RIDASCREEN Clostridium difficile GDH Madde no.: C0701 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D-64297 Darmstadt, Germany Telefon: +49 (0) 61 51 81 02-0 / Fax: Faks: +49 (0) 61 51 81 02-20
1. Kullanım amacı In Vitro Diagnostik Kullanım içindir Enzim immunoassay RIDASCREEN Clostridium difficile GDH, insan dışkısında Clostridium difficile'e spesifik glutamat dehidrogenazın kalitatif tespitini sağlar. 2. Özet ve test açıklaması Clostridium difficile tam olarak, insalarda normal dışkı florasının bileşenleri olan, anaerobik sporlu ve çubuk şekilli bakteridir. Normal şartlar altında, bu çoğunlukla zararsız patojenlerin kolonizasyon oranı % 80'e kadar değişen bir oranla çocukluğun ilk yıllarında çok yüksektir. Bu oran hayat sürecinde sürekli azalır, yetişkin yaş gruplarındaki ortalama %2-10'dan fazla değildir. Ancak belirli koşullar altında örneğin hastanede kalış esnasında muhtemelen %30'u aşabilir. Yüksek molekül ağırlığına sahip toksin proteinleri A (enterotoksin) ve B (cytotoxin)'nin oluşumu, Clostridium difficile infection (CDI) açısından belirleyicidir. Clostridium difficile'in bazı suşlarının toksin üretmediği ve sağlıklı yetişkinlerin yaklaşık %2-8'inde ve iki yaş altı çocuklarda %80' e kadar, Clostridium difficile ile kolonize olabildiği düşünülmektedir, C. difficile ile ilişkili bir ishal şüphesi A ve B toksinlerinin teşhisine patognomonik önem katmaktadır. Ancak bu öncelikle yeterli toksin oluşturabilen C. difficile bakterileri ile kalın bağırsakta başarılı bir kolonizasyonun olmasına bağlıdır. Normalde koruyucu bağırsak florasındaki azalma böyle bir kolonizasyon için elverişlidir. Bir antibiyosis sonucunda, örneğin, bağırsak immünitesinin bozabilen diğer faktörlerin ya da çeşitli antibiyotik ilaçlara karşı olan direncin geniş ve halen büyümekte olan yelpazesine sahip olan özellikler C. difficile suşlarının yayılmasına neden olacaktır. Yeni tanımlanan bazı suşların defekt sisteminden kaynaklanan toksin üretiminin takviyesi gibi diğer virulans faktörleri, bir patojenite ile "yeniden ortaya çıkan mikrop" C. difficile üretir, bu artık antibiyotik tedavisinden sonra gelişen Clostridium difficile enfeksiyonu (CDI) ile sınırlı değildir, gitgide artarak her hangi bir tedaviye tabii olmayan ve hastanede olmayan hastaları da kapsar. Özellikle hastane mikrobu olarak artan önemi, yeni tedavi yaklaşımlarına yol açmıştır, ancak hepsinden öte C. difficile enfeksiyonlarının tanısı için yeni algoritmalardır. C. difficile tanımlanmasının temel amacı, C. difficile'nin toksijenik veya toksijenik olmayan ilgili suşlarının hastanede yatan hastalara bulaşmasını önlemektir. Enzim glutamat dehidrojenazın (GDH), bazı organizmalar arasında yaygın ve yüksek miktarda kopyası olan sensitif tarama belirteci olduğu kanıtlanmıştır. Bağırsak bakterilerinin birçoğunda var olan bu enzim, güvenilir ve oldukça büyük bir duyarlılıkla C.difficile'e spesifik olan GDH'ın tespiti tanımlama sistemleri için belirleyicidir. Mevcut olan RIDASCREEN Clostridium difficile GDH Enzyme Immunoassay, bu koşulların her ikisini de büyük ölçüde karşılar. RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B ELISA daha önce ya da paralel olarak çalışıldığında, bu çok önemli hastane mikrobunun güvenilir teşhisini geliştiriyor olsa dahi, CDI'nın kanıtı olarak, A ve B toksinlerinin zorunlu tanımlama gereklerinin yerini alamaz. Sadece, hastalığın spesifik semptomlarını ve A ve B toksinlerinin tanımlanması, CDI tanısı ve uygun tedavi kararına yardımcı olur. RIDASCREEN Clostridium difficile GDH 13-09-05 2
