BÖLÜM 13 Bronkoalveoler Lavaj ve Hücre Analizi Bronkoalveoler lavaj (BAL), akciğerlerden bronkoskopi işlemi sonrası alınan, hücresel ile hücresel olmayan elemanlar içeren ve bunların değerlendirilmesiyle bazı periferik hava yolu-parankim hastalıklarının tanısına katkı sağlayan, önemli bir tanı materyalidir. Hastalıklara göre değişkenlik göstermekle birlikte, tanıya %50-90 oranında katkı sağlar. Hastanın kliniği, yaşı, kontrendikasyon faktörleri ile birlikte yorumlandığında özellikle biyopsi alınamayan hastalarda çok önem kazanmaktadır. BAL endikasyonlarını aşağıdaki şekilde sıralayabiliriz; 1. sebebi bilinmeyen etiyolojiler, 2. ilaç ve toksik ajanlara maruziyet, 3. organik ve inorganik partiküller, 4. infeksiyöz ajanlar, 5. neoplazmalar, 6. solunum hastalıklarının ayrımının yapılması ve etkenlerinin saptanması ile çok yönlü koruyucu mekanizmayı tanımlamak Görüldüğü üzere BAL, akciğer patolojilerine açılan penceredir (1,2). BAL incelemesi, metodoloji ve bulguların değerlendirilmesi şeklinde iki aşamada anlatılabilir. Bunlar aşağıda sırasıyla değerlendirilecektir. Metodolojik olarak; bronkoskopik işlemin yapılması 113
114 yeterli materyal alımı alınan materyalin değerlendirilmek için laboratuvar işlemlerinden geçirilmesi total sayım sitosantrifüj ile yayma, tespit ve boyama işlemi hücreleri değerlendirme, sayma, tanımlama bulguları yorumla ve raporlama aşamalarından geçmektedir (3-6). BAL de bulguların değerlendirilmesi aşamasında, hücresel ve hücresel olmayan elemanlar, mikroorganizmalar ve atipik oluşumlar değerlendirilir. Hücresel elemanlar alveoler makrofajlar inflamatuar elemanlar bu bölgeleri döşeyen epitelyal elemanlar Hücresel olmayan elemanlar Surfaktan, fosfolipidler Protein 70 µg/ml (Sp-A, B, C, D) Albümin 20 µg/ml Ig ler (IgG, IgA, IgM, IgE) α 1-Antiproteaz β 2-Makroglobülin CEA Transferin Fibrinolektin Lökosit elastaz, kollajenaz, ACE Prostoglandin E (200-2000 µg/ml) Tromboksan β (25-85 pg/ml) Karbonhidrat Bombesin, NO, vitamin (A, D, E) Eozinofil belirteçleri (ECP, MBP, END, EPX) Mast hücre belirteçleri (histamin, triptaz) (4,8) BAL ilk kez 1970 li yılların başında yapılmıştır. İlk amaç bronşları temizlemek olmuş, sonraki yıllarda da içeriklerin değerlendirilmesi için gerçekleştirilmiştir. Materyal alımı için tüm lob ve segmentler seçilebilir. Ancak, işlem için en uygunu sağ akciğerde orta lob, solda ise linguladır. İşlem sırasında verilen materyal (serum fizyolojik) ile geriye alınan materyalin oranı önemlidir, en az 2/4, ideal olarak ¾ ünün geri alınması gerekir.
BÖLÜM 13 Bronkoalveoler Lavaj ve Hücre Analizi 115 Uygun materyalin aşağıdaki özellikleri bulundurması gerekir: infeksiyona bağlı sekresyon (pürülans) olmamalı, uygulama kaynaklı hemoraji olmamalı, içindeki canlı hücre oranı %80 i bulmalı, mikroskopik değerlendirmeye geçildiğinde eritrosit ve epitel hücre miktarları total hücre sayısının %5 ini geçmemeli, makrofajların yarısı yapılarını korumuş olmalıdır. Geçerli bir sitoloji raporunda inflamatuar hücrelerin sayıları, farklı tiplerinin ayrımı ve lenfosit alt gruplarının ayrımı yapılmış olmalıdır. BAL de sağlıklı kişilerin hücresel elemanları Tablo 1 de verilmiştir BAL de materyal alma, laboratuvarda işleme ve değerlendirme gibi metolojik basamakların yanı sıra, hücre bilgisi olan kişiler tarafından yorumlanma aşaması da çok önemlidir (5,6). Doğru bir metodoloji için aşağıdaki: Total hücre sayımı (hemositometre) Sitosantrifüj (hücrelerin yayım hızları farklı olduğundan, sağlıklı ve doğru yayımı için; örneğin eozinofil veya mast hücre önemliyse düşük devir santrifüj gerekecektir). Lenfosit alt grupları için flow cytometre ve immün boya Normal hücrelerin belirlenmesinde May Grunwald Giemsa, Papanicolaou, PAS, Grocott, İHK boyalar, EZN, Toluidin vs. gereklidir. BAL de farklı hücre, tip, morfoloji ve biyokimyasal yapıların değerlendirilmesinde farklı boyama yöntemleri öne çıkar. Örneğin, tümör, pigment, P. jirovecii, mantar, bakteri, lenfosit alt grupları, lenfoma vs nin daha ayrıntılı bir şekilde belirlenmesinde farklı boyama yöntemleri kullanılır (4,6-10). Tablo 1: BAL de Sağlıklı Kişilerin Hücresel Elemanları Normalde alınıp işlenen miktar 40-60 cc Total hücre sayısı Makrofajlar Lenfositler T-Lenfosit CD4 CD8 B-Lenfosit T-Killer Henüz tanımlanamayan Diğer (PNL, Eo, Mast, Plazma vs) 10-14 x 106 mm 3 /hücre %85 %7-12 %70 %50 %30 %5-10 %7 %15 %2,5-3 (6,8)
116 BAL ve Bulgular BAL değerlendirilmesi hangi hastalıklarda yarar sağlamaktadır? Klinik kullanımda hangi hücre profili ne anlama gelmektedir? BAL nin klinikte hastanın değerlendirilmesine önemli katkı sağladığı bilinmektedir. Akciğerin periferik kanserleri, infeksiyonları, interstisyel hastalıkları ve diğerlerine tanı koymak için, hücreden hastalığa gidiş yapılabileceği gibi, klinik hastalıktan hücresel tanıya giderek doğrulama da yapılır. Hastalıklar dışında BAL hücre dağılımına sigaranın önemli etkisi vardır. Bu etkiler: Sigara içenlerde total hücre sayısı 3-4 kat artar. Sigara içenlerde alveoller makrofaj sayısı 4 kat artar Sigara içenlerde polimorf nötrofil sayısı 6 kat artar. Hiç içmeyenler ile içip bırakanların alveoler makrofaj sayısı 2. yıldan itibaren eşitlenir. Hiç içmeyenler ile içip bırakanların nötrofil sayısı eşitlenmez, yaklaşık 2 kat yüksek kalır. Sigara içenler ile içmeyenlerin nonselüler elemanlarının görünümleri farklıdır (Resim 1a, 1b). T-helper lenfositler, sigara içenlerde, içmeyenlere ve içip bırakanlara göre anlamlı derecede düşer. T-supresor lenfositler, sigara içenlerde anlamlı oranda artar. Th/Ts oranı sigara içenlerde, içmeyen ve içip bırakanlara göre anlamlı derecede düşüktür Hücre Profiline Göre BAL Bulguları Değerlendirildiğinde Polimorf nüveli lökosit, yaklaşık %1 lik normal değerinin üzerine çıkarsa; travmaya bağlı kan kontaminasyon, sigara içiciliği, alveollerde nötrofil artışı ile ilgili akciğer Resim 1a: Sigara içmeyen hastada BAL görüntüsü Resim 1b: Sigara içen hastada BAL görüntüsü
BÖLÜM 13 Bronkoalveoler Lavaj ve Hücre Analizi 117 hastalığı, inflamatuar hava yolu hastalığına bağlı bronş kaynaklı nötrofillerin bulunması gibi durumlar akla gelmelidir (5,6). Aşağıda hücrelerden hastalıklara gidiş trafiği görülmektedir (Tüm resim ve olgular Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıklarına aittir ve resimler yaklaşık 10 bin olgunun içinden seçilmiştir). BAL de Lenfosit Hakimiyeti Aşırı duyarlılık pnömonisi, ilaç indükte alveolit Sarkoidoz İdiyopatik pulmoner fibrozis Berilyozis Amiodoran pnömonitisi Lenfoma Histiositozis X (Resim 4b) (9-11) BAL de Polimorf Nüveli Lökosit Hakimiyeti İdiyopatik pulmoner fibrozis Organize pnömoni Asbestozis, Silikozis Evre 4 sarkoidoz Aşırı duyarlılık ve ilaç pnömonitisi (5,11) BAL de Eozinofil Hakimiyeti Eozinofilik pnömoni (Resim 2) Tropikal pulmoner eozinofili Histiositozis X, Evre 2-3 sarkoidoz Resim 2: Eozinofilik pnömoni Resim 3: Sarkoidoz
118 Selüler ve Nonselüler Elemanlar Birlikte Değerlendirildiğinde BAL Bulguları Sarkoidoz Lenfositler yükselir. Özellikle T hücre lenfositozu görülür. CD4/CD8 oranı normalde 3,5/1 iken 5-10 arasına yükselir (Resim 3) Yüksek ACE düzeyi (granülom yaygınlığının göstergesi) Yüksek prokollagen III peptid Yüksek IL-2 reseptörü Hücre tiplemesi gibi hücrelerin oranlamaları da tanı ile birlikte prognoz değerlendirmesine ışık tutar. Lenfosit artışlı akut başlangıç iyi prognoz, yüksek CD4/CD8 oranı daha hızlı progresyon, artmış mast hücresi kötü prognoz, artmış PNL hücreleri ileri hastalık olarak yorumlanır. İdiyopatik pulmoner fibrozis, sarkoidozla paralellik gösterir. Tanı açısından sarkoidoza göre biraz daha yetersizdir. Yüzde onun üzerinde PNL vardır. Eozinofil yükselmesi, lenfosit artışı olmadan PNL artışı kötü prognozu gösterir. Lenfosit oranı %10 un üzerinde olması steroid tedavisine yanıtın iyi olacağını, %8 den düşük lenfosit oranı ise tedaviye yanıtın zayıf olacağını düşündürür. Aynı şekilde, %4 ün altında PNL, %3 ün üzerinde eozinofil saptanması da tedaviye yanıtın zayıf olacağı anlamına gelir. Biyokimyasal parametreleri (lipid, dietilfosfotidilkolin, hiyalurinik asit, tip III prokollagen) değerlendirmek de tanı, takip ve tedaviye katkı sağlar (Resim 4a) (11). Ekstrensek alerjik alveolitte BAL de, T Lenfositler artar, CD4/CD8 oranı azalır. Ayrıca lenfosit alt gruplarından CD3, CD8, CD10, CD56 ve CD57 ler hastalığın fenotip karakterlerini belirler. Mast hücreleri ile birlikte lenfosit artışı spesifiktir. Makrofaj Resim 4a: İPF Resim 4b: Birbeck kristalleri
BÖLÜM 13 Bronkoalveoler Lavaj ve Hücre Analizi 119 oranları %40 ın altına inebilir. Plazma hücrelerinin varlığı aktif alveolit olarak yorumlanabilir. Özellikle bronkoalveoler karsinom ve lenfoma gruplarında, diğer girişimsel yöntemlerle karşılaştırıldığında %25 oranında tanıya katkı sağlamaktadır (Resim 5). İnfeksiyonlarda, PNL yükselişiyle karakterizedir. Ciddi nötropenik olgularda ise makrofajlar ön plana çıkar. İmmün yetmezlik sendromunda (AIDS) BAL tanıya katkı sağlar (5,9). Bağ dokusu hastalıklarında, interstisyel akciğer hastalığı olan ile olmayan gruplarda farklı hücre profilleri olabilir. Standartlar oturtulduğunda BAL değerleri anlamlı olmaktadır. Romatoid artritte PNL ve makrofajlar artar. Sistemik lupusta CD4/CD8 oranı azalabilir. Alveoler hemorajide (Resim 6), eritrositler, alveoler makrofajlar içinde eritrosit ve hemosiderin saptanması yeterlidir. Eozinofilik granülomda, total hücre Resim 5a: Adenokanser Resim 5b: Küçük hücreli akciğer kanseri Resim 6a: Eritrosit zemininde diğer hücreler (Giemsa) Resim 6b: Alveoler makrofajlarda hemosiderin partikülleri (Sudan III)
120 sayısı artar. PNL ve eozinofil miktarı artar. CD4/CD8 oranı azalır. Langerhans hücreleri ve makrofajlarda Bierbeck granülleri saptanır (Resim 6b). Alveoler proteinoziste proteinöz materyal görülür. İlaca bağlı toksisitelerde, balgam, bronşiyal lavaj materyalleri gibi BAL de tanı koydurucudur. Klinisyene önemli bulgular verir. Atipik dejenere hücreler, hücrelerde eozinofilik inklüzyonlar, doku hasarı bulguları, hemosiderin yüklü makrofajlar ve CD8 artışı tanı koydurucudur. Silikoziste hücre sitoplazmasının tamamını dolduran fagosite materyal bulunur. Hücreler tamamen ölmüştür. Asbestoziste, asbest cisimlerini belirlemede (Resim 7a) ve lipoid pnömoni olgularında köpüklü-vakuollü makrofajların görüntülenmesi tanı koydurucudur (Resim 7b). BAL ve Sigara Çağın en kötü bağımlılığı olarak tanımlanan ve en çok hava yollarında hasar oluşturan sigara içenler ile içmeyenlerin karşılaştırması ise Tablo 2 de verilmiştir. Genel olarak bakıldığında, solunum hastalıklarında bronkoalveoler lavajın alınması ve değerlendirilmesi konusunun çok geniş kapsamlı olması nedeniyle, bütün bilgilerin bir bölümde verilmesi neredeyse olanaksızdır. O nedenle yukarıda anlatılanların dışında bazı olmazsa olmaz bilgileri ancak başlıklar halinde sıralayabiliriz: BAL selüler elemanlarına bakmak için taze materyal kullanılır. Nonselüler elemanlarına bakmak için ilk alınan atılır. Nonselüler eleman bakılsa da tam standardizasyon sağlanamaz. Hücre tiplerine göre sitosantrifüj hızı farklıdır. Hücre tiplerine göre boyama yöntemleri farklı olabilir. En hızlı, basit, tanı değeri yüksek boya, MayGrunwald Giemsa dır. Resim 7a: Asbestozis Resim 7b: Lipoid pnömoni
BÖLÜM 13 Bronkoalveoler Lavaj ve Hücre Analizi 121 Tablo 2: Sigara İçenler ile İçmeyenlerde BAL Hücre Profili Sigara (-) Sigara (+) Total hücre sayısı 100 x 10 400 x 10 Alveoler makrofaj %80-90 %90-95 Lenfosit %10 %1 PNL %1 %1-4 Eozinofil %1 %1 Mast hücre %1 %1 Hücresel ve hücresel olmayan elemanların saklama standartları vardır. BAL de Respiratory syncytial virus, M. tuberculosis, Pneumocystis jirovecii, Legionella ve adeno virüs mikoorganizmalarına bakılır (5-7). BAL materyali değerlendirilmesi, göğüs hastalıkları hekimleri ile moleküler biyologların koordinasyon içinde çalışmasıyla devamlı gelişme gösterecek bir tanı yöntemidir. KAYNAKLAR 1. Technical recommendations and guideliness for bronchoalveolar lavage (BAL) Report of the European Society of pneumology Task Group. Eur Respir J 1989;2:561-85. 2. Costabel U. Atlas of bronchoalveolar lavage. Firsted. Philadelphia, PA:Chapman and Hall 1998. 3. Baughman RP. Technical aspects of bronchoalveolar lavage recommendations for a Standard procedure. Semin Respir Crit Care 2007;28:478. 4. Harbeck RJ. Immunophenotyping of bronchoalveolar lavage Lymphocytes. Clin Diagn Lab Immunol 1998;5:271. 5. Kinder BW, Brown KK, Schwarz MI, et al. Baseline BAL neutrophilia predicts early mortality in idiopathic pulmonery fibrosis. Chest 2008;133:226-32. 6. Yılmaz N. Solunum hastalıklarında sitolojik bulguların tanı değeri. Nobel Tıp Kitabevleri, 2011. İst./Turkey. 7. De Brauwer EI, