile istenen ürün bileşimini yüksek verim ile sağlamaktır [11,20]. Alkoliz, bir alkol ve bir ester arasında gerçekleşen esterleşme reaksiyonudur. Şekil 2.4 de alkoliz reaksiyonu ve reaksiyon sonu ortaya çıkan ürünler gösterilmiştir. Alkoliz esnasında TAG ların hidrolizi ile DAG ve MAG oluşabilir [21]. Şekil 2.4: Alkoliz reaksiyonu [5] Gliseroliz, gliserol ve bir TAG arasındaki açil gruplarının yer değiştirmesi sonucu MAG, DAG ve TAG oluşumunu sağlayan bir alkoliz reaksiyonudur. Yağların enzimatik gliserolizi, atmosferik basınç altında ve ortam sıcaklığına yakın değerlerde gerçekleştirilerek, kimyasal yönteme alternatif olarak MAG ve DAG üretiminde kullanılabilir. Gıda endüstrisinde yüzey aktif madde ve emülsifiye edici olarak önemli kullanım alanlarına sahip MAG ların üretimi için birkaç yol vardır. TAG veya serbest yağ asitleri ile gliserol arasında ester değişimi reaksiyonu ile MAG üretilebilir [22]. Asidoliz, bir asit ve bir TAG arasında, açil gruplarının yer değiştirmesi reaksiyonudur [23]. Asidoliz reaksiyonu ile bir yağ asidini TAG molekülüne bağlamak mümkündür. Belirli fonksiyonlara sahip serbest yağ asitlerini bitkisel yağlara bağlayarak, bu yağların besin değerleri yükseltilebilir [24]. Aşağıda Şekil 2.5 de asidoliz reaksiyonu gösterilmiştir. Şekil 2.5: Asidoliz reaksiyonu [5] 10
2.2.2 Enzimatik proseslerde ürün verimini etkileyen faktörler Kullanılan enzimin kaynağı, enzimin aktivitesi, enzimin miktarı, enzimin yükü, enzimin substrat tipine seçiciliği, su miktarı, solvent tipi, ortam ph sı, substrat-molar oranı, inkübasyon süresi ve uygulanan sıcaklık, prosesi ve ürün verimini etkileyen temel faktörlerdir. Kullanılacak metodun seçimi substratın tipine ve istenen ürüne bağlıdır [25,26]. 2.2.2.1 Lipaz seçiminin etkisi Lipaz enziminin katalizlediği reaksiyonlarda amaç en yüksek verimle en yüksek saflıkta ürün elde etmektir. Bu sebeple reaksiyon veriminin arttırılmasında proses koşullarının optimizasyonunun yanında enzim seçimi de oldukça önemlidir [26]. Lipazlar substrat seçiciliği açısından değişiklik gösterirler. Lipazların pozisyonel seçiciliği, yağ asidi seçiciliği ve stereospesifikliği, istenen TAG ın sentezi için en yüksek verimi elde etmeye olanak sağlar [27]. 2.2.2.2 Su miktarının etkisi Su miktarı, hem reaksiyon verimini hem de reaksiyon hızını etkiler. Lipazların katalizlediği reaksiyonlar tersinir reaksiyonlardır. Hidrolizde su tepkimeye girerken, esterleşme reaksiyonlarında su ürün olarak ortaya çıkmaktadır. Bu sebepten dolayı, su içeriği reaksiyonun yönünü belirleyen önemli bir faktördür. İç esterleşme reaksiyonu için su içeriğinin oldukça az olması gerekir. Bununla birlikte, lipazın katalitik aktivitesini sağlamak için de bir miktar suya ihtiyaç vardır. Ayrıca enzimin üç boyutlu yapısını koruması için suyun ortamda mevcut olması gerekmektedir [17,24-27] 2.2.2.3 Sıcaklığın etkisi Sıcaklık enzim aktivitesini belirleyen önemli faktörlerden biridir. Her enzim için optimum sıcaklık farklıdır. Enzim kaynağı, enzimin immobilize olup olmaması ve ortam ph ı, enzim için optimum sıcaklığı belirlemede etkili olan parametrelerdir. İmmobilize enzimler için optimum sıcaklık 30-62 C aralığındadır [5, 6, 16]. Genel olarak sıcaklık artışı reaksiyon hızının artmasına neden olur. Sıcaklık artışının reaksiyon hızını arttırma sebebi, hem enzim aktivitesini arttırması hem de açil göçünü hızlandırması olarak belirtilmiştir. Fakat çok yüksek sıcaklığın, enzimi geri dönüşsüz olarak denatüre etmesi ve çoklu doymamış yağ asitlerini ısıl bozulmaya uğratmasından dolayı, reaksiyonun hızını düşürdüğü bildirilmiştir [17,26]. 11
2.2.2.4 Sürenin etkisi Enzimatik yöntemle yapılandırılmış yağ sentezinde en kısa sürede en verimli reaksiyonun gerçekleştirilebilmesi, üretim maliyetlerinin düşürülmesi açısından oldukça önemlidir [28,29]. Genel olarak uzun sürelerin açil göçünü arttırdığı için daha etkili olduğu bildirilmektedir [16]. 2.2.2.5 Substrat-molar oranının etkisi Reaksiyonlarda substrat-molar oranı genellikle proses maliyetine, serbest yağ asitlerinin veya açil vericilerin evaporasyon veya distilasyon ile uzaklaştırılmasındaki güçlüklere bağlı olarak seçilir [5,6]. Kullanılan substrat-molar oranı inhibisyona sebep olmayacak bir aralıkta olmalıdır. Belli bir değere kadar substrat-mol oranının artması TAG yapısına istenen yağ asidinin bağlanmasını arttırırken aşırı substrat kullanmak inhibisyona sebep olabilir [5,6,24-26]. 2.2.3 Lipid modifikasyonunda kullanılan lipazlar Lipazlar (triaçilgliserolaçilhidrolaz, E.C.3.1.1.3) hidrolaz sınıfına ait enzimlerdir. Sulu ortamda triaçilgliseroller üzerindeki ester bağları üzerinde çalışırlar [11]. Ester bağlarının lipaz varlığında parçalanmasıyla TAG lardan serbest yağ asidi ve gliserol ortaya çıkar. Lipazlar, substrat olarak sudaki çözünürlüğü çok az olan TAG ları kullanırlar [17]. Substrata su-yağ ara yüzeyinde etki ederler. Lipazlar sulu fazda tersinir reaksiyon gerçekleştirebilme yeteneğine sahip olduklarından esterleşme, alkoliz ve asidoliz gibi reaksiyonları gerçekleştirebilir [5-6]. Lipazlar, pozisyonel seçiciliklerine göre genellikle üç sınıfa ayrılmaktadırlar [10]; sn-1,3-spesifik sn-2- spesifik spesifik olmayan Lipazların pozisyonel seçiciliği, yağ asidi seçiciliği ve stereospesifikliği, istenen triaçilgliserolün sentezi için en yüksek verim elde etmeye olanak sağlar. Rhizomucor miehei, Rhizopus delemar, Rhizopus javanicus ve Rhizopus niveus sn-1,3 seçiciliğine sahip lipaz enzim kaynaklarıdır. Bunun anlamı, TAG yapısında sn-1 ve sn-3 pozisyonlarında açil değişimi olurken sn-2 pozisyonda herhangi bir değişiklik olmamasıdır. Pozisyonel-seçici olmayan lipaz kaynakları ise; Candida sp. ve Pseudomonas sp. dir [15,26]. 12