3. Test prensibi RIDASCREEN Clostridium difficile GDH Test, sandviç tipi yöntemde monoklonal antikorlar kullanır. Bu Clostridium difficile'in glumat dehizrogenazına karşı olan monoklonal antikorlar, Mikrokuyucuk plağının kuyucuk yüzeylerine bağlanmıştır. Oda sıcaklığında (20 25 C) inkübasyon için, incelemek amacıyla dışkı numunesinin süspansiyonunu, ayrıca biyotinlenmiş anti-gdh antikorları (Conjugate 1)ile birlikte mikrokuyucuk plaka kuyucuğunun içerisine kontrol örneklerini koymak için pipet kullanılır. Yıkama adımından sonra, streptavidin poly-peroxidase conjugate (Conjugate) eklenir ve tekrar oda sıcaklığında (20 25 C) inkübe edilir. Örnekteki Clostridium difficle e spesifik GDH varlığında, hareketsiz antikorlar, GDH ve konjuge antikorlar bir bir sandwich kompleksi oluşturur. Diğer yıkama adımı, bağlanmamış olana streptavidin poly-peroxidase conjugate'ı uzaklaştırır. Substratın eklenmesinden sonra, test pozitif ise, bağlanmış enzim, mikrokuyucuk plakanın kuyucuklarındaki önceden renksiz olan solüsyonun rengini maviye dönüştürür. Stop solüsyonu eklendikten donra, renk maviden yeşile döner. Sönüm, numunede bulunan Clostridium difficile GDH konsantrasyonu ile orantılıdır. 4. Sunulan reaktifler Kitteki reaktifler, 96 tespit için yeterlidir. Plak Diluent 1 Yıkama Control + 96 Mikro kuyucuk plak, strip taşıyıcılı 12 mikro kuyucuk stripi (ayrılabilir) ; Clostridium difficile için spesifik glutamate dehydrogenase karşı spesifik antikorlar ile kaplı. 100 ml Sample dilution buffer (numune dilüsyon tamponu), proteintamponlu NaCl solüsyonu kullanıma hazır, mavi renkli 100 ml Wash buffer (Yıkama tamponu), fosfat tamponlu NaCl solüsyonu (10-kat konsantre) %0.1 thimerosal içerir. 2 ml Positive control (pozitif kontrol); inaktive toxin, kullanıma hazır Control - 2 ml Negative control (negatif kontrol) (sample dilution buffer); kullanıma hazır Conjugate 1 13 ml Stabilize protein solüsyonunda, Clostridium difficile spesifik glutamat dehidrogenaza karşı Biotin-konjuge antikorlar; kullanıma hazır; yeşil renkli Conjugate 2 Substrat Stop 13 ml Stabilize protein solüsyonunda Streptavidin poly-peroxidase konjugatı kullanıma hazır, turuncu renkli. 13 ml Hydrogen peroxide/tmb; kullanıma hazır 8 ml Stop reaktifi 1 N sülfirik asit; kullanıma hazır. RIDASCREEN Clostridium difficile GDH 13-09-05 3
5. Reaktifler ve muhafazaları Tüm reaktifler 2 8 C de muhafaza edilmelidir, etiketlerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilirler. Elde edilen dilüe wash buffer 2 8 C'de muhafaza edilir, bu solüsyon en fazla 4 hafta süreyle kullanılabilir. Mikrobiyal kontaminasyon önlenmelidir. Son kullanma tarihinden sonra kalite garantisi artık geçerli değildir. Alüminyum torba makasla açılmalıdır, bu şekilde yırtılması önlenmiş olur. Gerekli olmayan mikro stripler hemen alüminyum torba içine yerleştirilmeli ve 2-8 C'de muhafaza edilmelidir. Renksiz substratın da, oto-aksidasyon nedeniyle maviye dönüşümün engellenmesi ya da bozunmasına engel olmak adına, mutlaka direkt ışıktan korunmalıdır. Substrat maviye döndükten sonra kullanılmamalıdır. 