Rauf HAZNEDAR, Gülsan TÜRKÖZ SUCAK ÖZET

Türkiye Tıp Dergisi 2; 7(2): 66-74 Kronik Myeloproliferatif Hastal klarda Myelofibrozis ile Platelet Alfa Granül Sal n m Ürünleri ve İmmün Kompleksler Aras ndaki İlişki ve 1,25 Dihidroksivitamin D 3 Etkisi Rauf HAZNEDAR, Gülsan TÜRKÖZ SUCAK Gazi Üniversitesi T p Fakültesi, Hematoloji Bilim Dal, ANKARA ÖZET Amaç: Myeloproliferatif hastalıklarda (MPH) görülen kemik iliği fibrozisinin etyopatogenezi tam olarak aydınlatılmamış olmakla beraber, bu hastalıklarda fibrozisin sekonder bir proses olduğu bilinmektedir. İnefektif megakaryopoez ve bu sırada açığa çıkan platelet kökenli büyüme faktörü (PDGF), fibroblastları uyarmakta ve kollagen yapımını başlatmaktadır. Bu çalışmada myeloproliferatif hastalıklarda platelet alfa granül salınım ürünlerinden platelet faktör 4 (PF4) ve beta-tromboglobulinin (ßTG) ve immün komplekslerin hastalık patogenezindeki rolü ve 1,25 dihidroksikolekalsiferolün klinik ve histopatolojik parametrelere etkisi araştırılmıştır. Yöntem: Bu amaçla 1 i esansiyel trombositemi, 4 ü polistemia vera 3 ü idiopatik myelofibrozis ve 5 i kronik myeloid lösemili 13 olgudan oluşan MPH grubu ve yaş-uyumlu 19 sağlıklı bireyde plazma ßTG, PF4, platelet içi ßTG, serum immünkompleksleri ve aktif fibrogenezi yansıtmak üzere serum prokollagen-iii-polipeptid (P-III- P) düzeyleri bakılmıştır. Bulgular: MPH grubunda plazma ßTG, PF4 ve P-III-P değerleri ve ßTG/PF4 oranı sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubuna göre anlamlı olarak artmış, platelet içi ßTG düzeyleri ise kontrollere göre anlamlı olarak azalmış bulundu. MPH grubunda artmış olarak bulunan ßTG ve P-III-P değerleri arasında anlamlı ve kuvvetli korelasyon saptandı. Serum immunkompleks değerleri iki grup arasında anlamlı bir farklılık göstermiyordu. Yorum: Bu bulgular platelet alfa granül salınım ürünlerinin kemik iliği fibrozisinde rolü olabileceğini düşündürmektedir. 1,25 dihidroksivitamin D 3 ile MPH grubunda klinik, hematolojik ve histopatolojik düzelme saptanmamıştır. Anahtar Kelimeler: Myeloproliferatif hastalıklar, kemik iliği fibrazisi, platelet alfa granülleri, 1,25 dihidroksivitamin D 3. SUMMARY The Relationship Between Platelet Alpha Granule Release Products and Immune Complexes with the Degree of Myelofibrosis in Myeloproliferative Disorders and the Effect of 1,25 Dihydroxivitamin D 3 on Fibrosis Purpose: Although the exact mechanism of the bone marrow fibrosis in the myeloproliferative disorders is obscure, it is well known that it is a secondary phenomen. İneffective megakaryopoesis and the platelet derived 66

Türkiye Tıp Dergisi 2; 7(2): 66-74 growth factor (PDGF) released during this process stimulates fibroblast proliferation and collagen production. The role of immuncomplexes and platelet alpha granule products-platelet factor 4 (PF4) and beta-bhromboglobulin in the pathogenesis of myeloproliferative disorders and the effect of 1,25 dihydroxivitamin D 3 on the clinical, hematological and histopathologic parameters were investigated in this study. Method: Plasma ßTG) and PF4, intraplatelet ßTG, ßTG/PF4 ratio and serum immune complex and procollagen -III-polipeptid (P-III-P) levels were determined in 13 patients with myeloproliferative disorders-1 with esential thrombocythemia, 4 with polycythemia vera, 3 with idiopathic myelofibrosis and 5 with chronic myeloid leukemia -and 19 age matched healthy volunteers. Results: ßTG, platelet factor 4, ßTG/PF4 ratio and P-III-P levels were found to be significantly increased in the MPD group, whereas intraplatelet ßTG levels were significantly decreased. No difference in the immune complex levels was found between the MPD group and the control group. There was a significant positive and prominent correlation between the ßTG and P-III-P levels. Coclusion: These data suggest a role of platelet alpha granule products in the pathogenesis of bone marrow fibrosis in myeloproliferative disorders. Clinical hematological and histopathologic parameters were not found to be influenced from the 1,25 (OH) 2 Vit D 3 treatment. Key Words: Myeloproliferative disorders, bone marrow fibrosis, platelet alpha granules, 1,25 dihyroxivitamin D 3 GİRİŞ Kemik iliği fibrozisi, neoplastik veya neoplastik olmayan çeşitli hastal klarda görülmektedir (1). Myelofibrozise yol açan hastal klar içerisinde myeloproliferatif hastal klar (MPH) önemli bir yer tutmaktad r. MPH pluripotent hematopoetik kök hücreden köken alan