BİYOFİZİK 2015 1
Amaç Bu pratiğin amacı öğrencilerin polimeraz zincir reaksiyonu ve kullanım alanları hakkında bilgi sahibi olmalarını sağlamak 2
Hedefler Bu pratiğin sonunda öğrenciler, polimeraz zincir reaksiyonunun moleküler çalışmalardaki önemini kavrayabilmeli, kullanım alanlarını ve çeşitleri hakkında bilgi sahibi olabilmeli. 3
İlk kez 1985'de bilim dünyasına sunulduğundan beri polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); hem araştırmada hem de klinik laboratuarlarda tanıda yeni bir çığır açmıştır. ABD'de Cetus şirketinde çalışan Henry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saiki tarafından geliştirilmiştir. Bu buluşundan dolayı K. Mullis, 1993 yılı Nobel Kimya Ödülünü kazanmıştır. 4
PCR NEDİR? Metod basitçe, nükleik asitlerin uygun koşullarda tüpte çoğaltılması şeklindedir. Spesifik bir DNA parçasının kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek enzimatik olarak sentezlenmesi şeklinde tanımlanan in vitro(canlı dışında,tüpte) bir yöntemdir. 5
Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerini tamamlayıcı bir çift sentetik oligonükleotid primer kullanılarak, bu iki primerle sınırlandırılan genin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır. 6
7
KULLANIM ALANLARI Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı, Prenatal tanıda, Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması, Adli tıpta, Onkogenesisin araştırılmasında, Klonlamada,gen tanısı araştırmalarında, Nokta mutasyonlarının belirlenmesinde, 8
KULLANIM ALANLARI DNA dizi analizinde,büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında, Bilinmeyen dizi tayininde, Evrimin aydınlatılmasında, İn vitro fertilization yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılmasında, DNA-protein interaksiyonunun araştırılmasında, 9
PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile çalışmaya olanak sağlamaktadır. PCR tekniği ile laboratuvar tanısında çok büyük bir hız ve kesinlik kazanılmış; bir çok durumda radyoaktivite kullanımını gereksiz hale getirmiştir. 10
OLUŞUM MEKANİZMASI Polimeraz zincir reaksiyonunda üç temel basamak vardır ve çoğaltılmış ürünün miktarı,teorik olarak, bu üç adımın tekrarlanma sayısına bağlıdır: Denatürasyon Annealing (Hibridizasyon) Extension (Polimerizasyon) 11
DENATÜRASYON DNA nın iki zincirinin yüksek sıcaklıkta birbirinden ayrılmasıdır. ANNEALING Sentetik olgonükleotidlerin hedef DNA ya bağlanmasıdır (primer bağlanması). EXTENSION Zincirin uzaması ya da DNA polimerazın primerleri uzatmasıdır. 12
Her adım farklı sıcaklıklarda gerçekleşir: Denatürasyon, 94 0 C-98 0 C Annealing, 37 0 C-65 0 C Extension, 72 0 C 13
14
Ardarda tekrarlanan denatürasyon, primerlerin bağlanması, primerlerin uzaması evreleriyle DNA parçaları üssel olarak artar. Bu üssel artışın nedeni, bir döngü sonucu sentezlenen ürünün, ardışık döngüde diğer primerler için kalıp görevi yapmasıdır. Böylece her PCR döngüsü DNA molekülü üzerinde istenilen bölgenin iki katına çıkmasıyla sonuçlanır. 15
16
PCR boyunca biriken ürünlerin boyu, iki primerin boyu ve hedef DNA bölgeleri arasındaki mesafelerin toplamı kadardır. Matematiksel olarak amplifikasyon; (2 n -2n)X ile ifade edilir. n= döngü sayısı 2n= birinci ve ikinci döngü sonucunda oluşan boyları bilinmeyen ürünler. X= orijinal kalıbın kopya sayısı Her döngü %100 verimle çalışsa 20 döngü sonunda 2 20 kat ürün oluşur. 17
PCR nin işleyişi Verimli bir PCR için; 1. Denatürasyon 2. Primerlerin bağlanması 3. Primerlerin uzaması 4. Döngü sayısı 5. PCR makinesinin sıcaklık iniş ve çıkış süreleri önemlidir. 18
PCR nin Verimi PCR nin verimini etkileyen önemli bir faktör, DNA polimeraz enzimidir. Normalde enzim miktarı, 25-30 PCR döngüsü sonucunda hedef dizi artışı ve termal denatürasyon nedeniyle sınırlayıcı bir etken haline gelir. Verimliliği azaltan bir diğer faktör de konsantrasyonu artan hedef dizilerin primer ile bağlanma yarışıdır. 19
