ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Mehmet KENAR AROMATİK BİTKİLERDEN ELDE EDİLEN DOĞAL ANTİOKSİDANLARIN BALIK FİLETOSU ÜZERİNDEKİ DUYUSAL, KİMYASAL VE MİKROBİYOLOJİK ETKİLERİNİN İNCELENMESİ SU ÜRÜNLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ AROMATİK BİTKİLERDEN ELDE EDİLEN DOĞAL ANTİOKSİDANLARIN BALIK FİLETOSU ÜZERİNDEKİ DUYUSAL,KİMYASAL VE MİKROBİYOLOJİK ETKİLERİNIN İNCELENMESİ Mehmet KENAR YÜKSEK LİSANS TEZİ SU ÜRÜNLERİ ANABİLİM DALI Bu tez.../.../... Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza... İmza...... İmza.... Doç.Dr. Fatih ÖZOĞUL Prof. Dr. Abdurrahman POLAT Doç. Dr. Özkan ÖZDEN DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüzün Su Ürünleri Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No Prof. Dr Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No:SÜF-2009-YL1 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

Bu tezi sevgili annem ve babama ithaf ediyorum.

ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ AROMATİK BİTKİLERDEN ELDE EDİLEN DOĞAL ANTİOKSİDANLARIN BALIK FİLETOSU ÜZERİNDEKİ DUYUSAL, KİMYASAL VE MİKROBİYOLOJİK ETKİLERİNIN İNCELENMESİ Mehmet KENAR ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SU ÜRÜNLERİ ANABİLİM DALI Danışman : Doç.Dr. Fatih ÖZOĞUL Yıl : 2009, Sayfa:80 Jüri : Doç.Dr. Fatih ÖZOĞUL Prof.Dr. Abdurrahman POLAT Doç.Dr. Özkan ÖZDEN Bu çalışmada, biberiye (Rosmarinus officinalis) ve adaçayı (Salvia officinalis) bitkilerinden solvent ekstraksiyon yöntemi ile doğal antioksidan elde edilmiştir. Elde edilen bu doğal antioksidanların vakum paketlenen sardalya (Sardina pilchardus) filetolarının (4 C) duyusal, kimyasal (TVB-N, TBA, PV, FFA, yağ asitleri) ve mikrobiyolojik (TMBS ve koliform bakteri sayımı) kalitesi üzerine etkisi araştırılmıştır. Biberiye uçucu yağının ana bileşenleri %5.40 β-pinene, %68.83 1,8- cineol, %4.70 camphor,%5.28 borneol ve % 5.02 α-terpineol olarak tespit edilirken, adaçayında %77.56 1,8- cineol, %9.60 camphor, %3.46 borneol bulunmuştur. Duyusal verilere göre, 4 o C de depolanan sardalya filetosunun raf ömrü kontrol grubunda 13 gün, biberiye ve adaçayı ile muamele edilen gruplarda ise 20 gün olarak bulunmuştur. TVB-N değerleri depolama sonunda (20. gün), kontrol, biberiye ve adaçayı ile muamele edilen gruplarda sırasıyla 45.05, 29.26 ve 31.04 mg/100g olarak bulunmuştur. TBA değerleri ise depolama sonunda kontrol, biberiye ve adaçayı ile muamele edilmiş grublarda sırasıyla 0.98,0.66,1.14 mg malonaldehit/kg olarak belirlenmiştir. Depolama süresince peroksit değerlerinde artışlar gözlenmiş olup, bütün gruplar arasında önemli bir farklılık gözlenmemiştir (P>0.05). FFA değeri depolama boyunca bütün gruplarda artmış olup, kontrol grubuna kıyasla biberiye ve adaçayı muameleli gruplarda daha düşük FFA değeri bulunmuştur. Yağ asitleri bakımından depolama boyunca istatistiksel farklılıklar görülmüştür (P<0.05). Mikrobiyolojik sonuçlara göre, depolama süresince biberiye ve adaçayının balık eti üzerinde antibakteriyel etki gösterdiği bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: Sardalya, Biberiye, Adaçayı, Antioksidan, 1,8-Cineol. I

ABSTRACT MSc THESIS INVESTIGATION OF SENSORY, CHEMICAL AND MICROBIOLOGICAL EFFECTS OF NATURAL ANTIOXIDANT OBTAINED FROM AROMATIC PLANTS ON FISH FILLETS Mehmet KENAR DEPARTMENT OF FISHERIES INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor: Associate Prof.Dr. Fatih ÖZOĞUL Year : 2009, Pages: 80 Jury : Associate Prof.Dr. Fatih ÖZOĞUL Prof. Dr. Abdurrahman POLAT Associate Prof.Dr. Özkan ÖZDEN In this study, natural antioxidants from rosemary (Rosmarinus officinalis) and sage tea (Salvia officinalis) were produced using solvent extraction method. The effect of the natural antioxidant on sensory, chemical (TVB-N, TBA, PV, FFA, fatty acids) and microbiological (TVC and total coliform count) changes of vacuum packaged sardine (Sardina pilchardus) fillets stored at 4 o C were investigated. The main constituents of rosemary were 5.4% β-pinene, 68.83% 1,8- cineol, 4.7% camphor, 5.28% borneol and 5.02% α-terpineol, while sage tea was found to have 77.56% 1,8- cineol, 9.6% camphor, 3.46% borneol. According to sensory assessment results, the shelf life of sardine fillets stored at 4 o C was found as 13 days for control, 20 days for rosemary and sage tea treated samples. At 20 days of storage periods, TVB-N values for control, rosemary and sage tea groups reached 45.05 mg/100g, 29.26 mg/100g and 31.04, respectively. TBA values at the end of storage period were 0.98, 0.66, 1.44 mg malonaldehite/kg for control, rosemary and sage tea grups, respectively. Peroxide values increased throught the storage time and showed insignificant differences (P>0.05) amoung three groups. FFA values in three groups increased with storage time, and the values of FFA in rosemary and sage tea groups were lower than control groups. Statistical differences were observed among fatty acids during the storage period (P<0.05). According to microbiological results, antibacterial activity of rosemary and sage tea was found in fish fillets during storage periods. Key Words: Sardine, Rosemary, Sage tea, Antioxidant, 1-8 Cineol II

TEŞEKKÜR Tez çalışmamın her aşamasında bana hoş görü ve bilgisi ile ışık tutan değerli danışman hocam Sayın Doç Dr. Fatih ÖZOĞUL a, çalışmalarımda yardımlarını esirgemeyen Sayın Doç Dr. Yeşim ÖZOĞUL ve Arş.Gör. Esmeray Küley BOĞA a Çalışmam sırasında yardımlarını esirgemeyen Su Ürünleri Mühendisi Esra BALIKÇI, Mustafa DURMUŞ ve İlknur UÇAK a Tezin yürütülmesi sırasındaki aşamalarda yardımlarını esirgemeyen Çukurova Üniversitesi Su ürünleri Fakültesi İşleme Anabilim Dalı öğretim üyelerine, Materyal temininde yardımcı olan Arş. Gör. Deniz AYAS ve Robin Kozmetiğin sahibi Sayın Suat KANBER e Üniversite eğitimim boyunca maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen Biyoloji öğretmenim Sayın Serpil DEMİRSOY a, Tez çalışmam sırasında manevi desteğini esirgemeyen değerli arkadaşım Kimyager Sinem ABUT a Maddi ve manevi destekleriyle bana her zaman yardımcı olan babam Ahmet KENAR ve annem Mürüvet KENAR a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. III

İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ. I ABSTRACT.. II TEŞEKKÜR.. III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VII ŞEKİLLER DİZİNİ... VIII KISALTMALAR DİZİNİ IX 1.GİRİŞ. 1 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 4 2.1. Antioksidanlar 4 2.1.1. Antioksidan Mekanizması... 4 2.1.2. Sentetik Antioksidanlara Karşı Doğal Antioksidanlar 6 2.1.3. Doğal Antioksidan Kaynağı Olan Bitkiler 6 2.1.4. Antioksidan Olarak Biberiye ve Adaçayı... 11 2.1.4.1. Biberiye (Rosmarinus officinalis L.).. 11 2.1.4.2. Adaçayı (Salvia officinalis) 13 2.1.5. Su Ürünlerinde Doğal Antioksidanların Kullanımı 16 2.1.6. Yapılan Diğer Çalışmalar.. 18 3. MATERYAL VE METOT... 20 3.1. Materyal. 20 3.1.1 Aromatik Bitkiler... 20 3.1.2. Balık (sardalya). 20 3.2. Metotlar.. 21 3.2.1. Su Buharı Distilasyonu 21 3.2.2. GC-MS Analizi.. 22 3.2.3. Doğal Antioksidan Ekstraksiyonu... 23 3.2.4. Balığa Antioksidan Uygulanması ve Depolama Koşulları 23 3.2.5. Besin Değerleri Analizleri... 24 IV