Lipazların oleokimyasal proseslerde kullanımı ile enerjiden tasarruf edilmektedir. Lipazlar, yapıları gereği triaçilgliserolün ester bağlarının hidrolitik parçalanması için tasarlanmışlardır. Ancak sınırlı su miktarına sahip ortamda hidrolizin tersinir reaksiyonu olan ester sentezini de katalizlemektedirler. Hidroliz ve esterleşme, iç esterleşme reaksiyonunda aynı anda meydana gelebilmektedir [17]. 2.2.4 Yapılandırılmış lipid sentezi için yağ asidi kaynakları Yapılandırılmış lipid sentezinde çeşitli yağ asitleri kullanılır. Oluşturulan yapılandırılmış lipid, bünyesine katılan yağ asidinin fonksiyonlarını ve özelliklerini kazanarak daha yararlı hale getirilmiş olur. Yağ asitlerinin TAG molekülündeki kompozisyonu ve pozisyon olarak dağılımı, yapılandırılmış lipidin fonksiyonel ve fiziksel özelliklerini, metabolik etkisini ve sağlık açısından faydasını belirler [31]. Bu yüzden yapılandırılmış lipid üretiminde kullanılacak yağ asitlerinin fonksiyonları ve metabolizmaları çok iyi bilinmelidir. 2.2.4.1 Kısa zincirli yağ asitleri Kısa zincirli yağ asitleri (SCFA) 2 karbon uzunluğundan 6 karbon uzunluğuna kadar değişir. Bu yağ asitleri uçucu yağ asitleri olarak da bilinir. İnek sütü yağı ve tereyağı kısa zincirli yağ asitleri için geleneksel olarak kullanılan kaynaklardır [32]. Suda çözünebilen yapıları, moleküler yapıları ve kısa zincir uzunluğu bu yağ asitlerinin diğer yağ asitlerine kıyasla midede daha hızlı adsorbe olmasını sağlar. Ayrıca TAG ların sn-3 pozisyonuna katılan SCFA, midede ve ince bağırsakta tamamen hidroliz olurlar. Çünkü pankreatik lipaz, pozisyon ve zincir uzunluğu olarak bu yağ asitlerine spesifiktir [14]. SCFA lar diğer yağ asitlerine göre daha az kalori değerine sahiptir. Sıkça kullanılan kısa zincirli yağ asitlerinin kalorifik değerleri, sırasıyla, C2:0, 3,5 kcal/g; C3:0, 5,0 kcal/g; C4:0, 6,0 kcal/g; ve C6:0, 7,5 kcal/g dır [32]. 2.2.4.2 Orta zincirli yağ asitleri Orta zincirli yağ asitleri (MCFA) nin karbon sayısı C6:0 C12:0 arasındadır. Hindistan cevizi ve palm çekirdeği yağı MCFA için kullanılan temel kaynaklardır [17]. MCFA lar, uzun zincirli yağ asitlerine kıyasla sahip oldukları daha küçük boyutları ve çözünürlükleri sayesinde, ana toplardamar ile birlikte seçimli olarak karaciğere gider. Vücudun her dokusunda yağ asitlerinin mitokondrilere girmesi için gerekli olan carnitine proteini, MCFA lar için gerekli değildir. Ayrıca MCFA lar vücütta glikoz kadar çabuk metabolize olurlar. Ancak serbest haldeyken trigliseridlere esterifiye olmadıklarından, yağ olarak birikmeye eğilimlidirler. Obeziteyle mücadelede yararlı olabilecekleri halde serum içersindeki kolesterol 13
miktarını da belirgin şekilde arttırabilirler [14]. Bu yüzden MCFA ların sahip olduğu doğal hareket kabiliyetinin, çözünürlüğünün ve metabolizmada çok kolay kullanılma özelliklerinin, daha sağlıklı doymamış yağ asitleri ile birlikte kullanılması, MCFA lardan en iyi faydayı almayı sağlar [12,18]. 2.2.4.3 Uzun zincirli yağ asitleri Uzun zincirli yağ asitleri (LCFA) nin karbon sayısı C14:0-C:24 arasındadır [24]. Hayvansal, bitkisel ve balık yağlarında bulunurlar. SCFA ve MCFA lara göre daha yavaş adsorbe ve metabolize olurlar [14]. Çoğu LCFA, sabunlaşmış kalsiyum yağ asidi şeklinde dışkı ile atılır. LCFA ler kan içerisinde taşınamaz ya da adsorbe edilemezler. Çünkü bu yağ asitlerinin SCFA ve MCFA ya göre daha fazla hidrofobik özelliği vardır. Bunun için LCFA lar öncelikle misel yapı içerisine paketlenir. Daha sonra şilomikron olarak adlandırılan yağ damlacıklarının oluştuğu bağırsak hücrelerine geçer. Şilomikronlar, lenf sistemine salgılanır ve en sonunda kan çevrimine girer. Sonrasında LCFA lar, carnitine proteini yardımı ile hücrelerin mitokondrilerine taşınır[14]. Değişik tipte LCFA lar mevcuttur. Ama bunların içinde, yapılandırılmış yağlar için en önemlileri insanlar tarafından sentezlenemeyen, bu yüzden elzem kabul edilen esansiyel yağ asitleridir (EFA). Örneğin n-6 yağ asitleri insanlar tarafından sentezlenemeyen esansiyel yağ asitlerindendir. Bitki tohumları ve sebzelerde bulunan linoleik asit (18:2n-6) EFA grubundadır [13]. Linoleik asit dehidrojenlenerek çoklu doymamış asit olan araşidonik aside (20:4n-6) çevrilip yapılandırılmış lipid sentezinde kullanılabilir. Bir diğer EFA çeşidi, keten tohumu ve soya gibi bitkilerde bulunan linolenik asit (18:3n-3) gibi n-3 yağ asitleridir [16]. Eikosapentaenoik asit (20:5n-3) (EPA) ve dokosahekzaenoik asit (22:6n-3) (DHA) balıklarda bulunan ve yapılandırılmış yağ sentezinde kullanılan çoklu doymamış (PUFA) n-3 yağ asitleridir [24,30]. n-3 PUFA ları hücrelerin iltahap yapıcı aktivitelerini azaltır. n-3 PUFA larca zengin dietler, yüksek lipoprotein kolesterolu oranını (HDL) yükseltirken, alçak lipoprotein kolesterolü oranını (LDL) ve çok alçak lipoprotein kolesterolü oranını (VLDL) düşürürler. Çoğu sebzelerde bulunan n-9 yağ asitlerinden olan oleik asit (18:1n-9) vücüt için elzem olmasa da kan içindeki kolesterolü düşürmede önemli bir yeri vardır [14]. Anti-kanser çalışmalarında iyi sonuçlar veren konjuge linoleik asit (CLA) de yapılandırılmış lipid sentezinde kullanılabilir. Çoklu doymamış yağ asitlerinden olan 14
CLA, geviş getiren hayvanların etlerinden ya da yağlarından elde edilebilir. Terapi amacıyla medikal alanda sıkça kullanılmaya başlanmıştır [13]. Uzun zincirli yağ asitlerinin, genellikle serumdaki kolesterol seviyesini arttırdığı düşünülür. Fakat stearik asit (18:0) kandaki kolesterol seviyesine etki etmez. Çünkü vücut sıcaklığından daha yüksek erime noktasına sahiptir. Ayrıca uzun zincirli yağ asitlerince zengin TAG lar insan vücudunda kolay kolay adsorblanmazlar[14]. 2.2.5 Yapılandırılmış yağların sindirimi ve absorpsiyonu Yapılandırılmış yağlar, basit fiziksel yağ karışımlarına göre bünyesinde barındırdığı yağ asitlerinin pozisyonları ve stereo yapılarından dolayı daha avantajlıdır [31]. TAG molekülünün sn-2 pozisyonunda MCFA bulunan yapılandırılmış yağlar, standart uzun zincirli triaçilgliserollere (LCT) göre dolaşım sisteminden daha yavaş atılır. Çünkü, sn-2 pozisyonundaki MCFA nin lenf sistemine absorbsiyonu LCT lere kıyasla daha kolaydır. Lenf sistemine absorpsiyonun daha kolay olması, pankreatik lipazın TAG molekülünün sn-1 ve sn-3 pozisyonlarındaki yağ asitlerini hidroliz etmesinden kaynaklanır. Daha sonra açığa çıkan yağ asitleri ince bağırsak kılcallarından kan dolaşımına katılır [14]. Beslenme sorunu yaşayan hastalar ve özel diyet programları için hazırlanan yapılandırılmış yağlar, orta ve uzun zincirli yağ asitleri içerirler [33]. Orta zincirli yağ asitlerinden kaproik asit (C6:0) ve kaprik asit (C10:0) sindirildiklerinde şilomikronun yapısına katılmazlar. Dolayısıyla bu yağ asitleri depolanmayıp enerji için kullanılırlar. TAG yapısından ayrılır ayrılmaz karaciğerde yanarak, yeni doğmuş premature bebekler ve yağ absorpsiyonu yapamayan hastalar için yüksek enerji kaynağı olarak kullanılırlar [12,14]. In vitro koşullarda lipaz enzimi ile sindirilen ve daha sonra yapay olarak hazırlanan ince bağırsağa deneysel ortamda absorbe olan, sn-1,3 pozisyonlarında MCFA (kaprilik asit,8:0) ve sn-2 pozisyonunda LCFA bulunduran yapılandırılmış lipidler, normal uzun zincirli TAG molekülüne göre daha çabuk hidroliz olarak daha etkin bir absorpsiyon gerçekleştirirler [12]. 2.2.6 Yapılandırılmış lipidlerin uygulamaları Yapılandırılmış lipidlerin geliştirilmesi ile TAG ların beslenme amaçlı özellikleri geliştirilebilir. Enteral beslenme ile özel diyet uygulayan hastalar ve bebek mamaları için özel gıda üreten firmalar, kalori alımını arttırmak için sn-2 pozisyonunda doymuş yağ asidi bulunduran yağ tasarlamaktadırlar [10,12]. Bunlara benzer birçok uygulamada yapılandırılmış yağlardan faydalanılır. 15
2.2.6.1 Bebek mamaları Bebek mamalarının yağ içeriği, anne sütü ile aynı yağ asidi bileşimi ve dağılımına sahip olmalıdır. Bebek mamalarının üretiminde kullanılan yağ, çoğunlukla sn-2 pozisyonunda doymamış yağ asitleri içeren bitkisel yağlardır. Anne sütünün TAG yapısında esterleşen palmitik asitin %70 i sn-2 pozisyonunda yer alır. Bitkisel yağlarda ise palmitik asitin %80 inden çoğu TAG ın sn-1,3 pozisyonlarında yer alır [34]. Bağırsaklarda, pankreatik lipaz sadece bu yapıdaki sn-1,3 pozisyonunda esterleşen asitleri hidroliz eder. Dolayısıyla bitkisel yağların kullanılması durumunda, serbest kalan palmitik asit daha sonra sütte bulunan kalsiyum ile suda çözünmeyen kalsiyum sabunları oluşturabilir ve bunlar dışkı ile dışarı atılır. Bunun sonucu olarak vücut için gerekli enerji ve kalsiyum kaybedilmiş olur. Bu durum küçük çocuklar için problem yaratabilir, çünkü temel besin kaynakları olan sütün, kemik gelişimi için gerekli olan kalsiyumundan yeterli miktarda faydalanamamış olurlar [14]. Anne sütü TAG larına benzer yapıda yapılandırılmış triaçilgliserol üretimi, sn-1,3-spesifik lipaz kullanılarak, palm yağından elde edilen tripalmitin ile bitkisel yağlardan elde edilen oleik asitin transesterleşme reaksiyonu ile yapılır. Bu durumda sn-2 pozisyonunda esterleşen asitler, karaciğerde yerleşerek gerekli enerji kaynağını sağlaması ile kalsiyumun vücuttan atılması engellenmiş olur. Bu tür TAG lar çocuk mamalarında kullanılırlar [15,17]. Böylece bebek mamalarındaki yağın bebekler tarafından absorplanması arttırılmış olur. Ancak palmitik asitten başka uzun zincirli yağ asidi kullanmak hiperkolesterole neden olabileceğinden modifikasyona dikkat edilmelidir [19]. 2.2.6.2 Enteral ve parenteral beslenme için gıdalar Orta zincirli triaçilgliserol (MCT) lerin çok fazla avantajı olmasına rağmen, esansiyel yağ asitlerinin temini için uygulanan diyet programlarında bir miktar uzun zincirli triaçilgliserol (LCT) de gereklidir. MCT ve LCT den oluşan fiziksel karışımların enteral ve parenteral beslenmede faydası kanıtlanmıştır. Enteral ve parenteral beslenme doğal yollarla beslenemeyen hastalar için uygulanan beslenme şekilleridir [10]. Enteral beslenme bir hortum vasıtasıyla hastaya mide-bağırsak sisteminden besinin verilmesidir. Parenteral beslenme ise besinin hastaya damardan verilmesidir. LCFA ve MCFA içeren TAG lar, bu gibi hastalara verilen fiziksel karışımlarla aynı bileşimlere sahip olmasına rağmen, bu karışımlara alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Yapısında LCFA ve MCFA içeren yapılandırılmış yağ, MCFA ların daha yavaş ve kontrollü olarak kan dolaşımına katılması amacıyla tasarlanmıştır [14]. Enteral beslenmenin avantajı, yağların absorpsiyonunun ve sindirilmesinin kolaylığıdır. MCFA içeren yapılandırılmış TAG lar çok çabuk 16
hidroliz olurlar ve absorpsiyonu daha yüksektir. Çünkü uzun zincirli TAG lara kıyasla daha küçük molekül büyüklüğüne sahiptir ve sudaki çözünürlüğü daha iyidir [12,14]. Yapılandırılmış yağlar, doğal yağlara ve yağ karışımlarına göre daha avantajlıdır. Bağışıklık sistemini kuvvetlendirmesi, kanser riskini düşürmesi, tromboz (kan pıhtılaşması) u önlemesi, kolesterolü düşürmesi, azot dengesini kurması ve retiküloendotelyal sistemi (RES) için bir risk taşımaması yapılandırılmış lipidler için bazı avantajlardır [5,6,27]. 2.2.6.3 Düşük kalorili yapılandırılmış yağlar Yapılandırılmış yağların en ilgi çekici uygulama alanı bir TAG molekülüne SCFA, MCFA ve LCFA bağlayarak elde edilen düşük kalorili TAG sentezidir. Yeniden yapılandırılan bu TAG ların 1 gramı 5-7 kkal enerji değerine sahiptir. Halbuki doğal yağların 1 gramı 9 kkal enerji değerine sahiptir [12,15]. TAG ların düşük kalori değerine sahip olmasının sebebi, yapıya bağlanan kısa zincirli yağ asitlerinin uzun zincirli yağ asitlerine kıyasla daha az kalori vermesine bağlıdır [14]. Kalorisi düşürülmüş yapılandırılmış yağlar unlu gıdalarda, süt ürünlerinde veya kakao ikame yağlarında kullanılır. Günümüzde bu tip kalorisi düşürülmüş yağlar, bir kısa zincirli TAG molekülü (SCT) ile bir uzun zincirli TAG molekülü (LCT) arasında gerçekleşen iç esterleşme reaksiyonu sonucu üretilir [23]. En çok bilinen düşük kalorili yağlar Caprenin, Salatrim ve MCT lerdir. Capreninin 1 gramı 5 kkal enerji değerine sahip, kalorisi düşürülmüş yapılandırılmış yağdır. C8:0-C10:0-C22:0 yapısındadır. Gliserol ile orta zincirli doymuş yağ asitlerinden (MCFA) olan kaprilik asit (C8:0) ve kaprik asit (C10:0) ve çok uzun zincirli doymuş yağ asidi (LCFA) olan behenik asit (C22:0) in esterleşmesi sonucu oluşmuş bir TAG dır. Caprenin üretimi için kullanılan bu yağ asitlerinin hepsi doğal kaynaklıdır [23]. Kaprilik ve kaprik asit palm çekirdeği ve Hindistan cevizi yağlarının fraksiyonlanması ile elde edilir. Behenik asit ise yer fıstığı, kolza tohumu ve balık yağlarında bulunur. Behenik asit çok az absorbe olur ve MCFA absorbe olan LCFA ya göre daha az kalori verir [29]. Procter&Gamble firması Hindistan cevizi ve palm çekirdeği yağından elde edilen yağ asitleri ile Caprenin üretimini ilk yapan firmadır. Kaprenin kakao yağı benzeri özellikler göstermesinden dolayı bazı şekerleme ürünlerinde kakao yağı yerine kullanılır. Diğer TAG ların benzeri sindirilme, absorbe olma ve metabolize olma özellikleri gösterir [14]. Salatrim de Caprenin gibi 1 gramı 5 kcal enerji değerine sahip kalorisi düşürülmüş bir yapılandırılmış yağdır. Yapısında baskın olarak LCFA (C18:0) bulundurmakla 17
birlikte TAG bünyesinde SCFA (C2:0-C4:0) da bulunur [20]. Salatrim, kanola ve soya gibi bitkisel yağların SCFA larla transesterleşmesi sonucu üretilir. Salatrim şu an piyasada Benefat markasıyla pazarlanmaktadır. Konvansiyonel yağların sahip olduğu tat ve fonksiyonel özelliklere sahiptir [14]. Sentez esnasında kullanılan SCFA ve LCFA ların oranları değiştirilerek üretilen yağın erime noktası değiştirilebilir. Çikolata kaplı şekerlemeler, karamel, unlu mamuller, sos ve süt ürünleri Salatrimin kullanıldığı ürünlerin birkaçıdır. Orta zincirli triaçilgliseroller (MCT), mide-bağırsak sisteminde sorun yaşayan insanlara enerji kaynağı olması için hazırlanmış, terapatik amaçlı kullanılan yağlardır. MCT ler parenteral beslenmeler için hazırlanmış ürünlerde sıkça kullanılırlar. MCT ler Hindistan cevizi yağından elde edilen 8-10 karbon uzunluğundaki yağ asitlerini bünyesinde barındıran yapılandırılmış TAG lardır. Kaprik ve kaprilik asit MCT de kullanılan yağ asitlerinin %96 sını oluştururlar. Bu yüzden orta zincirli yağ asitlerine spesifik sindirim enzimleri tarafından hemen hidroliz edilirler ve ortaya çıkan yağ asitleri hızla kan dolaşımına katılır [14]. 1 gramı 7 kkal enerji değerine sahip MCFA lar, karaciğer tarafından acil enerji kaynağı olarak kullanılırlar. 2.2.6.4 Kakao yağı ikameleri Kakao yağı, özellikle çikolata ve şekerleme sanayinde çok yaygın olarak kullanılmasına karşın, fiyatının çok yüksek olması nedeniyle, yağ sanayini diğer yağları modifiye ederek, kakao yağı benzeri yağları üretmeye yöneltmiştir. Doğada kakao yağına benzer yapıda başka yağ bulunmamaktadır; bu yağın alternatifleri karışım halinde kullanılan bitkisel yağlar ve modifiye yağlardır [12,19]. Kakao yağının temel TAG ları, sn-2 pozisyonunda oleik asit, sn-1 ve sn-3 pozisyonlarında stearik ve palmitik asit olan TAG lardır ( SOS ve SOP, Tipik bileşim: %16 POP, %35 SOP, %26 SOS). Kakao eşdeğeri yağlar kimyasal ve lipaz katalizörü ile yürütülen interesterleşme reaksiyonu ile üretilir. Bu amaçla palm yağının orta fraksiyonu (POP) veya yüksek oleik asitli ayçiçeği yağı (OOO), stearik asit veya tristearin (SSS) ile interesterleştirilir [17]. Palm yağı, palm yağı ara fraksiyonları, İllipe yağı, Shea, Movrah yağı, Borneotalg yağı bilinen kakao yağı ikameleridir. Ayrıca bazı karışım alternatifleri de mevcuttur [17]. 18