PCR nin Temel Bileşenleri Kalıp olarak kullanılan DNA molekülü DNA polimeraz enzimi Primerler dntp karışımı Tampon ve MgCl 2 20
Kalıp DNA PCR de; genomik DNA lar, plazmid ve faj DNA ları çeşitli genler ve hatta herhangi bir DNA parçası kalıp olarak kullanılabilir. PCR de kalıp olarak DNA nın yanı sıra RNA da kullanılabilir. 21
Polimerazlar DNA polimeraz enzimleri, kalıp ipliğe tamamlayıcı bir DNA ipliği meydana getirmek üzere, orijinal kalıp iplikteki baz bilgisini kullanarak dört çeşit deoksiribonükleozid trifosfattan uzun polinükleotid zincirin sentezini kataliz eder. Bu enzimler, sentezi başlatmak için kalıp moleküldeki tamamlayıcı diziye bağlanan kısa DNA parçalarına (primerlere) gerek duyarlar. 22
Sentezin yönü, 5 uçtan 3 uca doğru olup, primerin serbest 3 hidroksil ucuna ortamdaki dntp lerin nükleofilik etki yapmalarıyla, fosfodiester bağlarının katalizi ve yeni DNA ipliğinin polimerizasyonu sağlanır. 23
Primerler Gen çoğaltılması dahil PCR nin birçok uygulaması için kalıp DNA ya tamamen tamamlayıcı olan primerlere ihtiyaç vardır. Genel olarak kullanılan kalıp ile yüksek oranda bağlanma sağlamak üzere primerler 20-30 nükleotid uzunluğundadır. 24
dntp Karışımı Deoksirübonükleozid trifosfatlar (datp,dgtp,dttp,dctp) yüksek saflıkta ya tek tek ya da dörtlü karışım halinde ticari olarak sağlanır. Optimal dntp konsantrasyonu; 1. MgCl 2 konsantrasyonuna 2. Reaksiyon koşullarına 3. Primer konsantrasyonuna 4. Çoğaltılmış ürünün boyuna 5. PCR döngü sayısına bağlıdır. Yapılacak PCR için en uygun dntp konsantrasyonu deneysel olarak belirlenmelidir. 25
Tamponlar ve MgCl 2 PCR de en çok kullanılan tampon Taq/Amplitaq enzimlerine özgü olan tampondur. Diğer enzimler için de benzeri tamponlar bulunur. MgCl 2 nin reaksiyon karışımındaki final konsantrasyonu değişebilmekle birlikte genellikle 0,5-5,0 mm lık değerler arasında çalışılır. 26
Mg +2 iyonları; 1. dntp ler ile çözünebilir kompleksler oluştururlar. 2. Polimeraz aktivitesini stimüle(uyarmak) ederler 3. Çift iplikli DNA nın Tm değerini arttırırlar 4. Primer/kalıp etkileşimini sağlarlar Bu yüzden MgCl 2 ün PCR nin özgüllüğü ve ürün verimi üzerinde çok önemli bir etkisi vardır. Genellikle optimum MgCl 2 konsantrasyonu olarak 1,0-1,5 mm lık değerler tercih edilir.düşük Mg +2 konsantrasyonu; ürün oluşumunda azalmaya, yüksek Mg +2 konsantrasyonu ise spesifik olmayan ürün birikimine yol açar. MgCl 2 içeren tamponlar kullanılıyorsa, ayrıca MgCl 2 kullanımına gerek yoktur. 27
PCR ürünlerinin belirlenmesi ve analizi PCR ürünleri (amplikonlar) boyları primerlerle sınırlandırılmış DNA parçası ya da parçalarıdır. PCR ürünlerinin analizi ile genellikle üç çeşit bilgi edinilebilir: 1. Hedef DNA dizisinin varlığının ve taşıdığı varyasyonun belirlenmesi 2. Başlangıç materyali olarak kullanılan DNA veya RNA nın kabaca ya da kesin miktarının belirlenmesi için çoğaltılmış PCR ürününün miktarının ölçülmesi 3. Dizi analizi 28
Çoğaltılmış ürünün saptanması ve doğrulanması için çeşitli yöntemler kullanılabilir. En basit ve en genel olanı elektroforezdir. (Agaroz ya da jel elektroforezi) 29
PCR ÇEŞİTLERİ 1. Yuvalanmış (nested) PCR: Özgün olmayan ürünlerin oluşumunu engelleyen, yüksek özgünlükte bir PCR yöntemi. İki primer çifti İle çoğaltım İki primerin bağlanma bölgesinin arasındaki ikinci primer çiftinin bağlanma yerleri Yeniden çoğaltım 30
Bu yönteme göre ardarda 2 PCR yapılır. İlk PCR özgün olmayan ürünlerin oluşumuyla sonuçlanır. 2. PCR ise ilk PCR sonucu çoğaltılmış DNA nın iç kısımlarına ait dizileri içeren NESTED primerleri ile yapılır. İlk PCR ürünleri 2. PCR için kalıp olarak kullanılır ve istenilen hedef bölge çoğaltılarak özgün ürünler elde edilir. 31
2.Demirlenmiş (anchored)pcr: DNA kesilir ve vektöre bağlanır (i) DNA ya ait primer ve (ii) Vektöre ait primer kullanımıyla PCR (i) (ii) 32
