HĠPOKSĠK ĠSKEMĠK ENSEFALOPATĠ OLUġTURULAN RAT MODELĠNDE ĠNDOMETAZĠNĠN NÖRONAL APOPĠTOZ ÜZERĠNE ETKĠSĠ

T.C. ÇUKUROVA ÜNĠVERSĠTESĠ TIP FAKÜLTESĠ ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI ANABĠLĠM DALI NEONATOLOJĠ BĠLĠM DALI HĠPOKSĠK ĠSKEMĠK ENSEFALOPATĠ OLUġTURULAN RAT MODELĠNDE ĠNDOMETAZĠNĠN NÖRONAL APOPĠTOZ ÜZERĠNE ETKĠSĠ Dr. Erdal TAġKIN NEONATOLOJĠ YANDAL UZMANLIK TEZĠ TEZ DANIġMANI Prof. Dr. Mehmet SATAR ADANA 2010

T.C. ÇUKUROVA ÜNĠVERSĠTESĠ TIP FAKÜLTESĠ ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI ANABĠLĠM DALI NEONATOLOJĠ BĠLĠM DALI HĠPOKSĠK ĠSKEMĠK ENSEFALOPATĠ OLUġTURULAN RAT MODELĠNDE ĠNDOMETAZĠNĠN NÖRONAL APOPĠTOZ ÜZERĠNE ETKĠSĠ Dr. Erdal TAġKIN NEONATOLOJĠ YANDAL UZMANLIK TEZĠ TEZ DANIġMANI Prof. Dr. Mehmet SATAR ÇUKUROVA ÜNĠVERSĠTESĠ TIP FAKÜLTESĠ ARAġTIRMA FONU TARAFINDAN DESTEKLENMĠġTĠR. PROJE NO: TF-2006/LTP-32 ADANA-2010

TEġEKKÜR Neonatolojii yan dal eğitimim süresince yardımlarını ve deneyimlerini esirgemeyen değerli hocam ve tez danıģmanım Prof. Dr. Mehmet SATAR a ve birlikte çalıģmaktan zevk duyduğum Prof. Dr. Nejat NARLI ya, Doç. Dr. Hacer YAPICIOĞLU YILDIZDAġ a, tezime yardımlarından dolayı Patoloji Ananbilim Dalı ndan Prof. Dr. Suzan ZORLUDEMĠR e, arkadaģlarım Uzm. Kenan ÖZCAN a, Uzm. Dr. Ferda ÖZLÜ ye ve Yenidoğan Kliniği çalıģanlarına teģekkür ederim. Ayrıca yan dal ihtisasım süresince desteğini esirgemeyen eģim Berrin TAġKIN a, sevgili çocuklarım Zeynep TAġKIN ve Beril TAġKIN a teģekkür ederim. I

ĠÇĠNDEKĠLER TEġEKKÜR II ĠÇĠNDEKĠLER III TABLO LĠSTESĠ V ġekġl LĠSTESĠ VI KISALTMA LĠSTESĠ VII ÖZET ve ANAHTAR SÖZCÜKLER VIII ABSTRACT- KEYWORDS IX 1. GĠRĠġ 1 2. GENEL BĠLGĠLER 2 2.1. Perinatal Asfiksi ve Hipoksik Ġskemik Ensefalopati 2 2.1.1.Tanım 2 2.1.2. Ġnsidans 2 2.1.3. Asfiksi Tipleri 3 2.1.3.1. Kronik Kısmi Asfiksi 3 2.1.3.2. Akut Tama Yakın Asfiksi 5 2.1.4. Patoloji 6 2.1.4.1.Selektif Nöronal Nekroz 8 2.1.4.2. Status Marmoratus 8 2.1.4.3. Parasagital Serebral Hasar 8 2.1.4.4. Periventriküler Lökomalazi 8 2.1.4.5. Periventriküler Hemorajik Ġnfarkt 9 2.1.4.6. Fokal ve Multifokal Ġskemik Beyin Hasarı 9 2.1.5. Perinatal Hipoksik Ġskemik Beyin Hasarının Patogenezi 10 2.1.5.1. Hipoksemi 12 2.1.5.2. Hipoksi-Ġskemi 12 2.1.5.3. Beyin hasarında hücresel mekanizma 13 2.1.5.3.1. Enerji DönüĢümü 13 2.1.5.3.2. Ġntrasellüler asidoz 14 2.1.5.3.3. Eksitatör aminoasitlerin salınması 14 2.1.5.3.4. Ġntrasellüler kalsiyum birikimi 17 2.1.5.3.5. Serbest radikaller 19 2.1.5.3.6. Sitokinler 20 2.1.5.3.8. Apopitoz 20 2.1.5.3.8.1. Nekroz ve Apopitozda Hücresel DeğiĢiklikler 23 2.1.5.3.8.2. Ekstrinsik Apopitotik Yolak 24 2.1.5.3.8.3. Ġntrinsik Apopitotik Yolak 25 2.1.5.3.8.4. Kapspaz Bağımsız Apopitoz Aktivasyonu 25 2.1.5.3.8.5. Kaspaz Bağımlı Apopitoz aktivasyonu 25 2.1.6. Hipoksik iskemik beyin hasarının önlenmesine yönelik giriģimler 26 2.1.6.1. Enerji kaybının azaltılması 26 2.1.6.2. Glutamat salınımının inhibisyonu 27 2.1.6.3. Glutamat geri alımındaki bozukluğun iyileģtirilmesi 27 2.1.6.4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi 29 2.1.6.5. Lökosit/mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu 29 2.1.6.6. Ġntrasellüler olayların akıģının bloke edilmesi 30 2.2. Eikozanoidler (AraĢidonik asid metabolitleri) ve Otakoidler 31 II

2.2.1.Eikozanoid Biyosentezi 31 2.2.1.1. Siklooksijenaz Ürünleri 31 2.2.1.2. Lipooksijenaz Ürünleri 32 2.2.1.3. Eikozanoid Metabolizması 33 2.2.1.5. Eikozanoidlerin Etki Mekanizması 33 2.2.2. Fosfolipaz A 2 ve Hipoksik Ġskemik Serebral Hasar 34 2.3. Ġnflamatuvar Merdiyatörler ve Neonatal Beyin Hasarı 35 2.3.1. Prostaglandin ve Hipoksik-iskemik Beyin Hasarı 36 3. GEREÇ ve YÖNTEM 38 3.1.Histokimyasal Olarak S7100 ApopTag Peroxidase Uygulanması 40 3.2. Histopatolojik değerlendirme 42 3.3. Ġstatistiksel Değerlendirme 42 4. BULGULAR 43 5. TARTIġMA 48 6. SONUÇLAR 52 7. KAYNAKLAR 53 8. ÖZGEÇMĠġ 62 III

TABLO LĠSTESĠ Tablo no Sayfa no Tablo 1. Perinatal kronik kısmi ve akut tam asfiksinin özellikleri 3 Tablo 2. Hipoksik iskemik ensefalopatide etkilenen organlar 4 Tablo 3. Fetus veya yenidoğan beyninin hipoksik-iskemik hasara cevabı 7 Tablo 4. HĠE li yenidoğanda nöropatolojik özellikler 7 Tablo 5. Nekroz ve apopitoz arasında anatomik ve iģlevsel farklılıklar 23 Tablo 6. Apopitozun moleküler düzenlenmesi 24 Tablo 7. Hipoksik-iskemik beyin hasarının önlenmesindeki mevcut değerli giriģimler 28 Tablo 8. Deneysel modellerde perinatal hipoksik iskemik beyin hasarında inflamasyon ve sitokinler 30 Tablo 9. Gruplara göre cinsiyet ve ağırlıkların dağılımı 43 Tablo 10. Gruplara göre apoptotik hücre dağılımı 44 IV

ġekġl LĠSTESĠ ġekil no Sayfa no ġekil-1. Hipoksik-iskemik serebral hasar patogenezine genel bakıģ 11 ġekil-2. Akson terminalinden salınan glutamatın postsinaptik dentrit ve astrosit içerisindeki döngüsü, reseptörleri ve iyon kanalları 15 ġekil-3. Hücre içi kalsiyum homeostazı 18 ġekil- 4. Reperfüzyon reoksijenizasyon döneminde serbest oksijen radikallerinin oluģumu 19 ġekil 5. Sham grubunda az sayıda TUNEL pozitif boyanan apoptotik hücreler 45 ġekil 6. Hipoksik-iskemik hasar oluģturulan grupta artan sayıda TUNEL pozitif boyanan apoptotik hücreler 45 ġekil 7. Hipoksik-iskemik hasar öncesi 2mg/kg indometazin uygulanan grupta TUNEL pozitif boyanan apoptotik hücreler 46 ġekil 8. Hipoksik-iskemik hasar sonrası 2mg/kg indometazin verilen grupta daha az sayıda TUNEL pozitif boyanan apoptotik hücreler 46 ġekil 9. Hipoksik-iskemik hasar sonrası 4mg/kg indometazin uygulanan grupta belirgin olarak azalan TUNEL pozitif boyanan apoptotik hücreler 47 V

KISALTMALAR ADP AMPA ATP BOS Ca 2+ COX DNA EDRF enos FAD GH HĠE IGF-1 ĠL-1 ĠL-6 inos KA MSS NAD NADP NMDA nnos NO NOS O 2 PG PVL PVHĠ QA TGFB TNF- Adenozin difosfat Alfa-amino-3.hidroksi-5.metil-4.izoksazol propionik asit Adenozin trifosfat Beyin omurilik sıvısı Kalsiyum Siklooksijenaz Deoksiribonükleik asit Endotelden derive edilen gevģetici faktör Endoteliyal nitrik oksit sentaz Flavin adenin dinükleotit Growth hormon Hipoksik iskemik ensefalopati Ġnsülin like growth faktör-1 Ġnterlökin-1 beta Ġnterlökin-6 Ġndüklenen nitrik oksit sentaz Kainat Merkezi sinir sistemi Nikotin adenin dinükleotit Nikotin adenin dinükleotit fosfat N-Metil-D-Aspartat Nöronal nitrik oksit sentaz Nitrik oksit Nitrik oksit sentaz Oksijen Prostaglandin Periventriküler lökomalazi Periventriküler hemorajik infarkt Kuiskalat A Transforming growth faktör B Tümör nekrozis faktör alfa VI

ÖZET Amaç: Siklooksijenaz yolağı ve prostaglandinler hipoksik-iskemik beyin hasarı patogenezinde ve gecikmiģ beyin hasarı mekanizmasında önemli rol oynar. Bu çalıģmada hipoksik iskemik rat modelinde farklı dozlardaki nonselektif siklooksijenaz inhibitörü olan indometazinin nöronal apopitoz üzerine etkisi araģtırıldı. Gereç ve Yöntem: Levine-Rice metoduna göre hipoksik iskemi oluģturulan yedi günlük ratlar beģ gruba ayrıldı. Grup I (n: 15) ratlara serum fizyolojik verildi, arter ligasyonu ve hipoksi yapılmadı. Grup II (n: 15) ratlara hipoksik-iskemiden sonra serum fizyolojik verildi. Grup III (n: 15) ratlara hiposik-iskemiden önce tek doz 2 mg/kg indometazin verildi. Grup IV (n: 15) ratlara hipoksik-iskemiden sonra 12 saat arayla üç doz 2 mg/kg indometazin verildi. Grup V (n: 15) ratlara hipoksik-iskemiden sonra 12 saat arayla üç doz 4 mg/kg indometazin verildi. Ratlar hipoksik-iskemiden 72 saat sonra dekapite edildi ve beyin hemisfer dokuları TUNEL yöntemi ile değerlendirildi. Bulgular: Hipoksik-iskemi öncesi ve sonrası verilen indometazin tedavisi hipoksik-iskemi sonrası serum fizyolojik verilen grup ile karģılaģtırıldığında rat beynindeki apopitotik hücre sayısını önemli ölçüde azalttı (p<0,001). Sonuç: Bu sonuçlara göre indometazin tedavileri hipoksik iskemik beyin hasarı tedavisinde iyi bir seçenek olabilir. Anahtar kelimeler: Hipoksik-iskemi, beyin zedelenmesi, apopitozis, indometazin VII

THE EFFECTS OF INDOMETHACIN ON NEURONAL APOPTOSIS IN NEWBORN RATS WITH HYPOXIC-ISCHEMIC BRAIN INJURY ABSTRACT Purpose: Cyclooxygenase pathway and prostaglandins plays an important role in the pathogenesis and delayed mechanisms of hypoxic-ischemic brain injury. The aim of this study was to investigate the effect of different doses of indomethacin, a nonselective cyclooxygenase inhibitor, on neuronal apoptosis in rats with hypoxicischemic brain injury. Material and Methods: Seven-day-old rat pups with the Rice model of hypoxic-ischemic cerebral injury were randomly divided into five groups. Group I (n: 15) pups were given physiologic saline, but neither ligation nor hypoxia were performed. Group II (n: 15) pups were treated with physiologic saline after hypoxic-ischemia. Group III (n: 15) pups were treated with indomethacin at a dose of 2 mg/kg per before hypoxic ischemia. Group IV (n: 15) pups were treated with three doses of indomethacin at a dose of 2 mg/kg every 12 h after hypoxicischemia. Group V (n: 15) pups were treated with three doses of indomethacin, at a dose of 4 mg/kg every 12 h after hypoxic ischemia. After 72 hours, the rats were decapitated and each brain hemispheres tissues were evaluated by using the TUNEL staining method. Results: Indomethacin treatment either before or after hypoxia, results in a significant reduction in the numbers of apoptotic cells in rat brains when it is compared with group treated with physiologic saline after hypoxicischemia (p<0,001). Conclusion: These results demonstrated that indomethacin administration either before or after hypoxicischemia reduce neuronal apoptosis, and we propose that indomethacin may be a good option for the therapy of hypoxic-ischemic brain injury. Key Words: Hypoxic ischemia, brain injury, apoptosis, indomethacin VIII

I. GĠRĠġ ve AMAÇ Hipoksik Ġskemik Ensefalopati (HĠE) yenidoğan mortalitesine ve uzun dönemde gözlenen serebral palsi, mental retardasyon ve epilepsi gibi morbiditeye neden olabilen yenidoğanın önemli sorunlarından biridir. 1,2 HĠE de olay ile hücre ölümü arasında geçen süre olan ve terapotik pencere olarak adlandırılan bu kritik dönemde oluģan hücre ölümüne neden olan moleküler olaylar kaskadının sonlandırılarak, programlanmıģ hücre ölümü olarak bilinen nöronal apopitozun önlenmesi HĠE nin tedavisinde güncel yaklaģımların temelini oluģturmaktadır. 3 AraĢidonik asit ve prostaglandinlerin (PG) HĠE etiyopatogenezinde önemli rolleri olduğu bilinmektedir. 4-6 Hipoksi-iskemi sonrasında intrasellüler kalsiyum konsantrasyonunun artmasıyla fosfolipaz A2 nin aktive olduğu, membran fosfolipidlerinin yıkılmasıyla hücrede araģidonik asid biriktiği, siklooksijenaz ve lipooksigenaz enzimlerinin aktivasyonuyla prostoglandinler, tromboksan A2 ve lökotrienlerle beraber serbest oksijen radikallerinin açığa çıktığı bilinmektedir. 2 Serbest radikalllerin hücrelere veya makromoleküllere doğrudan zarar verebildiği gibi proapopitotik genleri tetiklediği ve kaspaz-3 aktivasyonunu içeren ve hücreyi apopitoza götüren hücre içi olaylar kaskadını uyardığı ileri sürülmüģtür. 3 Ġndometazin gibi PG üretiminin baskılanmasına yol açan bir siklooksijenaz (COX) enzim inhibitörünün reperfüzyon-reoksijenasyon döneminden sonra verilmesinin, postiskemik infarkt alanını küçültüğü hem de nöronal hasarı azalttığı gösterilmiģitir. 7,8 Bu çalıģmada nonselektif bir siklooksijenaz inhibitörü olan indometazinin HĠE de nöroprotektif etki sağlayabileceği hipotezi öne sürülmüģtür. Bu amaçla HĠE oluģturulan 7 günlük ratların beyin dokusunda TUNEL yöntemi kullanılarak farklı dozlardaki indometazinin nöronal apopitozis üzerine olan etkisi araģtırılmıģtır. 1

II. GENEL BĠLGĠLER 2.1. Perinatal Asfiksi ve Hipoksik Ġskemik Ensefalopati 2.1.1. Tanım Neonatoloji alanındaki ilerlemelere rağmen hipoksi ve asfiksi özellikle az geliģmiģ ülkelerde sorun olmaya devam etmektedir. Perinatal hipoksi-iskemide kan ve dokulardaki oksijen (O 2 ) konsantrasyonu, ph değiģiklikleri ve glikoz gibi metabolize edilebilen substratların konsantrasyonlarındaki değiģikliklere bağlı olarak geliģen bir takım olayların tanımına ihtiyaç vardır. Hipoksi (anoksi), bir veya birkaç organda oksijenin kısmi veya tam yokluğudur. Hipoksemi ise kanda oksijen konsantrasyonunun azalmasıdır. Asfiksi plasental veya pulmoner gaz değiģiminin kesilmesi sonucu hipoksemi ve hiperkapninin kombinasyonu sonucu oluģan durumdur. Perinatal asfiksi tanımı hemen her yerde farklı anlamlarda kullanılmaktadır. Asfiksinin kelime anlamı "nabızsızlık" olup; ancak genel olarak perinatal asfiksi, doku zedelenmesine yol açacak kadar dokuya oksijen verilmesinin bozulması (hipoksi-iskemi) sonucu hipoksemi ve hiperkapninin birlikte olmasını tarifler. Ġskemi ise bir organdaki kan akımının azalması veya kesilmesidir. Bu durumda sadece O 2 değil, diğer substratlar da dokuya eriģemez. Fetus veya yenidoğandaki iskemi genellikle sistemik hipoksi-asidoz sonucunda meydana gelir. Ayrıca kardiyovasküler fonksiyonun deprese olduğu durumlarda veya okluzif vasküler hastalıklarda da iskemi oluģabilir. Perinatal hipoksi-iskemiye maruz kalan yenidoğan bebeklerde en önemli hasar santral sinir sisteminde olmak üzere buna ek olarak bir veya birden fazla organ tutulumu olur. 1,9,10 Yenidoğanda hipoksi-iskemi, çoğunlukla hipoksik iskemik ensefalopati (HĠE) Ģeklinde bulgu verir ve yenidoğan bebeğin tüm hayatını etkileyebilen en önemli sorunlardan biridir. 1 2.1. 2. Ġnsidans Hipoksik iskemik ensefalopatinin tanımlanmasındaki farklılıklar nedeniyle gerçek insidansını belirlemek güçtür. Antepartum ve intrapartum fetal monitorizasyon yöntemlerindeki geliģmelere rağmen doğumu takiben geliģen sistemik asfiksi insidansı term bebeklerde halen 1000 canlı doğumda 2 ile 4 arasındadır. 11 GeliĢmekte olan ülkelerde bu oranın 1000 canlı doğumda 9 ile 18 gibi daha yüksek oranlara ulaģtığı 2

bildirilmektedir. Asfiktik doğan bebeklerin % 15-20 si yenidoğan döneminde kaybedilmektedir. YaĢayanların % 25 inde mental retardasyonun da eģlik edebildiği serebral palsi, öğrenme güçlüğü veya epilepsi gibi kalıcı nörolojik hasarlar geliģmektedir. 11 Bu problemin önemi, serebral hipoksi iskemi riski altındaki fetus ve yenidoğana uygun yaklaģımı zorunlu hale getirmiģtir. 2.1.3. Asfiksi tipleri Perinatal asfiksi "kronik kısmi" veya "akut tam" asfiksi Ģeklinde iki ayrı tablo halinde ortaya çıkmaktadır. Bu iki durum birbirinden klinik ve patolojik özellikler ile ayırt edilebilir (Tablo 1). 12 Tablo 1. Perinatal kronik kısmi ve akut tam asfiksinin özellikleri 12 Kronik Kısmi Akut - Tam Riskli durumlar Ablasyo plasenta, plasental hipoperfüzyon, uterusta hipertonisite Ablasyo plasenta Uterus rüptürü Kordun tam obstrüksiyonu Annenin kardiyo-respiratuvar arresti Asfiksi oluģması için geçen süre 1 3 saat < 10 dk Serebral kan akımında yeniden OluĢmuĢ Yetersiz düzenleme Klinik bulguların çıkıģı için sessiz Var Yok dönem (6 48 saat) Beyin Ödemi Var Yok Konvülziyonlar Var Var/Yok Beyin sapı bulguları Yok Var 2.1.3.1. Kronik kısmi asfiksi Hayvanlar üzerinde yapılan çalıģmalarda maternal plasental hipoperfüzyon, uterus hipertonisitesi, ablasyo plasenta, umblikal kord obstrüksiyonu ve fetal hipoperfüzyon gibi nedenlerle oluģan plasental perfüzyon bozukluklarında, olay bir saat veya daha uzun sürmüģse fetusta progresif hipoksemi ve asidoz geliģtiği gösterilmiģtir. Bu durumu kompanse etmek için vücuttaki kan akımı yeniden düzenlenmekte, kan 3

akımı vital olmayan organlardan (böbrekler, gastrointestinal sistem, karaciğer, kas ve deri), vital organlara (kalp, beyin ve adrenaller) yönlendirilmekte ve beyine giden kan akımı belirgin Ģekilde artmaktadır. Bu uyum sırasında serebral perfüzyon oldukça iyi korunmaktadır. Ancak fetal hipoksemi bir süre daha devam ederse, böyle bir kompansasyon ile sağlanan serebral perfüzyon yetersiz kalır ve santral sinir sistemine giden kan akımında yeni bir düzenleme ortaya çıkar. 1 Serebral hemisferlerde kan akımında azalma olurken, bazal metabolizmanın en fazla olduğu talamus, beyin sapı ve serebelluma daha fazla kan gönderilmeye çalıģılır (intraserebral Ģant). Bu durumda serebral hemisferler, özellikle perfüzyonun en uç noktaları olan parasagittal korteks ve bunun altındaki beyaz cevher hipoksemiden etkilenmeye baģlar; küçük infarktlar veya lokal konvülziyon odakları geliģir, olay daha da ilerlerse bütün serebral hemisferleri etkileyen infarkt alanları ortaya çıkar. 1,13 Yenidoğan bebeklerde ortaya çıkan klinik bulgular kan akımındaki bu değiģikliklere bağlı olmakta, birçok organda hipoksik-iskemik zedelenme görülmektedir (Tablo 2). Olguların üçte ikisinde beynin yanı sıra en az iki organ da etkilenmiģtir. Tablo 2. Hipoksik iskemik ensefalopatide etkilenen organlar 1 Kardiyovasküler sistem Sıvı-elektrolit dengesi Miyokard iskemisi Akut böbrek yetmezliği Kalp yetmezliği Uygunsuz ADH Salgılanması Solunum sistemi Metabolik Respiratuvar distres sendromu (RDS) Hipotermi Apne Hipoglisemi Pulmoner kanama Hipokalsemi Pulmoner hipertansiyon Hiponatremi Santral sinir sistemi Hiperpotasemi Serebral ödem Kanamalar Konvülziyonlar Dissemine intravasküler koagulasyon Ġntrakraniyal kanama Adrenal kanama Hipoksik-iskemik ensefalopati Gastrointestinal sistem Nekrotizan enterokolit Hematemez, melena 4

Nörolojik bulgular, hipoksik-iskemik zedelenmenin derecesine, süresine ve dağılımına bağlıdır. Bebek doğumdan hemen sonra beyin zedelenmesi ve metabolik asidoz nedeni ile depresedir. Hipotoni, letarji ve konvülziyonlar görülebilir. Hipotoni çok ağır olabilir. Ancak dakikalar veya saatler içinde bebeğin aktivitesi ve tonusunda artma olur, spontan ve uyarılarla tremorlar görülebilir. Konvülziyonlar genellikle 6-12 saat sonra ortaya çıkar, hemen her zaman hayatın ilk günü içinde görülür. Konvülziyonların sıklığı giderek artar ve genellikle baģlangıçta tedaviye dirençlidir. 2-5 gün sonra konvülziyonlar azalır veya tamamen ortadan kalkar ve ilaçla kontrol edilebilir duruma gelir. Ağır zedelenme olan vakalarda Ģiddetli beyin ödemi bulguları vardır. Kafa içi basınç artıģı bulguları (fontanelde bombeleģme, suturalarda açılma gibi) genellikle 24 saat sonra baģlar, 48. saatte en Ģiddetli düzeye eriģir. Bu hastalarda yeniden hipotoni geliģir, bebeğin hareketleri azalır veya ortadan kalkar. Beyin sapı disfonksiyonu bulguları (sabit pupiller ve apne gibi) vardır. 1,15 Serebral hemisferlerdeki infarkt yaygınsa, özellikle beyin ödemi bulguları varsa, lateral ventriküller kompresedir, serebral beyaz cevher ekojenitesinde difüz artma olur, serebral gri cevher (korteks ve bazal ganglionlar) ile beyaz cevher arasındaki görünüm farklılığı ortadan kalkar. Bir iki hafta sonra hemisferlerdeki nekroz alanları belirginleģir ve sonunda multikistik ensefalomalazi veya serebral hemisferlerin total obliterasyonu olur; talamus, beyin sapı ve serebellum daha iyi korunmuģtur. 1,15 2.1.3.2. Akut tama yakın asfiksi Bu durumda olay akuttur, hipoksemi ani ve Ģiddetlidir. Olay hızlı geliģtiğinden organlar arası ve beyin içindeki kan dolanımının yeniden düzenlenmesi yetersizdir. Buna bağlı olarak hipoksik-iskemik zedelenme bulguları, metabolik aktivitenin fazla, enerji depolarının az olduğu yerlerde daha fazla görülür. Talamus ve beyin sapı nükleusları belirgin derecede etkilenirken, serebral hemisferler daha iyi korunmuģtur, beyin ödemi görülmez. Parsiyel asfiksidekinin tersine nörolojik bulguların (konvülziyon ve beyin ödemi) ortaya çıkması için nisbeten sessiz geçen dönem görülmez. Hayvanlar üzerinde yapılan çalıģmalarda, olay on dakikadan kısa sürerse, beyin zedelenmesi bulgularının tamamen düzeldiği gösterilmiģtir. 10-25 dakika kadar sürdüğünde talamus ve beyin sapı nükleuslarında ağır zedelenme görülür. 25 dakikadan uzun süren 5

durumlarda ise ağır kardiyak zedelenme de olduğu için geriye dönüģümsüz vasküler kollaps geliģir. 1 Ġnsanlarda tama yakın asfıksi çok seyrektir. Ancak tam ablasyo plasenta, akut tam kord obstrüksiyonu, uterus rüptürü, maternal kardiyorespiratuvar arrest gibi durumlarda görülebilir. Bazı vakalarda ise hiç bir neden bulunamaz. Bununla birlikte bu vakaların bir çoğunda daha önceden baģlamıģ kısmi asfıksi bulguları da vardır. Ağır derecede etkilenmiģ bebekler doğduklarında deprese ve bradikardiktir, resüsitasyon gerekir. Spontan solunumları uzun süre yoktur. Konvülziyonlar ve uzun süren stupor görülür. Beyin ödemine bağlı kafa içi basınç artıģı bulguları yoktur. Beyin sapı disfonksiyonu bulguları 24 saat kadar sonra ortaya çıkar. Sabit pupiller, okulosefalik refleks yokluğu (orta-beyin, pons zedelenmesi), kornea refleksi yokluğu (pons zedelenmesi), öğürme refleksinin kaybı, dilde fasikülasyonlar (medulla spinalis zedelenmesi) görülebilir. Bu bulgular bebeğin uyanık durumlarında biraz düzelme gösterse bile genellikle kalıcıdır. Öğürme refleksinin azalması nedeni ile beslenme ve yutma bozuklukları görülür, nazofarenkste biriken sekresyonlar sorun olur ve bu nedenle bebeğin entübe edilmesi gerekebilir. Beyin-dıĢı organlardaki zedelenme bulguları daha hafiftir. 1 2.1.4. Patoloji Hipoksi-iskemi ardından geliģen serebral hasarın patolojik görünümü üniform özellikte değildir. OluĢan beyin hasarının lokalizasyonu, yaygınlığı ve Ģiddeti Ģu faktörlere bağlıdır: 1. Asfiksiye neden olan olayın Ģiddeti (total veya parsiyel), 2. Etiyolojik faktörün zamanı ve süresi (akut veya kronik) 3. Beynin geliģimsel olgunluğu (prematüre veya term) 4. Beyinde bölgesel duyarlı bölümler [vasküler faktörler ve N-metil D- aspartat (NMDA) reseptörlerinin dağılımı]. 1,26 Beyin zedelenmesinin ne zaman olduğu ile ilgili yapılmıģ çalıģmalar az olmakla birlikte histolojik incelemelerle lezyonun yaģı konusunda bilgi edinilebilir (Tablo 3). 1 6

Tablo 3. Fetus veya yenidoğan beyninin hipoksik-iskemik hasara cevabı Bulgu Gün Reaktif astrositozis 0.5-4 Mikroglial proliferasyon 0.3-3 Nöronal karyoreksis 0.5-2 Makrofaj infiltrasyonu 4-6 Kapiller endotelyel reduplikasyon 5 Fibriller gliosis 6 Kist oluģumu 10-42 HĠE de patolojik görünüm, serebral matürasyon ve dolayısıyla gestasyon yaģı ile farklılık göstermesi nedeniyle ayrı ayrı tartıģılmaktadır (Tablo 4). 10 Term bebekte gözlenen hipoksik-iskemik beyin hasarında; selektif nöron nekrozu, parasagittal zedelenme ve fokal iskemik beyin nekrozu görülür. Bunların arasında esas olan selektif nöron nekrozudur. Prematür bebekte görülen oligodendroglial /beyaz cevher hasarı term bebekte de görülmekle birlikte nöron hasarı daha baskındır. 10 Hipoksik iskemik ensefalopati esas olarak term bebeklerde geliģtiği için burada daha çok nöron nekrozuna neden olan patolojik biyokimyasal olaylardan bahsedilecektir. Tablo 4. HĠE li yenidoğanda nöropatolojik özellikler 10 Matür yenidoğan Selektif nöronal nekroz Bazal ganglia ve talamusun status marmoratusu Parasagital serebral hasar Fokal ve multifokal iskemik serebral nekroz Prematüre yenidoğan Selektif nöronal nekroz Periventriküler lökomalazi Fokal ve multifokal iskemik serebral nekroz Periventriküler hemorajik infarkt 7

Hipoksik iskemik ensefalopati de geliģebilen baģlıca serebral lezyonlar: 1) Selektif nöronal nekroz 2) Bazal ganglion ve talamusta status marmoratus Ģeklinde lezyon 3) Parasagital serebral hasar 4) Periventriküler lökomalazi (PVL) 5) Periventriküler-Ġntraventriküler kanama (PV-ĠVK) 6) Fokal ve multifokal iskemik beyin lezyonlarıdır. 1 2.1.4.1.Selektif nöronal nekroz Miyadında doğan bebeklerde H-Ġ hasarın sık rastlanan bir tipi olan selektif nöronal nekroz sıklıkla serebral korteks, talamus, beyin sapı ve spinal kordun ön boynuz hücrelerini içerir. Bu tip hasara en yatkın bölge serebral korteks tabakaları ve hipokampus bölgesidir. Lezyonlu bölgede sitoplazmik eozinofili ve nükleer kırılmalar dikkati çeker. Kronik nöropatolojik değiģiklikler, nöronal kayıp, astrositozis ve multikistik ensefalomalazi ile sonuçlanır. 26 2.1.4.2. Status Marmoratus Hayvan modellerinde bu tip lezyon daha çok akut, tama yakın asfikside görülür. Bazal ganglionlar ve talamusta nöronal kayıp, gliozis ve anormal miyelinizasyon ile bu bölgeler mermerimsi bir görünüm alır. 1,16 2.1.4.3. Parasagital Serebral Hasar Daha çok serebral korteks ve subkortikal beyaz cevheri tutan bir lezyon tipidir. Hasar genellikle bilateral ve simetriktir, lezyonlardan çoğunlukla hemoraji değil, infarktlar sorumludur. BaĢlıca anterior, posterior ve median serebral arterlerin sulama alanlarında yaygın nöron kaybı olur. 16 2.1.4.4. Periventriküler Lökomalazi Periventriküler lökomalazi (PVL) özellikle lateral ventriküllerin dorsal ve laterallerinde serebral beyaz cevherin hipoksik-iskemik nekrozu Ģeklinde tanımlanır. Serebral arteriyel anatomik farklılıklar nedeni ile ortaya çıkan tablo, bebeğin gestasyon yaģına göre değiģir. Daha çok prematüre bebeklerde gözlenir ve oluģan hasar, koagülasyon nekrozu ve periventriküler beyaz maddenin infarktı ile sonuçlanır. Çok 8

düģük doğum ağırlıklı (<1500 gr) bebeklerin % 25-40 ında PVL görülür. Ön, orta ve arka serebral arterlerin meningeal dallarındaki zengin interarteriel anastomozlara bağlı olarak serebral korteks rölatif olarak korunur. Hastaların yaklaģık % 25'inde periventriküler infarkt alanlarında hemoraji görülür ve genellikle ağır intraventriküler hemoraji ile birliktedir. 1,16 Oligodendrosit hasarı geliģen prematür bebeklerde 32 haftalık olduklarında beklenen hızlı miyelinizasyon safhası olmaz ve miyelinizasyon artıģına bağlı beyaz cevher artıģı görülmez. Buna bağlı olarak rölatif ventriküler dilatasyon geliģir ki bu duruma sıklıkla ex vacuo veya atrofik ventrikülomegali denir. 1 2.1.4.5. Periventriküler Hemorajik Ġnfarkt Periventriküler hemorajik infarkt (PVHI), prematürelerde sıklıkla ciddi IVH ile birlikte ortaya çıkar. Genellikle bilateraldir. Daha çok venöz orijinlidir. Venöz infarkt medüller ve terminal venlerin geniģ subepandimal germinal matriks hemorajisi ile tıkanması sonucu oluģur. 17 2.1.4.6. Fokal ve Multifokal Ġskemik Beyin Hasarı Fokal nekroz, asfiktik bebeklerin % 5-20'sinde görülebilen ana serebral arterlerden birinin tıkanması sonucu geliģen bir iskemik beyin hasarıdır. Arteriyel oklüzyonla iliģkili fokal iskemik serebral lezyonlar prematürelerde daha az görülür. Prematüre bebeklerde daha çok multipl küçük damarların tıkanması sonucu oluģan çok sayıda, küçük, dağılmıģ infarktlar görülür. Tromboembolizm fokal beyin hasarının en muhtemel nedeni olarak kabul edilir. Embolinin kaynağı genellikle plasental infarkt, harabiyete uğramıģ veya kateterize edilmiģ damarlardır. Polisitemi, hiperkoagülabililite (protein C ve S, antitrombin III eksikliği), yaygın damar içi koagülasyon diğer nedenler arasındadır. Lezyon, vakaların yaklaģık yarısında orta serebral arterin sulama alanında gözlenir ve yaygındır. Bu tip lezyonlarda hücrenin tüm organellerinde nekroz oluģur. Anoksik nöronal değiģiklikten 18 24 saat sonra ıģık mikroskobunda değiģiklikler izlenmeye baģlar. Bölgeye aktive monosit-makrofaj migrasyonu olur. 36 48 saat sonra bu hücreler geniģ, köpüksü makrofajlara dönüģür. Bir süre sonra astrositik hipertrofi ve proliferasyon geliģir. Bazı lezyonlarda kalsifikasyon izlense de genellikle ventrikülle bağlantılı veya bağlantısız kistik kavitasyon ile sonuçlanır. Kavite oluģumuna bağlı 9

lezyon tek ve büyük bir boģluk Ģeklinde olduğunda porensefali olarak tanımlanır. Hidranensefali de ise bilateral masif nekroz oluģur ve bu kavitelere beyin omurilik sıvısı (BOS) dolar. Bir diğer lezyon multikistik ensefalomalazi de bilateral küçük kavitasyon odakları geliģir. Bu lezyon daha çok beyaz cevherde izlenir. Fokal ve multifokal iskemik beyin lezyonları kraniyal USG, BBT ve MR ile diğer lezyonlara göre daha kolay saptanabilirler. 1,16,18 2.1.5. Perinatal Hipoksik Ġskemik Beyin Hasarının Patogenezi Hipoksi-iskemi prematür ve matür bebeklerde farklı nöropatolojik olaylara yol açar. Term bebeklerde esas olay nöron hasarı iken prematür bebeklerde oligodendroglial/beyaz cevher hasarı daha hâkimdir. Hipoksik-iskemik serebral hasarın önlenebilmesi, hücre yıkımına yol açan biyokimyasal olayların anlaģılması ile mümkün olabilir. 10 Serebral hasar ile sonuçlanan hipoksik iskemik ensefalopati tablosunun patogenezinden hipoksi ve iskeminin birlikteliği sonucunda meydana gelen bir dizi biyokimyasal ve patolojik reaksiyonlar sorumludur. Tek baģına hipoksi, iskemi ya da ATP gibi enerji kaynağı olan moleküllerin azalmasının hipoksik-iskemik (H-Ġ) serebral hasar oluģması için yeterli olmadığı çok sayıda yapılan hayvan deneylerinde gösterilmiģtir. 1,19,20 H-Ġ beyin hasarının esas bulguları akut hipoksi-iskemi döneminde değil, daha çok reperfüzyon ve reoksijenasyon döneminde ortaya çıkmaktadır. Ġlk oluģan olay glikoz ve oksijenin azalmasıdır. Hücre ölümüne neden olan olaylar hipoksik-iskemik olayın sonlanmasından sonra ve reperfüzyon sırasında enerjide çok da fazla düģüģ olmasını beklemeden oluģur ve bunu glutamat reseptörlerinin aktivasyonu izler. Nöron ölümüne neden olan diğer olaylar sitozolik kalsiyumun artması ve kalsiyuma bağlı süperoksid anyon, hidroksi radikaller gibi serbest radikallerin ve nitrik oksit derivelerinin oluģması gibi çeģitli zararlı olayların aktive olmasıdır. Nöron ölümüne neden olan olaylar kaskadı hipoksik-iskemik hasarın sonlanmasından birkaç saat sonra oluģur. Bu nedenle bu dönemde beyin hasarını azaltabilecek veya daha kötü olmasını engelleyebilecek önemli giriģimler yapılabilir. 10 HĠE de geliģen patolojik mekanizmalar Ģematik olarak ġekil-1 de gösterilmiģtir. 1 10

Hipoksik İskemik Hasar ATP tükenişi Sitotoksik ödem Primer nöron ölümü Resusitasyon Reperfüzyon ve Oksijenasyon Nötrofil PAF+ Serbest aktivasyonu eikosanoidler radikaller Glutamat Salınımı Serbest Radikaller Serebrovasküler disfonksiyon NMDA Kalsiyum Lipit peroksidasyonu Mikrovasküler tıkanma Otoregülasyon Vazojenik DNA kırılması kaybı NĠTRĠK ödem OKSĠT + DNA Lipaz Proteaz Yetersiz Kırılması oksidatif fosforilasyon Apoptozis ATP tükeniģi Pompa Yetersizliği Serbest radikaller Hipoksantin SEKONDER NÖRONAL ÖLÜM ġekil-1. Hipoksik-iskemik serebral hasar patogenezine genel bakıģ 10 11

2.1.5.1. Hipoksemi Intrauterin dönemde fetus, O 2 basıncının 22-28 mmhg arasında olduğu fizyolojik hipoksemik bir ortamdadır. PO 2 nin 15 mmhg e kadar düģtüğü durumlarda normal kardiyovasküler fonksiyonların bir kaç saat kadar devam edebildiği, kalp hızının ve sistemik kan basıncının düģmesi ile birlikte ilerleyici laktik asideminin oluģtuğu gösterilmiģtir. Dokuda yüksek enerjili fosfat rezervleri (özellikle ATP), hipoksemi esnasında oldukça iyi korunur. Ancak sistemik hipotansiyona hipoksemi eģlik ediyorsa ve serebral iskemi oluģmuģsa beyin hasarının meydana gelme Ģansı yüksektir. 21,22 2.1.5.2. Hipoksi-Ġskemi Hipoksinin meydana getirdiği beyin hasarında doku O 2 nin azalmasına ek olarak bir veya daha fazla faktörün rol oynadığı düģünülmektedir. Hayvanlardaki ilk çalıģmalar Myers ve arkadaģları tarafından yapılmıģtır. 5 Annelerinin abdominal aortası sıkıģtırılarak asfiksi yaratılan term maymun fetüslerinde iyileģmeyi takiben esas olarak serebral hemisferlerde zararlanma olduğu gösterilmiģtir. Ayrıca kortikal gri cevherde atrofi, beyaz cevherde skleroz ve bazal gangliyonlarda status marmoratus Ģeklinde hasarlanma gözlenmiģtir. Benzer lezyonlar perinatal periyotta serebral hipoksi-iskemi meydana gelip yaģayan bebeklerde de saptanmıģtır. Bu çalıģmalara ek olarak Brann ve Myers, gaz anestezik ve halotan ile annelerinde hipotansiyon yaratarak parsiyel intrauterin asfiksiye maruz bıraktıkları termindeki maymun fetüslerinde ağır hipoksemi ile birlikte kombine metabolik ve respiratuvar asidoz oluģtuğunu tespit etmiģlerdir. Doğumu ve resüsitasyonu izleyen dönemde maymunların mekanik ventilasyona gereksinim duydukları, konvülziyon geçirdikleri ve 96 saatten önce stabilize olmadıkları görülmüģtür. Yapılan nöropatolojik incelemelerde yaygın beyin ödemi ve soluklukla birlikte, hemorajik nekrozun özellikle serebral korteks ve subkortikal beyaz cevherde oluģtuğu gösterilmiģtir. Sistemik kan basıncı daha düģük olan maymunlarda asfiksinin daha ağır beyin hasarına yol açtığı görülmüģtür. Hipoksik kardiyovasküler depresyon sonucu sistemik hipotansiyon oluģması için O 2 basıncının %40 veya altında olması gerekmektedir. Hipoksemi esnasında kan basıncı daha düģük olduğunda serebral iskemi daha da artmakta ve beyin hasarı daha ağır olmaktadır. 5,21 12

Beyin hasarının oluģabilmesi için serebral hipoksi-iskeminin minimum ne kadar sürmesi gerektiği sorusu en önemli sorudur. Bu sorunun yanıtı serebral hipoksi-iskeminin ağırlığına, olayın olduğu zamanki beynin anatomik ve fonksiyonel maturasyonuna bağlıdır. Hipoksi-iskemi esnasında daha matür hayvanlarda daha kısa total asfiksi süresinde beyin hasarı meydana gelmektedir. Parsiyel serebral H-Ġ de bu süre daha uzun olmaktadır. Hayvanlarda yapılan deneylerde bu süre muhtemelen üç saatten daha fazla değildir. Üç saatten daha az hipoksi-iskemiye maruz kalan hayvanların baģarılı bir Ģekilde canlandırıldığı görülmüģtür. 21 Deneysel verilere ek olarak klinikte de sistemik hipoksemiye bağlı serebral iskeminin meydana getirdiği beyin hasarı radyografik bulgular, prognoz ve postmortem sonuçlar ile değerlendirilmiģtir. Yapılan çalıģmalarda hipoksemi ile birlikte sistemik hipotansiyonun özellikle prematür bebeklerde subkortikal veya periventriküler lökomalaziye neden olduğu tespit edilmiģtir. Miall-Allen ve arkadaģları, 31 haftanın altındaki 33 yenidoğan bebekte ortalama arteriyel kan basıncının bir saatten daha fazla 30 mmhg nın altında seyretmesi durumunda periventriküler beyaz cevherde ağır hemorajik infarkt veya iskemi geliģtiğini göstermiģtir. Ortalama arteriyel kan basıncı 30 mmhg üzerinde olan bebeklerde ise daha az lezyon geliģmiģtir. 5 2.1.5.3. Beyin hasarında hücresel mekanizma 2.1.5.3.1. Enerji DönüĢümü Ġrreversibl doku hasarına neden olan serebral H-Ġ de beynin enerji durumunda belirgin değiģiklikler söz konusudur. Hipoksiye ilk metabolik yanıt anaerobik glikolizdir. Doku O 2 basıncı kritik bir değer altına indiğinde (<0.1 mmhg) mitokondrilerin sitokrom sistemleri ansatüre hale gelir. Redükte ajanlar (NADH, FADH) birikmeye baģlar. Oksidatif fosforilasyonla oluģan ATP üretimi durur. ATP, tüm hücrelerde olduğu gibi nöronlarda da primer enerji kaynağıdır. Ġki yüksek enerjili fosfat bağı biyokimyasal reaksiyonlar ve fizyolojik olaylarla yakından iliģkilidir. ATP enerji tüketen reaksiyonlarda ve iyon pompalanması gibi fizyolojik iģlemlerde önemli rol oynar. ATP ye bağımlı Na + pompası ve değiģimi, Na + un intrasellüler birikimine neden olarak sitotoksik ödeme yol açar. 23 Aerobik ortamda mitokondriumlarda gerçekleģen oksidatif fosforilasyon ile 36 mol ATP üretilirken anaerobik glikoliz ile sadece 2 mol ATP üretilir. Enerji ihtiyacının 13

karģılanması için anaerobik glikoliz hızının 18 kat artması gerekir. Ancak glikolizisin maksimum stimülasyonu ile kapasite en çok 4 5 kat artabilir. Bunun nedeni bu sırada biriken NADH tan kaynaklanan H + iyon birikiminin glikolizin kilit enzimlerinden biri olan fosfofruktokinaz (PFK) aktivitesini inhibe etmesidir. Böylece glikoliz, parsiyel oksijen yokluğunda oksidatif fosforilasyonu stimüle edebilmesine karģın, hiçbir zaman mitokondriyal oksidasyonun yerini dolduramaz. 1,23 Hipoksi-iskemi sırasında primer enerji yetmezliğinin ardından geliģen ve enerjinin kısmen geri kazanıldığı bir reperfüzyon devresi vardır. YaklaĢık 24 saatlik bir latent süre sonunda yeterli serebral perfüzyon ve oksijenizasyonun olmasına rağmen ikinci bir enerji yetmezliğinin olduğu dönem geliģir. Latent faz döneminde gecikmiģ hücre hasarı oluģur. Bu dönem çalıģmaların yoğun olarak yapıldığı ilgi çeken bir dönemdir. 10 2.1.5.3.2. Ġntrasellüler asidoz Beyinde hasar oluģturacak kadar yeterli H-Ġ, hemen daima doku asidozu ile birliktedir. Bunun nedeni laktik asit birikimidir. 1 Ġntrasellüler laktik asidoz, glikozun oksidatif metabolizmasının kısmi veya total anaerobik glikolizise dönüģümü sonucu meydana gelir. Bu olay esnasında doku O 2 i çok düģük seviyelere iner. Bazı araģtırıcılar beyindeki laktik asidozun hipoksik-iskemik hasarın major nedeni olduğunu öne sürmüģlerse de yapılan bazı araģtırmalarda immatür hayvanlarda serebral laktik asidozun beyin hasarı oluģmasında kritik rolünün bulunmadığı yönünde bulgular da elde edilmiģtir. 24 Hipoksi-iskemide laktik aside ek olarak hidrojen iyonlarının da hücresel asidoza neden olduğu düģünülmüģtür. ĠndirgenmiĢ ekivalanların major kaynağı, ATP nin asit hidrolizi ile oluģan ve sellüler enerji kaybı ile biriken NADH +, H + dir. 25 Hipoksi-iskemi esnasındaki sellüler asidoza bağlı nöronal nekrozdan değiģik mekanizmalar da sorumlu olabilir. Bunlar arasında mitokondriyal fonksiyonun inhibisyonu, iyon dengesinin bozulması, Ca +2 birikimi ve ödem oluģumunun artıģı gösterilebilir. 5 2.1.5.3.3. Eksitatör aminoasitlerin salınması H-Ġ serebral hasarın en önemli nedenlerinden birisi sinapslarda eksitatör nörotransmitterlerin birikmesidir. Eksitatör aminoasitlerin en önemli özelliği fizyolojik 14

düzeyleriyle toksik düzeyleri arasındaki farkın çok az olmasıdır. Ġnsanda en çok bulunan eksitatör nörotrasmitter aminoasit L- glutamattır. Daha az miktarda bulunan L- aspartat da önemli bir eksitatör aminoasittir. 1,26 L-glutamat sinaptik aralıktan ATP ye bağımlı aktif transport ile geri emilir. Astrositler içine alınan glutamat, ATP ye bağımlı bir enzim olan glutamin sentetaz aracılığıyla NH 3 ile birleģerek glutamin Ģeklinde ortamdan uzaklaģtırılmıģ olur. Hipoksik iskemi durumunda ATP nin üretiminde azalma olması nedeniyle sinaptik aralıktan uzaklaģtırılamayan L-glutamat, nörotoksik etkisini bağlandığı reseptörler aracılığıyla gösterir (ġekil-2). Bu reseptörler baģlıca; N-metil D- aspartat (NMDA), alfa amino 3-OH 5-metil 4 isoksazol propionik asit (AMPA), kainat (KA) ve 1-amino-siklopentan-15,3R-dikarboksilik asittir (ACPD veya kuiskalat-b). NMDA, AMPA ve KA reseptörleri postsinaptik membrandan Na + ve Ca +2 iyon geçiģini sağladıkları için bunlara iyonotropik reseptörler denir. ACPD reseptörüne ise fosfoinositol hidrolizi, protein kinaz-c aktivasyonu ve endoplazmik retikulumdan Ca +2 mobilizasyonunu sağladığı için metabolizmayı uyaran anlamında metabotropik reseptör denir. Ġyonotropik reseptörlerin hepsinde Na +, K + geçiģi sağlanır. NMDA reseptöründeki iyon kanalından Na + ve K + a ek olarak Ca +2 da geçer. AMPA reseptörü yalnız immatür nöronlarda Ca +2 a geçirgen özellik taģır. 1,27 ġekil-2. Akson terminalinden salınan glutamatın postsinaptik dentrit ve astrosit içerisindeki döngüsü, reseptörleri ve iyon kanalları (VBKK: voltaj bağımlı kalsiyum kanalı, Glu: glutamat, Gln: glutamin). 15

Nöronal hücre kültürlerinde yapılan çalıģmalarda iyona bağımlı nöronal hasar mekanizması iki Ģekilde açıklanmıģtır: A- Erken nörotoksisite: Depolarizasyon esnasında nöronların içine fazla miktarda Na + ve Cl - geçiģinin olması nedeniyle hücre içi ozmolaritesi artar. Hücre içine su giriģi artar. Sitotoksik ödem meydana gelir ve hücre ölümü gerçekleģir. B- GecikmiĢ nörotoksisite: NMDA reseptörlerine bağlı kanallar yoluyla hücre içine giren fazla miktardaki Ca +2 iyonları, biyokimyasal bazı olayları harekete geçirirerek nöron ölümüne yol açar. Eksitatör aminoasitlerin, serebral hipoksi iskemide, nöronal zedelenmenin nedeni olduğunu gösteren bulgular Ģunlardır: 1. Beynin hipoksiye daha duyarlı olan bölgeleri glutamik asit içeren sonlanmanın en fazla olduğu yerlerdir. 2. HIE'li yenidoğanlarda BOS glutamat ve aspartat düzeylerinin arttığı gösterilmiģtir. 3. Beyine glutamat enjekte edildiğinde HĠE benzeri değiģiklikler olmaktadır. Glutamat salım inhibitörü (BMW 1003C87 triklorofenil- diaminopirimidin) verilmesi H-Ġ beyin hasarını büyük ölçüde önlerken glutamat alım inhibitörü (L- trans 2, 4- Pyrolidin dikarboksilat) verilmesi nörotoksik etki yapmaktadır. 28,29 4. Glutamat reseptör antagonistleri H-Ġ hasarı büyük ölçüde önler. NMDA reseptör antagonisti olan MK801 'in ve AMPA reseptör antagonisti olan NBQX'un hasarı azalttığı; bunda NMDA reseptör antagonistlerinin daha etkili olduğu gösterilmiģtir. 30 NMDA reseptör kanal kompleksinde antagonistik etki yapan ilaçların (ketamin, dekstrometorfan, fensiklidin) ve magnezyumun hasarı önlemede yararlı olduğu gösterilmiģtir. Magnezyum antikonvülzan etkisini NMDA reseptörünü bloke ederek yapmaktadır. Nitekim annelerine Ģiddetli preeklamsi nedeniyle magnezyum sülfat tedavisi uygulanan bebeklerin uzun dönem izlemlerinde nörolojik prognozlarının daha iyi olduğu özellikle serebral felç oranının daha az olduğu saptanmıģtır. Ancak bu konuda yapılan baģka bir çalıģmada benzer sonuçların alınmadığı bildirilmiģtir. 31,32 16

2.1.5.3.4. Ġntrasellüler kalsiyum birikimi Bir hücrenin yaģam fonksiyonlarını sürdürebilmesi için hücre içi homeostazı sağlayan enzimlerin iģlevlerini etkileyen intrasellüler ikinci bir messenger olarak görev yapan Ca +2 iyon konsantrasyonunun çok dar bir aralıkta tutulması gerekmektedir. Hücre içinde fazla miktarda Ca +2 birikimi nöron ölümü ve membran bütünlüğünün bozulmasına neden olur. Normalde serbest Ca +2 hücre içinde çok düģük düzeylerde olup, tamamına yakını mitokondri ve endoplazmik retikulumda, az miktarı ise nöronun plazma membranı ve nükleus gibi hücre içi organellere bağlı halde bulunur. Bağlanma iģlevi enerjiye (ATP) bağımlı ve intrasellüler ph dan etkilenen bağımsız olaylar ile meydana gelir. Ayrıca Ca +2 bağlayan çok özel proteinler de sitozol içinde bulunur ve bunlar serbest Ca +2 konsantrasyonlarının hücre içerisinde dar sınırlarda korunmasını sağlarlar. Kalsiyumun fizyolojik ekstrasellüler seviyeleri plazma membranı boyunca serbest kalsiyumun hücreye giriģ çıkıģına imkân verir. 1 Hipoksi-iskemi de glutamat reseptörlerinin aģırı uyarılması sonucu hücre içinde serbest sitozolik Ca +2 konsantrasyonu artar. 1 Bu yükselmenin iki kaynağının olduğu tahmin edilmektedir: 1. Kalsiyumun intrasellüler depolardan serbest hale geçmesi 2. Plazma membranı boyunca geçiģinin artması Açığa çıkan serbest sitozolik Ca +2, potansiyel olarak toksik seviyelere eriģir. Sitozolde kalsiyum birikimi Ģu Ģekilde gerçekleģir; AMPA reseptörlerinin uyarılması hücre membranının sağladığı Na + -K + dengesini bozarak depolarizasyona neden olur. Bu depolarizasyon NMDA reseptörlerindeki magnezyumun uzaklaģmasına yol açarak hücre içine daha fazla Ca +2 girmesine neden olur. Hücre, önce Na + giriģinin artmasıyla ĢiĢerse de, esas zedelenme hücre içindeki Ca +2 düzeyinin artmasıyla olur. 1 ACPD (kuiskalat) reseptörlerinde ise intrensek iyon kanalı yoktur. Etkilerini G proteinlerini aktive ederek gösterirler. G proteini fosfolipaz C'yi aktive eder. Bu enzim hücre zarının iç kısmındaki fosfatidil inositol'ü inositol trifosfat ve diaçilgliserole parçalar. Diaçilgliserol bazı hücre içi proteinleri aktif hale getirirken, inositol trifosfat hücre içi depolardan sitoplazmaya serbest Ca +2 salınmasına neden olur (ġekil -3). Kalsiyum dengesinde meydana gelen bu değiģiklikler hücre içerisinde birçok enzimin aktivasyonuna yol açarak nöronun canlılığının devamını etkiler. 1 17

ġekil-3. Hücre içi kalsiyum homeostazı (DAG: diaçil gliserol, PL-C: fosfolipaz- C, PIP 2 :fosfatidil inositol -4,5 -difosfat, IP 3 :inozitol trifosfat). Hücre içi serbest Ca +2 'un artması 1. Endonükleazların aktive olmasıyla DNA, proteazların aktive olmasıyla sitoskeletal proteinler ve bazı membran proteinleri parçalanır. 2. Fosfolipaz A 2 aktive olur ve membran fosfolipidlerinin yıkılmasına yol açar. Hücrede araģidonik asit birikir. Siklooksijenaz enziminin aktivasyonu ile prostoglandinler ve tromboksan A 2 meydana gelir. Siklooksijenaz yolağı ve hipoksikiskemik serebral hasardaki rolü aģağıdaki bölümlerde daha detaylı anlatılacaktır. Lipooksigenaz enzimi de aktive olarak lökotrienlerle beraber serbest oksijen radikalleri açığa çıkar (ġekil-4). 3. ATP düzeyi azalır; ADP, AMP, adenozin, ve hipoksantin oluģur. Ksantin dehidrogenaz enzimi ksantin oksidaza çevrilir bu enzimle hipoksantin parçalanır ve bol miktarda serbest oksijen radikali ortaya çıkar. 1 4. Ca +2 -kalmodülin kompleksi NOS u aktive etmesiyle NO oluģur. NO in HĠE patogenezindeki rolüne daha sonraki bölümlerde ayrıntılı bir Ģekilde değinilecektir. Nörotransmitterlerin salınımı ile artan hücre içi kalsiyum, Ca +2 -kalmodulin bağımlı protein kinaz II enzimini aktive eder. Bu enzim, içi nörotransmitterlerle dolu vezikülleri skeletal proteinlere bağlı tutan sinapsin adlı proteini fosforile ederek bu veziküllerin serbestleģmesine neden olur. Serbest kalan veziküller yine Ca +2 yardımıyla 18

presinaptik bölgedeki sinaptofizin adlı proteinle birleģir ve içeriklerini sinaptik aralığa boģaltırlar. Eksitatör aminoasitlerin ekstrasellüler aralığa salınmasıyla olay daha da Ģiddetlenir. ÇeĢitli lipaz, proteaz ve endonükleazların da aktivasyonu sonucu diğer nöronlar da etkilenir. Kalsiyum ayrıca ksantin ve prostoglandin formasyonu ile serbest O 2 radikallerinin oluģumuna da yol açar. Nihayet intrasellüler serbest Ca +2 un yüksek konsantrasyonları mitokondriyumda oksidatif fosforilasyonun kesintiye uğramasına neden olur. 1,33 2.1.5.3.5. Serbest radikaller Özellikle reperfüzyon-reoksijenizasyon döneminde prostaglandinlerin yapımı, hipoksantinin parçalanması ve NO artıģı ile serbest radikaller açığa çıkmaktadır (Ģekil- 4). Bunlar doğrudan hücre için toksik olabildikleri gibi, retikülo endotelial hücrelerin aktive olmalarına yol açarak doku zedelenmesini de arttırırlar. 34 Burada toplanan lökositlerin ürettikleri O 2 radikalleri, sitokinler ve proteazlarla hücre zedelenmesi yaparlar. 35 Hipoksi-iskemi (Eksitatör aminoasit etkisi) ATP Fosfolipitler Arjinin Hipoksantin AraĢidonik asit Nitrik oksit Reperfüzyon- Oksijenasyon Ksantin Lökotrienler Peroksinitrit Serbest oksijen radikalleri Zedelenme ġekil- 4. Reperfüzyon reoksijenizasyon döneminde serbest oksijen radikallerinin oluģumu. 19

2.1.5.3.6. Sitokinler Proinflamatuvar sitokinler birkaç değiģik mekanizma ile beyin hasarına neden olurlar. Ġnflamatuvar sitokinler direk serebral sitotoksik etki göstererek oligodendrosit öncüllerinin farklılaģmasını önlerler, 36 oligodendrosit apoptosisini stimüle ederler. 37,38 ve vakuoler myelin dejenerasyonuna neden olurlar. 39 Sitokinlerin potent vazomotor ve vazooklusif etkileri olabilir. 40,41 Son bilgiler sitokin toksisitesinin glutamat transportundaki bozukluklar nedeni ile olabileceğini göstermiģtir. 42 Ekstrasellüler glutamat regülâsyonunda önemli rolü olan astrositler, glutamatı 1000 kat konsantre etme yeteneğine sahiptir. Glial kültürlerde proinflamatuvar sitokinlerden Ġnterlökin (ĠL)-1β ve Tümör nekrozis faktör (TNF)- α nın glutamat transportörünün fonksiyonunu bozdukları ve glutamat aracılıklı oksidatif stresi arttırdıkları gösterilmiģtir. 42 Buna karģın anti-inflamatuvar olan ĠL-4 ve ĠL-10 bu etkiyi pro-inflamatuvar sitokinlerin üretimini engelleyerek indirek yoldan inhibe eder. Astrositlerdeki glutamatı temizleme kapasitesindeki bozulma antioksidanlar, vitamin-e ve glutatyon ile düzeltilebilir. Bu durum, astrositik glutamat transportörlerinin serbest radikaller ile kısmen de olsa hasarlandığını göstermektedir. Oligodendrositlerdeki glutamat transportörlerindeki geriye dönüģüm de hipoksik-iskemik hasarın mekanizması ile iliģkilendirilmiģtir. 43 Son olarak glutamat reseptörlerinin fetal geliģim sırasında aksonlarda geçici olarak bulunduğu tanımlanmıģtır, bu nedenle aksonal zedelenme immatür beyaz cevherdeki glutamat birikiminin diğer bir nedeni olabilir. 44 DolaĢımda yer alan sitokinler, iskemi veya maternal, fetal ve neonatal kaynaklı enfeksiyon zemininde oluģabilirler. Tek baģına iskemi dolaģımdaki sitokinlerin artmasına neden olabilir. Buna karģın ĠL-1β ve TNF-α gibi inflamatuvar sitokinlerin insitu üretimi endotoksinler aracılığı ile mikroglialar üzerinde toll-like reseptörlerin aktivasyonu ile sağlanır ve oligodendrosit ölümüne neden olur. 45 2.1.5.3.8. Apopitoz Hipoksi iskemiden sonra nöronlar dejenere olur. Nöronların nasıl öldüğünü anlamak tedavinin yönlendirilmesi için oldukça önemlidir. Nöronlar farklı yollarla ölebilir. Hücre ölümü apopitoz ve nekroz diye iki farklı tip olarak sınıflandırılmıģtır. Bu hücre dejenerasyonun yapısal ve biyokimyasal açıdan farklı oldğuna inanılmaktadır. 1 20

Apopitoz özel moleküler yolaklarla ilerleyen kendine özgü meknizmaların karıģtığı aktif organize programlanmıģ hücre ölümüdür. Apopitoz genelde geliģen beyinin fizyolojik hücre ölümü olarak görülür. Memelilerde birkaç gen ailesi apopitozu düzenler (Tablo 6). Bcl-2 ailesi; sistein içeren kaspaz ailesi, aspartat spesifik proteazlar; apopitoz inhibitör protein (AĠP); ailesi, tümör nekrozis faktör (TNF) reseptör ailesi ve p53 gen ailesi 46 Bcl-2 protoonkogen ailesi birtakım etkileģimler yoluyla proteinleri kodlayan apopitozis düzenleyici bir gen grubudur. Bu Bcl-2 ailesi içerisindeki etkileģimler hücresel yaģam ve ölüme etki eder. Kaspazlar (sisteinil aspartat- spesifik proteazlar) proenzimler tarafından aktive edilirler. Nükleer proteinler, hücre iskeleti proteinleri, sitozolik proteinler kaspazlar tarafından parçalanan hedef proteinlerdir. Normal hücrelerde istenmeyen apopitozu önlemek için proapopitotik proteinlerin aktiviteleri apopitoz inhibitör proteinler tarafından etkisizleģtirilir. Apopitoza bağlı hücre ölümü hücre membranında bulunan ölüm reseptörleri olarak adlandrılan yüzey reseptörlerince baģlatılabilir. Tümor nekrozis faktör reseptör ailesi ölüm reseptörleri olarak görev yapar. Fas (CD95/Apo 1) ve p75 (düģük afiniteli sinir büyüme faktör reseptörü) bu ailenin üyeleridir. Bu mekanizmayla apopitoz Fas ın hücre yüzeyinde birikimi ile baģlatılır. Çok değerli Fas ligandların TNF ailesinden bir üye tarafından bağlanması ile Fas aktivasyonuna neden olur. P53 ve onun iki homologu olan p63 ve p73 apopitozu harekete geçirir. 46 Nekroz, hücreye dıģarıdan gelen saldırılardan (osmotik, termal, toksik veya travmatik) dolayı hemostazı sürdürememesi ile sonuçlanan hücre ölümüdür. Hücresel nekroz süreci hücre membranın yapısal ve fonksiyonel içerğinin hasarı, hızlı iyon ve su giriģi sonuç olarak hücrenin çözülmesini içerir. Böylece hücresel nekroz hücre içindeki bir program değil fakat ani veya yavaģ homostatik karıģıklıklar ve fizyolojik durumlardan gelen değiģiklikler tarafından baģlatılır. Hipoksi iskemiden sonra nörodejeneratif hastalıklardan farklı bir hücre ölümü meydana gelir. Havyan modelleri HĠE için tedaviler geliģtirilmesine yardım edebilir. Bu tedaviler anahtar enzim aktivasyonunun inhibisyonu, hücre membranındaki iyon kanallarının (NMDA, Ca +2 kanalları), diğer proteinlerin veya nöronal hasar sürecinde ortaya çıkan toksik kimyasal ürünlerin (serbest oksijen radikaller) bloke edilmesi veya aktivasyonunun önlenmesini sağlayan ilaçlar olabilir. 47 21

Ġmmatür beyinde nörodejerasyon fenotipik olarak heterojenöz veya bölgeye özeldir. Hayvan modelinde korpus striatum nöronal hasar daha baskın bulunmuģtur. 48-50 Yenidoğan rat beyninde apopitoz daha çok saptanmıģtır. 51-53 EriĢkinlerde hipoksi iskemiden sonra selektif nöronların apopitoza yatkın olması kavramı halen tartıģmalıdır. 54,55 Yenidoğan beyninde, bu düģünce daha çok sorgulanmalıdır. Hipoksi iskemiden sonra apopitozun ve nekrozun nöronal ölüme katkısının doğru olarak tanımlanması son derece önemlidir. Çünkü hem klinik çalıģamalarda hemde hayvan modellerinde hipoksi-iskemiden sonra antiapopitotik tedaviler önerilmiģtir. 56 Hipoksi iskemiden sonra striatal nöronlarda 24 saatten sonra nekroz geliģir. Golgi aygıtında ve endoplamik retikulumda 3 12 saatte hasar oluģurken, mitokondri 12 saate kadar sağlamdır. Mitokondride önce aktivitede bir baskılanma daha sonra zararlnma ve sonunda mitokondriyal yetersizlik geliģir. Lizozomlarda hasar 3-6 saatte görülür. Na,K-ATPaz inaktivasyonu 3 saatte gözlenir. Hipoksinin 6 saatinde DNA ve RNA hidroksil readikallerinden zarar görür. 49,50,54 Nöronal apopitoz hipoksi iskemiden sonraki ilk 24 saatte nöron ölümünün en büyük nedeni değildir. Nöron ve mikrogliadaki apopitoza en büyük katkı gecikmiģ veya ikincil hücre ölümünde görülür. 49,50,57 Hipoksik iskemik yenidoğan ratlarda nörodejenerasyon hem nekroz hem de apopitoz Ģeklinde görülmektedir. Ayrıca bu iki nöronal hücre ölümü karıģık olarak ta görüldüğü bildirilmiģtir. Bu çalıģamalarda nöronal nekroz serebral kortekste daha belirgin iken, apopitoz talamus ve beyin sapında, hem nekroz hemde apopitoz ise hipokampus ve striatumda görülmektedir. 52,58 Yenidoğan rat beyninde hipoksi-iskemiden sonraki talamik nöron apopitozu yapısal olarak kortikal zedelenmeden sonraki talamik nöron apopitozu ile benzerdir. 51,58 Yenidoğan rat beyninde hipoksi-iskemiden sonraki talamik nöronlardaki apopitoza Fas ölüm resptölerinin ve kaspaz 8 düzeylerinde hızlı bir artıģın eģlik ettiği saptanmıģtır. Aynı zamanda mitokindriden zengin hücre fraksiyonlarında Bax ve çüzülebilir protein kısmında sitokrom c düzeyinin arttığı gösterilmiģtir. Talamusta artan Fas ölüm reseptörü ve Bax, sitokrom c birikimi ve kaspaz 8 kaspaz-3 ün belirgin artıģına ve apopitoz oluģumuna neden olur. 52 Bir haftalık ratlarda hipoksi-iskemiden sonra talamustaki yapısal nöron dejenerasyonunun apopitoz olduğu bildrilmiģtir. 59 Bununla birlikte elektron mikroskopik çalıģmalar yalnız apopitozun olmadığını nekrozun da devam ettiğini ve 22

devam eden apopitoz-nekroz olayının olduğunu göstermiģitir. 54,57,60 DNA fragmantasyon analizleri bu yorumu destekler niteliktedir. 61,62 2.1.5.3.8.1. Nekroz ve Apopitozda Hücresel DeğiĢiklikler Hipoksi- iskemi süresince dokulara zarar veren metabolik değiģiklikler meydana gelir. Hücrede aerobik metabolizmadan anaerobik metabolizmaya kayıģ olur. 63 Tablo 5. Nekroz ve apopitoz arasında anatomik ve iģlevsel farklılıklar 63 Nekroz Apopitoz Hücresel hemostaz bozulur Hücresel hemostaz sağlamdır Hücre zarında iyon akıģı artar (Na +, Ca +2 ) Hücre zarında iyon akıģı korunur Organeller ĢiĢer Sitozol yoğunlaģır Enerji tükenir Enerji depoları korunur Makromoleküler sentaz azalır Makromoleküler sentez uyarılır Kromatin aggregasyonunda kayıp olur Kromatin aggregasyonu yoğunlaģır Pasif atrofi Aktif bozulma Bunun sonucunda NADH, FADH ve laktik asit birikimi H + unu arttırır. Anaerobik metabolizma hücrenin enerji ihtiyacını karģılayamaz ve yüksek enerjili fosfat depoları boģalır. Transselüler iyon pompasının yetersizliği hücre içi Na +, Cl - ve su birikimine neden olur (sitotoksik ödem). Hipoksi iskemi aynı zamanda akson sonlanmalarından eksitator aminoasitlerin (glutamat) salınımını uyarır. Sinaptik aralığa glutamat salınımı dendritlerdeki AMPA-QA ve NMDA yüzey reseptörlerini uyararak Na + ve Ca +2 akıģına neden olur. Sitozoldeki Ca iyonu birikimi hücre zarına akıģı arttırır, dıģarı akıģı azaltır. Bu etki nöron ölümüne neden olan biyokimyasal olaylar kaskadını baģlatır. 63 Nöronlar hem nekroz hem de apopitoza uğradıklarında reperfüzyon sırasında nöronların iģlevsel ve antomik bütünlüğünde belirgin farklılıklar oluģur. Nöron nekroza gittiğinde yeni oksijen ve substrat gereksiniminden dolayı en az bazı biyokimyasal oluģumlarda tersine dönmeyi içeren yavaģ ilerleyen metabolik bozukluklar görülür. Hücresel asidoz ve laktat glikolizisi inhibe eder. Sonuç olarak glukoz tüketimi azalır ve hücre içi glukoz birikimine neden olur. Oksidatif metabolizma yeniden gerçekleģtiğinde NADH ve FADH mitokondride tüketilir, hem mitokondri hem de sitozol okside olur. 23

Oksijenizasyonla birlikte değiģik metabolik süreçler yoluyla serbest radikal üretilir. Mitokondriyal Ca+2 ve serbest radikal birikimi oksidatif fosforilasyonu bozarak ikincil enerji yetersizliğine neden olur. Hücre memebranı parçalanmaya baģlar ve özellikle mitokondride daha belirgin olmak üzere organellerde ĢiĢme meydana gelir. Çekirdek kromatini yoğunlaģır ve piknozis oluģur, sonuçta nöron çözülür ve ölür. 64 Apopitozdaki iģlevsel ve anatomik değiģiklikler nekrozdan farklıdır. En belirgin bozukluk mitokondride meydana gelir, ikinci olarak çekirdekte etkiler görülür. Histolojik olarak çekirdek DNA sındaki değiģiklikler özel bir boyama yöntemi olan terminal deoxynucleotidyl transferase nick end labeling (TUNEL) ile gösterilebilir. 63 67 Tablo 6. Apopitozun moleküler düzenlenmesi 66 Bcl-2 ailesi Antiapitotik proteinler Proapopitotik proteinler Kaspaz ailesi Bcl-2 Bax Apopitoz baģlatıcılar : kaspaz -2, -8, -9, -10 Bcl-x 1 Bak Apopitoz cellâtlar : kaspaz 3, -6, -7 Sitokin iģlemciler: kaspaz - 1, -4, -5, -11, -12, -14 Boo Bcl-x s Bad Bid Bik Apopitoz inhibitör proteinler (AIP) NAIP SMN AIP1 AIP2 XAIP Tümör süresör ailesi p53 p63 p73 2.1.5.3.8.2. Ekstrinsik Apopitotik Yolak Ölüm reseptörlerinin bulunduğu bölgede adaptör proteinlerin trimerizasyonu ile apopitoz baģlatıcıları olan prokaspaz 8, -10 ve -2 nin etkisi, prokaspaz 3,-6 ve -7 nin aktivasyonuna yol açar. Bu membran reseptörleri tumör nekrozis faktor ile iliģkili apopitoz reseptör 1 ve -2, CD95/Fas/APO 1, tumör nekrozis faktör reseptör 1 ve 2, 24

TWEK resptörlerini içerir. FAS/APO 1 (CD95) sitokin reseptör gibi hücre yüzeyi reseptörleri hem apopitoz hem de enflamatuvar mekanizmalara karıģır. 68 2.1.5.3.8.3. Ġntrinsik Apopitotik Yolak Bu yolak mitokondri bağımlıdır, mitokondri iç membranından salınan Bax ve Bcl 2 ailesi üyeleri bu yolakta rol alır. Apopitotik uyarılar mitokondriyal fonksiyonları bozar ve aģırı miktarda serbest radikal üretimine ve serbest radikallerin yok edilmesini sağlayan glutatyon gibi serbest radikal temizleyici sistemlerin azalmasına neden olur. Ġskemiden sonra reperfüzyon ile birlikte serbest radikaller hücre içinde intrinsik apopitotik yolağı etkin hale getirirler. Ayrıca mitokondriyal fonksiyonların bozulması birlikte elektron transport zincirinin ve ADP fosforilasyonunun bozulmasına, Ca +2 nin hücre içinde artmasına neden olur. Ca +2 birikimi enerji üretilmesine engel olarak mitokondriyal transitiyon permeabilite poru nun (mptp) açılmasına yol açar. Bu durum proapopitotik protein olan Bax ın mitokondri içinden dıģına çıkmasını sağlar. 69 Fizyolojik koģularda Bcl-2 bir antiapopitotik proteindir ve Bcl-2 ailesi üyesidir, mitokondri dıģ memranında yerģik olup membran bütünlüğünü ve sitokrom salınıını düzenler. Burada Bcl-2, kaspazdan bağımsız olarak apopitoz baģlatır. Sitokrom c salınımı prokaspaz-9 yoluyla apopitozu baģlatır. 68 2.1.5.3.8.4. Kaspaz Bağımsız Apopitoz Aktivasyonu Kaspaz bağımsız apopitoz mitokondri iç membranından salınan daha sonra hücre çekirdeğine yerleģen AIF tarafından oluģturulan ölüm sinyaline bir yanıttır. 68 2.1.5.3.8.5. Kaspaz Bağımlı Apopitoz aktivasyonu Proteolitik enzimler olan kaspaz -3, -6 ve -7 aktive olduklarında çeģitli proteinleri parçalarlar. Bu proteinler kinazlardan sitoskletal proteinlere, transkripsiyonel regulatorlere kadar değiģebilir. CAD (Caspase activated deoxyribonuclease) ve PARP (poly ADP-ribose polymerase) apopitozu gösteren DNA parçalanmasına katkıda bulunan iki aktive kazpaz parçasıdır. CAD sitozolden çekirdeğe geçerek orada DNA yı parçalar. 68 25

2.1.6. Hipoksik iskemik beyin hasarının önlenmesine yönelik giriģimler Son çalıģmalarda H-Ġ de olay ile hücre ölümü arasında geçen sürenin çok kritik olduğu görülmüģ ve bu dönem terapodik pencere olarak adlandırılmıģtır. Bu dönemde oluģan hücre ölümüne neden olan moleküler olaylar kaskadının sonlandırılması klinikte çok yararlıdır. Bu dönem fetal koyunda 6 saat kadardır. 70 Fetüste ve yenidoğan bebekte olayın baģlangıç zamanını ve ciddiyetini bilmek zordur. Term yenidoğanda H-Ġ e neden olan intrauterin asfiksinin ne zaman beyin hasarına yol açtığını belirleyen bir metot henüz yoktur. Benzer Ģekilde beyin hasarlarının daha çok postnatal dönemde olduğu prematürelerdeki beyin hasarı genellikle bulgu vermez veya sessizdir. Bu nedenle hem prematürelerde hem de term bebeklerde beyin hasarının geç tespit edilmesi terapodik pencere döneminin kaçırılmasına neden olur. Tablo 5 te hipoksik-iskemik beyin hasarının önlenmesinde değerli olan mevcut giriģimler gösterilmiģtir. 10 2.1.6.1. Enerji kaybının azaltılması Enerji kaybı çok ciddi olmasa dahi iskemiden sonra nöron ölümüne yol açan kaskadı baģlatan olaydır. Glikoz düzeyleri normal değerlerin çok üstüne çıktığında serebral laktat düzeyleri yükselmektedir. Bu nedenle glikozun fizyolojik düzeylerde tutulması önemlidir. 1 Yüksek doz barbitüratın serebral metabolik hızı azalttığı ve böylece enerjinin korunmasını arttırdığı bilinmektedir. Ġnsanlarda yüksek doz barbitürat kullanımı ile ilgili çalıģmalar yapılmıģtır. Hafif hiperkapninin de hayvan modellerinde protektif etkisi olduğu gösterilmiģtir. Enerji tüketiminin azaltılmasında en umut verici giriģim hafif hipotermi gibi görünmektedir. Biyokimyasal etkiler bu giriģimin nöroprotektif yararları ile korelasyon göstermektedir. Dahası, hafif hipotermi reperfüzyondan saatler sonra geliģen ikincil enerji yetersizliğini de azaltır. Hafif hipoterminin perinatal hayvan modellerinde, H-Ġ deki etkisi birçok çalıģmada incelenmiģ ve etkisi gösterilmiģtir. Hemen hemen tüm çalıģmalarda hipotermi H-Ġ sırasında veya reperfüzyondan hemen sonra veya her iki dönemde birden uygulanmıģtır. Ancak iskemik kuzularda yapılan bir çalıģmada olaydan 5,5 saat sonra kranyumun hafif soğutulmasının da hasarı azalttığı elektrofizyolojik ve nöropatolojik olarak gösterilmiģtir. Tüm bu anlatılan giriģimlerden hafif hipoterminin önemli bir nöroprotektif etkisi olduğu görülmektedir. 10 26

2.1.6.2. Glutamat salınımının inhibisyonu Ekstrasellüler glutamat birikimi hem nöronal hem de oligodendroglial hücre ölümüne yol açar. Presinaptik sinir uçlarından glutamat salınımının kalsiyum aracılıklı olduğu ve magnezyumun bu olayı bloke ettiği için, kalsiyum kanal blokörleri veya magnezyumun bu basamakta yararlı olabileceği bildirilmiģtir. Ancak kalsiyum kanal blokörlerinin kardiyovasküler yan etkilerinin olması, magnezyumun da bir çok H-Ġ modelinde tam olarak yararlı olduğunun gösterilememiģ olması nedeniyle rutin tedavide kullanımı önerilmemiģtir. 10 Adenozin reseptörlerinin inhibisyonu glutamat salınımını inhibe ettiği için adenozin, adenozin antagonistleri ve adenozin agonistlerinin nöroprotektif etkisi üzerine çalıģmalar yapılmıģtır. Bazı perinatal modellerde adenozin agonistlerinin etkili olduğu görülmüģ olsa da mevcut bilgiler her zaman tutarlı sonuçlar göstermemektedir. 20 Kültüre edilmiģ nöronlarda ve yenidoğan domuzlarda yapılmıģ çalıģmalarda hafif hipoterminin nöroprotektif etkisinin bir kısmından sinaptik sinir uçlarından glutamat salınımını inhibe etmesinin sorumlu olduğu gösterilmiģtir. Ancak çalıģmaların bazılarında bu gösterilememiģtir. 10 Serbest radikal tutucularının nöroprotektif etkisi, kısmen glutamat salınım düzeyinde etki göstermesine bağlı olabilir çünkü serbest radikallerin bazı modellerde nöronal glutamat salınımını arttırdığı görülmüģtür. Ayrıca fenitoin ve lamotrijinin de H- Ġ de yararlı etkisinin görülmesi bu antikonvülzanların glutamat salınımını inhibe etmesinden kaynaklanmaktadır. 10 2.1.6.3. Glutamat geri alımındaki bozukluğun iyileģtirilmesi Hipoksi-iskemi de ekstrasellüler glutamat artıģının nedeni sadece artmıģ salınım değil aynı zamanda astrosit ve presinaptik sinir uçlarından geri alımın bozulmasıdır (Ģekil-2). Hipotermi, iskemi nedeni ile geliģen astrositlerde enerji bağımlı glutamat alımındaki bozukluğu azaltarak bir miktar nöroprotektif etki sağlayabilir. Bu kanıya kültüre astrositlerdeki çalıģmalar sonucunda varılmıģtır. 10 27