6. İlave gerekli reaktifler ve gerekli ekipman 6,1. Reaktifler - Distile veya deiyonize su. 6,2. Ekipman - Test tüpleri - Tek kullanımlık pipetler (Madde no.: Z0001) - Vorteks mikser (opsiyonel, bakınız 9.3.) - Mikropipet 50 100 µl ve 1 ml hacimleri için - Ölçüm silindiri (1,000 ml) - Kronometre - Mikro kuyucuk plağı için yıkama cihazı ya da çok kanallı pipetler (300 µl) - Mikro kuyucuk plağı için fotometre (450 nm ve referans filtre 620 650 nm) - Filtre kağıdı (laboratuvar havlusu) - %0.5 hipoklorit solüsyonlu atık kabı 7. Kullanıcı önlemleri Sadece in vitro diagnostik içindir. Bu test sadece eğitimli laboratuvar personeli tarafından yapılmalıdır. Medikal laboratuvarlarda çalışanlar, talimatları takip etmelidir. Daima testin kullanıcı talimatlarına kesinlikle uyulmalıdır. Örnekler ya da reaktifler ağızla pipetlenmemeli ve mukuza membranları veya yaralı deri ile temasından kaçınılmalıdır. Örneklerle çalışırken, kişisel koruyucu malzemeler ( uygun eldiven, laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük) giyilmeli/kullanılmalı ve test bittikten sonra eller yıkanmalıdır. Örnek çalışma alanlarında sigara içmeyin, bir şey yemeyin veya içmeyin. Daha fazla bilgi için, www.r-biopharm.com da bulunan Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) na bakınız. RIDASCREEN Clostridium difficile GDH 13-09-05 4
Bu kit rekombinant GDH protein içeren bir pozitif kontrol içermektedir. Hasta örnekleri, potansiyel bulaşıcı madde olarak ele alınmalı ve ulusal güvenlik yönetmeliklerine göre çalışılmalıdır. Wash buffer (yıkama tamponu), koruyucu olarak %0.1 lik thrimerosal içerir. Bu maddenin cilt veya mukoza ile temasından kaçınılmalıdır. Tüm reaktiflerin ve malzemelerin kullanımından sonra, uygun ve güvenilir bir şekilde atılmasını/imha edilmesini sağlayın. İmha için, ulusal yönetmeliklere uyunuz. 8. Örnek Toplama ve Muhafaza Dışkı örnekleri ishalin ilk belirtileri ortaya çıktıktan sonra, üç gün içinde mümkün olduğunca çabuk alınmalıdır. Test malzemelerini, kullanılıncaya kadar 2 8 C'de muhafaza edin. Malzemelerin üç gün içerisinde test yapmak üzere kullanılmayacaksa, -20 C ya da daha soğuk bir ortamda muhafaza edilmelerini öneririz. Örnekleri, tekrar tekrar dondurup-çözmeyin. Dışkı örnekleri sample buffer (numune tamponu)'da 1:11 oranında dilüe edildikten sonra, üç gün içerisinde kullanılmak üzere 4 C'de muhafaza edilebilir. Dışkı örnekleri ve rektal smearlar, RIDASCREEN Clostridium difficile GDH Test, ile etkileşimde bulunabileceği için; koruyucu, hayvan serumları, metal iyonları, oksitleyici ajanlar ya da deterjan içeren taşıma malzemeleri gibi taşıma kaplarında toplanmamalıdır. Rektal smears kullanılıyorsa, dışkı örneğinin son hacminin, tahlil için yeterli olduğundan emin olunuz (yaklaşık 100 mg). Contact tracing (Temas izleme)(, klinik semptomlar göstermeyen asemptomik taşıyıcıları tespit etmek amacıyla, temas eden kişilerden alınan dışkı örneklerini de içermelidir. 