3.2.5.1. Toplam Ham Protein Analizi 24 3.2.5.2. Lipit Analizi.. 25 3.2.5.3. Ham Kül Analizi... 25 3.2.5.4. Nem Analizi.. 26 3.2.5.5. Yağ Asitleri Tayini 26 3.2.6. Kimyasal Kalite Analizleri 28 3.2.6.1. Toplam Uçucu Bazik Azot (TVB-N) Tayini. 28 3.2.6.2. Tiyobarbitürik Asit (TBA) Sayısı Tayini... 28 3.2.6.3. Peroksit Sayısı 29 3.2.6.4. Serbest Yağ Asitleri Analizi.. 29 3.2.7. Duyusal Analiz... 30 3.2.7.1. Çiğ Sardalya Filetosundaki Duyusal Analiz.. 30 3.2.7.2. Pişmiş Sardalya Filetosundaki Duyusal Analiz. 32 3.2.8. Mikrobiyolojik Analizler... 33 3.2.8.1. Toplam Mezofilik Bakteri Sayımı (TMBS)... 33 3.2.8.2. Toplam Koliform Sayımı... 33 3.2.9 İstatistik Analizler... 33 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA... 34 4.1. Uçucu Yağ Verimi. 34 4.2. Uçucu Yağ Bileşenlerinin Analizi. 34 4.3. Besin Değerleri... 39 4.3.1.Yağ Asitleri... 40 4.4. Duyusal Analiz. 51 4.4.1. Çiğ Sardalya Filetosunun Duyusal Bulguları 51 4.4.2. Pişmiş Sardalya Filetosunun Duyusal Bulguları... 52 4.5. Kimyasal Analizler 54 4.5.1. Toplam Uçucu Bazik Azot (TVB-N) Bulguları. 54 4.5.2. Tiyobarbitürik Asit (TBA) Sayısı Bulguları.. 56 4.5.3. Peroksit Sayısı Bulguları 57 4.5.4. Serbest Yağ Asitleri Bulguları... 59 4.6. Mikrobiyolojik Analizler... 60 V

4.6.1. Toplam Mezofilik Bakteri Sayımı (TMBS)... 60 4.6.2. Toplam Koliform Sayımı... 62 5. SONUÇ VE ÖNERİLER.. 64 KAYNAKLAR. 67 ÖZGEÇMİŞ.. 80 VI

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 2.1. Antioksidan aktivite mekanizması... 5 Çizelge 3.1. Gaz Kromotografisi-Kütle spektrometre Koşulları 22 Çizelge 3.2. Gaz Kromotografisi Koşulları 27 Çizelge 3.3. Modifiye edilmiş çiğ sardalya filetosu için kullanılan kalite değişimleri değerlendirme şeması.. 31 Çizelge 3.4. Pişmiş sardalya filetosu için kullanılan hedonoik skala... 32 Çizelge 4.1.Biberiye (Rosmarinus officinalis L.) uçucu yağı kompozisyonu 34 Çizelge 4.2. Adaçayı (Salvia officinalis L.) uçucu yağı kompozisyonu... 37 Çizelge 4.3. Sardalya (Sardina pilchardus) filetosunun besin değerleri.. 39 Çizelge 4.4. Kontrol grubu yağ asiti profili değişimi... 44 Çizelge 4.5. Biberiye grubu yağ asiti profili değişimi.. 46 Çizelge 4.6. Adaçayı grubu yağ asiti profili değişimi.. 48 Çizelge 4.7. 4 ºC de depolanan sardalya filetosunun çiğ olarak duyusal kalitesinin değişimi.. 51 Çizelge 4.8. 4ºC de depolanan sardalya filetosunun pişmiş olarak duyusal kalitesinin değişimi 52 Çizelge 4.9. 4ºC de depolanan sardalya filetosunun TVB-N değerlerindeki değişimleri 54 Çizelge 4.10. TVB-N kalite değerleri.. 54 Çizelge 4.11. 4ºC de depolanan sardalya filetosunun TBA değerlerindeki değişimi 56 Çizelge 4.12. Peroksit sayısının kalite sınıflandırılması... 58 Çizelge 4.13. 4ºC de depolanan sardalya filetosunun Peroksit sayısı değerlerindeki değişimler 58 Çizelge 4.14. 4ºC depolanan sardalya filetosunun FFA değerlerindeki değişimler 59 Çizelge 4.15. 4 ºC de depolanan sardalya filetosunda TMBS değişimi 61 VII

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 2.1. Gıdalarda kullanılan sentetik fenolik antioksidanların kimyasal yapıları 7 Şekil 2.2. Tokoferol ve tokotrienol izomerlerinin kimyasal yapısı... 8 Şekil 2.3. Dört temel flavonoid grubunun moleküler yapısı 9 Şekil 2.4. Yaygın olarak bilinen fenolik asitlerin kimyasal yapıları... 10 Şekil 2.5. Biberiye (Rosmarinus officinalis L.) nin görünümü... 11 Şekil 2.6. Adaçayı (Salvia officinalis) nın görünümü.. 13 Şekil 2.7. Biberiye ve adaçayı bitkilerinin önemli antioksidatif bileşikleri. 15 Şekil 3.1. Sardalya (Sardina pilchardus) filetosunun genel görünümü... 20 Şekil 3.2. Clavenger aparatının genel görünümü. 21 Şekil 3.3. Gaz Kromotografisi-Kütle spektrometresinin genel görünümü.. 22 Şekil 3.4. Balığa doğal antioksidan uygulaması.. 24 Şekil 3.5. Gaz Kromotografisinin genel görünümü. 27 Şekil 4.1. Biberiye (Rosmarinus officinalis L) uçucu yağ kromotogramı... 36 Şekil 4.2. Adaçayı(Salvia officinalis L) uçucu yağ kromotogramı 38 Şekil 4.3. Yağ asiti standart kromotogramı.. 50 Şekil 4.4. 4 ºC de depolanan sardalya filetosunda toplam mezofilik bakteri sayımı değişimi (TMBS). 61 Şekil 4.5. 4 ºC de depolanan sardalya filetosunda toplam koliform bakteri sayımı değişimi... 63 VIII

KISALTMALAR DİZİNİ KOB : Koloni Oluşturan Birim MAP : Modifiye Edilmiş Atmosfer Paketleme KGM : Kalite Gösterge Metodu TMBS : Toplam Mezofilik Bakteri Sayımı TVB-N : Toplam Uçucu Bazik Azot PV : Peroksit Sayısı FFA : Serbest Yağ Asiti TBA : Tiyobarbitürik Asit Sayısı GC-MS : Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometre GC : Gaz Kromatografisi SFA : Doymuş yağ asitleri MUFA : Tekli doymamış yağ asitleri PUFA : Çoklu doymamış yağ asitleri C14: 0 : Miristik asit C16: 0 : Palmitik asit C18:1n9 : Oleik asit C18:2n6 : Linoleik asit C18:3n3 : Linolenik asit C20:5n3 : Eikosapentaenoik asit(epa) C22:6n3 : Dokosaheksaenoik asit(dha) IX

