MEZENKİMAL KÖK HÜCRE ÜRETİMİNDE KALİTE STANDARTLARI Bio. Özlem BEYDİLLİ Acıbadem Labcell Hücre Laboratuvarı
Yüksek çoğalma ve kendilerini yenileme özelliklerine sahip, vücut içinde veya laboratuvar ortamında uygun şartlar sağlandığında birçok farklı hücre tipine dönüşebilen (multipotensi) ve uygulandığı dokuyu fonksiyonel olarak destekleyebilen farklılaşmamış hücrelerdir. M Dominici,Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.cytotherapy (2006) Vol. 8, No. 4, 315 317
Uygun kültür şartlarında hücrelerin plastik yüzeye yapışabilir olması, CD73, CD90, CD105 taşıyor, ancak CD45, CD34 ve HLA- DR antijenlerini taşımıyor olması, Uygun farklılaştırma mediası içerisinde osteoblast, kondroblast, ve adipozite farklılaşması özelliklerine sahip hücrelerin Mezenkimal olduğunu belirtilmiştir. Kök Hücre M Dominici,Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.cytotherapy (2006) Vol. 8, No. 4, 315 317
Hematopoetik kök hücre engrafmanını destekleme, GVHD (Graft-Versus-Host) ML MacMillan,Et al.transplantation of ex-vivo culture-expanded parental haploidentical mesenchymal stem cells to promote engraftment in pediatric recipients of unrelated donor umbilical cord blood:results of a phase I II clinical trial. Bone Marrow Transplantation (2009) 43, 447 454 Xiong YY,Mesenchymal Stem Cells versus Mesenchymal Stem Cells Combined with Cord Blood for Engraftment Failure after Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation: A Pilot Prospective, Open-Label, Randomized Trial and Marrow Transplantation,Biol Blood Marrow Transplant 2014 Feb;20(2):236-42 Cipriani P,Et al.mesenchymal stromal cells and rheumatic diseases: new tools from pathogenesis to regenerative therapies,cytotherapy 2015.pii:S1465-3249(14)00893-7 Otoimmün hastalıklar (Crohn Hastalığı,Multiple skleroz gibi) Sagynbaeva VE,Et al.transplantation of mesenchymal bone marrow stromal cells as new opportunity to overcome ineffectiveness of primary anticytokine therapy in Crohn's disease.eksp Klin Gasrtoentereol.2013;(10):5-10. Peter Conning,Et al.autologous mesenchymal stem cells for the treatment of secondary progressive multiple sclerosis: an open-label phase 2a proofof-concept study.the Lancet Neurology.Volume 11, Issue 2, February 2012, Pages 150 156 Glenn JD,Et a.mesenchymal stem cells: Emerging mechanisms of immunomodulation and therapy. World J Stem Cells.2014 Nov 26;6(5):526-39.