9. Test prosedürleri 9,1. Genel bilgi Tüm reaktifler ve bir mikro kuyucuk plak, kullanılmadan önce oda sıcaklığında (20-25 C) getirilmelidir. Mikro kuyucuk stripleri, oda sıcaklığına ulaşana kadar alüminyum torbalarından çıkarılmamalıdır. Reaktifler, kullanımdan hemen önce iyice karıştırılmalıdır. Mikro kuyucuk stripler (mühürlü torbalarına yerleştirilmiş halde) ve reaktifler kullanımdan sonra, tekrar 2 8 C'de muhafaza edilmelidir. Bir kere kullanılmış olan mikro kuyucuk stripler tekrar kullanılmamalıdır. Paketleri hasarlı olan ya da şişelerinde sızıntı olan reaktifler ve mikro kuyucuk stripler kullanılmamalıdır. Çapraz kontaminasyonu önlemek için; numunelerin kit bileşenleri ile direkt teması engellenmelidir. Test, direkt güneş ışığı altında çalışılmamalıdır. Buharlaşmadan kaynaklanan kayıpların önüne geçmek için, mikro kuyucuk plağının örtülmesini ya da plastik ile sarılmasını öneririz. RIDASCREEN Clostridium difficile GDH 13-09-05 5
9,2. Yıkama tamponu (wash buffer) hazırlanması 1 kısım wash buffer concentrate Wash ile 9 kısım distile suyu karıştırın. Konsantratta herhangi bir kristal varsa, bunların önceden 37 C sıcaklığındaki su banyosunda ısıtarak çözülmesi gerekmektedir. 9.3 Numunelerin hazırlanması Etiketli tüplere 1 ml RIDASCREEN sample diluent buffer Diluent 1 koyun. Test tüpünde bir süspansiyon elde etmek için, tek kullanımlık pipet kullanarak (madde no. Z0001) dilüe edilmiş dışkı numunesinden (yaklaşık 100 µl) aspire edin ve tampona ekleyin. Katı dışkı örneği ile süspansiyon yapmak için, tek kullanımlık aşı sprali ya da spatula ile eşit miktarda (50-100 mg) ekleyin. Dışkı süspansiyonunu tek kullanımlık pipetle aspire edip tekrar boşaltarak ya da Vorteks mikserle karıştırarak homojenize edin. İri dışkı parçacıklarını gidermek için, süspansiyonu kısa bir süre (10 dakika) bekletin, berrraklaşan dışkı süparnatantı test için direkt kullanabilir. Test prosedrü otomatik bir ELISA sisteminde gerçekleştiriliyorsa, süpernatant kesinlikle partikül içermemelidir. Böyle bir durumda, numunelerin 2.500 G'de 5 dakika santrifüjlenmesi tavsiye edilir. Not: Dilüent 1 de dilüe edilmiş dışkı örnekleri, diğer RIDASCREEN ELISA'da da kullanılabilir, çünkü onlarda da Dilüent 1 kullanılmaktadır. 9,4. Birinci inkübasyon Strip tutucuya yeterli sayıda kuyucuk yerleştirildikten sonra, kuyucuklara 100 µl positive control Control +, negative control Control -, ya da dışkı numune süspansiyonu ekleyin. Daha sonra 100 μl biotin-konjuge antikor Conjugate 1 ekleyin ve karıştırın (plakanın yanına hafifçe vurarak); 60 dakika oda sıcaklığında (20 25 C) inkübe edin. 9,5. Yıkama Doğru sonuçlar elde etmek için usulüne uygun bir şekilde dikkatli yıkama yapmak önemlidir, bu nedenle talimatlara göre çalışılmalıdır. Kuyucuklarda inkübe edilen maddeler, yerel gerekliliklere uygun olarak imha edilmesi için atık kabına boşaltılmalıdır. Bundan sonra, kalan nemi uzaklaştırmak için plağı kurutma kağıdının üzerine koyarak hafifçe vurun. Sonra plağı, 300 µl wash buffer kullanarak 5 kez yıkayın. Her yıkamadan sonra kuru ve kullanılmamış olan kurutma kağıdının üzerinde kuyucukları tıklatarak, kuyucukların tamamen boşalmış olduğundan emin olun. Mikroplak yıkayıcı ya da tam otomatik ELISA kullanıyorsanız, makinanın doğru ayarlanmış olduğundan emin olun, gerekirse üreticisinden ayarları isteyin. R-Biopharm tarafından verilen aletler, onaylı ayarlar ve çalışma programları ile programlanmıştır. Yıkama iğnelerinin bloke olmasını önlemek için, sadece partikül içermeyen dışkı süspansiyonları kullanılmalıdır (Madde RIDASCREEN Clostridium difficile GDH 13-09-05 6
