1 Doç.. Dr. Serap COŞANSU AKDEMİR HIZLI YÖNTEMLER (III) 2 MOLEKÜLER GENETİK YÖNTEMLER Gıda kaynaklı patojenlerin tanımlanmasında ve karakterizasyonunda fenotipik yöntemler halen yaygın olarak kullanılmakla birlikte, son yıllarda genetik yöntemlere olan eğilim artmıştır. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 1
3 Bakteriyel ribozom (70S) 3 farklı rrna fraksiyonu içerir: 5S, 16S ve 23S 5S: 120 nükleotid 16S: 1500 nükleotid 23S: 3000 nükleotid Bunlardan 16S rrna bakterilerin tanımlanmasında kullanılır. 4 Bakteri hücresinden 16S rrna yı ekstrakte etmek ve ampilifiye etmek (çoğaltmak) nispeten kolay 1 g yaş ağırlığa sahip hücre kitlesinde DNase enzimi ile DNA parçalandıktan sonra, ticari kitler kullanılarak RNA ekstrakte edilebilir. Ortama nükleotid primerleri, revers transkriptaz (RT) ve deoksiribonükletid ilave edildiğinde RT rrnaşablonunu okur ve şablona göre DNA kopyalarını (cdna) oluşturur. Bir seri manupulasyondan sonra orijinal 16S rrna sekansı ortaya çıkarılabilir. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 2
5 Nükleik Asit (DNA) Probları Bir DNA probu, hedef mikroorganizmadan elde edilmiş ve homolog DNA veya RNA sekanslarını belirlemeye yarayan DNA sekansından oluşur. Buna göre, prob DNA aranan mikroorganizmanın DNA sı ile hibridize olabilmelidir. Hibridizasyonun gerçekleşip gerçekleşmediğini ortaya çıkarmak için prob DNA işaretlenir. İşaretleme için radyoizotoplar kullanılabilir: 32 P, 3 H, 125 I ve 14 C 6 Kromozomal DNA sıklıkla hedef nükleik asidin kaynağıdır, ancak çoğu durumda hücre içinde tektir. Bu nedenle mrna, rrna veya plazmid DNA sı gibi çoklu hedefler tercih edilir. Böylece yöntemin hassasiyeti artar. Sentetik oligonükleotid probları 20-50 bazdan oluşur ve hibridizasyon 30-60 dk da gerçekleşir. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 3
7 İşlem: 1. Restriksiyon endonükleaz ile bilinmeyen organizmanın DNA fragmentlerinin oluşturulması 2. Fragmentlerin elektroforez ile ayrılması ve nitroselüloz filtrelere aktarılması. 3. İşaretlenmiş problarla hibridizasyon 4. Reaksiyona girmeyen probların uzaklaştırılması için yıkama ve hibridizasyonun otoradyografi ile tespiti 8 Standart bir probla belirlenebilecek minimum bakteri hücresi sayısı 10 6-10 7, ancak bazı araştırıcılar 10 4 adet bakteri hücresini belirleyebilmişler Gıda örneğinde patojen bakterilerin belirlenmesinde sayı çok düşük (1 kob/ml) olabileceğinden mutlaka zenginleştirme yapılmalı. Başlangıç hücre sayısı 10 8 olduğunda 10-12 saat sonunda sonuç alınabilir. Zenginleştirme gerekli olduğunda toplam süre en az 44 saat Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 4
9 Digoksigenin ile işaretlenmiş prob kullanılarak 48 saatte çiğ et örneğindeki 10 kob/g düzeyindeki enterotoksijenik C. perfringens belirlenebilmiş L. monocytogenes in süt, et ve su ürünlerinde aramasında kolorimetrik DNA probu ile FDA in yöntemi karşılaştırılmış 660 süt ve su ürünü örneğinin 354 ünde FDA in yöntemi ile patojen belirlenmiş, buna karşın prob ile 393 örnek pozitif sonuç vermiş 540 et örneğinin 261 i FDA in yöntemi ile, 378 i ise DNA probla pozitif bulundu. Prob 48 saat içinde sonuç verirken, FDA/USDA in metodu ile sonuç almak için 3-4 gün gerekli 10 Salmonella spp. için geliştirilen kolorimetrik prob 110 serotipin tamamını tanımlamış, 61 Salmonella olmayan izolatın hiçbirinde sahte-pozitif sonuç vermemiştir. Salmonella için geliştirişmiş radyoizotopla işaretlenmiş prob 269 kanatlı karkası ve su örneğinde test edilmiştir. İki kez zenginleştirme uygulandıktan sonra 0,03 hücre/ml kadar düşük sayıdaki Salmonella belirlenebilmiştir. Prob ml de ~10 4 kadar az sayıdaki hücreyi saptayabilir. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 5