Kardiyovasküler hastalıklar Jiyeon Kin,Et.al.The clinical application of mesenchymal stem cells and cardiac stem cells as a therapy for cardiovascular disease,pharmacol Ther,2015,S0163-7258(15)00047-9 Choi YH,Mesenchymal stem cells for cardiac cell therapy.2011 Jan;22(1):3-17. Nörodejeneratif hastalıklar Nanette Joyce,Et al.mesenchymal stem cells for the treatment of neurodegenerative disease. Regen Med. 2010 November ; 5(6): 933 946 Rejeneratif tıbbın diğer alanları
Ham Ürün Operasyon Süreci Kalite Kontrol Süreci Üretim Süreci Bitmiş Ürün Operasyon Süreci Donör Seçimi Ham Ürün Kabul Öncesi Kalite Kontrol İşlem Öncesi Süreci Üçüncül Paketleme Bilgilendirilmiş Onam Formu İşlem Öncesi Kalite Kontrol Ara Ürün Süreci Transfer Ürünün Toplanması Ara Üretim (pasajlar) Kalite Kontrol Bitmiş Ürün Süreci Uygulama Ham Ürünün Paketlenmesi Bitmiş Ürün Kalite Kontrol Etiketleme Takip (cell vigilance) Transfer Birincil ve İkincil Paketleme Doküman
İŞLEM Ham Ürün Kabul Süreci İşlem Öncesi Kalite Kontrol Süreci Ara Ürün Kalite Kontrol Süreci SORUMLU Operasyon / Kalite Kontrol Kalite Kontrol Kalite Kontrol / Üretim Bitmiş Ürün Kalite Kontrol Süreci Kalite Kontrol / Üretim Paketleme Transfer Uygulama Üretim / Operasyon Operasyon Operasyon / Klinik
KİA 800g 20 Dak Santrifüj Ficol Plazma MNH tabakası Ficol Eritrosit Yıkama DMEM+%15PRP İçeren hücre süspansiyonu 48-72 saat inkübasyon Taze medium Çöp Tripsinizasyon ile hücre kaldırma 14 gün inkübasyon Nonadheren hücrelerin atılması Üretilen hücrelerin uygun izotonik solusyon içerisinde paketleme işlemi yapılır. Tripsin blokajı ve yıkama Tekrar kültür ve tripsinizasyon işlemleri ile 2-6 pasaj
Parametre Yöntem Limit Referans Johnson& Johnson, 1982, 12 y. Marry piyasadan 31 milyon şişe Kellerman a soğuk algınlığı ürünü geri çağırdı; 100 Doküman Göz ile kontrol Saklama 1983 de için ailesi FDA sırasında Doldurulması tarafından sabotaja raftan ve milyon $ üzerinde zarara Türkiye ve Tıbbi İlaç ve alınan karşı Tylenol paketleme ürünlere imzalanması kapsül CYANID ilkelerini verildi. gereken Cihaz Kurumu 4 Nisan Isı Takip İndikatör/ ve dijital prestij ısı evrakların kaybına Paket uğradı. içerisindeki eksiksiz Türkiye ve Tıbbi İlaç ve Cihaz enjekte getirdi Marry ve edilmişti. bir GMP kaç saat sonra olması 2014 tarihli tebliğ takip sistemleri Olay, sabotaj cihazın sıcaklık olarak aralığı Kurumu 4 Nisan 2014 tarihli düzenlemelerine Etiketleme Göz ile kontrol öldü. Benzer Etiket şekilde 4-12 C ve ilave 6 olmalıdır. tanımlama kişi etti tebliğ değerlendirildi. Bazı Miktar Aspirasyon/ daha hayatını bilgilerinin Kemik kaybetti. İliği uyumlu >20 ml ve kapsüllerde siyanid Labcell Deneyimi. eksiksiz olması bulaşığı Yağ saptandı Dokusu >100 mg Ambalaj Fiziksel kontrol Kargo paketinin sağlam olması, Göbek Bağı >5cm Viral Seroloji biyopsi alımı İnsan Doku ve Hücreleri ile Güvenlik kordon bandının Bunlarla İlgili Merkezlerin HBsAg, anti-hcv, yırtılmamış Synovial olması >100 mgr Kalite ve Güvenliği Hakkında HIV antikoru (I-II) ELISA/NAT Doku Yönetmelik, Sayı: 27742 +p24 antijeni, Negatif Görünüm Göz ile kontrol Temiz ve Berrak Sifilis RPR/VDRL
Parametre Yöntem Limit Referans Viral Seroloji HIV RNA, HCV RNA, HBV DNA Hücre Sayısı Sifilis Nükleik asit testi (NAT) Thoma / Otomatik RPR/VDRL Sayıcı Canlılık Tripan Blue/ Sterilite Aerob/anaerob Kültür Thioglicollate,Tripti Etidium Bromürc Acridin soy,broth Orange/ agar,kanlı 7AAD Mantar Kültürü agar/saboraud Dekstroz Agar/ Otomatik Kültür Sistemi >%90 Negatif Negatif Türkiye ve Tıbbi İlaç ve Cihaz Kurumu 4 Nisan 2014 tarihli tebliğ >1x10 4 Luc Sensebé, Clinical grade production of mesenchymal stem cells, Bio-Medical Materials and Engineering 18 (2008) S3 S10. EudraLex Volume 4 Part1 Chapter 6: Quality Control 28 March 2014
Parametre Yöntem Limit Referans Canlılık Tripan Blue/ Etidium Bromür- Acridin Orange/ 7AAD > %90 Luc Sensebé, Clinical grade production of mesenchymal stem cells, Bio-Medical Materials and Engineering 18 (2008) S3 S10. Hücre Sayısı Thoma / Otomatik Sayıcı 1.Pasaja giriş 1 10 6 hücre 2.Pasaja giriş 10 10 6 hücre Phuc Van Pham, Good manufacturing practice-compliant isolation and culture of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells. Journal of Translational Medicine 2014, 12:56
Parametre Yöntem Limit Referans Hücre Sayısı Thoma / Otomatik Sayıcı 1-10 10 6 hücre/kg Michalis Mastri,Et al.enhancing the efficacy of mesenchymal stem cell therapy.world J Stem Cells 2014 April 26; 6(2): 82-93 Canlılık Tripan Blue/ Etidium Bromür- Acridin Orange/ 7AAD > %90 Luc Sensebé, Clinical grade production of mesenchymal stem cells, Bio-Medical Materials and Engineering 18 (2008) S3 S10. Saflık Akım sitometri CD34 < %2 CD45 < %2 HLA-DR < %2 CD105> %90 CD73> %90 CD90 > %90 Dominici M,Et al.minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8: 315 317 Mimmi Patrikoski,et al. Development of fully defined xeno-free culture system for the preparation and propagation of cell therapycompliant human adipose stem cells,stem Cell Research & Therapy 2013, 4:27
Parametre Yöntem Limit Referans Sterilite Thioglicollat, Negatif EudraLex Volume 4 Part 1 Toksisite Endotoksin Analizi İV verilecek Luc Sensebé, Clinical grade production of Triptic soy, Broth ürünlerde Chapter mesenchymal 6: Quality Control stem cells, 28 March Bio-Medical 2014 Aerob/ anaerob agar, Kanlı agar, Gel Clot <5Ü/ kg Materials and Engineering 18 (2008) Kültür /Saboraud veya S3 S10. Mantar Kültürü Dekstroz Agar/ toplamda Otomatik kültür <50 Ü. http://www.fda.gov/iceci/inspections/insp sistemi Kromojenik /PCR ectionguides/inspectiontechnicalguide Metod İT verilecek s/ucm072918.html Mikoplazma PCR/ DAPI Boyama Negatif ürünlerde Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals(1993), 0.2 Ü/kg Department of Health&Human Services, veya Memorandum,July.02.1993 toplamda 10 Ü altı Artık Ürün Varlığı HPLC Kullanılan Pen-Strep <0,5µgr/ml EudraLex Volume 4 Part 1 Chapter 6: Quality Control 28 March 2014
Parametre Yöntem Limit Referans Etkinlik Analizi; Osteosit farklılaşma Adiposit farklılaşma Kondrosit farklılaşma Luc Sensebé, Clinical grade Yağ Farklılaştırma; production of mesenchymal stem %10 Hücre Adiposit içi lipid cells, birikimi Bio-Medical ölçülmesi Materials esasına and dayanılarak ölçülebilir. farklılaşma Engineering 18 (2008) S3 S10. 1. MKH'ler, kendi kültür ortamı ile 96 kuyulu plakalarda her bir kuyuda 5x10 4 hücre olacak şekilde kültüre edilir. Lenfosit 2. Hücreler kuyucukların tabanlarını Proliferasyon %10 kapladıktan sonra 1x10-9 M Dexametazon İnhibisyon Testi ve 5µg/ml insülin ekleyerek 2 hafta daha inkübe edilir. Kullanım amacına uygun olarak her üretici 3. Bu kendi süre içinde her 3 günde birtaze kültür standartlarını belirler; medyumu ve 1x10-9 M Dexametazon ve 5µg/ml insülin ekleyerek işleme devam edilir. 1. Rejeneratif amaçlı kullanım için Farklılaştırma 4. Süre sonunda % 3.7 paraformaldehid ile Testleri fikse edilir. Oil Red Boyası, hücre içi lipid üretimini görselleştirmek için kullanılır ve optik yoğunluklar spektrofotometrisi 2. İmmünterapi (GVHD) kullanımda :Lenfosit kullanılarak 500 nm'de ölçülür. Proliferasyon İnhibisyon Testi yapılmalıdır.