9.3 Numune hazırlanmasına bakın). Ayrıca her yıkama adımında, tüm sıvıların aspire edildiğinden emin olun. 9,6. İkinci inkübasyon Pipet kullanarak, kuyucukların içerisine 100 µl streptavidin poly-peroxidase conjugate Conjugate. 2 doldurun, sonra oda sıcaklığında (20 25 C) 30 dakika inkübe edin. 9,7. Yıkama Madde 9.5 de tarif edildiği gibi yıkayın. 9,8. Üçüncü inkübasyon Tüm kuyucukları 100 μl Substrate ile doldurun. Sonra plağı karanlık bir ortamda oda sıcaklığında (20 25 C) 15 dakika inkübe edin. Ardından tün kuyucuklara reaktsyonu durdurmak amacıyla, 50 µl durdurma reaktifi Stop u ekleyin. Plakanın yan tarafına hafifçe vurarak dikkatlice karıştırdıktan sonra 450 nm de ölçün (opsiyonel: 450/620 nm Mikro kuyucuk plağı olmadan, havaya göre sıfırlama ayarını yapın. Not: Yüksek pozitif olan hasta numuneleri, siyah renkli substrat çökeltisine neden olabilir. 9.9 Kısaltılmış test protokolü İnkübasyon süreleri, plak 20 25 Hz titreşim frekansı (DSX, Dynex tarafından üretilen) ile 37 C'de inkübe edilirse, madde 9.4, 9.6. ve 9.8'de belirtilenden büyük ölçüde kısa tutulabilir İnkübasyon süreleri aşağıdaki gibi değişir: İnkübasyon 1 : 30 dk İnkübasyon 2 : 15 dk. İnkübasyon 3 : 15 dk. Thermomixer-Eppendorf (frekans ayarı: 850 rpm) ya da DTS-2 -LTF Labortechnik (frekans ayarı: 800 rpm) gibi mikro kuyucuk plak çalkalayıcıları da kullanım için uygundur. 10. Kalite kontrol- reaktif kullanımının bittiğinin göstergeleri Kalite kontrolü amacıyla, testlerin doğru yapıldığından ve reaktiflerin stabil olduğundan emin olmak için, test yapılırken her zaman pozitif ve negatif kontroller kullanılmalıdır. Negatif kontrolün sönüm hızı (OD) 450 nm'de 0.2 den daha düşükse (450/620 nm de 0.160'tan daha düşük) ve pozitif kontrolün ölçüm değeri 450 nm'de ya da 450/620 nm'de 0.8'den daha büyükse, test doğru yapılmıştır. Negatif kontrol değerinin 0.2 (0.160) ten büyük olması yıkamanın yetersiz olduğunun göstergesi olabilir. Kuyucuklara eklenmeden renksiz substratın bulanıklaşması ya da maviye dönmesi, gereken değerden sapma reaktifin kullanımının bittiğini gösterebilir. RIDASCREEN Clostridium difficile GDH 13-09-05 7
Öngörülen değerler elde edilmemişse, aşağıdaki hususlar testi tekrarlamadan önce kontrol edilmelidir: - Kullanılan reaktiflerin son kullanım tarihi - Kullanılan ekipmanların işlevselliği (örn:kalibrasyon) - Doğru test prosedürü - Kontaminasyon ya da sızıntı olup olmadığını anlamak için kit bileşenlerinin görsel kontrolü; maviye dönmüş olan substrat kullanılmamalıdır. Testin tekrarından sonra şartlar hala karşılanamamışsa, üretici ya da yerel R-Biopharm distribütörüne danışın. 11. Değerlendirme ve yorumlama 11,1. Cut-off un hesaplanması Cut-off'u oluşturmak için, 0.10 sönüm birim, ölçülmüş olan negatif kontrolün sönüm birimine eklenir. 