1. GİRİŞ Mehmet KENAR 1. GİRİŞ Antioksidan maddeler, gerek gıda sektöründe gerek diğer endüstriyel sektörlerde kullanılması mutlak derecede önemli katkı maddeleridir (Anonim, 2008a). Bu maddeler özellikle yağlı gıdalardaki oksidatif bozulmayı engellemek ve raf ömrünü arttırmak amacıyla gıda katkı maddesi olarak yıllardır kullanılmaktadır. Antioksidanlar ayrıca insan vücudunda ortaya çıkan hücre hasarlarını onaran önemli besin maddeleridir. İnsanlar bu besin maddesini mutlak suretle dışarıdan almak zorundadır. Antioksidan yetersizliği, insanlarda alzhemir hastalığı, kanser, kalp ve damar hastalığı, katarakt, diyabet, hipertansiyon, kısırlık, zihinsel hastalıklar, kızamık, perodontal hastalıklar, solunum sistemi enfeksiyonu ve eklem iltihabı gibi önemli rahatsızlıklara neden olabilmektedir. Antioksidanlarca zengin besinlerin tüketimi, insanlarda kanser ve kalp hastalıkları ile savaşmaya yardımcı olmakta, ayrıca çeşitli enfeksiyonları önlemeye ve yaşlanma sürecini azaltmaya yardımcı olmaktadır. Gelişen ülkelerde balık, zengin besin madde içeriğinden dolayı önemli bir gıda kaynağıdır. Özellikle, esansiyel yağ asitleri ve çoklu doymamış yağ asitlerini (PUFA) içeren balık yağları insan sağlığı açısından önemli bir yere sahiptir. Ancak, su ürünleri sektöründe yağlı balıkların oksidasyonu önemli bir problemdir. Özellikle, yağlı balıkların kalitesinin azalmasında ve bozulmasında lipit oksidasyonu önemli rol oynamaktadır (Tappel, 1961). Yüksek seviyede PUFA içeren balık lipitleri bu oksidasyona karşı oldukça fazla hassastır (Fraser ve Sumar, 1998). Depolama ve işleme boyunca meydana gelen otooksidasyon sonucunda yıkıma uğrayan PUFA, uçucu bileşiklerin oluşumundan dolayı balık eti içerisinde acı bir aromanın ortaya çıkmasına yol açar. Ayrıca su ürünleri yüksek konsantrasyonda metal içermesi nedeniyle kırmızı etlerden daha fazla oksidasyona uğramaktadır (Ramanathan ve Das, 1992). Bu nedenle depolama süresince balık tazeliği ve kalitesini korumak önemlidir. Yağlı su ürünlerindeki lipit oksidasyonunun artması, yağ asitlerinin kimyasal yapısına, ürün üretimine, gıdaların pişirilme yada depolama şartlarına bağlıdır. Yağlı su ürünlerinin depolanması süresince ortaya çıkan lipit oksidasyonunu önlemek 1

1. GİRİŞ Mehmet KENAR amacıyla kullanılan en etkili madde antioksidanlardır (Tian ve White, 1994). Gerek su ürünlerinde gerekse diğer gıda ürünlerinde oksidasyonu sabit halde tutmak yada engellemek için çeşitli antioksidan maddeler kullanılmaktadır (Auroma, 1996). Ticari olarak kullanılan en önemli antioksidanlar, tert-butilhidroquinon (TBHQ), propil gallat (PG), butillenmişhidroksi toluen (BHT) ve butillenmişhidroksi anisol (BHA) dur. Son yıllarda, bu tür sentetik gıda katkı maddelerinin güvenirliklerinin test edilmesi için çok ciddi çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Araştırmalar sonucunda BHT ve BHA gibi yaygın olarak kullanılan antioksidanların toksik aktiviteye sahip olduğu ve insanlar için kanserojen etki gösterdiği saptanmıştır (Yingming ve ark., 2004; Torre ve ark., 2001;Suja ve ark., 2004). Ayrıca, Avrupa pazarlarında TBHQ gibi bazı antioksidanların kullanımı yasaklanmıştır(nakatani, 1981). BHT, BHA gibi bilinen sentetik antioksidanların toksik etkilerinin ortaya çıkması ile birlikte doğal antioksidanlara karşı talepler artmıştır (Cuvelier, 1996; Durling ve ark., 2007). Ayrıca, tüketicilerin daha çok sağlıklı, kaliteli, doğal ve taze balık ürünlerine karşı talep göstermesi (Anonim, 2007), doğal antioksidanların üretimi ve başta gıda sektörü olmak üzere endüstriyel kullanımı ile ilgili çalışmaların artmasına neden olmuştur. Yapılan bir çok çalışmada doğal antioksidanların lipit oksidasyonunu önlemede önemli bir etkiye sahip olduğu rapor edilmiştir (Nakatani ve ark., 1983; Akhtar ve ark. 1998). Bitkiler iyi bir doğal antioksidan kaynağı olmakla birlikte büyük çeşitlilikte polar ve polar olmayan fenolik bileşikleri bünyesinde barındırır (Chipault ve ark., 1952; Economou ve ark., 1991; Nakatami, 1994). Bitkilerin antioksidan aktiviteleri polar fenolik bileşiklerin ve esansiyel yağların varlığından kaynaklanmaktadır (Shahidi, 2004). Bitki polifenolleri insan besininde en önemli antioksidan kaynağıdır. Adaçayı, biberiye ve kekik gibi çeşitli bitkilerden izole edilen doğal fenolik antioksidanların işlenmiş gıdaların tazeliğini korumada güçlü bir etkiye sahip olduğu rapor edilmiştir. Bu antioksidanlar ayrıca kanser önleyici bir potansiyele sahiptir (Ho 2008). Bu nedenle bu bitkilerden elde edilen antioksidanlar endüstri açısından bir öneme sahiptir. Biberiye ekstraktı, zengin antioksidan içeriği ve diğer bitkilere 2

1. GİRİŞ Mehmet KENAR nazaran daha az renk ve koku maddesi içermesi nedeniyle son zamanlarda endüstri amaçlı en çok tercih edilen bitki çeşitlerinden birisi olmuştur (Banias ve ark., 1992). Bu nedenle bu çalışmada, biberiye ve adaçayından solvent ekstraksiyon yöntemiyle doğal antioksidanların üretilmesi ve üretilen bu antioksidanların sardalya (Sardina pilchardus) filetosuna uygulanması ile vakum paketleme koşulunda depolama süresince (4 ºC) balık filetosu üzerindeki duyusal, kimyasal ve mikrobiyolojik etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. 3

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Antioksidanlar (oksidasyon inhibitörleri) Bazı yıkılma reaksiyonları yağlı gıdalarda depolama boyunca bozulmaya sebep olmaktadır. Oksidasyon tepkimeleri ve oksidasyon ürünleri, gıdaların duyusal kalitesini ve besinsel değerini azaltan ana etkenlerdir (Gordon 2001). Araştırıcılar yaşlanma, kanser, damar sertliği, kalp rahatsızlıkları ve alzheimer gibi hastalıkların, oksidatif ve serbest radikal reaksiyonlarıyla ilişkisi olduğunu düşünmektedirler (Lanhance ve ark., 2001). Bu tip oksidasyon reaksiyonlarının geciktirilmesi ya da engellenmesi gıda üreticileri ve tüketicileri açısından büyük önem arz etmektedir. Oksidasyonun engellenmesi için gıdaların daha düşük sıcaklıkta tutulması, oksidasyonu kolaylaştırıcı enzimlerin inaktive edilmesi ve uygun paketleme sistemleri kullanılmaktadır (Yanishlieva 2001). Ayrıca oksidasyona karşı koruyucu olarak kullanılan diğer yaygın metotlar, oksidasyonu geciktirici yada durdurucu özel katkı maddelerinin kullanımıdır. Bu oksidasyon koruyucuları genellikle antioksidanlar olarak bilinirler (Huang, 2005). 2.1.1 Antioksidan Mekanizması Antioksidanlar, kimyasal yapısı ve etki mekanizması bakımından farklı bir sınıfta yer alır. Antioksidan bileşiklerin en önemli mekanizması lipid serbest radikalleri ile reaksiyona girip, inaktif ürünleri oluşturmalarıdır (Pokorny ve Korczak, 2001). Antioksidan aktivitesi mekanizması Çizelge 2.1 de gösterilmiştir. Antioksidanlar primer ve sekonder olmak üzere 2 ana grupta sınıflandırılırlar. Primer antioksidanlar lipit radikalleriyle birlikte direkt olarak tepkimeye girer ve ürünün stabil olmasını sağlar. Sekonder antioksidanlar ise farklı mekanizmalarla oksidasyon düzeyini daha düşük seviyelere düşürür. Fakat bu doğrudan serbest radikal süpürücü etkiyi kapsamamaktadır (Decker ve ark., 2005). Primer antioksidanların çoğu indüksiyon periyodu boyunca bir hidrojen atomu vererek yada eksilterek rol oynar. Sekonder antioksidanlar metal iyonları 4