Tümör İnokulasyon Testi; Parametre Yöntem Limit Referans Üretilen hücre kültürü hatlarının, nude farelerin sağ kasık bölgesinden deri altı (subkutan) uygulaması ve 10 hafta süre ile kontrolü esasına dayanır.seçilecek fare türleri sağlıklı genç (8-16 5Lorena Hernandez,et Vivo Assay for Tumor haftalık) dişi transgenik haftalık nudeal.in fareler olmalıdır. Tümörojenite Tümör Negatif fare veya 5 Cell Invasion.Methods Mol Biol. 2009 ; 571: Fare başına 0,2 ml medyum içerisinde 2x10 hücre enjekte Testi; İnokulasyon 227 238 edilmelidir. Tümör oluşumunu takip için fareler sakrifiye İnvitro Kültür süresi 2 Vasavietmek M,Et al.assessment of genetic damage testi etmek suretiyle histopatolojik incelemeler sonucu tümörand oluşumu pasajın üstünde olan in inflammatory, precancerous, cancerous Telomer <1,5 RTA tespiti yapılır. pathologies of the esophagus using the comet ve/veya tümör gerilemesi ürünlerde en az 1 Telomer Enzim Aktivitesi; assay.2010, Department of Genetics and tümörojenite analizi, Enzim Aktivite Telomerik tekrarların PCR ile çoğaltılması ve analiz edilmesi esasına dayanır.medicine, Kamineni Hospital, Molecular 4 pasajın üzerinde Tayini Hyderabad, India. veya 2'den fazla TRAP (Telomeric Repeat Amplification Luc Sensebé, Clinical grade production of Comet Assay Protocol) Skor < 2 hastada 1.Eğer hücrekullanılacak kültür süspansiyonu telomeraz içeriyorsa, ortama mesenchymal konan özel stem cells, Bio-Medical Sitogenetik Normal ise en primerler az 3'ütelomeraz ile uzatılır. Materials and Engineering 18 (2008) S3 S10. hazırlanmış 2.Uzama ürünleri, PCR amplifikasyonunda kalıp; myogenin (sıçan) Comet Assay; yapılmalıdır.endüstriy Analiz fragmentleri internalisestandard olarak kullanılır. el kullanımlarda 3.Ürünler mutlakaspekroforetik Tümör olarak ayrılır. Hücreler parçalanıp DNA fragmentlerinin 4.Radyoaktif işaretli primerler PCR ortamına eklenerekkuyruklu telomeraz İnokulasyon testi elektroforezde yıldız görüntüsü ürünlerinin görüntülenmesi sağlanır. yapılmalıdır. oluşturarak kapladığı alan taraması limitler 5.Elde edilen veri, döngü sayısına karşı grafiklenir. Standarda göre aralığında olması esasına dayanır. değerlendirilir.
Parametre Yöntem Limit Referans Stabilite Canlılık- Fonksiyon testi 4 saat; >%90 24 saat; >%85 Luc Sensebé, Clinical grade production of mesenchymal stem cells, Bio-Medical Materials and Engineering 18 (2008) S3 S10. 48 saat ; >%80
TEŞEKKÜRLER