11,2. Test sonuçları Cut-off = negatif kontrol sönümü + 0.10 Sönüm oranı, hesaplanan cut-off değerinden %10 daha büyük ise numune, pozitif olarak değerlendirilir. Sönüm oranı, cut-off değerinden %10 düşük -%10 yüksek aralığında ise numune, marijinalsınırda olarak değerlendirilir. Yeni dışkı numunesi ile tekrarlanan test yine gri alanda çıkmış ise numune, negatif olarak değerlendirilir. Hesaplanan cut-off değerinin %10'undan daha düşük çıkan sönüm değerli numune, negatif olarak kabul edilmelidir. 12. Yöntem limitleri RIDASCREEN Clostridium difficile GDH Testi dışkı örneklerinde Clostridium difficile' e spesifik glutamat dehidrogenazı tespit eder. Klinik semptomların ortaya çıkması veya şiddetini, tespit edilen sönüm seviyesi ile ilişkilendirmek mümkün değildir. Kinik semptomlarla ilişkili CDI tanısının son derece kesin bir şekilde yapılabilirliğinin sağlanması için sadece RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B ELISA gereklidir. Pozitif sonuç, diğer bulaşıcı patojenlerin ya d nedenlerin varlığı ekarte etmez. Negatif bir sonuç ise C. difficile enfeksiyon olasılığını ekarte etmez. Böyle bir sonuç, patojen salgının aralıklarla olmasından ya da numunedeki antijen miktarının çok az olmasından kaynaklanabilir. Hasta öyküsü CDI şüphesini destekliyorsa, test başka bir dışkı numunesi ile tekrarlanmalıdır. RIDASCREEN Clostridium difficile GDH 13-09-05 8
Sınır değer, dışkı numunesindeki antijenlerin homojen olmayan dağılımından da kaynaklanmış olabilir. Bu gibi durumlarda, aynı numuneden ya da yeniden talep edilen başka bir numune ile yapılan ikinci bir süspansiyon ile testin tekrar yapılması gerekir. 13. Performans özellikleri 13,1. Test kalitesi RIDASCREEN Clostridium difficile GDH ELISA'nın tanısal performansı, rutin bir laboratuvarda 300'den fazla dışkı numunesi ile test edilmiştir. Numuneler CDI şüphesi olan hastalardan alınmıştır. Referans olarak, 16S rdna of Clostridium difficile'da polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve piyasada mevcut olan rakip bir ELISA kullanılarak, önceden homojenize edilmiş olan dışkı örnekleriyle karşılaştırmalı bir inceleme çalışması yapılmıştır. Bu çalışmanın sonuçları, Tablo 1'de gösterilmiştir. Tablo 1: Spesifik 16S rdna'da PCR'a (a) karşı ve rakip ticari ELISA'ya (b) karşı yapılan RIDASCREEN Clostridium difficile GDH ELISA karşılaştırmaları PCR Rakip ELISA Poz Neg Poz Neg RIDASCREEN Clostridium difficile GDH Poz 60 2 62 0 Neg 6 239 7 ** 238 ** 7 numunenin 4'ü PCR ve kültürde negatifti > değerleri düzeltilmiş Duyarlılık %90,9 %95,4 Özgünlük %99,2 %100,0 Pozitif Öngörülen Değer (PPV) %96,8 %100,0 Negatif Öngörülen Değer (NPV) % 97,6 % 98,8 Korelasyon: %97,4 % 99,0 13.2 Analitik duyarlılık RIDASCREEN Clostridium difficile GDH ELISA analitik duyarlılığı, iki ticari GDH ELISA ile karşılaştırılmasıyla, saf glutamat dehidrogenaz proteinin titrasyonu ile tespit edilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları, Tablo 2'de verilmiştir. Tablo 2: Saf GDH proteini için üç rakip ELISA nın analitik duyarlılığı GDH protein konsantrasyonu [ng/ml] RIDASCREEN ELISA 1 ELISA 2 OD450nm OD450nm OD450nm 118,64 3,933 +++ 2,906 +++ 3,520 +++ 39,55 3,423 +++ 1,518 +++ 1,681 +++ 13,18 1,648 +++ 0,511 ++ 0,630 ++ RIDASCREEN Clostridium difficile GDH 13-09-05 9
4,39 0,598 ++ 0,150-0,269 + 1,46 0,242 + 0,122-0,162 (+) 0,49 0,096-0,067-0,069-13,3. Çapraz reaktivite Bağırsak sistemi patojenik mikroorganizmaların çeşitleri RIDASCREEN Clostridium difficile GDH ELISA ile test edilmiş ve herhangi bir çapraz reaksiyon görülmemiştir. Bu testler, parazit kültürlerinin (107 ile 109 organizma / ml) ile ve virüs bulaşmış hücrelerden hücre kültürü süpernatanları ile bakteriyel süspansiyonlar (106-109 cfu / ml) ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları, Tablo 3'de özetlenmiştir. Tablo 3: Bağırsak sistemi patojenik mikroorganizmaları ile çapraz reaksiyon Organizma Sonuç [OD 450 ] Adenovirus 0,046 Aeromonas hydrophila 0,054 Astrovirus 0,055 Bacillus cereus 0,061 Bacteroides fragilis 0,059 Campylobacter coli 0,161 Campylobacter jejuni 0,067 Candida albicans 0,059 Citrobacter freundii 0,056 Clostridium perfringens 0,051 Clostridium sordellii 0,051 Cryptosporidium muris 0,055 Cryptosporidium parvum 0,054 E. coli (O26:H-) 0,050 E. coli (O6) 0,053 E. coli (O157:H7) 0,043 Enterobacter cloacae 0,051 Enterococcus faecalis 0,043 Giardia lamblia sample 0,043 Klebsiella oxytoca 0,044 Proteus vulgaris 0,044 Pseudomonas aeruginosa 0,042 Rotavirus 0,056 Salmonella enteritidis 0,051 Salmonella typhimurium 0,047 RIDASCREEN Clostridium difficile GDH 13-09-05 10
Serratia liquefaciens 0,050 Shigella flexneri 0,047 Staphylococcus aureus 0,047 Staphylococcus epidermidis 0,047 Vibrio parahaemolyticus 0,046 Yersinia enterocolitica 0,046 13,4. Kesinlik RIDASCREEN Clostridium difficile GDH ELISA nın tekrarlanabilirliği, negatiften (Referans 6) yüksek pozitife (Referans 1) kadar olan aralıktaki tam ölçüm aralığını temsil eden altı referans ile incelenmiştir. Intra-assay tekrarlanabilirliğinin tespiti için, bu referansların 40 kez tekrar analizi yapılmıştır. Kitin üç farklı lotuna göre, ortalama değerler ve varyasyon katsayıları (VC) belirlenmiştir. Interassay tekrarlanabilirlik, on ardışık çalışma gününden gelen referanslar, her gün iki çalışmalı tekrarda denendi. Ölçümler, kitin üç farklı lotu ve üç teknisyen ile yapılmıştır. Inter-lot tekrarlanabilirliği, kitlerin üç lotunun tamamında yapılmıştır. Referans: Ortalama değer / VC 1 2 3 4 5 6 Intra-test Inter-test Inter-lot Kit lot 1 Kit lot 2 Kit lot 3 Kit lot 1 Kit lot 2 Kit lot 3 Kit lot 1-3 %2.014 / 5.59 %1.310 / 6.15 0.869/ %4.35 0.628 / %6.09 0.355 / %6.72 0.054 /% 17.90 %1.838 / 3.59 %1.258/ 4.08 0.731 / %3.76 0.549 / %4.58 0.372 / %4.22 0.049 /% 8,66 1.409 / %8.02 0.908 / %5,64 0.646 / %5.65 0.488 / %7.45 0.250 / %6.65 0.045 / %6.56 2.743 / %9,88 2.466 / %12.69 1.090 / %12.35 0.691 / %13.21 0.438 / %13.47 0.056 / %14,37 3.337 / %19,83 2.537 / %22.80 1.530 / %23,20 1.219 / %23.76 0.718 / %24.45 0.055 / %19,09 3.146 / %8,46 2.239 / %10,20 1.337 / %12,73 1.040 / %14.70 0.615 / %16.53 0.049 / %13.60 3.075 / %17,10 2.414 / %17.47 1.319 / %24,38 0.983/ %33.53 0.590 / %31.30 0.053 / %17.14 14. Müdahale eden maddeler Aşağıda listelenen maddelerin, belirtilen konsantrasyonlarda