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR bağlayabilme, oksijen süpürücü, UV radyasyon absorbantı, enzim inhibisyonu yada hidroperoksit bozucu olarak rol oynayabilir (Schwarz ve ark., 2001). Bazı doğal fenolik bileşiklerin hem primer hemde sekonder özellik gösterdiği yapılan araştırmalar sonucunda bildirilmiştir (Gordon, 2001). Çizelge 2.1 Antioksidan aktivite mekanizması (Hall, 2001) Antioksidan sınıfı Antioksidan aktivitesi mekanizması Antioksidan Örneği Antioksidanlar Lipit serbest radikallerinin inaktivasyonu Fenolik bileşikler Hidroperoksit stabilizerleri Hidroperoksitlerin serbest radikallere dönüşümünün önlenmesi Fenolik bileşikler Sinerjistler Uygun antioksidanların teşvik edici aktiviteleri Sitrik asit, Askorbik asit Metal tutucu Ağır metallerin inaktif ürünlere bağlanması Fosforik asit, Maillard tepkimesi bileşikleri, sitrik asit Singlet oksijen kırıcı Singlet oksijenin triplet oksijene dönüşümü Karotenler Hidroperoksidi parçalayan maddeler Hidroperoksitlerin radikal olmayan yöntemlerle azalması Proteinler, amino asitler 5

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR 2.1.2 Sentetik Antioksidanlara Karşı Doğal Antioksidanlar Antioksidanlar yağlı gıdaların depolanmasında ve paket imalatında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Sentetik antioksidanların dünya çapında kullanımının azaltılması yada yasaklanmış olması dikkat çekmesinden dolayı, son on yıldan beri doğal antioksidanlara karşı olan ilgi artmaktadır (Pokorny ve Korczak, 2001). Fenolik bileşiklerin sentetik ve doğal formları tam anlamıyla tipik bir antioksidandır. En yaygın kullanılan sentetik antioksidanlar BHA, BHT, PG ve TBHQ dır (Barlow 1990). Bu bileşiklerin yapısı Şekil 2.1 de verilmiştir. Bu bileşikler gıdalarda oksidasyonu geciktirmek ve engellemek amacıyla kullanılmaktadır (Shi ve ark., 2001). Doğal antioksidanlar sentetik antioksidanlardan daha etkili ve daha yararlıdır. Örneğin α-tokoferol sentetik razemik α-tokoferol den daha etkilidir. Çünkü α-tokoferolü taşıyan protein doğal α-tokoferolü tanır (Shi ve ark., 2001). Ek olarak sentetik antioksidanlar kanser oluşumunu destekleyici olarak etki gösterebilir (Barlow 1990). Bu nedenle, gelecek 20 yıl içerisinde doğal antioksidanların sentetik antioksidanların yerini alabileceği düşünülmektedir (Wanasundara ve ark., 1998). 2.1.3 Doğal Antioksidan Kaynağı Olarak Bitkiler Doğal antioksidanlar bitkilerin farklı kısımlarında bulunabilir. Meyve, sebze, baharat, tohum, yaprak, kök ve ağaç kabuklarında doğal antioksidan kaynağı potansiyeli olduğu yapılan bir çok araştırma sonucunda bildirilmiştir. Antioksidanlar keten, ayçiçeği, soya, pamuk ve kanola gibi tohum yağlarında bulunmaktadır. Doğal antioksidanların en temel bileşikleri fenolik bileşiklerdir. Ayrıca önemli doğal antioksidan grupları tokoferol, flavonoidler ve fenolik asitler çoğu bitkinin yapısında yaygın olarak bulunmaktadır (Naczk ve ark., 2006). Tokoferoller en çok bilinen ve en yaygın kullanılan doğal antioksidandır (Blokhina ve ark., 2003). Tokoferoller, tokoferol ve tokotrienoller olarak iki sınıfta incelenmektedir. Her iki grubun α, β, γ, δ olmak üzere 4 izomeri vardır (Blokhina ve 6

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR ark., 2003; Yanishlieva 2001). Tokorefoller hemen hemen bitkilerin bütün kısımlarında bulunmaktadır (Yanishlieva 2001). Şekil 2.1. Gıdalarda kullanılan sentetik fenolik antioksidanların kimyasal yapıları (Yanishlieva 2001). 7

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR Flavonoidler fenoliklerin büyük bir grubunu temsil etmektedir. Flavonoidler meyve, sebze, tahıl, ağaç kabuğu, kök, gövde, çiçek, çay ve şarapta doğal olarak bulunmaktadır (Blokhina ve ark., 2003). Flavonoidler C 6 -C 3 -C 6 karbon iskeleti tarafından karakterize edilir. Bu bileşiklerin temel yapısı iki aromatik halkaya üç alifatik karbon zincirinin bağlanmasıyla meydana gelmektedir. Bazı flavonoid sınıfları flavonlar, flavanonlar, kateşinler ve antosiyaninler moleküler yapısına göre tanımlanmaktadır (Nijveldt ve ark. 2001). Fenolik asitler ve türevleri bitkiler aleminde yaygın bir şekilde bulunmaktadır. Örneğin baklagiller, tahıllar, meyveler, çay, elma suyu, yağlar, şarap, meşrubatlar ve tıbbi bitkiler gibi bitkisel ürünlerde bulunmaktadır (Odacı ve ark., 2007). Fenolik asitler serbest ve konjüge formda tahıllarda bulunabilir. Fenolik maddeler tahıllarda en yüksek tohum ve embriyo da bulunmaktadır (Nack ve Shahidi, 2006). Bitki fenoliklerinin konsantrasyonları yetiştirilme tekniklerine, büyüme ve depolama koşullarına, stres koşullarına (UV, patojonler ve parazitler tarafından enfekte edilmesine), hava kirliliğine ve ekstrem sıcaklıklara göre değişmektedir. Şekil 2.2. Tokoferoller ve tokotrienolların izomerlerinin kimyasal yapısı (Yanishlieva, 2001). 8

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR Şekil 2.3. Dört temel flavonoid grubunun moleküler yapısı (Nijveldt ve ark., 2001) 9

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR Şekil 2.4. Yaygın olarak bilinen fenolik asitlerin kimyasal yapıları (Yanishlieva, 2001). 10

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR 2.1.4. Antioksidan Olarak Kullanılan Biberiye ve Adaçayı 2.1.4.1 Biberiye (Rosmarininus officinalis L) Şekil 2.5 Biberiye (Rosmarinus officinalis L.) nin görünümü Dünyanın birçok yerinde yetişmesine rağmen en çok Akdeniz çevresindeki ülkelerde ve Türkiye de1500 metre yüksekliklerde bulunur. Bu yüzden kökeninin bu çevreler olduğu belirtilmektedir (İlisulu, 1992). Biberiye 50-150 cm boylanan, otsu veya ağaçcık görünüşünde sapı lifli, küçük ince narin, açık veya koyu yeşil yapraklı, yaprak arkası kül renkli ve tüylüdür. Çiçek açık mavi beyazımsıdır ve bütün sene çiçeklidir. Bir eksen üzerinde salkım halinde bulunan çiçekler aromatik ve güzel kokuludur (İlisulu, 1992). Biberiye gıda üretiminde yaygın bir şekilde kullanılan en etkili baharat bitkisidir. Avrupa ve Amerika da antioksidan olarak ticari amaçlı yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Biberiye antioksidanları WOF (warmed-over flavor) u baskılamak amacıyla kullanılmaktadır. 11