Tablo 7. Hipoksik-iskemik beyin hasarının önlenmesindeki mevcut değerli giriģimler 1 1. Enerji kaybının azaltılması Glikoz Hipotermi Barbitürat Hiperkapni (hafif) 2. Glutamat salınımının inhibisyonu Kalsiyum kanal blokörleri Magnezyum Adenozin/adenozin agonistleri Hipotermi Serbest radikal tutucuları Lamotrijin Fenitoin 3. Glutamat alım yetersizliğinin düzeltilmesi Hipotermi 4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi NMDA reseptör antagonistlerinin (MK 801, magnezyum, ketamin, dekstrofan) verilmesi Non-NMDA reseptör antagonistlerinin (NBQX, CNQX) verilmesi 5. Lökosit/ mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu Nötropeni Platelet aktivasyon faktör (PAF) antagonistleri IL-1 reseptör antagonistleri Anti-ICAM-1 antikoru Antisitokin antikorları/ilaçları 6. Ġntrasellüler olayların akıģının bloke edilmesi Hipotermi Serbest radikal sentez inhibitörleri (allopurinol, indometazin, demir Ģelatörleri, magnezyum) Serbest radikal tutucuları (vitamin E, 21-aminosteroidler) NOS inhibitörleri/tutucuları (nitroarjinin deriveleri) Growth faktörleri (ĠGF 1, BDNF, GH, NGF) içeren anti-apopitotik ajanlar Monosialogangliosidler (GM 1) 28

2.1.6.4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi NMDA reseptör antagonistlerinden özellikle MK 801, magnezyum; ketamin ve destrofan ın iskemik nöron hasarının değiģik modellerinde hem kültür hem de in-vivo Ģartlarda nöroprotektif etkisinin olduğu gösterilmiģtir. Benzer Ģekilde bazı modellerde non-nmda (AMPA/kainate) antagonistlerinin (örn.nbqx, CNQX) kullanımı ile ek yararlı etki gösterilmiģtir. Bu ajanlar daha sıklıkla hasardan birkaç saat sonra veya hasarın sonlanmasından hemen sonra uygulandığında nöroprotektif etkisi belirgindir. 10 Non-NMDA reseptörlerin inhibisyonu sadece nöronal zedelenmeyi değil aynı zamanda oligodendroglial zedelenmeyi de inhibe eder. Son çalıģmalar AMPA/kainate reseptörlerinin aktivasyonunun kültüre oligodendrositlerin ve in-vivo çalıģmalarda oligodendrogliaların ölümüne neden olduklarını göstermiģtir. 10 Bu bulguların hepsi birden değerlendirildiğinde glutamatın hem reseptör hem de non-reseptör aracılıklı mekanizmalar ile immatür oligodendroglialara toksik etki gösterdiği görülmektedir. Mekanizmaların her ikisi de non-reseptör aracılıklı olanlar serbest radikal tutucuları ile ve reseptör aracılıklı olanlar da spesifik reseptör antagonistleri ile önlenebilir. Non- NMDA antagonistlerinin farklılaģan oligodendrositleri hipoksik-iskemik olaydan korumadaki yararlı etkisinden dolayı bu ajanlar hem nöronal hem de beyaz cevher hasarına karģı koruyucu olabilir. Oligodendrositler NMDA reseptörü eksprese etmezler ve nöronlardan farklı olarak NMDA antagonistleri oligodendroglial korumada önemli görünmemektedir. 10 2.1.6.5. Lökosit/mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu Hipoksi-iskemiye maruz kalan immatür oligodendrositler sitokinlerden en fazla zarar gören hücrelerdir. 3 Lökosit adherasyonu, mikroglial aktivasyon ve sitokin etkisi hipoksik-iskemik beyin hasarında önemli görünmesine rağmen perinatal modellerde bu düzeyde nöroproteksiyon ile ilgili çalıģmalar azdır. Ġn-vivo perinatal hipoksik iskemik hasarda H-Ġ öncesi yaratılan nötropeninin yararlı etkisi olduğu gösterilmiģtir. Ġskemi/reperfüzyon ile artan PAF lökosit adezyonunda ve daha sonra geliģen inflamatuvar kaskatta önemlidir. Ġmmatür ratta PAF antagonistinin hem tedavi öncesi hem de tedavi sonrası reperfüzyondan sonra uygulanmasının infarkt sahasını azalttığı gösterilmiģtir. 10,71 EriĢkin hayvanlarda yapılan çalıģmalarda lökosit adezyon molekülleri 10 29

veya değiģik sitokinlerin üzerine etki eden antikor veya ilaçların önemli nöroprotektif etkisi olduğu görülmüģtür. Mikroglia/makrofajların önemli bir ürünü IL-1β dır. IL-1β TNF-α yı da içeren diğer proinflamatuvar sitokinlerin salınımını sağlar. Yenidoğan ratta H-Ġ de IL-1β reseptör antagonistinin olaydan önce ve reperfüzyon sırasında kullanılmasının yararlı etkileri olduğu gösterilmiģtir. 10 Benzer Ģekilde bir fosfodiesteraz inhibitörü olan, H-Ġ den sonra beyinde arttığı bilinen ve TNF-α üretimini inhibe eden pentoksifilin in H-Ġ den hemen önce uygulandığında hipoksik-iskemik hasarını azalttığı görülmüģtür (Tablo 8). 10 Tablo 8. Deneysel modellerde perinatal hipoksik iskemik beyin hasarında inflamasyon ve sitokinler 10 Hipoksi- iskemiden sonra hızlı ve aktif bir Ģekilde mikroglia aktivasyonu olur Nötropeni koruyucudur Sitokinler (özellikle de IL-1β ve TNF-α) H-Ġ den sonra hızlı bir Ģekilde artar TNF-α antagonisti olan pentoksifilin H-Ġ den hemen önce uygulandığında hipoksik iskemik beyin hasarını azaltır IL-1 β reseptör antagonistleri H-Ġ den önce veya H-Ġ sonlandıktan hemen sonra uygulandığında hipoksik- iskemik beyin hasarını azaltmaktadır 2.1.6.6. Ġntrasellüler olayların akıģının bloke edilmesi Hücre ölümüne neden olan intrasellüler biyokimyasal olayların akıģının blokajı kalsiyumla aktive olan iģlemler, serbest oksijen radikallerinin oluģumu, nitrik oksit sentezi ve apopitotik ve nekrotik hücre ölümüdür. Hipotermi bu kaskadta bir çok düzeyde etki eder ancak bu etkiler arasında en belirgin olanları serbest radikal oluģumu ve nitrik oksit sentezindeki azalmadır. DeğiĢik H-Ġ modellerinde nöroprotektif olduğu gösterilen serbest radikal inhibitörleri; ksantin oksidazı inhibe eden allopurinol, siklooksijenazı inhibe eden indometazin, Fenton reaksiyonu ile hidroksil radikallerin üretimini azaltan demir Ģelatörleri ve lipid peroksidasyonunu inhibe eden magnezyum dur. Serbest radikal tutucularının (vitamin E, 21-aminosteroidler, idebenon) nöroprotektif etkilerinin olduğu gösterilmiģtir. 10 Deneysel modeller hem nöronal hem de oligodendroglial hasarı içermektedir. 30

2.2. Eikozanoidler (AraĢidonik asid metabolitleri) ve Otakoidler Eikozanoidler yirmi karbon atomlu yağ asidlerinden türeyen ve güçlü biyolojik etkinlik gösteren endojen maddelerdir. Eikozanoid adı Yunanca yirmi anlamına gelen eicosa dan gelir. Yirmi karbonlu yağ asidi iskeleti üzerinde varolan yapı değiģikliklerine göre, doğrudan biyolojik etkinliği olan primer eikozanoidler değiģik altgruplarda toplanırlar. Bu alt-gruplardaki maddeler dokularda araģidonik asid ve diğer prekürsör yağ asidleri üzerine belirli enzimlerin etkimesi sonucu oluģurlar. Bu enzimler siklooksijenazlar, lipooksijenazlar ve sitokrom P450 monooksijenaz enzimleridir. 72 Eikozanoidler, prekürsör yağ asidlerinden oluģmalarında rol oynayan enzim türüne göre siklooksijenaz ürünleri, lipooksijenaz ürünleri ve 450 mono oksijenaz ürünleri Ģeklinde üç gruba ayrılır. Bu grupların fizyolojik ve patolojik olaylara katkıları ve çeģitli sistem ve organlara etkileri bakımından aralarında belirgin farklar vardır. 72 2.2.1.Eikozanoid Biyosentezi Eikozanoidlerin biyosentezi, araģidonik asidin hücre membranındaki fosfolipidler veya diğer kompleks lipidlerden fosfolipaz A2 (PLA2) gibi eikozanoid sentez enzimleri aracılığı ile mobilize edilmesine veya salınımına bağımlıdır. AraĢidonik asid kısmen de fosfatidilinozitidlerden fosfolipaz C ve digliserid lipaz kombinasyonu aracılığı ile sentezlenmektedir. 73,74 Eikozanoid biyosentezindeki artıģ, genel olarak fiziksel, kimyasal ve hormonal uyarılara cevap olarak oluģmakta veya düzenlenmektedir. Daha sonraki basamakta araģidonik asid, dört ayrı sentez yolağına girer: siklooksijenaz (prostaglandin endoperoksidaz sentaz), lipooksijenaz, P450 epoksijenaz (sitokrom P450) ve izoprostan (ġekil 1). 74 2.2.1.1. Siklooksijenaz Ürünleri (Prostaglandinler, Prostasiklinler ve Tromboksanlar) Siklooksijenaz enziminin 2 izoformu vardır: siklooksijenaz-1 (COX- 1) ve siklooksijenaz-2 (COX-2). COX-l bir çok hücrenin içeriğinde gösterilmiģtir ve daima vardır. Aksine COX-2 normal olarak bulunmaz fakat belli serum faktörleri, tümör promotorları, sitokinler ve growth faktörler ile indüklenebilir ve bu etki deksametazon 31

gibi glukokortikoidler ile inhibe edilebilir. Lipopolisakkarid (endotoksin) kısmen bu indükleme yönünden potent bir ajandır. Bu sentez basamakları üzerinde nonsteroidal anti-infiamatuvar ilaçların kendi terapötik etkilerini göstermesi açısından büyük önem taģır. Ġndometazin ve sulindak baģlıca COX-l üzerinden etkisini gösterir. Meklofenamat ve ibuprofen COX- 1 ve COX-2 üzerinde eģit derecede potent etki gösterirken. selokoksib ve rofekoksib tercihen COX-2 yi inhibe etmektedir. Selektif COX-2 inhibitörleri, COX-l inhibitörlerine göre daha az gastrik strese neden olmakta ve kronik inflamasyonun tedavisinde daha tercih edilmektedir. Aspirin her iki enzimi de farklı uzantılarda asetiller ve inhibe eder. Siklooksijenazların iki farklı aktivitesi mevcuttur: (1) endoperoksidaz aktivitesi esterleģmemiģ prekürsör yağ asidlerini siklik endoperoksid prostaglandin G (PGG) ye oksijenalize ve siklize eder, (2) peroksidaz aktivitesi ile PGG yi prostaglandin H (PGH) ye dönüģtürür. Stabil olmayan PGG ve PGH ileri basamaklarda prostasiklin (PGI2), tromboksan (TXA), prostaglandin E (PGE), prostaglandin F (PGF) veya prostaglandin D (PGD) gibi ürünlere dönüģür. PGE2 ve PGD2 sentezi için farklı izomerazlar tespit edilmiģtir. PGH2 nin PGF2 ye dönüģümünü katalizleyen bir redüktaz enzimi de karakterize edilmiģtir. PGH2 ayrıca iki ayrı stabil olmayan ve oldukça aktif maddelere dönüģür: (1) tromboksan A2 (TXA2) tromboksan sentaz ile oluģturulmaktadır. Bu ürün 30 saniye içinde stabil fakat inaktif TXB2 ye dönüģmektedir. PGI2 prostasiklin sentaz ile oluģturulmakta ve nonenzimatik olarak inaktif 6-keto PGFct ye dönüģmektedir. Çoğu dokuların serbest araģidonik asidden PGG ve PGH sentezi yapabilme yeteneği varken, her bir dokuda enzimlerin varlığına ve miktarına bağlı olarak yazgıları değiģmektedir. Örneğin, akciğer ve dalak bu ürünlerin tümünü sentezleyebilir. Buna karģılık trombositler PGH yi metabolize eden baģlıca enzim olarak tromboksan sentaz enzimini içermekte iken, endotel hücreleri baģlıca prostasiklin sentaz enzimini içermektedir. 72 2.2.1.2. Lipooksijenaz Ürünleri AraĢidonik asidin 5-, 12- ve 15-lipoksijenaz ile metabolize olması sonucu hidroksiperoksieikozatet raenoik asid (HPETEs) oluģur, daha sonra bu ara ürün hızlı bir Ģekilde hidroksi türevlerine (HETEs) ve lökotrienlere dönüģür. Aktif olarak araģtırılan lökotrienlerin çoğu inflamatuvar hücrelerde (PMNs, bazofil, mast hücreleri, eozinofil, 32

makrofaj) 5- lipooksijenaz tarafından oluģturulmaktadır. Bu yolak astım ve anafilaktik Ģok ile iliģkili olduğundan önem taģır. Bu hücrelerin uyarılması intraselüler kalsiyum seviyesini yükseltir ve araģidonik asid salımmına, daha sonra da 5-lipooksijenaz ile unstabil epoksid lökotrien A1 (LTA1) oluģumuna neden olur. Bu ara ürün dihidroksi lökotrien B4 (LTB4) ya da lökotrien C4 (LTC4) e dönüģür. LTC4 peptidazlarla LTD4 ve LTE4 e dönüģebilir. LTC4 ve LTD4 kuvvetli bronkokonstriktördür ve slowreacting substance of anaphylaxis (SRS-A) ın baģlıca yapıları olarak fark edilmiģlerdir. Anti-lökotrien ilaç geliģimine yönelik dört yaklaģım vardır: 5-lipooksijenaz enzim inhibitörleri, lökotrien reseptör antagonistleri, membrana bağlı 5- lipooksijenaz aktive edici protein (FLAP) inhibitörleri ve fosfolipaz A2 inhibitörleri. Diğer bir grup lipoksinlerin LXA ve LXB in biyolojik rolleri henüz aydınlanamamıģtır. 10 2.2.1.3. Eikozanoid Metabolizması Prostaglandinler sentez edildikleri dokularda bulunan enzimler tarafından veya akciğer ve böbrek korteksinde bulunan enzimler tarafindan inaktive edilirler. Özellikle akciğer damar yatağı bu maddeleri inaktive etmekte oldukça etkindir ve bu organda %95 e varan bir oranda inaktivasyon gerçekleģir. Tüm prostaglandinlerin biyolojik aktivitesi için önemli olan C15-hidroksil grubu ilk olarak prostaglandin 15- hidroksidehidrojenaz enzimi ile okside edilir. Ardı sıra gelen bir dizi olaydan sonra PGE ve PGF ler inaktif tetranor (16 karbonlu) metabolitlerine, PGD2 ise PGJ2 ye dönüģür. Prostasiklin akciğerde parçalanmaz fakat karaciğer ve böbrekte inaktive edilir. Ana metaboliti olan 6-keto-prostagiandin F1 ya yıkılır. TXA2 inaktivasyonu ise karmaģıktır. Enzimatik olmayan bir hidrolizle TXB2 ye dönüģür. LTC4 ün inaktivasyonu akciğerler, böbrek ve karaciğerde geliģir. BaĢlangıç basamağında LTE4 e dönüģür ve biyolojik aktivitesini kaybeder. LTB4 ün metabolizması ise baģlıca oksidasyonla oluģur. 75 2.2.1.4. Eikozanoidlerin Etki Mekanizması Eikozanoidler otokrin ve parakrin özellik gösterirler ve hücre yüzeyinde reseptörlere bağlamrlar. Prostanoidlerin farmakolojik spesifikliği farklı hücrelerde reseptör tipi ve yoğunluğu ile belirlenir. Bütün reseptörler ve alt tipleri G-proteinine kenetli olarak etkilerini gösterirler. Ġkincil ulaklar olarak adenilil siklaz stimülasyonu 33