C. difficile pozitif ve negatif dışkı örneklerinde karıştırıldığında, test sonuçları üzerinde herhangi bir etkide bulunmadıkları görülmüştür: baryum sülfat (%5 a/a), loperamide (Antidiyaretik ilaç; %5 h/a), Pepto-Bismol (Antidiyaretik ilaç; %5 a/a), mucins (%5 a/a), sodyum siklamat (yapay tatlandırıcı, %5 h/a), insan kanı (%5 h/a), stearic asit ve palmitinic asit (karışım 1:1, %40 a/a), metronidazole (0.5) (antibiyotik 5% v/w), diclofenac (%0.00263 v/w). RIDASCREEN Clostridium difficile GDH 13-09-05 11
Ek Test özel sembolleri: Plak Diluent 1 Yıkama Control + Control - Mikro kuyucuk plak Sample dilution buffer Wash buffer Positive control Negative control Conjugate 1 Conjugate 1 Conjugate 2 Conjugate 2 Substrate Stop Substrate Stop reaktifi RIDASCREEN Clostridium difficile GDH 13-09-05 12
Kaynakca 1. Lyerly, D.M. et al.: Clostridium difficile: Its disease and toxins. Clin Microbiol. Rev. (1988); 1: 1-18. 2. Knoop, F.C. et al.: Clostridium difficile: Clinical disease and diagnosis. Clin Microb. Rev. (1993); 6: 251-265. 3. Kelly, C.P. et al.: Clostridium difficile Colitis. New Engl. J. Med. (1994); 330: 257-262. 4. Sullivan, N.M. et al.: Purification and characterization of toxins A and B of Clostridium difficile. Infect. Immun. (1982); 35: 1032-1040. 5. Thomas, D.R. et al.: Postantibiotic colonization with Clostridium difficile in nursing home patients. J. Am Geriatr. Soc. 38, 415-420 (1990). 6. Bartlett, J.G.: Clostridium difficile: Clinical considerations. Rev. Infect. Dis. (1990); 12: 243-251. 7. Cefai, C. et al.: Gastrointestinal carriage rate of Clostridium difficile in elderly, chronic care hospital patients. J. Hosp. Infect. (1988); 11: 335-339. 8. Asha, N.J. et al.: Comparative analysis of prevalence, risk factors and molecular epidemiology of Antibiotic associated diarrhea due to Clostridium difficile, Clostridium perfringens, and Staphylococcus aureus. J.Clin. Microbiol. (2006); 44: 2785-2791. 9. Voth, D.E., Ballard, J.: Clostridium difficile toxins: Mechanism of action and role in disease. J.Clin. Microbiol. (2005); 18: 247-263. 10. Borgmann, S. et al.: Increased number of Clostridium difficile infections and prevalence of Clostridium difficile PCR ribotype 001 in southern Germany. Eurosurveillance (2008); Vol 13: No.49 11. Mc.Donald, L.C. et al.: An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. N.Engl.J.Med. (2005); 353: 23. 12. Loo,V.G. et al.: A predominantly clonal multi-institutional outbreak of Clostri-dium difficileassociated diarrhea with high morbidity and mortality. N.Engl.J.Med. (2005); 353.23 13. Bartlett,J.G., Gerding,D.N.: Clinical recognition and diagnosis of Clostridium difficile infection. CID (2008); 46(Suppl. 1): 12-18. 14. Kufelnicka, A.M., Kirn, T.J.: Effective utilization of evolving methods for labora-tory diagnosis of Clostridium difficile infection. Clin.Infect. Dis. (2011)52: 1451-1457 15. Riggs,M.S.A. et al.: Asymptomatic carriers are a potential source for trans-mission of epidemic and nonepidemic Clostridium difficile strains among long-term care facility residents. Clin Infect. Dis.(2007)45:992-998 RIDASCREEN Clostridium difficile GDH 13-09-05 13