Çoğaltılacak olan DNA nın sadece bir bölgesinin bilindiği durumda uygulanır. Bilinen bölgeden yaralanılarak ilgilenilen DNA parçasının çoğaltılmasıdır. Çoğaltılacak DNA bilinen bir diziye bağlanır ve bu bilinen dizi 2. primer bölgesi olarak kullanılır. 33
3. Geri (revers) Transkripsiyon PCR si RNA PCR olarak da adlandırılan RT-PCR, iki aşamalı olup RNA dan tamamlayıcı DNA sentezi (geri transkripsiyon) ve tamamlayıcı DNA nın da standart PCR yoluyla çoğaltılması aşamalarını kapsar. 34
4. Asimetrik PCR: Asimetrik PCR yöntemi, fazla miktarda çoğaltılan tek iplikli ürünün dizilenmesi için kullanılır. Bu PCR çeşitinde, kullanılan iki primerden biri miktarca diğerinden çok daha fazladır. Bu nedenle asimetrik PCR sonucu ipliklerden biri diğerinden çok daha fazla miktarda artar. Asimetrik PCR herhangi bir kalıp ipliğe uygulanabilir ancak tek iplikli ürünün fazla miktarda üretilememesi gibi bir sorunla karşılaşılabilir.bu nedenle çoğunlukla klasik PCR ile önce çift iplikli hedef DNA çoğaltılır, ardından asimetrik PCR uygulamasıyla kalıp yeniden çoğaltılarak tek iplikli ürün yeterli miktarda üretilir. 35
5. Ters (ınvers) PCR (IPCR): Bilinen bir DNA dizisinden yararlanılarak bu DNA nın her iki ucundaki bilinmeyen bölgelerin çoğaltılması için kullanılır. Bilinen dizi DNA nın kesimi Kendiliğinden ligasyon Bilinen dizinin enzim kesimi Her iki ucunda Bilinen diziler taşıyan Ve PCR için uygun hedef dizi 36
Bilinen diziyi içeren DNA önce restriksiyon enzim kesimi ile doğrusal ve sonra bilinen DNA yı içerecek şekilde halkasal hale getirilir. Ardından bilinen DNA dizilerine ikinci bir restriksiyon kesimi uygulanmasıyla tekrar doğrusal olarak elde edilen DNA molekülü bilinen dizilere uygun olarak tasarlanan primerler yardımıyla çoğaltılır. Böylece dizisi bilinmeyen DNA parçası çoğaltılmış olur. 37
6. In Situ PCR: Lam üzerindeki hücre, doku ya da doku parçaları içindeki kalıp DNA nın PCR ile çoğaltılması işlemidir. Bu yöntem viral DNA nın ve tek kopyalı genlerin saptanmasında veya RT-PCR ile birlikte viral RNA ve transkriptlerin belirlenmesinde kullanılır. İn situ PCR, hücre içine PCR bileşenlerinin girişine izin vermek üzere hücre membranları yarı geçirgen hale getirildikten sonra fikse edilmiş hücre veya dokularda kullanılır. 38
7.Çoklu (Multipleks) PCR Bir PCR ile birden fazla hedef dizinin birlikte çoğaltılmasıdır. Çoklu PCR, birden fazla bölgeye bağlanan multipleks primerler ile gerçekleştirilir. Bu PCR gen delesyonlarının haritalanması, küçük delesyonların, çerçeve kayması ve nokta mutasyonların analizinde kullanılan bir yöntem olduğundan kistik fibrozis gibi genetik hastalıkların tanısında kullanılabilir. 39
8.Rastgele çoğaltılmış poliformik DNA (RAPD) Bu metot, dizisi bilinmeyen DNA parçalarının çoğaltılmasını kapsar. Reaksiyonun ürünleri, oligonükleotidlerin dizisine, uzunluğuna ve reaksiyon şartlarına bağlıdır. RAPD yönteminin en büyük üstünlüğü çok sayıda marker sağlamasıdır. 40
9. Immuno PCR PCR ile antijen saptama sistemidir. Özgül olarak antijen-antikor kompleksine bağlanmış bir işaret DNA parçasının çoğaltılması için kullanılır. epitop antijen x antikor Uygun primerlerle PCR PCR ürünlerinin analizi 41
Real Time PCR Son yıllarda PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri sağlamak için kullanılan cihazların (thermocycler) hassas ölçüm aletleriyle birleştirilmesi, gerçek zamanlı(real-time) PCR olarak adlandırılan yeni bir yöntemin gelişmesine neden olmuştur. Real-time PCR da ürünlerin analizi reaksiyon sırasında yapılmaktadır. 42
Bu nedenle, agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarının mor ötesi ışık altında görüntülenmesi gibi işlemlerin uygulanmasına gerek kalmamaktadır. Real-time PCR ürünlerinin niteliksel ve sayısal analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan boyalardan ya da diziye özgün problardan yararlanılmaktadır. 43
(www) 44
Real-Time PCR Tüp içinde oluşan fluorescence saptanır Amplifikasyon sırasında saptama yapılır 45
BioRad icycler 46
47
48
49
50
51