(camp artıģı) veya inbibisyonu (camp azalıģı) ya da fosfolipaz C stimülasyonu (diaçilgliserol ve inozitol 1,4,5- trifosfat artıģı sonucunda hücre içi kalsiyum artar) meydana gelir. Eikozanoidlerin düz kas üzerindeki kontraktil etkileri kalsiyum salınımı aracılığı ile olurken, onların gevģetici etkileri camp üretimi ile olmaktadır. Eikozanoidlerin immün sistem dâhil birçok hedef hücrede etkileri benzer Ģekilde açıklanabilir. Eikozanoidlerin çoğunun kontraktil etkileri ekstraselüler kalsiyumun azaltılması veya kalsiyum kanal blokörü ilaç kullanımı ile inhibe edilebilir. Lökotrien Reseptörleri: DeğiĢik hücre ve dokularda LTB4, LTC4 ve LTD4 için reseptörler tanımlanmıģtır (cyslt1 ve cyslt2). Lökotrien reseptörleri de G proteine kenetlidir ve onların aktivasyonu intraslüler kalsiyum konsantrasyonunu artırır. 75 2.2.2. Fosfolipaz A 2 ve Hipoksik Ġskemik Serebral Hasar Beyin fosfolipaz A 2, sn-2 pozisyonundaki membran fosfolipidlerindeki açil esterlerini parçalayan bir esterazdır, serbest yağ asidi ve lizofosfolipid üretimine neden olur. AraĢidonik asit ve lizofosfolipid fosfolipaz A2 nin katalizlediği en önemli reaksiyonlardır. Normal koģullar altında bir kısım araģidonik asit inflamatuvar mediyatörlere, prostaglandinlere, lökotrienlere ve tromboksanlara çevrilirken araģidonik asitin büyük bir kısmı tekrar beyin fosfolipidlerinin içerisine katılır. 76 Fosfolipaz A 2 ailesi sekretuvar fosfolipaz A 2, sitozolik fosfolipaz A 2 ve kalsiyum bağımsız fosfolipaz A 2 den oluģur. AraĢidonik asit salınımı genellikle sitozolik fosfolipaz A 2 yoluyla meydana gelir. Sekretuvar fosfolipaz A 2, intraselüler olarak sentez edilir daha sonra ektraselüler olarak seekrete edilir. Sekretuvar fosfolipaz A 2 esas olarak sinaptazomlarda ve sinaptik vesiküllerde depo edilir. 77,78 Fosfolipaz A 2 iki tip hücre yüzeyi reseptörüne bağlanır. N tipi reseptör nöronlarda, M tipi reseptör ise kaslarda bulunur. 79 Beyin sekretuvaar fosfolipaz A 2, bir sekresyon molekülü ve enzim aktivasyonu için gerekli milimolar konsantrasyonda Ca +2 içeririr. Bu enzim fosfolipid yağ açil zincirleri için seçici özellik göstermez. Sektretuvar fosfolipaz A 2 memeli beyinin tüm bölgelerinde bulunur. Fakat hipokampus, medulla oblongata ve ponsta daha yüksek aktivite gösterir. 80 34

Rat beyin sinaptozomlarında ve nöron hücre kültürlerinde sekretuvar fosfolipaz A 2, asetil kolin, glutamat reseptörleri, veya voltaj bağımlı kalsiyum kanalları yoluyla depolarizasyona neden olduğu gösterilmiģtir. Bu bulgulara göre sekretuvar fosfolipaz A 2 nöronal metabolizmada önemli rol oynayabilir. 78,81 Glutamat ve analogları sekretuvar fosfolipaz A 2 yi doza ve zamana bağlı olarak uyarır. 82 Kortikal hücre kültürlerinde glutamat nörotoksisitesinin artmıģ sekretuvar fosfolipaz A 2 ile birlikteliği vardır. Bu gözlem glutamatın sinaptik aktivitesinin sekretuvar fosfolipaz A 2 tarafından düzenlendiğini gösterebilir. 83 Sitozolik fosfolipaz A 2 tüm beyin dokularında bulunmasına karģın tam olarak pürifye edilelmemiģtir. Rat beyninde sitozolik fosfolipaz A 2 nin Hve L diye iki formu bulunmuģtur. Fosfolipaz A 2 -H kalsiyum ile inhibe olurken, fosfolipaz A 2 L nin aktivite göstermesi için mikromolar konsantrasyonda kalsiyuma gereksinim vardır. 84 Sitozolik fosfolipaz A 2 izoenzimleri araģidonik asit salınımı ve eikozonoid formasyonundan sorumlu olduğu düģünülür. 85 Hücresel seviyede, kalsiyum mobilizasyonu, sitoplazmik fosfolipaz A 2 ve ektraselüler sitoplazmik fosfolipaz A 2 arasındaki etkileģim eikozanoid artıģından sorumlu olabilir. Patolojik koģullar altında kalsiyum, fosfolipaz A 2 ve ektraselüler sitoplazmik fosfolipaz A 2 arasındaki etkileģim oksidatif stres ve inflamasyonun eģlik ettiği nörolojik hastalıkların patofizyolojisinde önemli rol oyanayabilir. Kalsiyumdan bağımsız fosfolipaz A 2 nöronal hücre proliferasyonu, apopitozis ve diferensiyasyonunda görev alır. 77 2.3. Ġnflamatuvar Merdiyatörler ve Neonatal Beyin Hasarı Hipoksik-iskemik beyin hasarı, hipoksi-iskemi anında baģlayıp resusitasyon ardından iyileģme döneminde devam eden bir süreçtir. Akut dönemde selektif nöronal nekroz veya infarkt Ģeklinde gözlenen doku hasarı, nöron, glia ve endotel hücre yapısının bozulması ile devam eder. Ġnfarkt alanına en yakın bölgede yer alan nöronlarda nekroz ya da programlanmıģ hücre ölümü yani apopitozis geliģir. 11 Özellikle prematüre bebeklerde son yıllarda yapılan epidemiyolojik ve deneysel çalıģmalarda inflamasyon, periventriküler lökomalazi ve serebral palsi arasında yakın iliģki olduğu görülmüģtür. 3 Nekroz geliģmiģ hücrelerde hasarın önüne geçilmesi söz konusu değildir. Ancak infarkt etrafında devam eden hasar sürecinin önüne geçilmesi bu dönemde meydana gelen biyokimyasal olayların iyi bilinmesi ile mümkün olabilir. 35

Hasar sürecinin devam ettiği reperfüzyon-reoksijenasyon döneminde küçük damar endotel hücrelerinde serbest radikallerin üretimine neden olan siklooksijenaz ve ksantin oksidazın aktive olduğu iki önemli yol tetiklenir. Açığa çıkan serbest radikaller lökosit, platelet ve endotel hücrelerindeki adezyon moleküllerini aktive ederek lökositlerin adezyonu ve ekstravazasyonunu sağlar. Kan beyin bariyerinin bozulmasıyla serbest radikaller parankim içine boģalarak hasarın yayılmasına neden olur. 86 Neonatal beyin hasarının erken döneminde gözlenen nötrofil akümülasyonu ile hasarın derecesi arasında yakın iliģki olduğuna inanılmaktadır. Ayrıca serebral iskemide santral sinir sisteminde inflamatuvar mediyatörlerin açığa çıktığı bilinmektedir. EriĢkin ve immatür kemirgen hayvanlarda hipoksi iskemi sonrasında beyinde IL-1 ve TNF- gibi sitokinlerin açığa çıktığı gösterilmiģtir. 87 2.3.1. Prostaglandin ve Hipoksik-iskemik Beyin Hasarı Ġskemik zedelenme beyin dokusunda fosfolipaz A2 uyarısı doğurur. Bu enzimlerin uyarılması beyinde büyük miktarda serbest yağ asidi salınımı ile sonuçlanır. 77 Serbest yağ asidi oluģumu, ATP nin tükenmesi ve iyon hemostazındaki değiģiklilkler membren fonksiyon bozukluğu ve hücresel hasara neden olur. 77 Ayrıca iskemik zedelenmeden sonra sitoplazmik fosfolipaz A 2 mrna gen ekpresyonunda artıģ meydana gelir. 88 Sitoplazmik fosfolipaz A 2 nin nöronal hasar ile iliģikisi güçlü bir biçimde ortaya konmuģtur. 89 Orta serebral arterin bağlanmasından sonra sitoplazmik fosfolipaz A 2 genetik olarak olmayan farelerde daha az nöronal hasar, daha az infarkt ve beyin ödemi oluģtuğu gösterilmiģtir. Yine bu grup farelerde prostaglandin ve lökotrien üretiminin önemli ölçüde azalmıģtır. 90 Hipoksi iskemiden sonra sitozolik Ca ++ konsantrasyonu artar. Artan sitozolik fosfolipaz A 2 yi aktive eder ve serbest yağ asitleri ve araģidonik asit üretimine neden olur. AraĢidonik asit metabolizasyonu sonrası serbest oksijen radikallerinin üretimi ile sonuçlanır. HĠE geliģen yenidoğan bebeklerde HĠE nin ağırlığı ile BOS ta ölçülen prostanoidlerin konsantrasyonu arasında iliģki olduğu bildirilmiģtir. 6,91 Ġndometazin uygulaması PGD2 nin yükselmesini ve hasarlı bölgenin alanını azaltmıģtır. PGD2 sentezinin inhibisyonu bu etkileri reseptör aracılı mekanizmalar ile 36

iliģkili olabileceği gibi sikjlooksijenazın katalize ettiği ve serbest radikallerin üretimine neden olan yolak gecikmiģ nöronal ölüme neden olabilir. Yine prostanoide bağlı beyin hasarı glutamat toksistesi ile iliģkili olabilir. 6 Ġskemiyi takiben doku hasarı ve apopitozis meydana gelir. Hipoksi-iskemiden sonra siklooksijenaz 2 nin upregülasyonu ve PGE2 düzeyinin arttığı bildirilmiģtir. 93 Bir çalıģmada PGE2 nin uyardığı apopitozis kaspaz-3 bağımlı olduğu ve kaspaz inhibitörleri PGE2 nin uyardığı apopitozisi önlediği gösterilmiģtir. Bu olayda kapsaz-8 ve kaspaz-7 de olaya karıģmıģ olabileceği ileri ileri sürülmüģtür. 94 Iedocala ve arkadaģları 95 genetik olarak COX-2 negatif ratlarda iskemiye olan yatkınlığın azaldığını göstermiģtir. Bu veriler PGE2 nin gecikmiģ nöronal ölümde rol aldığını göstermektedir. COX-2 aktivasyonu ile bazı prostanoidler üretilir ve bu durum doğrudan nöronal ölüm ile iliģkili olabilir. 96 Ayrıca PGE 2 sitokin üretimini arttırarak nörotoksisiteye katkıda bulunabilir veya glutamat toksisitesini arttırabilir. 97 NS-398 uygulaması glutamat toksisitesine bağlı nöronal hasardan korur. Belki de hücre içi Ca ++ hemostazını sağlayarak bunu gerçekleģtirir. 98 COX inhibitörlerinin verilmesinin deney hayvanlarında geçici ön beyin iskemisinden sonra gecikmiģ hipokampal CA1 nöronal ölümü azalttığını göstermiģitir. 99 Ayrıca nonselektif COX inihibisyonunun iskemik infarkt alanını küçülttüğünü göstermiģtir. 100. Öte yandan kortikal hücre kültürlerinde NMDA reseptör aracılı nörotoksistenin patogenezinde COX-2 nin katkısının olduğu ve nöronal hücre hasarında COX-2 mrna eksprsyonu ve aktivitesini takiben nörotoksik NMDA konsantrasyonu arttığı ileri sürülmüģtür. Nonselektif COX enzim blokajı prostaglandinlerin uyardığı NMDA yı azaltır. Bu etki sadece COX-2 inhibisyonu ile meydana gelir COX-1 inhibisyonun böyle bir etkisi yoktur. Yine COX-2 inhibisyonu ile yalnızca NMDA aracılı nöroprotektif etki meydana gelir. 98 37

3. GEREÇ ve YÖNTEM Perinatal hipoksik-iskemik beyin hasarının patogenezinin anlaģılması ve yeni tedavi yaklaģımlarının belirlenmesi amacıyla yıllardan beri immatür rat modelleri kullanılmaktadır. 101-103 Yedi günlük ratların tercih edilmesinin nedeni bunların beyinlerinin geliģim düzeyinin histolojik olarak 32-34 haftalık insan fetusları ile olan benzerliğidir. Yedi günlük ratlarda serebral kortikal nöron tabakası geliģimini tamamlamıģ, germinal matriks involüsyona uğramıģ ve beyaz cevher henüz miyelinize olmaya baģlamıģtır. Postnatal 12-13 günlük ratların beyinleri ise fulterm yenidoğanlarınkine benzemektedir. Ġmmatür ratlarda hipoksi-iskemi oluģturmak amacıyla tek taraflı karotis arter ligasyonu ardından % 8 oksijen, % 92 nitrojen karıģımının inhalasyonu Ģeklinde uygulanan Levin in rat modeli kullanılmaktadır. 80 Bu çalıģma, hipoksi-iskemi modeli oluģturulan 7 günlük Winstar-albino ratlar üzerinde yapıldı. ÇalıĢmaya alınan ratlar Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Deneyler AraĢtırma ve Uygulama Merkezinde üretime alınan 10 ayrı rat çiftinin bulunduğu kafeslerden seçildi. Aynı merkezde oluģturulan etik kurul tarafından çalıģmanın etik onayı alındı. Ratların bulunduğu ortamda 12 saat gündüz, 12 saat gece ortamı sağlandı. 0da sıcaklığı sürekli olarak 21-23 0 C ve nemi % 40-60 arasında tutuldu. Üretime alınan eriģkin ratlar Adana TavaĢ yem fabrikasından temin edilen standart rat yemi ile beslendi. ÇalıĢmaya ağırlıkları ve cinsiyetleri arasında fark olmayan üç tedavi, bir hipoksi iskemi grubu ve bir kontrol olmak üzere toplam beģ grup rat alındı. Ġlk doğdukları günden itibaren annelerinin yanında bulunan ve anne sütü ile beslenen rat yavruları 7 günlük olduklarında çalıģmaya alındı. Her bir ratın hangi gruba alınacağı randomize seçimle belirlendi. Grup 1, hipoksi ve iskemi iģlemi uygulanmayan ancak sadece cilt kesisi yapılan ve tek doz 2 ml /kg % 0,9 NaCl (serum fizyolojik=sf) verilen shame grubu (n=15). Grup 2, hipoksi iskemi grubu hipoksi iskemi iģlemi yapılan ve 2 ml/kg % 0,9 NaCl (serum fizyolojik: SF) (n: 15), Grup 3, hipoksi iskemi iģleminden 30 dakika öncesinde tek doz 2 mg/kg/doz indometazin verilen grup (n: 15). Grup 4, hipoksi iskemi iģlemi sonrası 2 mg/kg/doz indometazin tedavisi verilen grup (n: 15, Grup 5, hipoksi iskemi iģlemi sonrası 4 mg/kg/doz indometazin tedavisi verilen grup (n: 15) olarak belirlendi. ÇalıĢmaya alınan rat yavrularının iģlem öncesi ağırlıkları ve cinsiyetleri kaydedildi. Eter anestezisi altında boyun ortasından, trakeanın hemen solundan 38

uygulanan 0,5 cm lik kesi ile sol arteria karotis kommunis bulundu. 4/0 ipek sutur materyali ile arter iki tarafından bağlanılarak ortası kesildi. Cilt aynı sutur materyali ile kapatıldıktan sonra 1-2 saat süreyle anestezi etkisi geçene kadar annelerinin yanına verilen ratlar beģerli gruplar halinde % 8 oksijen, % 92 nitrojen içeren transparan fiberglastan yapılmıģ, çevre ısısı ıģık kaynağı yardımıyla 33 o C ye ayarlanan bir kafeste 2,5 saat bekletildi. Ortamdaki oksijen konsantrasyonu oksijen monitörü (ohmeda 5120 seri numarası: FABQ0104 USA) ile sürekli ölçülerek %8 oksijen içeren hipoksik ortam 2,5 saat süreyle korundu. Bu iģlemin ardından yarım saat oda havasında iyileģmeye bırakılan ratlar deney sonuna kadar kalmak üzere annelerinin yanına verildi. Ġlaçlar ve SF; intraperitoneal yoldan 50 lt içerisinde, insülin enjektörleri ile uygulandı. Grup 1 de (Shame grubu) tek doz 2 ml/kg % 0,9 NaCl uygulandı. Grup 2 de (Hipoksik iskemik grup) 2 ml /kg % 0,9 NaCl hipoksi-iskemi iģlemi bittikten yarım saat sonra baģlanıp 12 saat aralıklarla toplam 3 doz verildi. Ġndometazin (Confortid R flakon 50 mg Alpharma-ISIS Germany) verilen grup 3 de indometazin 2 mg/kg dozda hipoksiiskemi iģleminden yarım saat önce tek doz verildi. Grup 4 te indometazin 2 mg/kg dozda hipoksi-iskemi iģlemi bittikten yarım saat sonra baģlanıp 12 saat aralıklarla toplam 3 doz verildi. Grup 5 de indometazin 4 mg/kg dozda hipoksi-iskemi iģlemi bittikten yarım saat sonra baģlanıp 12 saat aralıklarla toplam 3 doz verildi. Üç günün sonunda 10 günlükken deney ve kotrol grubunda yer alan ratlar derin anestezi altında intrakardiyak formaldehit perfüzyonu ardından dekapite edildi. Organ perfüzyonu öncesi her bir deney hayvanına 50 mg/kg intraperitoneal yoldan pentotal verildi. Derin anestezi sağlandıktan sonra toraks açıldı, sol ventrikülden girilip sağ atriumdan drene olacak Ģekilde 1 dk süreyle SF perfüzyonunun ardından % 10 formaldehit içeren solüsyon ile 5 dk süreyle organ perfüzyonu sağlandı. Bu iģlemin ardından kraniyum açılarak beyin dokusu çıkarıldı ve % 10 formaldehit içinde patolojik inceleme yapılacağı güne kadar bekletildi. Beyinlerden, 10 günlük rat atlası kaynak alınarak hipokampal bölgeyi tam olarak temsil eden koronal kesitler örneklendi (82). Her bir kesitte iskemik hasar oluģması beklenen sol hemisferin lokalizasyonunu belirlemek için çentik ile iģaret konuldu. % 10 Formaldehitle tespit edilen kesit örneklerinden parafin bloklar hazırlandı. Hazırlanan parafin bloklardan 5 kalınlığında kesitler alınıp, Histokimyasal inceleme için S7100 39

ApopTag Peroxidase ile iģleme tabi tutuldu. IĢık mikroskobunda değerlendirilip, her bir grupta apopitotik hücreler sayılarak kaydedildi. 3.1.Histokimyasal Olarak S7100 ApopTag Peroxidase Uygulanması 3.1.1.Dokuların Hazırlanması Parafin bloklardan, lam üzerine 5 kalınlığında kesitler alındı. a. Her kesit 5 dakika süre ile 3 kez XYLENE içinde yıkandı. b. Her kesit 5 dakika süre ile 2 kez ABSOLUTE ETHANOL içinde yıkandı. c. Her kesit önce %95 ETHANOL i.çinde tekrar yıkanır yıkanmaz % 70 lik ETHANOL içinde 3 dakika süre ile yıkandı. d. Her kesit deparafinize edilip alkolden geçirildikten sonra fosfat tamponlu salinde (PBS, ph 7,4) 5 dakika süre ile yıkandı. Her kesitin çevresi kurutulduktan sonra, kesitler nemli ortama konuldu. Bu evreden baģlayarak her basamakta kurutma iģlemi tekrarlandı. 3.1.2 Endojen peroksidazların giderilmesi a. Her kesitin üzerini tamamen kaplayacak Ģekilde 2-3 damla Peroksidase Blocking Reagent (% 3 lük H 2 O 2 ) damlatılarak 5 dakika oda sıcaklığında bekletildi. b. Ġlk durulama için kesitler dikey olarak lavabo içine doğru silkelendi. Sıkılabilir bir ĢiĢe ile PBS nin kesit üzerine akması sağlandı. c. Kesitler 2 dakika süre ile 2 kez deiyonize su ile yıkandı. 3.1.3 Dokuların hazırlanması a. Kesitler proteinaz K ile 15 dakiaka süre ile oda ısısnda iģleme tabi tutuldu (60-150 μl/5 cm 2 ). b.. Ġlk durulama için kesitler dikey olarak lavabo içine doğru silkelendi. Sıkılabilir bir ĢiĢe ile PBS nin akması sağlandı c. Kesitler 2 dakika süre ile 2 kez deiyonize su ile yıkandı. 3.1.4 Denge Tamponun uygulanması (EQUILIBRATION BUFFER) a. Nazikçe fazla sıvı preparat üzerinden alındı. b. Hemen EQUILIBRATION BUFFER (60 μl/5 cm 2, #S7100) doğrudan kesit üzerine uygulandı. 10 saniye süreile oda ısısında inkübe edildi. 40

c. Kesitler 10 16 saat süre ile 16 22 C de nemli bir ortam içerisinde inkübe edildi. 3.1.5 Working Strength Ligase Enziminin uyglanması a. Nazikçe fazla sıvı preparat üzerinden alındı. b. Bir pipet yarımıyla kesitler üzerine hemen Working Strength Ligase Enzimi (60 μl/5 cm) uygulandı. 3.1.6 Yıkama a. Kesitler dikey olarak lavabo içine doğru silkelendi. Sıkılabilir bir ĢiĢe ile PBS nin kesit üzerine akması sağlandı. b. Kesitler 10 dakika süre ile 2 kez deiyonize su ile yıkandı. 3.1.7 Streptavidin-Peroxidase Conjugate uygulaması a. Hemen bir pipetle kesit üzerine STREPTAVIDIN-PEROXIDASE (50 60 μl/5 cm2 of S7200 5) uygulandı. b. Nemli bir ortam içerisinde 30 dakika süre ile inkübe edildi. 3.1.8 PBS içerisinde yıkama a. Kesitler dikey olarak lavabo içine doğru silkelendi. Sıkılabilir bir ĢiĢe ile PBS nin kesit üzerine akması sağlandı. b. Oda ısısında 5 dakika süreyle 3 kez PBS değiģtirilerek yıkandı. 3.1.9 Peroxidase Substratında renk geliģimi a. Kesitin üzerindeki fazla sıvı nazikçe alındı. b. Yeterli miktardaki PEROXIDASE SUBSTRATE (75 μl/5 cm2) kestin üzerini örterecek Ģekilde uygulandı. c. Oda ısısında 3-6 dakika koyulaģaması için beklendi. d. Optimal koyulaģmayı bulmak için ıģık mikroskobu altında bakıldı. 3.1.10 Kesitlerin yıkanması a. Kesitler distile su ile 3 kez 1 dakika süre ie yıkandı. b. kesitle oda ısısnda 5 dakika süreyle distile su içinde inkübe edildi. 41

3.1.11 Ġkinci kez örneklerim koyulaģtırılması a. Oda ısısında 10 süre ile %0.5 methyl green uygulandı. b. Kesitler 3 kez distle su ile yıkandı. c. Kesitler % 100N-BUTANOL içine 3 kez 30 saniye süre ile daldırıldı. 3.1.12. Örnekleri mikroskop altında incelemeye hazırlama a. Örnekleri dehidrate etmek için 3 XYLENE li kavanozda ikiģer dakika süreyle örnekler bekletildi. b. Örnekler üzerindeki sıvı nazikçe alındı. c. Lam üzerine lamel kapatıldı. 3.1.13. Mikroskop altında inceleme a.örnekler ıģık mikroskopualtında incelenmeye alındı. 3.2. Histopatolojik değerlendirme Rat beyinleri %10 luk formaldehitde tespit edildikden sonra, hipokampus seviyesinden geçen bir dilim ile örneklendi. Bu dilimden parafin bloklar hazırlanarak seri kesitler yapıldı. Hazırlanan toplam 60 histolojik kesit Histokimyasal Olarak S7100 ApopTag Peroxidase ile iģleme tabi tutularak ıģık mikroskobunda değerlendirildi. Apopitotik hücre sayımı bilateral hipokampus CA1 bölgesi ve parietal kortekste yapıldı. 10 X 40 güçteki ıģık mikroskobunda patolog tarafından hücre sayımı 5 alanda sayılarak kaydedildi ve Nicon E500 fotograf makinesi ile görüntülendi (Resim 1,2,3,4). 3.3. Ġstatistiksel Değerlendirme Tedavi ve kontrol grubunda yer alan ratların özellikleri ve sonuçlar hazır istatistik programı SPSS version 11.0 ile değerlendirildi. Sonuçların değerlendirilmesinde Mann Whitney U testi ve ki-kare analiz yöntemleri kullanıldı. Kontrol ile tedavi grupları arasında yapılan ikili karģılaģtırmalarda; genel hata oranı = 0,05 te tutulabilmesi için her bir karģılaģtırmada önemlilik seviyesi /k olarak alındı (k=karģılaģtırma sayısı). P değeri 0.05 den küçük bulunduğunda anlamlı farklılık olduğu kabul edildi. 42

4. BULGULAR Serum fizyolojik verilen shame grubuna (Grup 1) ağırlıkları 9,8 13 gr arasında değiģen, ortalama 10,3 1,21 gr ağırlığında sekiz i erkek 15 rat alındı. Hipoksi iskemi iģlemi uygulanan ve serum fizyolojik verilen hipoksik iskemik grubuna (Grup 2) ağırlıkları 9,1 13,5 gr arasında değiģen, ortalama 10,8 1,1 gr ağırlığında yedi si erkek 15 rat alındı. Hipoksi iskemi iģlemi öncesi indometazin verilen tedavi grubuna (Grup 3) ağırlıkları 10,0 13,1 gr arasında değiģen, ortalama 10,3 0,7 gr ağırlığında dokuz u erkek 18 rat alındı. Hipoksi-iskemi iģlemi sonrası 2 mg/kg indometazin verilen tedavi grubuna (Grup 4) ağırlıkları 9,3 15,3 gr arasında değiģen, ortalama 10,6 1,9 gr ağırlığında sekiz i erkek 15 rat alındı. Son grup hipoksi- iskemi sonrası 4 mg/kg indometazin verilen tedavi grubuna (Grup 5) ağırlıkları 8,9 13,9 gr arasında değiģen, ortalama 10,5 1,3 gr ağırlığında yedi si erkek 15 rat alındı. Tablo-9 da gruplara göre cinsiyet ve ağırlıkların dağılımı gösterildi. Gruplar arasında ağırlık ve cinsiyet bakımından istatistiksel farklılık yoktu (p>0,005). Tablo 9. Gruplara göre cinsiyet ve ağırlıkların dağılımı Grup Cinsiyet Ağırlık (gr) Ortalama SS (alt sınır-üst sınır) 1 (Sham) n=15 7 diģi, 8 erkek 10,3 1,21 (9,8 13,0) 2 (Hipoksik-iskemik) n:15 8 diģi, 7 erkek 10,8 1,1 (9,1 13,5) 3 (Hipoksi iskemi öncesi 2 mg/kg n:15 10,3 0,7 indometazin) 8 diģi, 7 erkek (10,0 13,1) 4 (Hipoksi iskemi sonrası 2 mg/kg indometazin) n:15 7 diģi, 8 erkek 10,6 1,9 (9,3 15,3) 5 (Hipoksi iskemi sonrası 4 mg/kg indometazin) n:15 8 diģi, 7 erkek 10,5 1,3 (8,9 13,9) 43

Gruplar arasında cinsiyet ve ağırlık ortalamaları arasında istatistiksel olarak fark saptanmadı. Hipoksik-iskemiden sonraki 72. saatte TUNEL positif hücre sayısı grup 2 de 22.00±5.28 iken, sham grubunda 3,86±1,09 idi (p<0.001). Hem H-I öncesi hem de H-I sonrası 2mg indometazin tedavisi ile apopitotik hücre sayısı yaklaģık yarı yarıya azaldı (sırasıyla 9,83±1,23, 9,50±0,73, p<0,001 ve p<0,001). H-I sonrası 4 mg/kg indometazin tedavisi ile TUNEL pozitif hücre sayısını (6,30±1,12) neredeyse sham grubundaki apopitotik hücre sayısına yakın bir düzeye azalttı ve sham grubu apoptotik hücre sayısı ile karģılaģtırıldığında aralarında anlamlı istatistiksel farklılık yoktu (p>0,05). Tedavi grupları içerisinde en iyi nöroprotektif etkiyi H-I sonrası 4mg/kg indometazin gösterdi. Yine H-I sonrası 2 mg/kg indometazin tedavisi gibi H-I öncesi tek 2 mg/kg indometazin tedavisi de oldukça baģarılı biçimde nöroprotektif etki gösterdi. Tablo 10. Gruplara göre apopitotik hücre dağılımı Gruplar TUNEL pozitiv boyanan apopitotik hücre sayıları Ortalama ± SS (alt-üst sınır) Sağ hemisfer Sol hemisfer p 1 (Sham) 3,90±1,10 3,53 1,06 >0,05 (n: 15) (2 5) (2 5) 2 (Hipoksik-iskemik) 12,40±1,58 a 31,46 0,97 a <0,01 (n: 15) (11 14) (13 47) 3 (Hipoksi-iskemi öncesi 2 mg/kg 8,26±1,03 a 11,33 1,58 a <0,05 indometazin) (n: 15) (6 10) (10 14) 4 (Hipoksi-iskemi sonrası 2mg/kg 7,93±0,79 a 11,00 0,65 a <0,05 indometazin) (n: 15) (6 10) (10 12) 5 (Hipoksi-iskemi sonrası 4mg/kg indometazin) (n:15) 5,86±0,91 (5 7) 6,60 1,40 (5 8) >0,05 a Grup 2, 3, 4 te sağ ve sol hemisferler arasında TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücre sayıları arasında istatisitiksel farklılık saptandı. görülmektedir Gruplarda TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücreler Ģekil 5-9 da 44

ġekil 5. Sham grubunda az sayıda TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücreler (10x40). ġekil 6. Hipoksik-iskemik hasar oluģturulan grupta artan sayıda TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücreler (10x40). 45

ġekil 7. Hipoksik-iskemik hasar öncesi 2mg/kg indometazin uygulanan grupta TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücreler (10x40). ġekil 8. Hipoksik-iskemik hasar sonrası 2mg/kg indometazin verilen grupta daha az sayıda TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücreler (10x40). 46

ġekil 9. Hipoksik-iskemik hasar sonrası 4mg/kg indometazin uygulanan grupta belirgin olarak azalan TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücreler (10x40). Indometazinin beyin hemisferlerinde hipoksi ve hipoksik-iskemi üzerine etkileri değerlendirildiğinde; sham ve H-I sonrası 4mg/kg indometazin tedavi grubu hariç tüm gruplarda sol hemisferlerdeki apopitotik hücre sayısı sağ hemisferdeki hücrelerden istatistiksel olarak anlamlı ölçüde daha yüksekti (p<0,05), (Tablo 10). Sol hemisferlerde; H-I öncesi ve sonrası 2 mg/kg indometazin tedavileri apopitotik hücre sayısını 3 kat azaltırken (p<0,01), H-I sonrası 4 mg/kg indometazin tedavisi ise apopitotik hücre sayısı H-I grup ile karģılaģtırıldığında yaklaģık 5 kat azalttı (p<0,001). 47