eritroid, granülositik ve megakaryositik dizi hücrelerinin klonal çoğalma gösterdiği bozukluklard r (2). Bu hastal klarda görülen kemik iliği fibrozisinin sekonder bir proses olduğu gösterilmiş olmakla beraber etyopatogenez tam olarak aç kl ğa kavuşmam şt r (3). Bugünkü görüşlere göre myelofibrozis oluşumunda kemik iliğinde megakaryosit ve plateletlerin anormal degranülasyonu (inefektif megakaryopez) önemli yer tutmaktad r. Bu şekilde platelet-megakaryosit alfa granüllerinden aç ğa ç kan platelet kökenli büyüme faktörü (PDGF) fibroblastlar uyararak kollajen yap - m n başlatmaktad r (4-). Ayr ca myeloproliferatif hastal klarda immünkomplekslerin artt ğ na ilişkin baz veriler (11,12) ve immün komplekslerin platelet aktivasyonuna yol açabileceğinin bilinmesi patogenezle ilgili sorular artt rm şt r (13). Öte yandan myelofibrozisin yarar kan tlanm ş belirli bir tedavi yöntemi yoktur. Son y llarda 1,25 kolekalsiferol tedavisi ile fibrozisin gerilediğine ve klinik düzelme elde edildiğine ilişkin çal şmalar yay nlanm şt r (12,14,15). 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 ün monosit-makrofaj matürasyonunu sağlayarak kollajenaz artt rd - ğ, fibroblastlar ve CFU-M i inhibe ettiği bilinmektedir (16). Plateletler ve diğer baz kan hücrelerinin zarlar nda 1,25 (OH) 2 vitamin D3 reseptörleri bulunduğuna ilişkin veriler mevcuttur (17,18). Ancak 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 ün platelet α granül sal n m ürünlerine bir etkisinin olup olmad ğ hala bilinmemektedir. 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 ün myelofibrozisi düzeltici etkisi de tart şmal d r (19,21). Bu çal şma myelofibroziste platelet alfa granül sal - n m ürünlerini, immün komplekslerin rolünü ve 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 ün myelofibrozise etkisini değerlendirmek üzere yap lm şt r. HASTALAR ve YÖNTEM Bu çal şma MPH tan s alan ve ve kemik iliği biyopsisinde retikülin art ş saptanan yaşlar 34-74 aras nda değişen (ortalama yaş 54) 5 i erkek 8 i kad n 13 hasta ile gerçekleştirilmiştir. Hastalar n başl ca klinik ve laboratuvar verileri Tablo 1 de verilmiştir. Onüç hastaya 8 hafta boyunca günde 1 µg 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 (Rocaltrol, Roche) verildi. Rocaltrol uygulamas ndan iki hafta öncesinden başlayacak şekilde hastalara aspirin veya kemoterapi verilmedi. Olgulardan hiçbirinde klinik olarak saptanabilir tromboz veya kanama ile karş laş lmad. Flebotomi, transfüzyon uygulanmad. Hastalar n tamam nda karaciğer ve böbrek fonksiyonlar normal olarak bulundu. Tüm hastalar günde 3 mg allopurinol tedavisi ald. Onüç hasta ve kontrol grubunu oluştuan yaşlar uyumlu 19 sağl kl bireyden tam öykü, fiziksel inceleme, tam kan say m, periferik kan yaymas, retikülosit say m, idrar analizi, akciğer ve direkt kar n grafileri, karaciğer ve böbrek fonksiyon testleri, serum ferritin, albumin, globulin, kalsiyum, fosfor alkalen fosfatazve ürik asit tayini elektrokardiografi, kemik iliği aspirasyonu, kanama 67

Haznedar R, Türköz Sucak G Tablo 1. MPH grubunun başl ca klinik ve laboratuar verileri. İsim Yaş Cinsiyet Tanı Hb(g/dl) Lökosit Platelet Kİ fibrozisi Hepatomegali Splenomegali Ca ++ (x 6 /l) (x 6 /l) (mg/dl) İA 74 E ET 12 12 122 ++ - 8 cm 8.4 BO 57 K PV 17.3 172 646 + - 5 cm.3 MK 5 K PV 11 94 182 + - 12 cm 8.5 SH 61 K PV 17.7 5 ++ - 8 cm 8.4 NB 4 E PV 17 1 23 + 4 cm 9 cm 9.5 AA 6 E IM 8 5 172 ++++ 5 cm 23 cm 8.9 ÇB 49 E IM 6.1 244 579 ++++ 2 cm 14 cm 8.8 ET 34 K IM 32 198 +++ - splenektomili 8.2 DA 45 K CML 9.5 376 258 ++++ - 3 cm 9.3 SK 61 K CML 12 166 73 ++ - 9 cm 9.5 FB 56 K CML 2 29 + 2 cm 13 cm 9.7 LÖ 48 K CML 9.7 18 34 + - 6 cm 9. MA 43 E CML 9.8 19 32 + 4 cm 16 cm 9.9 zaman, parsiyel tromboplastin zaman, protrombin zaman ve fibrin y k m ürünleri testleri yap ld. Ayr ca hastalarda iki hafta ara ile tam kan say m, periferik yayma ve kalsiyum çal ş ld. Plazma Beta-Tromboglobulin (ßTG) Tayini: ßTG için antekübital bölgeden minimal oklüzyon ile venöz kan EDTA ve teofilin içeren plastik tüplere al nd. Tüpler kan al nmas n takiben 3 kez başaşşağ getirildi ve 3 dakika süreyle buz-su kar ş m nda bekletildi. Plateletten yoksun plazma eldesi için 4 C de, 3 dakika süre ile 2 g de santrifüj edildi. Elde edilen süpernatan n en üstteki 5 µl lik k sm ßTG çal ş lmak üzere fraksiyonlar halinde- 7 C de dondurularak sakland. ßTG tayini radyoimmunassay (RIA) ile yap ld (22,23). Bu amaçla Amersham RIA kitleri kullan ld. Her plazma örneği çift çal ş