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR Biberiye antioksidan özellikleri hakkında çok sayıda araştırma yapılmıştır (Huisman ve ark. 1994). Biberiye hem lipit antioksidanı hemde metal tutucu olarak işlev görmektedir (Basaga ve ark. 1997). Ayrıca süperoksit radikal süpürücüsü olarak da işlev görmektedir. Biberiye ekstraktının gıdalarda uygulanması çok farklı şekillerde olmaktadır(nozaki. 1989). Antioksidatif bileşiklerin ekstraksiyonu için farklı çözücü maddeler kullanılmaktadır. Chang ve ark. (1977), biberiye yapraklarını hekzan, benzen, etil eter, kloroform, etilen diklorid, diokzan ve metanol ile ekstrakte ederek domuz yağı üzerindeki antioksidan özelliğini araştırmıştır. Bu çalışmada metanol ekstaktının çok iyi bir antioksidatif etki gösterdiği rapor edilmiştir. Trojakova ve ark. (2000), yaptıkları bir araştırmada biberiye ekstraktının kolza yağı oksidasyonuna karşı tokoferollere benzer bir antioksidan etki gösterdiğini bildirmişlerdir. Wada ve Frang (2006), 30 o C de sardalya yağı ve dondurulmuş balık eti üzerine biberiye ekstraktı ile alfa-tokoferolu birlikte uygulamışlardır. Çalışma sonunda biberiye ekstraktı ve alfa- tokoferolun aralarında kuvvetli bir sinerjik etki gösterdiğini bildirmişlerdir. Ahn ve ark. (2007), doğal bitki ekstraktlarının mikrokapsül yüksek oleik asit içeren ayçiçeği yağı üzerindeki antioksidan etkisini araştırmışlardır. Bu çalışma sonucunda biberiye, brokoli filizi ve turunçgil gibi doğal bitki ekstraktlarının ayçiçeği yağının lipit oksidasyonunu etkili bir şekilde engellediği görülmüştür. Ayrıca biberiye ekstraktının, gıdalarda lipit oksidasyonunu engellemesi amacıyla kullanıldığını ve son zamanlarda yapılan araştırmaların, ekstraktın içerisindeki aktif bileşiklerin izolasyonu ve identifikasyonu yönünde eğilim gösterdiğini bildirmişlerdir. Bracco ve ark.(1981), yaptıkları araştırmada 16 bileşik izole etmişlerdir. Biberiye ekstraktının antioksidan aktivitesinin, başlıca karnosol ve karnosik asit isimli iki fenolik diterpen den kaynaklandığını tespit etmişlerdir. Nakatani ve Inatani (1981), biberiye den rosmanol ve karnosol bileşiklerini tanımladıkları çalışmada rosmanol ve karnosolun BHT, BHA ve α-tokoferolden daha 12

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR etkili olduklarını rapor etmişlerdir. Yine aynı araştırmacılar biberiyeden rosmadial maddesini izole etmeyi başarmışlardır. Haulıhan ark. (1984), biberiye ekstraktındaki diğer antioksidatif maddelerin diterpenler, epirozmanol, izorozmanol, rozmaridifenol ve rozmariguinon olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca aynı araştırıcılar, biberiye ekstraktı içerisindeki karnosik asitin depolama boyunca karnosola yada diğer diterpenik bileşiklere (rozmanol gibi) dönüştüğünü bildirmişlerdir. Gerhardt ve Schröter (1983), yaptıkları araştırmada rozmarinik asitin kafeik asit ve 3,4-dihidroksifenillaktik asitin bir esteri olduğunu bildirmişlerdir. Aynı araştırcılar rozmarinik asitin, biberiye, adaçayı, kekik, nane ve fesleğen gibi bitkilerde bulunduğunu bildirmişlerdir. Auroma ve ark. (1992), karnosik asit ve karnosolun demir tutucu ve radikal süpürücü olarak rol aldığını rapor etmişlerdir. Ayrıca bu bileşiklerin mikrozomal ve lipozomal sistemde muhteşem bir lipit peroksidasyonu durdurucu etki gösterdiği bulunmuştur. 2.1.4.2. Adaçayı (Salvia officinalis) Şekil 2.6 Adaçayı (Salvia officinalis) ın görünümü 13

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR Adaçayı nın kökeni Akdeniz ve çevresi, özellikle Batı Anadolu ve Yunanistan olarak kabul edilmektedir. Ülkemiz de güney sahillerimizde 1300-1500 m de yetişmektedir. Batı Anadolu ve Güney Anadolu başta olmak üzere, ülkemizin her yerinde çeşitleri görülmektedir. Salvia officinalis in yayılış alanı Akdeniz çevresidir (İlisulu, 1992). Adaçayı genel olarak 1 m büyüyen ve 30 cm yayılabilen bir bitkidir. Saçak köklü, sert saplıdır. Yaprakları oval, tüylü ve sert kaplıdır. Yaprak uzunluğu 10 cm kadar çıkar. Salkım şeklinde veya bir eksen üzerinde 4-6 kadar çiçek küme halinde veya başak şeklinde oluşur. Çiçek rengi açık viyole az olarakta beyazdır. 2-3 mm büyüklükte yuvarlak meyveleri vardır (İlisulu, 1992). Adaçayı dünya genelinde gıdalarda aroma ve baharat olarak kullanılan bir bitkidir. Pek çok bitki arasında en iyi antioksidan aktiviteye sahip olduğu test edilmiştir (Chipault ve ark., 1952). Adaçayı ekstraktı çok etkili bir antioksidan olarak bilinir (Djarmati ve ark., 1991; Pizzale ve ark., 2002). Bitkisel materyallerden antioksidan ekstraksiyonu için en uygun solvent metanol ve etanol olarak bulunmuştur. Biberiye ve adaçayı Labiatae familyasındandır. Bu yüzden karnosol, karnosik asit, rosmanol, rosmadial ve rozmarinik asit gibi aynı antioksidan maddeleri içerirler. Adaçayında diğer Labiatae familyasına ait bitki ekstraktlarında karnosol, rosmanol ve karnosik asitin çeşitli metil ve etil esterleri bulunabilir (Gerhardt ve ark., 1983;Brieskorn ve ark., 1969). Adaçayının esas antioksidan etkisinin karnosik asit, karnosol ve rosmarinik asitten ileri geldiği araştırıcılar tarafından bildirilmektedir (Cuvelier ve ark., 1996). 14

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR Şekil 2.7. Biberiye ve adaçayı bitkilerinin önemli antioksidatif bileşikleri 15

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR 2.1.5. Su ürünlerinde Doğal Antioksidanların Kullanımı Ramanathan ve Das (1992), rutin (30 ve 200 ppm), alfa-tokoferol (30 ppm), askorbik asit (30 ve 200 ppm), quersetin (200 ppm), mirisetin (200ppm), tannik asit (30 ve 200 ppm) ve elajik asit (30-200ppm) gibi farklı polifenollerin taze ve pişmiş Scomberomorus commerson da 4 ve 20 C de depolamıştır. Depolama süresince gruplar arasındaki TBARS değişimleri araştırılmıştır. Çiğ balıkta α-tokoferolun lipit oksidasyonuna karşı etki göstermediğini, L-askorbik asitin mikrodalgada ve buharla pişirilen balık üzerine prooksidan etki göstermesine rağmen, aynı koşullarda quersetin, mirisetin, tannik asit ve elajik asitin çok iyi bir antioksidan etki gösterdiğini bildirmişlerdir. He ve Shahidi (1997), farklı miktarlarda kateşin içeren çay ekstraktlarının 75 C de pişirilen uskumru üzerinde çok iyi bir oksidatif stabilite gösterdiğini bulmuşlardır. Ayrıca α-tokoferol, BHT, BHA yada TBHQ gibi diğer antioksidanlar ile karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak α-tokoferol un diğer antioksidanlardan daha etkili olduğunu bulmuşlardır. Akhtar ve ark. (1998), biberiye ekstraktının yüksek miktarda karnosik asit ve karnosol gibi fenolik diterpenik madde içermekte olduğunu ve yaptıkları çalışmada biberiye ekstraktının dondurulmuş ve buzdolabında depolanmış gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) nın depolanması boyunca çok etkili bir antioksidan etki gösterdiği bildirilmiştir. Khalil ve Mansour (1998), vakum paketlenen 5 C de 16 gün depolanan çiğ ve pişmiş sazan balığı filetolarının lipid oksidasyonuna bazı ticari antioksidanların etkisini araştırmışlardır. Çalışma sonucunda, buzdolabı koşullarında depolanan örneklerin lipid oksidasyonu kontrolünde en iyi antioksidan maddenin 200 ppm konsantrasyon da 45 dakika daldırılan antraksin maddesi olduğu görülmüştür. Lipit oksidasyonunda, vakum paketlemenin vakumsuz paketlemeden daha etkili olduğu görülmüştür. Vakumlu ya da vakumsuz paketlemiş olan pişirilmiş filetoların TBA değerinin, pişirilmemişlerden daha yüksek olduğu bulunmuştur. Sant-Ana ve Mancini-Filho (1999), deneysel koşullarda alfa tokoferol, BHT ve biberiye ekstraktlarının balık filetolarının yağ asidi kompozisyonuna olan etkisini 16