11 DNA probları koloni hibridizasyon tekniklerinde de kullanılır. Koloni hibridizasyon tekniğinde hedef mikroorganizma uygun bir katı besiyerinde inkübe edildikten sonra mikrokolonilerin direkt olarak bir membran üzerinde oluşması sağlanır. Asıl petri veya membran ile eş zamanlı kopyası hazırlanır. 12 Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 6
13 Kolonilerin oluştuğu petri kutusu üzerine nitroselüloz disk yerleştirilir ve belirli süre inkübe edilir. Böylece kolonilerin disk üzerine kopyası çıkarılmış olur. Disk petriden ayrılır ve sırasıyla şu işlemler yapılır: a) NaOH ilave edilerek bakterilerin lize olması ve DNA nın hücre dışına çıkması sağlanır. b) NaOH nötralize edilir. c) Proteinleri uzaklaştırmak için proteaz ilave edilir. d) Membran yıkanır. e) DNA yı membrana sabitlemek için 80 o C ye ısıtılır. f) Membran üzerindeki DNA radyoaktif prob ile uygun koşullar altında hibridize edilir. g) Membran yıkanarak hibridize olmamış problar uzaklaştırılır. h) Membran x-ray film üzerine konur. X- ray film üzerine bir veya daha fazla leke oluşması orada hibridizasyon olduğunu, dolayısıyla hedef bakteriyi işaret eder. 14 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Moleküler genetik yöntemler içinde gıdalardaki bakteri ve virüsleri tespit etme ve tanımlamada en fazla kullanılan yöntemdir. Çünkü; Yüksek hassasiyet Yüksek spesifiklik Ticari kitler halinde kolaylıkla ulaşılabilir olması vs İlk kez 1971 yılında Kleppe ve ark. tarafından ortaya konmuş Şu an kullanılmakta olan yöntem Perkin Elmer-Cetus Corp. da çalışan bilim adamları tarafından geliştirilmiş. PCR yöntemine katkılarından dolayı K.B. Mullis 1993 yılında kimya dalında Nobel Ödülüne ortak olmuş Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 7
PCR yöntemi genel olarak şu şekilde uygulanır: Başlangıç materyali dsdna (double strand DNA) ise tek sarmal DNA elde etmek için 95 o C ye ısıtılır. Başlangıç materyali RNA ise (örneğin virüs genomu) önce revers transkriptaz (RT-PCR) kullanılarak dsdna ya dönüştürülür. DNA zincirlerini ayırmak için ısıttıktan sonra oligonükleotid primerleri varlığında 55 o C ye soğutulur. Böylece soğutma sırasında tekrar dsdna oluşur. Ortama DNA polimerazla birlikte datp, dctp, dttp, dgtp ilave edilir (d: deoksinükleotid). Bunlar DNA sentezinin ön maddeleridir. Bu işlem tekrar edildiğinde 2 zincir 4, 4 zincir 8, vs olur. Yeterince tekrarlanırsa başlangıçtaki DNA nın birkaç milyon kopyası elde edilebilir. 15 16 Primerler genellikle kısa oligonükleotidlerdir. 20-30 nükleotid uzunluğunda olup baz dizilimi hedef DNA bölgesinin son kısmı ile uyumludur. Amplifikasyon çok sayıda döngüden oluşur. Her bir döngü sırasında çift sarmal DNA ısıtılarak denatüre edilir yani tek sarmala dönüşür. Daha sonra reaksiyon karışımı soğutularak primerlerin tek sarmal DNA lara bağlanması sağlanır. Böylece termostabil DNA-polimerazın bağlanabileceği aktif bölgeler oluşur. DNA-polimerazın çalışmasıyla tekrar çift sarmal DNA meydana gelir. Bir sonraki döngüde primerler hem orijinal hem de yeni üretilen DNA zincirine bağlanır. Böylece DNA kopyalarının sayısı logaritmik olarak artar. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 8