ld ve elde edilen ßTG değerinin ortalamas esas al nd. Platelet İçi ßTG Tayini: Atravmatik teknikle içerisinde EDTA ve teofilin bulunan plastik tüplere venöz kan al nd. 22 C ve 15 g de dakika santrifüjlenerek elde edilen plateletden zengin plazma (PRP) de platelet say m yap ld. PRP den 5 µl lik bir k s m al narak 5 µl % triton X- (Sigma) ile lize edildi. PBS ile gerekli dilüsyonlar yap larak elde edilen örneklerde çift olarak ßTG çal ş ld. Bu amaçla Amersham ßTG kitleri kullan ld.platelet içi ßTG her 6 platelet için nanogram olarak gösterildi (24). Plazma Platelet Faktör 4 (PF4) Tayini: Ondokuz numara kelebek set ile antekübital venden atravmatik olarak ve minimal oklüzyon ile al nan kan içerisinde s v EDTA, 2-klorodeoksiadenozin ve prokain HCl bulunan tüplere al nd. Kar ş m sağland ktan sonrabuz-su kar ş m nda 3 dakika bekletildi. PPP elde etmek için 4 C de 2 g de 3 dakika santrifüj edildi. PPP fraksiyonlar halinde dondurularak -7 C de sakland. PF4 tayini Abbott un (North Chicago Ill) RIA kitleri kullan larak gerçekleştirildi (7). ßTG/PF4 Oran : Her birey için elde edilen ßTG değeri ve PF4 değerlerinin birbirleriyle oranlanmas ile elde edildi (25). Serum İmmün Kompleks (İC) Tayini: Serum İC leri için Digeon ve ark. n n tan mlad ğ fizikokimyasal bir yöntem olan polietilen glikol (PEG) presipitasyonu uyguland (26). Serumun, borat tamponu (.1M ph: 8.4) ile %4 lük dilusyonu haz rlanarak 4 ml PEG 6 (Merck) ile son PEG konsantrasyonu %3.5 olacak şekilde kar ş m sağland. Kar ş m 4 C de 18 saat bekletildikten sonra 2. g de 2 dakika süre ile santrifüj edildi. Süpernatan uzaklaşt r ld. Presipitat ayn konsantrasyonda PEG ile bir kez y kand. Sonra presipitat 5 ml.1 N Na OH ile çözündü. Presipite olan proteinler spektrofotometrede (Beckman) 28 nm de okundu. Serum Prokollajen III Peptid (P-III-P ) Tayini: Venöz kan al narak seum ayr ld ve - 2 C de sakland. Serum P-III-P tayiniradyoimmunassay yöntemle Behring firmas n n kitleri kullan larak yap ld. Her serum örneği çift çal ş ld. Elde edilen değerin ortalamas P-III-P olarak kabul edildi (27). 68

Türkiye Tıp Dergisi 2; 7(2): 66-74 Kemik iliği biyopsisi krista iliaka posterior superiordan ergonomik Jamshidi kemik iliği biyopsi seti kullan larak yap ld. Biyopsi materyalleri formalinde fikse edildikten sonra % luk formik asitle dekalsifiye edildi. Rutin parafinlemeden sonra 5 mikronluk kesitler al nd. Hematoksilen eozin ile boyand ve retikülin fibrozis için gümüşleme yap ld. Örneklerdeki fibrozisin derecelendirilmesi aşağ daki gibi yap lm şt r: + = fokal minimal fibrozis ++ = multifokal fibrozis +++ = yayg n fibrozis ++++ = çok yayg n fibrozis İstatistiksel değerlendirmelerde iki ortalama aras ndaki fark n önem kontrolü ve iki eş aras ndaki fark n önem kontrolü testleri uyguland. Korelasyon katsay - s geleneksel yöntemle hesapland ve regresyon doğrusu en küçük kareler yöntemiyle çizildi. BULGULAR Bulgular Tablo 2 de verilmiştir. Plazma ßTG değerleri konrol grubunda 25.52±1.67 ng /ml, hasta grununda Rocaltrol öncesi 66.73±4.4 ng/ml, Rocaltrol sonras 66.34±4.97 ng/ml olarak bulundu. MPH olan grupta ßTG düzeyi anlaml olarak artm ş bulunurken (p 1 <.1), hasta grubunda Rocaltrol öncesi ve sonras ßTG değerleri aras ndaki fark anlams z bulunmuştur (p 2 >.5) (Şekil 1). Platelet içi ßTG değerleri kontrol grubunda 72.57±3.6, MPH grubunda ise Rocaltrol öncesi 5.±2.63 Rocaltrol sonras 48.3±2.68 ng/ 6 platelet olarak bulunmuştur. Platelet içi ßTG değeri MPH da kontrol grubuna göre anlaml olarak düşük bulunmuştur (p 1 <.1). Platelet içi ßTG düzeyleri Rocaltrol öncesi ve sonras nda anlaml bir farkl l k göstermemiştir (p 2 >.5) (Şekil 2). Plazma PF4 değerleri kontrol grubunda 8.84±1.57 ng/ml MPH da Rocaltrol öncesinde.±1.51 ng/ml, Rocaltrol sonras.57±.5 ng/ml olarak bulunmuştur. MPH da PF4 değeri kontrol grubuna göre anlaml olarak artm ş bulunmuştur (p 1 <.5). Ancak Rocaltrol öncesi ve sonras PF4 değerleri aras nda anlaml bir farkl l k bulunmam şt r (p 2 >.5). MPH da saptanan PF4 art ş ßTG art ş ölçüsünde anlaml değildir (Şekil 3). ßTG/PF4 oran kontrol grubundaki ortalama oran 2.9±.55 olarak bulunurken MPH da Rocaltrol öncesi 6.37±.29, Rocaltrol sonras nda ise 6.33±.23 olarak saptanm şt r. ßTG/PF4 oran MPH da belirgin olarak art ş göstermiştir (p 1 <.1). Bu oranda Rocaltrol tedavisi ile herhangi bir değişiklik olmam şt r (p 2 >.5) (Şekil 4). Plazma P-III-P değerleri kontrol grubunda 16.92±.89 ng/ml olarak bulunurken MPH da Rocaltrol öncesinde 34.39±4.71 ng/ml, Rocaltrol sonras nda ise 35.71±4.19 ng/ml olarak bulunmuştur. MPH da P- III-P değeri anlaml olarak artm şt r (p<.1). Rocaltrol uygulamas MPH da P-III-P değerlerinde anlaml bir değişiklik oluşturmam şt r (p>.5). Plazma ßTG değerleri ile P-III-P değerleri aras nda pozitif bir korelasyon vard r. (=.88). Bu korelasyon istatistiksel olarak anlaml d r (p<.1) (Şekil 5). Serum immün kompleks değerleri normallerde ve MPH olan grupta ortalama immün kompleks düzeyi.