2.2.6.5 Medikal alanda kullanılan yapılandırılmış yağlar Bu bileşikler, gıda ve sağlık açısından önemli etkileri saptanmış bazı yağ asitlerinin TAG moleküllerine yerleştirilmesi ile üretilir. Özellikle n-3 ve n-6 yağ asitleri bu tip yapılandırılmış lipid sentezinde kullanılırlar. Dokosahekzaenoik asit (DHA), eikosapentaenoik asit (EPA) ve gamma-linoleik asit (GLA) kullanılan yağ asitleridir [30]. İçerisinde n-3 ve n-6 yağ asitlerini taşıyan yapılandırılmış lipidler, kireçlenme ile mücadelede, tromboz (kanın pıhtılaşması) un engellenmesinde, kalp hastalıklarında, diabet ile mücadelede ve kanser riskini düşürmede kullanılır [26]. Bu asitlerin TAG yapısındaki belirli pozisyonlara katılması, spesifik lipaz enzimleri ile yürütülen asidoliz reaksiyonları neticesinde mümkün olabilmektedir [12]. 2.3 Tripalmitin ve kaprik asitle yapılan çalışmalarla ilgili literatür çalışması Jennings ve Akoh tarafından yapılan çalışmada Rhizomucor miehei kaynaklı immobilize lipaz kullanılarak, %40,9 EPA ve %33 DHA içeren balık yağı TAG larına asidoliz reaksiyonu ile kaprik asit bağlanmaya çalışılmış ve çalışmanın sonunda %43 kaprik asit, %27,8 EPA ve %23,5 DHA içeren yapılandırılmış TAG elde edilmiştir [30]. Akoh ve Moussata tarafından yapılan başka bir çalışmada yine Rhizomucor miehei kaynaklı immobilize lipaz kullanılarak balık yağı modifiye edilmeye çalışılmıştır. Bu çalışmanın sonucunda elde edilen yapılandırılmış balık yağı %40,8 (mol) kaprik asit, %25 (mol) EPA ve %22,6 (mol) DHA içermektedir [28]. Senaneyake ve Shahidi tarafından yapılan bir çalışmada balina yağına kaprik asit katılmaya çalışılmıştır. Mucor miehei kaynaklı immobilize lipaz kullanılan çalışmada 24 saatlik reaksiyon süresinin sonucunda maksimum %25,4 kaprik asit bağlanması gerçekleştirilmiştir. Çalışma %1 (ağırlıkça) su miktarında, 45 C de ve toplam substratın %10 u enzim kullanıldığı şartlarda gerçekleştirilmiştir [29]. Sellappan ve Akoh tarafından yapılan bir diğer çalışmada da trilinoleinin kaprik asitle asidolizi sonucu yapılandırılmış lipid üretilmiştir. Çalışmada enzim olarak Lipozyme IM-60 kullanılmıştır. Trilinolein e en yüksek kaprik asit bağlanması 55 C, 1:4 (trilinolein/kaprik asit) mol oranı, %1 (ağırlıkça) su içeriği, %10 enzim miktarı ve 32 saat reaksiyon süresi sonunda %23,73 olarak bulunmuştur. Ayrıca bu çalışmada kullanılan Lipozyme IM-60 enziminin uzun zincirli yağ asitlerinde orta zincirli yağ asitlerine göre daha seçici olduğu belirtilmiştir [35]. Lee ve Akoh tarafından yapılan başka bir çalışmada kaprilik asit ile %58 oleik asit içeren yer fıstığı yağının asidolizi gerçekleştirilmiştir. Reaksiyon Rhizomucar miehei 19