17 BAX system Probelia Foodproof 18 Multiplex PCR (MPCR) Birden fazla mikroorganizmanın tek bir reaksiyonla hızlı bir şekilde belirlenmesine olanak sağlar. MPCR, çoklu virülens faktörlerin tanımlanmasında ve çok sayıda izolatın aynı anda tanımlanmasında kullanılabilir. MPCR nin ticari şekli GeneDisc Uygulanması kolay Birkaç saat içinde sonuç alınabilir Gıda endüstrisinde gıda kaynaklı patojenler belirlenebilir. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 9
19 GeneDisc Sistem üç birimden oluşur: GeneDisc DNA Ekstraktörü GeneDisc Plate (Üzerindeki kuyucuklarda anahtar nitelikteki iki reaktif primer ve prob kullanıma hazır halde bulunur.) GeneDisc Cycler: Testi yapar ve sonuçları kaydeder. 20 Sistem nasıl çalışır? GeneDisc DNA ekstraktörü örneği analize hazırlamak için kullanılır. 4 temel aşamadan oluşur: filtrasyon, sonikasyon, ısıtma, DNA saflaştırma GeneDisc Plate yaklaşık aynı çaptaki üst üste konmuş DVD ye benzer bir aparattır. Üstteki diskin orta kısmında 6, 9 veya 12 bölme içeren bir oyuk yer alır. Alttaki diskte ise 36 kuyucuk ve mikrokanal bulunur. Her bir bölme sırasıyla 6, 4 veya 3 kuyucuğa mikrokanallarla bağlıdır. Buna göre aynı anda 6, 9 veya 12 örnek test edilebilir. Reaktiflerin kuyucuklara yerleştirilmiş olması taşımada kolaylık sağlar. Oda sıcaklığı veya 4 o C de nakliye edilebilir, çoğu zaman olduğu gibi -20 o C veya daha düşük sıcaklık gerektirmez. Her bir bölmede bir negatif kontrol ve bir pozitif kontrol kuyucuğu yer alır. Böylece test sonucunun geçerliliğinden emin olunur. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 10
21 22 Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH) Ribozomal RNA yı hedef alan FISH PCR-olmayan moleküler teknikler içinde en çok kullanılanıdır. DNA yerine RNA yı hedef almak hem yöntemi duyarlı hale getirir, hem de canlı hücreleri belirlemeye olanak sağlar. Bu yöntemde hücreler kimyasal bağlayıcılar ile muamele edilir ve uygun koşullar altında cam üzerinde veya oligonükleotid prob içeren sıvı ortamda hibridize edilir. Genellikle problar 15-25 nükleotid uzunluğunda olup 5 ucundan kolvalent olarak floresan boya ile etiketlenir. Bağlanmayan probu uzaklaştırmak için yıkadıktan sonra boyanan hücreler epifloresan mikroskop ile belirlenir. Teşhis limiti yaklaşık 10 4 kob/ml dir. Yaklaşık bir gecelik zenginleştirme işlemi ile bu seviyeye ulaşılır. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 11
23 24 Mikroarray teknolojisi Basit bir mikroarray bilinen farklı bakteri türlerinden elde edilmiş tek sarmal DNA (ss-dna) parçacıklarının tutturulduğu katı bir yüzeyden oluşur. Katı yüzey naylon membran, cam slayt veya silikon çip olabilir. Bilinmeyen yada tanımlanmak istenen DNA parçacıkları mikroarraya maruz bırakılırsa çip üzerinde kendisine uyan tek sarmal DNA zincirini tamamlayacaktır. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 12
25 Mikroarray ler nasıl üretilir ve nasıl çalışır? Mikroarray lerin üretiminde çeşitli yöntemler kullanılabilir: cam lamlar üzerine ince uçlu iğnelerle baskı, önceden hazırlanmış maskelerle fotolitografi, dinamik mikroayna cihazlarıyla fotolitografi, ink-jet baskı, mikroelektrod array lerinde elektrokimya gibi... Temel olarak çiplerin hazırlanması iki şekilde yapılabilir: Çip üzerinde oligonükleotid sentezi DNA nın direkt olarak yüzeye bırakılması 26 Çip üzerinde oligonükleotid sentezi (On-chip oligonucleotide synthesis) DNA ya da gen parçaları direkt olarak cam maddenin üzerinde sentez edilir. Genellikle fotolitografi yöntemi kullanılır. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 13
27 28 DNA nın direkt olarak yüzeye bırakılması (Direct DNA deposition): Bu teknikte genomik DNA nın parçaları fiziksel olarak cam yüzeydeki yerlerine bırakılır. Yöntem Stanford Üniversitesi nden Pat Brown un laboratuvarında tasarlanmıştır. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 14
Stanford çiplerinin DNA fragmentleri; genlerin PCR amplifikasyonuyla elde edilip, cam film üzerine robotic spotting yöntemiyle kusursuz bir şekilde yerleştirilmesiyle elde edilir. PCR ürünleri cam film üzerine yaklaşık 2 cm 2 bir alana noktacıklar halinde yerleştirilir. Her bir PCR ürününün yerleştirildiği bölge ve içerdiği DNA dizisi kesin olarak bellidir. Daha sonra slayt üzerindeki DNA lar kurutulur (100ºC de 2 sn ), sabitlenir (UV cross-linking), ve denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir (95º C de 2 dk). Hazırlanan çipler, işaretlenmiş cdna fragmentleriyle bağlanmak üzere kullanılırlar. 29 30 Ice nucleation assay Bu yöntem prensip olarak lux geninin hedef bakteriye özgü faja aktarıldığı bakteriyel biyolüminesans yöntemine benzer. Gram-negatif bakteri cinslerinin çoğu «ice nucleator» gibi davranan bir proteinin sentezini kodlayan «ina» geni içerir. Bu geni içeren bakterilerden biri Pseudomonas syringae olup ina geni 3600 baz çiftinden oluşur. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 15
31 Bu protein suyun normalden daha yüksek sıcaklıklarda donmasına olanak sağlar. Yani normal koşullarda -6 o C veya daha düşük sıcaklık gerekirken -2 o C de su buza dönüşebilir. Söz konusu ice nükleatörler yumurta akı, somon gibi gıdalara uygulandığında hem donma süresi kısaltılmış hem de enerji tasarrufu sağlanmıştır. 32 Bakteriyel ice nükleasyon testi ilk kez Salmonella yı belirlemek için geliştirilmiştir. P. syringae den elde edilen ina geni Salmonella ya spesifik bir faja aktarılır. Faj Salmonella varlığı araştırılan ortama ilave edilir. Eğer Salmonella varsa faj tarafından edilecek ve faj genleri bakteri genomu ile birlikte ifade edildiğinde dış membranın bir parçası olarak ice nükleasyon proteini sentezlenecektir. -9 o C civarında buz kristallerinin oluşumu ile Salmonella varlığını gösterir. Floresan özellikteki freeze indikatör boya ilave edilirse yeşil renk buz kristallerini yani Salmonella varlığını, turuncu renk ise negatif sonucu gösterir. Salmonella nın P22 fajı ile 25 hücre/g düzeyindeki patojen 24 h içinde belirlenebilmiştir. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 16
33 Biyosensörler Biyosensörler, biyospesifik tanıma sistemlerinin fiziksel veya elektrokimyasal sinyaller ile kombine edildiği analitik cihazlardır. Gıdalardaki patojenlerin belirlenmesinde kullanılan biyosesörler enzim, antikor, antijen veya nükleik asit gibi biyolojik olarak aktif bir materyal ile alınan sinyalleri dönüştüren bir birimden oluşur. Alınan sinyal hedef molekülün konsantrasyonu ile doğru orantılı olup elektrik, optik veya termal bir sinyaldir. 34 Biyosensörler analiz süresini kısaltmakla birlikte kullanılabilirlikleri seçici ve hassas olmalarına bağlıdır. Otomatik ve minyatürize sistemlerdir. Örnek miktarı nanolitre ile ifade edilir. Bu nedenle kullanılan reaktif miktarı azalacağından maliyet düşer. Aynı anda çok sayıda örneğin analizine olanak sağladığından zamandan tasarruf sağlar. Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 17
35 Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir 18