±.3 (optik dansite) olarak bulunmuştur. Bu iki grup aras ndaki fark önemsiz bulunmuştur. MPH da ve Rocaltrol öncesi ve sonras hemoglobin düzeyleri, lökosit say s, platelet say s ve kalsiyum düzeyleri aras nda anlaml bir farkl l k saptanmam şt r. MPH olan 13 hastada 1,25 (OH) 2 Vitamin D 3 tedavisi ile klinik ve hematolojik parametrelerde hiçbir düzelme sağlanmam şt r. Hepatosplenomegalide küçültücü bir etkisi olmad ğ gibi kemik iliğindeki retikülin fibrozisde de gerileme saptanmam şt r. Hastalar ilac iyi tolere etmiş, hiperkalsemi de dahil olmak üzere herhangi bir yan etki görülmemiştir. Tablo 2. ßTG, PF4 ve P-III-P ve İC sonuçlar (ortalama ± standart sapma olarak). Kontrol Rocaltrol öncesi Rocaltrol sonrası p 1 p 2 Plazma ßTG (ng/ml) 25.52±1.67 66.73±4.4 66.34±4.97 <.1 >.5 Platelet,içi-ßTG (ng/ 6 platelet) 72.57±3.6 5.±2.63 48.3±2.68 <.1 >.5 Plazma PF4 (ng/ml) 8.84±1.57.±1.51.57±.5 <.1 >.5 ßTG/PF4 oranı 2.9±.55 6.37±.29 6.33±.23 <.1 >.5 Serum İC (OD).±.3.±.3.±.3 >.5 >.5 Plazma P-III-P (ng/ml) 16.92±.89 34.39±4.71 35.71±4.19 <.1 >.5 p 1 : Kontrol grubu ile Rocaltrol öncesi değerler arasındaki farkın anlamını, p 2 : Rocaltrol öncesi ve sonrası değerler arasındaki farkın anlamını göstermektedir. 69

Haznedar R, Türköz Sucak G ßTG(ng/ml) 9 8 7 6 5 4 3 2 Kontrol MPH-RÖ MPH-RS Şekil 1. Plazma ßTG değerlerinin kontrol grubu ve myeloprolifertaif hastal kta hastal kta Rocaltrol öncesi (RÖ) ve Rocaltrol sonras (RS) dağ l m. Enine çubuk ortalama değeri, dikine çubuk standart hatay göstermektedir. P-III-P (ng/ml) 8 7 6 5 4 3 2 Kontrol MPH-RÖ MPH-RS Şekil 4. Serum P-III-P değerinin kontrol grubu ve myeloproliferatif hastal kta Rocaltrol öncesi (RÖ) ve Rocaltrol sonras (RS) dağ l m. Enine çubuk ortalama değeri dikine çubuk standart hatay göstermektedir. Platelet içi ßTG (ng/ 6 11 9 8 7 6 5 4 3 Kontrol MPH-RÖ MPH-RS P-III-P (ng/ml) 8 7 6 5 4 3 2 2 3 4 5 6 7 8 9 Şekil 2. Platelet içi ßTG değerlerinin kontrol grubu ve myeloproliferatif hastal kta Rocaltrol öncesi (RÖ) ve Rocaltrol sonras (RS) dağ l m. Enine çubuk ortalama değeri, dikine çubuk standart hatay göstermektedir. PF4 (ng/ml) 26 24 22 2 18 16 14 12 8 6 4 2 Kontrol MPH-RÖ MPH-RS Şekil 3. Plazma PF4 değerlerinin kontrol grubu ve myloproliferatif hastal kta Rocaltrol öncesi (RÖ) ve Rocaltrol sonras (RS) dağ l m. Enine çubuk ortalama değeri, dikine çubuk standart hatay göstermektedir. Şekil 5. Myeloproliferatif hastal ğ bulunan grupta ßTG değerleri ile P-III-P değerleri aras ndaki ilişki. TARTIŞMA Platelet ultrastrüktürü ile ilgili çal şmalar kronik myeloproliferatif hastal klarda platelet alfa granüllerinin azald ğ n ve aç k kanaliküler sistemde aş r genişlemeler olduğunu göstermiştir (28). Bu duruma paralel olarak MPH da plazma ßTG ve PF4 düzeyleri artm ş olarak bulunmuştur (5,7,8,29). Aş r miktarlarda PDGF sal n m ile kemik iliği fibrozisinin oluştuğu düşüncesi Bernabei ve Katoh un çal şmalar nda saptanan düşük platelet içi PDGF değerleri ile de desteklenmektedir (4,3). Sunulan çal şmada plazma ßTG ve PF4 değerleri yüksek, platelet içi ßTG değerleri ise düşük bulunmuştur. Plateletlerin MPH da degranüle olduğunu gösteren bu sonuçlar platelet alfa granül sal n m ürünlerinin fibroblastlar için mitojenik olduğu sav na ek bir kan t say labilir (4,7,8,31,32). Plazma PF4 art ş ßTG art ş kadar yüksek bulunmam şt r. Bu farkl l ğ n nedeni PF4 ün yar ömrünün 3-4 dakika gibi çok k sa bir süre olmas ile aç klanabilir. Bu çal şmada ßTG/PF4 oran artm ş olarak bulunmuştur. 7