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR araştırmışlardır. Çalışmanın sonucunda en etkili maddenin alfa tokoferol olduğu saptanmıştır. Saito ve ark. (2002), yaptıkları çalışmada içerdiği epigallokateşin gallate maddesi nedeniyle Tung Ting oolong (Camellia sinensis) çayının yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğunu bildirmişlerdir. Epigallokateşin (EGCG) kollejen dokunun proteolitik yıkılmasını düşürerek balık kasının yumuşaklığını baskılayıcı olarak önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca marine edilmiş gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) kasının depolanması boyunca metalloproteinaz inhibitörü olarak rol almıştır. Serdaroğlu ve Felekoğlu (2003), sardalya filetosuna biberiye ekstraktı ve soğan özütü uygulayarak -20ºC de depolama ile yapmış oldukları çalışmada TBA, FFA, PV ve yağ asitleri kompozisyonu 5 ay boyunca incelemişlerdir. Çalışma sonunda TBA, PV ve FFA oranlarının lipit oksidasyonu nedeniyle artış gösterdiğini, biberiye ekstraktının kontrol grubuna göre TBA, PV ve FFA düzeylerinde antioksidatif etki gösterdiğini tespit etmişlerdir. Soğan özütünün uygulandığı grubun dondurulmuş sardalyanın raf ömrünü 3 ay geciktirdiği saptanmıştır. Gimenez ve ark. (2004), ticari sıvı biberiye ekstraktını çipura (Sparus auratus) balığı filetosuna uygulayarak modifiye atmosferik pakette buzdolabı koşullarında depolamıştır. Bu çalışma sonucunda biberiye ekstraktının balığın raf ömrünü uzattığını bulmuşlardır. Seto ve ark. (2005), mavi çaça (Spratelloides gracilis) balığının sıcak çay ekstraktı muamelesinin 5 C lik depolanması boyunca lipit oksidasyonunun bozulmasında baskılayıcı etki gösterdiği bulunmuştur. Pazos ve ark. (2005),yaptıkları başka bir çalışmada üzümün dondurulmuş uskumru (Scomber scombrus) ve balık yağında oksidasyonu önlemede çok başarılı olduğu bulunmuştur. Bu flavonal oligomerlerin balığın depolanması boyunca balık kasındaki endojenik α-tokoferol ile sinerjik bir etki gösterdiği ve raf ömrünü uzattığı bildirilmiştir. Pazos ve ark. (2006), üzüm ve zeytinyağı yan ürünlerinden elde edilen fenolik bileşiklerin dondurulmuş istavrit (Sarda australis) filetoları üzerine fizikokimyasal etkisini araştırmışlardır. Sprey yada glazeleme yöntemiyle uygulanan bu bileşiklerin 17

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR antioksidan aktiviteleri araştırılmıştır. Bu araştırma sonucunda kontrol grubunda sırasıyla depolamanın 5 ve 3. gününde oksidasyona bağlı koku belirlenirken üzümden elde edilen glazeleme ve sprey yöntemiyle uygulanan prosiyanitlerin depolamanın sırasıyla 10 ve13. günün de oksidasyona bağlı koku belirlenmiştir. 2.1.6. Yapılan Diğer Çalışmalar Piccaglia ve ark. (1993), Akdenizde tipik olarak bulunan 11 adet aromatik bitkinin (lavanta, kekik, geyik otu, biberiye, ada çayı, nane, sarı papatya, tarhun otu, acı ve tatlı rezene), buhar distilasyonla elde edilen esansiyel yağlarının antioksidan ve antibakteriyel etkisine çalışmıştır. Bu çalışmada kekik ve geyik otunun test edilen bakteriyel üyelere karşı en yüksek antibakteriyel, sarı papatyanın ise en yüksek antioksidan aktivite gösterdiği rapor edilmiştir. Ababouch ve ark. (1996), farklı zamanlarda yakalanmış, 2-4ºC de buzda ve 21-27 ºC de oda sıcaklığında depolanan sardalyaların bozulma aşamasında TVB-N in hızlı bir şekilde 57.3 mg/100g a ulaştığını bulmuşlardır. Buzda depolanan örnekler için günlük TVB-N seviyesi, iki farklı zamanda (Mayıs ve Haziran 1989) elde edilen sardalyalar için 20mg/100g a ve üç farklı zamanda (Haziran, Temmuz 1990; Nisan- Mayıs, 1992) elde edilen sardalyalar için ise 3.7mg/100g artış göstermiştir. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlara dayalı olarak sardalyadaki kabul edilebilir TVB-N limiti 25-35 mg/100g olarak belirlenmiştir. Yousef (2003), deneysel koşullarda siyah ve yeşil çayın deneysel koşullarda antibakteriyel ve antifungal etkisine çalışmıştır. Bu çalışmada siyah çayın Salmonella spp. gelişiminde inhibitör etki yarattığı, %3-4 konsantrasyonundaki yeşil çay ekstraktlarının ise E. coli gelişimini engellediği rapor edilmiştir. Gökoğlu ve Yerlikaya (2004), sardalya filetosunun tazelik belirleyicisi olarak göz sıvısının refraktif indeksinin kullanıldığı bir çalışmada, 0ºC ve 4ºC lik depolama boyunca sardalyanın kalite analizi ve göz sıvısı indeksi miktarı 24 saatlik aralıklarla uygulamışlardır. Duyusal analiz sonuçlarına göre, balığın raf ömrü 0ºC de 6 gün iken 4ºC de 4 gün olduğu saptanmıştır. Göz sıvısının refraktif indeksi, TVB-N,TMA-N değeri 4ºC de istatistiki açıdan önemli bir artış olurken, 0ºC deki depolama için 18

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet KENAR önemli farklılığın olmadığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak göz sıvısı refraktif indeksi miktarının 4ºC de depolandığında sardalya filetosu için kalite kriteri olarak kullanılabileceği bildirilmiştir. Venskutonis ve ark., (2008).Yaptıkları bir çalışmada çeşitli aromatik ve tıbbi bitki ekstraktlarının antioksidan aktivitesini incelenmiştir. Çalışma sonucunda adaçayı, kekik, ve ısırgan otundan elde edilen ekstraktların iyi bir antioksidan aktivitesi gösterdiği rapor edilmiştir. Erkan ve Özden (2007), yapmış oldukları bir çalışmada iç organları çıkarılmış ve çıkarılmamış sardalyaları buzda depolayarak sardalyanın duyusal, kimyasal ve mikrobiyolojik değişimlerini incelemişlerdir. Çalışma sonunda iç organları çıkarılmış ve çıkarılmamış balığın 4 ºC de duyusal olarak 7 gün kabul edilebildiğini bulmuşlardır. Kimyasal analizler sonucunda TVB-N ve TMA miktarının iç organları çıkarılmış sardalyada yavaş bir şekilde artmasına karşın iç organları çıkarılmamış sardalya etindeki değerlerinin daha hızlı bir artış gösterdiğini bulmuşlardır. İç organları çıkarılmamış balık örneklerinin 9 günlük depolama boyunca TBA değerlerinin iç organları çıkarılmış balık örneklerinden daha yüksek olduğunu bildirmişlerdir. Stamatis ve ark. (2007), +3 ºC de vakumlu, vakumsuz ve modifiye atmosfer (%50 CO 2 -%50 N 2 ) paketlerde depolanan sardalya filetolarının mikrobiyolojik, fizikokimyasal ve duyusal kalite değişimlerini incelemişlerdir. Mikrobiyolojik çalışmalar sonucunda en düşük bakteriyel gelişme modifiye atmosferik paketlemede görülmesine karşın, bakteriyel gelişim vakum paketsiz grup da daha fazla görülmüştür. Depolama boyunca gruplar arasında nem, kül, protein, yağ ve PUFA değerleri etkilenmezken, ph değeri ve laktat ve amonyum miktarlarının kendi aralarında önemli farklılıklar gösterdiğini bildirmişlerdir (P<0.05). Mendes ve ark. (2008), sardalya filetolarını vakumlu, vakumsuz ve modifiye atmosferik paketlerde depolayarak raf ömrünü araştırdıkları çalışmada, TVB-N değerinin depolama boyunca hemen hemen değişmediğini gözlemlemişlerdir..modifeye atmosfer paketlerde depolanan örnek ile vakumsuz paketlerde depolanan örneğin raf ömrünün 5 gün olmasına rağmen vakum paketlenen örneğin 8 gün raf ömrünün olduğu saptanmıştır. 19

3. MATERYAL VE METOT Mehmet KENAR 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal 3.1.1. Aromatik Bitkiler Bu çalışmada bitkisel materyal olarak ticari olarak temin edilen biberiye (Rosmarinus officinalis L.) ve adaçayı (Salvia officinalis L.) bitkileri kullanılmıştır. 3.1.2.Balık Bu çalışmada balık materyali olarak Mersin Körfezinden 08/05/2009 tarihinde yakalanan ortalaması 26.74±1.33 g ağırlığında 14.14±0.31 cm uzunluğunda sardalya (Sardina pilchardus, Walbaum 1972) kullanılmıştır. Balıklar yakalandıkları gün buzun içerisinde Su Ürünleri Fakültesi İşleme Laboratuarına getirilmiş olup, aynı gün filetoları çıkarılmıştır. Şekil 3.1. Sardalyanın (Sardina pilchardus, Walbaum 1972) genel görünümü 20

3. MATERYAL VE METOT Mehmet KENAR 3.2. Metotlar 3.2.1. Su Buharı Distilasyonu Ayıklanmış, kurutulmuş biberiye ve adaçayı yapraklarından 100 g materyal, 2000 ml lik balona yerleştirildikten sonra 1000 ml saf su eklenerek 4 saat boyunca distilasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Distilasyon işlemi tamamlandıktan sonra Clevenger aparatının (Şekil 3.2) dereceli kısmından yağ miktarı okunarak % yağ verimi hesaplanmıştır. Su buharı distilasyonu sonucunda elde edilen uçucu yağlar gaz kromatografisi/ kütle spektrometresi (GC-MS) yöntemi kullanılarak uçucu yağ kompozisyonları analiz edilmiştir. Şekil 3.2. Clavenger aparatının genel görünümü 21

3. MATERYAL VE METOT Mehmet KENAR 3.2.2. Gaz Kromatografisi/Kütle Spektrometresi Analizleri Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (Şekil 3.3) analizleri Su Ürünleri Fakültesi Analitik Kimya Laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. 1 damla uçucu yağ örneği içerisine 1 ml n-hekzan eklenerek vortekste karıştırılmıştır. Bu örnekler sonrasında enjektörle 1µl alınarak GC-MS e enjekte edilmiştir. Araştırmada kullanılan GC-MS koşulları Çizelge 3.1. deki gibidir. Şekil 3.3. Gaz Kromotografisi-Kütle spektrometre (GC-MS) in genel görünümü Çizelge 3.1. Gaz Kromotografisi-Kütle spektrometre Koşulları Cihaz Kolon Kolon Sıcaklığı Enjeksiyon Sıcaklığı Taşıyıcı Gaz Split Oranı 0 Elektron Enerjisi 70eV Perkin Elmer Clarus 500(GC-MS) SGE kolunu (60 m. 0,25mm ID. BPX5 0,25um, USA) 60 o C de 10 dk, 4 o C/dk artışla 220 o C ye, 220 o C de 10 dk beklenir. 4 o C/dk artışla 250 o C ye, 250 o C de 10 dk beklenir. 240 o C Helyum (1,5 ml/dk) Kütle Aralığı Tarama Kütüphanesi 35-425 m/z Nist ve Wiley 22

3. MATERYAL VE METOT Mehmet KENAR 3.2.3.Bitkilerden Doğal Antioksidan Ekstraksiyonu Bitkilerden doğal antioksidan ekstrasiyonu için solvent ekstraksiyon yöntemi kullanılmıştır. Bitkilerden doğal antioksidan ekstresi elde etmek amacıyla su buharı distilasyonu ile esansiyel yağlarından arındırılmış bitki posaları kullanılmıştır. Ekstraksiyon 2000 ml hacimli geri soğutmalı ekstraktörde gerçekleştirilmiştir. 200 g öğütülmüş bitki üzerine 1000ml etanol konularak 60ºC de 2 saat boyunca geri soğutmalı sistemde ekstrakte edilmiştir. Elde edilen ekstrakt filtre kâğıdından süzülerek ayrı bir kaba konulmuştur. Ardından tekrar 1000 ml etanol eklenerek aynı ekstraksiyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Daha sonra ekstraktlar birleştirilerek 60ºC 30 dakika boyunca 40 gr aktif karbon ile ağartma işlemi gerçekleştirilmiştir. Karbon kısmını ayırmak için filtre edildikten sonra evaporatörde (Heidolph WB 2000) etanol uçurularak doğal antioksidan ekstresi elde edilmiştir (Chen ve ark. 1992). Elde edilen antioksidan ekstraktları küçük plastik kaplarda hava almayacak şekilde sıkıca kapatılarak -18ºC de saklanmıştır 3.2.4 Balığa Antioksidan Uygulanması ve Depolama Koşulları Öncelikle sardalyanın (Sardina pilchardus) baş ve iç organları temizlendikten sonra filetoları çıkarılarak steril saf su içerisinde hazırlanmış antioksidan solüsyonlarında (%1 lik) 4 dk bekletilmiştir. Ardından vakum paketlenerek 4ºC de depolanmıştır. Balıkların depolanması için 90µm kalınlığında poliamid ve polietilen bazlı bariyer film Polibar özelliğine sahip vakum paketler (Polinas, Manisa, Türkiye) kullanılmıştır. Balık bozulana dek depolamanın 0, 3, 6, 10, 13, 17, 20. günlerinde duyusal, kimyasal ve mikrobiyolojik değişimleri araştırılmıştır. 23

3. MATERYAL VE METOT Mehmet KENAR Şekil 3.4. Balığa doğal antioksidan uygulaması 3.2.5 Besin Değerleri Analizi 3.2.5.1 Toplam Ham Protein Analizi Toplam ham protein Kjeldahl metoduna (AOAC, 1998) göre yapılmıştır. Kjeldahl tüpleri içerisindeki 1 g homojenize edilmiş örnek üzerine, 2 adet kjeldahl tablet (Merck, TP826558) ve 20 ml H 2 SO 4 eklenerek yakma ünitesinde örnekler yeşil renk alana kadar 2-3 saat yakılmıştır. Oda sıcaklığına geldikten sonra örneğin bulunduğu tüp içerisine 75 ml su eklenmiştir. 25 ml %40 lık borik asit (H 3 BO 3 ) solüsyonu eklenen erlen ile, kjeldahl tüpleri kjeldahl cihazına yerleştirilerek %40 lık NaOH ile 6 dakika distilasyon işlemi yapılmıştır. Kjeldahl cihazından alınan erlen içerisindeki solüsyon 0.1 M HCl ile rengi şeffaf olana kadar titre edilmiştir. Sarf edilen HCl miktarı kaydedilerek, aşağıdaki formül yardımıyla protein miktarları bulunmuştur. N= 14.01x(A-B)xMx100 gx10 % Protein = %N x 6.25 24

3. MATERYAL VE METOT Mehmet KENAR A: Örnek için sarf edilen HCl miktarı B: Kör için sarf edilen HCl miktarı M: Asit molaritesi g: Örnek miktarı 3.2.5.2. Lipit Analizi Lipit analizi Bligh ve Dyer (1959) in uyguladığı yönteme göre yapılmıştır. 15 g homojenize edilmiş örnek, üzerine 120 ml metanol/kloroform (1/2) eklendikten sonra Warring blender ile karıştırılmıştır. Daha sonra bu örnekler üzerine 20 ml %0.4 lük CaCl 2 solüsyonundan eklenerek süzme kağıdından (Scleicher&Schuell, 595 1/2 185 mm) süzülen örnekler, 105 C de 2 saat etüvde bekletilip darası alınmış olan balon jojelere süzdürülmüştür. Bu balonlar ağızları hava almayacak şekilde kapatılıp 1 gece karanlık bir ortamda bekletilmiş ve ertesi gün metanol-sudan oluşan üst tabaka bir ayırma hunisi yardımıyla alınmıştır. Balonların içinde kalan kloroform-lipit kısmından kloroform 60 C de su banyosunda rotary evaparatör kullanılarak uçurulmuştur. Daha sonra balonlar etüvde 1 saat süreyle 60 C de bekletilerek içerisindeki kloroformun tamamının uçması sağlanmış ve bir desikatör içerisinde oda sıcaklığına kadar soğutulup 0.1 mg duyarlı hassas terazide tartılmıştır. Lipit oranının hesaplanmasında aşağıdaki formül kullanılmıştır. Lipit miktarı (%) = [Balon Darası(g)+Lipit(g)]-[Balon Darası (g)]x 100 Örnek Miktarı (g) 3.2.5.3 Ham Kül Analizi Ham kül analizinde kullanılan porselen krozeler ilk önce 103 ºC de 2 saat süreyle etüvde kurutulup daha sonra desikatörde soğutulduktan sonra 0.1 mg duyarlı hassas terazide daraları alınmıştır. Krozeler içerisine homojenize edilmiş örnekten 3.3-5 g tartılıp bu örnekler 4 saat +550 ºC de rengi açık gri oluncaya kadar yakılmış ve ardından desikatör içinde oda sıcaklığına kadar soğutulduktan sonra, hassas 25

3. MATERYAL VE METOT Mehmet KENAR terazide tartılmıştır (Mattissek ve ark., 1989). Örneğe ait % ham kül sonuçları aşağıdaki formül yardımıyla hesaplanmıştır. Ham Kül (%)= [Dara (g)+ham Kül(g)]-Dara(g)x100 Örnek Miktarı (g) 3.2.5.4. Nem Analizi Nem analizi Ludorf ve Meyer (1973) in uyguladığı yöntem esas alınarak yapılmıştır. Petri kutuları etüvde 105 C de 1 saat süreyle kurtulmuş ve desikatörde 30 dakika süreyle soğutulduktan sonra 0.1mg duyarlı hassas terazide darası alınmıştır. Daha sonra homojenize edilmiş örnekten darası alınan petrilere yaklaşık 4-5g koyularak sabit bir ağırlığa ulaşana kadar (8 saat) kurutulmuştur. Bu işlemin ardından oda sıcaklığına kadar soğumaları için desikatöre yerleştirilmiş ve 0.1mg duyarlı hassas terazide tartılarak sonuçlar kaydedilmiştir. Analiz sonucunda örneğe ait nem miktarı aşağıdaki formülle hesaplanmıştır. %Nem miktarı = İlk Tartım -Son Tartım x 100 Örnek Miktarı (g) 3.2.5.5. Yağ Asitleri Tayini Ekstrakte edilmiş lipitten, yağ asidi metil esterleri, methanol ve n-heptan içinde 2M lık KOH oluşmuş transmetillendirme yöntemi ile hazırlanmıştır. 10mg eksrakte edilmiş yağ örneği üzerine 4 ml 2M lık KOH oluşan 2 ml heptan ilave edilmiştir. Daha sonra oda sıcaklığında 2 dakika vortekste karıştırılmış ve 4000rpm de 10 dakika süreyle santürfüj edilmiş ve heptan tabakası GC de analiz için (Çizelge 3.2) alınmıştır. 26

3. MATERYAL VE METOT Mehmet KENAR Şekil 3.5. Gaz Kromotografisi genel görünümü Çizelge 3.2. Gaz Kromotografisi Koşulları Cihaz Kolon Kolon Sıcaklığı Enjeksiyon Sıcaklığı Taşıyıcı Gaz Perkin Elmer Clarus 500(GC) SGE kolunu(30 m. 0,32mm ID.BPX20 0,25um, USA) 140 o C de 5 dk, 4 o C/dk artışla 200 o C ye, 1 o C/dk artışla 220 o C ye getirilerek sonlandırıldı. 220 o C 16psi Split Oranı 1:100 Dedektör Alev iyonizasyon dedektörü (FID) Dedektör Sıcaklığı 280 ºC Örnek Miktarı 2µl Yağ asitleri standartı 37 bileşenden oluşan FAME karışımının gelme zamanlarına bağlı olarak karşılaştırılmasıyla tanımlandı. Aynı şekilde yapılan iki GC analiz sonuçları ± standart sapma değerleri ile % olarak GC bölümünde ifade edildi (Ichibara ve ark. 1996). 27

3. MATERYAL VE METOT Mehmet KENAR 3.2.6 Kimyasal Kalite Analizleri 3.2.6.1. Toplam Uçucu Bazik Azot (TVB-N) Tayini Antonocoppoulus (1973) ün uyguladığı yönteme göre yapılmıştır. Uygulanan yöntemde homojenize edilmiş 10g örnek alınarak Kjeldahl aleti tüplerine aktarılmıştır. Daha sonra örneğin üzerine 2 g MgO ve 100 ml distile su eklenmiştir. 250 ml lik erlenler içerisine ise 100 ml su ve 10 ml %3 lük borik asit ve 7-8 damla Taşiro indikatörü eklenmiştir. Bu işlemden sonra tüp ve erlen Kjeldahl cihazına yerleştirilerek erlen içerisinde 200 ml destilat elde edilene kadar destilasyon yapılmıştır. Elde edilen destilat 0.1 N lik HCI asit ile mevcut rengin pembemsi renge döndüğü noktaya kadar titre edilmiştir. TVB-N miktarının hesaplanması aşağıdaki formüle göre yapılmıştır. TVB-N mg/100g = Harcanan 0.1 N Asit Miktarı (ml)x1.4x100 Örnek Miktarı (g) 3.2.6.2. Tiyobarbitürik Asit (TBA) Sayısı Tayini Tarladgis ve ark. (1960) nın uyguladığı yönteme göre yapılmıştır. Bu amaçla homojenize edilmiş örnekten tam 10 g örnek 0.1mg duyarlı hassas terazide tartılarak, Kjeldahl cihazının tüplerine aktarılmıştır. Daha sonra örneğin üzerine 97.5ml distile su ve 2.5 ml (1:2) lik HCl çözeltisi ilave edilerek destilasyon işlemine geçilmiş ve 200 ml destilat elde edilinceye kadar kaynatılmaya devam edilmiştir. Kaynatma işleminin sona ermesinin ardından destilat karıştırılarak, 5 ml si cam kapaklı deney tüpüne yerleştirilmiş ve üzerine de %90 lık 100ml glacial asetik asit içerisinde 0.2883g çözdürülmüş 5ml TBA reaktifi ilave edilerek tüpün kapağı kapatılıp, bir vorteks kullanılarak karıştırılmıştır. Kör için ise bir başka deney tüpüne 5ml TBA reaktifi ve 5ml distile su ilave edilerek kapağı kapatılıp yine vorteksle karıştırıldıktan sonra, tüpler kaynayan su banyosunda 35 dakika tutulup, soğumaya bırakılmıştır. 28

3. MATERYAL VE METOT Mehmet KENAR Daha sonra spektrofotometre tüplerine aktarılarak 538 nm dalga boyunda köre karşı, optik dansitesi okunmuştur. Elde edilen dansite değeri ise 7.8 ile çarpılarak 1000g örnekteki mevcut malonaldehit miktarı mg olarak saptanmıştır (Varlık ve ark., 1993b). 3.2.6.3. Peroksit Sayısı Ekstrakte edilmiş 1g lipit örneği üzerine 20ml kloroform ilave edilmiş ardından, 50ml asetik asit:kloroform (60:40) çözeltisi ilave edilerek lipit tamamen çözülene kadar çalkalanmıştır. Lipidi çözme işleminin ardından 1ml, doymuş potasyum iyodür ilave edilerek 1-2 dakika süreyle kaynatılmıştır. Daha sonra 20 saniye gibi bir süre döndürerek çalkalama işleminin ardından karanlık bir ortamda 30 dakika bekletildikten sonra 100ml distile su ilave edilip ardından %1 lik nişasta solüsyonundan birkaçla damla damlatılıp berrak renk oluşana kadar kaynatılarak 0.002M lık sodyum tiyosülfatla titre edilmiştir. Aynı uygulama lipit olmaksızın kör içinde yapılmıştır. Hesaplama ise aşağıdaki formül yardımıyla gerçekleştirilmiştir (AOAS, 1994). 2 (C-B) Peroksit Sayısı = meq O 2 /kg W C: Harcanan 0.002M lık sodyum tiyosülfat (ml cinsinden) B: Kör için harcanan 0.002M lık sodyum tiyosülfat (ml cinsinden) W: Örnek Ağırlığı 3.2.6.4. Serbest Yağ Asitleri Analizi Önceden ekstrakte edilmiş lipitten 0.5g örnek tartılarak, dietileter:ethanol (25:25 ml oranında) içerisinde nötralize edilmiştir. Daha sonra bu dietileter:etanol içerisine 1ml, %1 lik fenolftalein indikatörü ilave edilmiştir. Elde edilen bu karışım 0.1M lık sodyum hidroksit ile kalıcı pembe renk oluşuna kadar (en az 15 saniye 29