Türkiye Tıp Dergisi 2; 7(2): 66-74 Kaplan ve Owen da benzer sonuçlar bildirmiş ve bu durumu artm ş invivo platelet aktivasyonunun bir ölçütü gibi kabul etmişlerdir (25). Myelofibrozis patogenezinde İC lerin rol oynad ğ düşüncesi idyopatik myelofibrozisli (IM) olgularda dolaşan İC lerin varl ğ n n anlaş lmas ile ortaya ç km şt r (33). Cervantes ve arkadaşlar 51 IM olgusunun 12 sinde (%23.5) lenfoid nodüller saptam ş ve sözkonusu lenfoid nodüllerle serum İC düzeyleri aras nda anlaml bir ilişki saptam şt r (34). Yine Hasselbach ve ark. IM li 8 olguda çeşitli otoimmun fenomenlere rastlam şlard r (35). Ancak tüm bu verilere karş n İC lerin myelofibrozis oluşumundaki rolü aç kl ğa kavuşmuş değildir. İC lerin plazmaferez ile uzaklaşt r lmas ile platelet PDGF sinin değişmediği, platelet içi PDGF değerleri ile serum İC düzeyleri aras nda bir korelasyon bulunmad ğ gösterilmiştir (36). Bizim çal şmam zda literatürdeki çoğu çal şmadan farkl olarak İC düzeylerinin artmad ğ ortaya ç km şt r. Bunun bir nedeni olgu say s n n azl ğ, bir başka nedeni de hasta grubunun kompozisyonu olabilir. Literatürde bildirilen İC ler ve plateletlerle birlikte olan immunglobulinler ve gerekse kemik iliğinde saptanan lenfoid nodüller özellikle IM li hastalarda görülmektedir. Öte yandan bu çal şmadaki IM li olgularda da İC lerin artmad - ğ, kemik iliği biyopsilerinde lenfoid nodül saptanmam ş olmas da bir gerçektir. Bu sonuçlara göre çal şmam zdaki plazma ßTG art - ş ve platelet içi ßTG düşüklüğü intrinsik megakaryosit defekti veya bozulmuş alfa granül yap s işle aç klanabilir. IM de megakaryosit kolonilerinin spontan büyüyebildiği bilinmektedir (37). Megakaryosit koloni uyar c aktivite (Meg-CSA) de MPH da düşük bulunmuştur (38). Bu nedenle spontan büyüme gösteren megakaryositik progenitör hücrelerinin intrinsik bir anormallik taş d ğ sonucuna var labilir. IM deki megakaryositlerin morfolojik ve fonksiyonel anormallik göstermesi de intrinsik anormalliği destekler niteliktedir (39). IM deki artm ş megakaryosit ve platelet kinetikleri de inefektif megakaryopoezi ortaya koymaktad r (4). Bu şekilde PDGF, epidermal growth faktörü (EGF), ve transforming growth faktör-b (TGF-ß) gibi her biri platelet ve megakaryosit α granüllerinde bulunan büyüme faktörleri aç ğa ç kmakta ve fibroblastlar ve kollagen sentezini uyarmaktad r (41). Kronik myeloid lösemi (KML) de görülen myelofibrozis ile kromozom bozukluklar aras nda bir ilişki bulunmas kuvvetli olas l kt r. Yirmiikinci kromozomdaki c-sis onkogeninin PDGF nin B- polipeptid zincirini kodlamas ndan sorumlu olduğu ortaya ç kar lm şt r (42). Megakaryoblastik dönüşüm gösteren bir IM olgusunda PDGF yi kodlayan c-sis onkogeninin anormal olarak aktive olduğu gösterilmiştir (43). MPH da intrinsik platelet anormalliğinin bir başka kan t MPH plateletlerinin adrenalin ile agregasyona tama yak n bir yan ts zl k göstermesidir. MPH plateletlerinde α adrenerjik reseptörlerin azald ğ saptanm şt r (39). Bir platelet α granül hastal ğ olan gri platelet sendromunda görülen myelofibrozis de intrinsik platelet defekti ile myelofibrozis aras ndaki ilişkiyi kan tlar özelliktedir (44-46). Caenazzo ve ark. n n PDGF nin mitojenik aktvitesi ile ilgili geliştirdikleri bir deneysel modelde IM li hastalarda diğer MPH a göre PDGF sal n m n n çok daha fazla olduğu gösterilmiştir (31). PDGF hücre siklusunun G faz nda etki göstermekte, hücre proliferasyonunda başl ca rolü oynamakta ve fibroblastlar öbür büyüme faktörlerinin etkilerine de yan t verebilir duruma getirmektedir. MPH da PDGF uyar m ile kemik iliği fibroblast proliferasyonunun normale göre çok artt ğ kan tlanm şt r. Kimura ve arkadaşlar PDGF ve EGF nin fibroblast proliferasyonunu sinerjistik olarak uyard ğ n ortaya koymuştur (47). Myeloproliferatif hasta grubunda plazma ßTG değerleri ile P-III-P değerleri aras nda anlaml ve kuvvetli pozitif bir korelasyon bulunmuştur (Şekil 5). Buna göre ßTG değeri yüksek olgularda P-III-P değeri değeri artm ş bulunmaktad r. Bu da platelet degranülasyonu ile fibrozis aras ndaki bağlant y desteklemektedir. Bu çal şmada bulunan P-III-P değerleri ayn yöntemi kullanan Barosi ve arkadaşlar ndan daha yüksektir (48). Bunun bir nedeni büyük olas l kla aktif hastal k bulgular ortaya ç kan, lökosit say s yüksek KML li olgular n grup içerisinde oluşudur. Bu çal şmadaki olgu say s P-III-P düzeyleri ile kemik iliği fibrozisi aras ndaki olas bağlant yönünden karar vermek için yeterli değildir. Barosi ve ark. çal şmalar nda mm 3 deki megakaryosit say s ile P-III-P düzeyi aras nda anlaml bir ilişki bulmam şlard r (48). 1984 te ilk kez Mc Carthy 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 ün IM yi geriletebileceğini bildirmiştir (15). Arlet ise üç farkl nedenle ortaya ç kan myelofibrozis olgusunda.25-.5 µg gibi düşük dozlarda 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 ile myelofibroziste düzelme sağlad ğ n yay nlam şt r (14). Richard ve ark. ise 2.5 µg gibi yüksek doz 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 ile 6 ay süre ile tedavi ettikleri hastalar nda düzelme elde edememişler, hatta bir olgular nda ilikteki retikülin fibrozisin artt ğ n saptam şlard r (21). Daha yüksek dozlarda 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 uygulanmas ndan ise oluşabilecek ciddi hiperkalsemi tablosu nedeniyle kaç - n lmaktad r. Genellikle 1 µg/gün üzerindeki uygula- 71

Haznedar R, Türköz Sucak G malarda hiperkalsemi riski artmaktad r (2). Petrini ise.5 µg/gün dozunda etkisiz kalan ilac n 1 µg/gün dozunda etkili olduğunu ve etkinin çabuk görüldüğünü belirtmiştir (15). 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 çal şmam zda 1 µg/gün dozunda ve 2 ay sürekli verildiği halde hemoglobin, lökosit, platelet değerlerinde ve ilikteki retikülin fibroziste hiçbir düzelme sağlanmam şt r. Çal şmam zda P-III-P düzeyleri de aktif fibrogenezin bir göstergesi olarak Rocaltrol tedavisi öncesi ve sonras izlenmiştir. Kontrol grubuna göre MPH da önemli bir art ş gösteren P-III-P düzeyleri rocaltrol tedavisinden etkilenmemiştir. Bu sonucun bir nedeni olgular n önemli bir k sm n KML li olgular n oluşturmas olabilir. Çal şma süresince KML li tüm olgular n lökosit say lar artm ş platelet say mlar nda ise önemli bir değişiklik görülmemiştir. Dolay s ile PDGF aktivitesinde bir değişme olmamas beklenen bir sonuçtur. Bu çal şmada plazma ßTG ve platelet içi ßTG değerleri aras nda fark bulunmay ş da dolayl olarak PDGF etkisinin ayn kald ğ na işaret etmektedir. Hyodo ve ark. İse 1 α-hidroksivitamin D 3 ün IM tedavisindeki yeri ve D 3 metabolitlerinin kemik iliği fibroblastlar üzerindeki invitro etkilerini araşt rd klar çal şmada olgular n n az bir k sm nda fibroblastlar n farmakolojik dozlardaki 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 e duyarl olduğunu, bu olgular n 1 α- hidroksivitamin D 3 e daha düşük dozlarda ve daha s k yan t verdiğini, dolay s ile 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 e yan ts z olgular 1 α-hidroksivitamin D 3 ile tedavi edilmesinin mümkün olabileceğini bildirmişlerdir (49). Bu bulgular bizim çal şmam z n sonuçlar n desteklemektedir. 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 ün antifibrotik etkisinden çok, hücre farkl laşma ve matürasyonunu sağlay c etkisinin bulunduğunu gösteren veriler vard r (5). 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 ün KML hücreleri üzerine in vitro olarak farkl laşt r c etkisi gösterilmişse de bu aç dan bak ld ğ nda Rocaltrolün bu çal şmada da KML li olgularda kan tablosunu düzeltici etkisi beklenirdi. İmmün sistem üzerindeki etkileri olduğu bilinen Rocaltrol çal şmam zda immünkompleks düzeylerine bir etki göstermemiştir. Literatürde de myelofibrozisteki Rocaltrol etkisinin lenfositler üzerinden ve immün kompleksleri azaltarak oluştuğuna ilişkin bir çal şmaya rastlanmam şt r. Literatürde Rocaltrolün daha çok IM da kullan ld ğ görülmektedir. Özellikle anemi ve trombositopenili olgularda yarar sağlad ğ ileri sürülmüştür (49). Eugster ise bu tedavi ile 4 hastas nda sonuç alamad - ğ n bildimiştir (51). Ayn şekilde, Duncombe 6 ay süre ile 1 µg/gün 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 uygulad ğ hastalar nda hematolojik parametrelerin düzelmediğini, retikülin fibrozisin düzelmediği hatta baz olgularda arttğ n bildirmiştir (19). Bu çal şman n ve literatürdeki çal şmalar n sonuçlar 1 µg/gün dozunda 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 ün hiperkalsemi yönünden oldukça güvenilir bir doz olduğunu göstermektedir. Kolsitriolün invitro hücre kültür sistemlerinde optimal etkisi serumdaki fizyolojik düzeyinin - kat kullan ld ğ nda ortaya ç kmaktad r (2). Bu bak mdan vitamin D 3 ün IM de daha yüksek dozlarda kullan lmas gerekebilir. Gerçi Richard ve ark. 2.5 µg/gün dozunda bile fibroziste düzelme sağlayamam şt r (21). Ancak olas invivo matürasyon sağlay c hatta antifibrotik etki aç s ndan, hiperkalsemiye sebep olmayan yeni vitamin D 3 anologlar geliştirilmiştir (2,52,53). Sonuç olarak, bu çal şmada MPH olan grupta kontrol grubuna göre plazma ßTG ve PF4 ve P-III-P değerleri ve ßTG/PF4 oran anlaml olarak artm ş bulunurken, platelet içi ßTG düzeyleri hasta grubunda kontrollere göre düşük bulunmuştur. Plazma ßTG değerleri ile P-III-P değerleri aras nda anlaml ve pozitif bir korelasyon vard r. Rocaltrol tedavisi ile klinik, hematolojik ve histopatolojik bulgularda değişiklik gözlenmemiştir. MPH da saptanan artm ş plazma ßTG ve PF4 değerleri ile azalm ş platelet içi PF4 değerleri bu hastal ktaki artm ş platelet degranülasyonunu göstermekte ve hastal k patogenezinde platelet alfa granül içeriğinin rol oynayabileceğini düşündürmektedir. KAYNAKLAR 1. Mc Carthy DM. Fibrosis of the bone marrow. Content and causes Br J Haematol 1985; 59: 1-7. 2. Fialkow PJ, Jacobson RJ, Papayyannopoulou T. Chronic Myeloid Leukemia. Clonal origin in astem cell common to the granulocyte, erythrocyte, platelet and monocyte/macrophage Am J Med 1977; 63: 125-13. 3. Jacobson RJ, Salo A, Fialkow PJ. Agnogenic myeloid metaplasia: A clonal proliferation of hematopoietic stem cells with secondary myelofibrosis Blood 1978; 51: 189-192. 4. Barnabei PA, Arcangeli A, Casini M. Platelet derived growth factor (s) mitogenic activity in patients with myeloproliferative disase. Br J Haematol 1986; 63: 353-357. 5. Boughton BJ, Allington MJ, King A. Platelet and plasma B thromboglobulin in myeloproliferative syndromes and secondary thrombocytosis. Br J Haematol 1978; 4: 125-132. 6. Breton-Gorius J, Bixet M, Reyes F. Myelofibrosisand acute megakaryoblastic leukemia in a child: Topographic relationship between fibroblasts and mega- 72

Türkiye Tıp Dergisi 2; 7(2): 66-74 karyocytes with alpha granule defect. Leuk Res 1982; 6: 97-1. 7. Burstein SA, Malpass TW, Yee E. Platelet factor-4 expression in myeloproliferative disease: Implications for the aetiology of myelofibrosis. Br J Haematol 1984; 57: 383-392. 8. Castro-Malaspina H, Rabellino EM, Yen A, Nachman RL, Moore MAS. Human megakaryocyte stimulation of proliferation of bone marrow fibroblasts Blood 1981; 57: 781-787. 9. Groopman JE. The pathogenesis of myelofibrosis in myeloproliferative disorders. Ann Intern Med 198; 92: 857-858.. Kaplan DR, Chao FC, Stiles CD, Antoniades HN, Scher CD. Platelet alfa granules contain a growth factor for fibroblasts Blood 1979; 53: 43-52. 11. Baglin TP, Simpson AW, Price SM, Boughton BJ. Composition of immune complexes and their relation to plasma fibronectin in chronic myeloproliferative disorders. J Clin Pathol 1987; 4: 1468-1471. 12. Lane AM, Adams JA, Mc Carth DM, Barret AJ. 1,25 (OH)2 Vit D3 powerfully supresses fibroblast colony formation invitro and induces a rise in hemoglobin level in some patients with myelofibrosis. Br J Haematol 1985; 61: 56-567. 13. Pfueller SL, Lüscher EF. The effects of immune complexes on blood platelets and their relationship to complement activation. Immunchemistry 1972; 9: 1151-1165. 14. Arlet PH, Nicodeme R, Adoue D. Clinical evidence for 1,25 cholecalciferol action in myelofibrosis Lancet 1984; 1: 13-14. 15. Petrini M, Cecconi N, Azzara A. 1,25 (OH) 2 Vit D 3 in the treatment of idiopathic myelofibrosis. Br J Haematol 1986; 64: 624-625. 16. Editorial. Vitamin D and lymphomedullary system. Lancet 1984; 1: 15-1111. 17. Ostrem VK, Tanaka Y, Prahl J. 24-26-Homo 1,25 (OH) 2 Vit D 3 : Preferential activity in inducing differentiation of human leukemia cells HL-6 in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 26-2614. 18. Wieslander S, Mortensen BT, BinderupL. 1 (OH) D 3 (Etalpha) treatment and receptor studies in 16 patients with chronic myeloproliferative disorders Eur J Haematol 1987; 39: 35-38. 19. Duncobe AS, Pearson TC, Nunan TO. 1,25 (OH) 2 Vit D 3 in the treatment of idiopathic myelofibrosis. Br J Haematol 1987; 66: 579-58. 2. Kelsey SM, Newland AC. Vitamin D and human leukemia. Br J Haematol 1989; 71: 173-176. 21. Richard C, Mazorra F, Iriondo A. The usefullness of 1,25 (OH) 2 Vit D 3 in the treatment of idiopathic myelofibrosis. Br J Haematol 1986; 62: 399-4. 22. Dawes J, Smith RC, Pepper DS. The release, distrbution and clearence of human ß-thromboglobuin and platelet factor 4. Thromb Res 1978; 12:, 851-861. 23. Zahavi J, Kakkar VV. ß-thromboglobuin -a specific marker of in vivo platelet release reaction Thromb Haeomostas 198; 44: 23-29. 24. Pogliani EM, Colombi M, Confrancesco E. Platelet dysfunction in acute megakaryoblastic leukemia. Acta Haematol 1989; 81: 1-4. 25. Kaplan KL, Owen J. Plasma levels of ß-thromboglobuin and platelet factor 4 as indices of platelet activation in vivo. Blood 1981; 57: 199-22. 26. Digeon M, Laver M, R za J, Bach JF. Detection of circulating immune complexes in human sera by simplified assays with polyethylene glycol. J Immunol Meth 1977; 16: 2165-2183. 27. Najean Y, Poirier O, Arrago JP. Interet cliniquedes des dosagesdu fragment aminoterminal procollagene III dans les desorders myeloproliferatifs. Nouv Rev Fr Haematol 1987; 29: 123-128. 28. Boughton BJ, Jerrome DW, Rychetnik M. Chronic myeloproliferative disorders. A quantitative assesment of platelet ultrastructure. Acta Haemat 198; 64: 319. 29. Cortelazzo S, Viero P,Barbui T. Platelet activation in myeloproliferative disorders. Thromb Haemostas 1981; 45: 211-213. 3. Katoh O, Kimura A, Kuramato A. Platelet derived growth factor is decreased in patients with myeloproliferative disorders Am J Hematol 1988; 27: 276-28. 31. Caenazzo A, Pietrogrande F, Polato G. Changes in the mitogenic activity of platelet derived growth factor (s) in patients with myeloproliferative disease. Acta Haematol 1989; 81: 131-135. 32. Assoian RK, Grotendasst GR, Aillar DM Cellular transformation by coordinated action of three peptide growth factors from human platelets. Nature 1984; 39: 84-86. 33. Lewis CM, Pegrum CD. Immune complexes in myelofibrosis. Br J Haematol 1978; 39: 233-237. 34. Cervantes F, Pereira A, Marti J, Felin E, Rozman C. Bone marrow lymphoid nodules in myeloproliferative disorders: association with the nonmyelosclerotic phases of idiopathic myelofibrosis and immunological significance Br J Haematol 1988; 7: 279-282. 35. Hasselbach H. Idiopathic myelofibrosis: A clinical study of 8 patients. Am J Hematol 199; 34: 291-3. 36. Baglin TP, Price SM, Boughton BJ. A reversible defect of platelet PDGF content in myeloproliferative disorders Br J Haematol 1988; 69: 483-486. 37. Adams JA, Barret AJ, Beard J, Mc Carthy DM. Primary polycthemia, essential thrombocytemia and myelofibrosis. Three faces of a single disase process Acta Haematol 1988; 79: 33-37. 73

Haznedar R, Türköz Sucak G 38. Kimura H, Ohkoshi T, Matsuda S. Megakaryocytopoiesis in polycythemia vera: Characterization by megakaryocytic progenitors (CFU-Meg) in vitro and quantitation of marrow megakaryocytes. Acta Haematol 1988; 79: 1-6. 39. Schafer AI. Bleeding and thrombosis in the myeloproliferative disorders. Blood 1984; 64: 1-12. 4. Harker LA. Kinetics of thrombopoiesis. J Clin Invest 1968; 47: 458-465. 41. Reilly JT. Pathogenesis of idiopathic myelofibrosis: Role of growth factors. J Clin Pathol 1992; 45: 461-464. 42. Antoniades HN, Pantazis P, Owen AJ. Human platelet derived growth factor and the sis/pdgf-2 gene. In: Gurrof G (ed). Oncogenes, Genes and Growth Factors. 1st ed it, New York, John Wiley Sons, 1987: 1-4. 43. Marcus RE, Hibbin JA, Mattutes E. Megakaryoblastic transformation of myelofibrosis with expression of the c-sis oncogene. Scand J Haematol 1986; 36: 186-193. 44. Martyré MC, RomquinN, Le Bousse K, et al. TGF-α and and megakaryocytes in the the pathogenesis of myelofibrosis in myeloproliferative disorders. Leuk Lymphoma 1994; 88: 9-16. 45. Caen JP, Cramer EM, Rendu F, Bryckaert M, Dupuy E, Levy Toledano S. Gray platelet syndrome, an example of myelofibrosis of megakaryocytic origin. Bull Acad Natl Med 1991; 175: 7, 1145-1153. 46. Reilly JT. Pathogenesis of idiopathic myelofibrosis: Present state and future direction Br. J Haematol 1994; 88: 1-8. 47. Kimura A, Katoh O, Kuramoto A. Effects of platelet derived growth factor, epidermal growth factor,and transforming growth factor- on the growth of human marrow fibroblasts direction Br J Haematol 1988; 69: 9-12. 48. Barosi G, Costa A, Liberato LN. Serum procollagen -III-peptide level correlates with disase activity in myelofibrosis with myeloid metaplasia direction Br J Haematol 1989; 72: 16-2. 49. Hyodo H, Kimura A, Nakata Y, Ohta H, Kuramoto A. 1 alpha- Hydroxivitamin D 3 in the treatment of primary myelofibrosis: In vitro effect of Vitamin D 3 metabolites on the bone marrow fibroblasts. Int J Hematol 1993; 57: 131-137. 5. Koeffler PH. Human acute myeloid leukemia line models of leukomogenesis. Semin Hematol 1986; 23: 223-228. 51. Eugster C, Brun del Re GP, Bucher U. The role of 1,25 (OH) 2 Vit D 3 in the traetment of idiopathic myelofibrosis. direction Br J Haematol 1987; 65: 381. 52. Abe J, Morikama M, Miyamato K. Synthetic anolouges of Vitamin D3 with an oxygen atom in the side chain skeleton. FEBS Lett 1987; 226: 58-62. 53. Kasukabe T, Honma Y, Hozumi M. Control of proliferating potential of myeloid leukemia cells during long term treatment with Vitamin D 3 anolouges and other differentiation inducers in combination with antileukemic drugs. Cancer Research 1987; 47: 567-572. YAZIŞMA ADRESİ: Dr. Gülsan TÜRKÖZ SUCAK Kader Sokak, No: 4/5 67 Gaziosmanpaşa-ANKARA 74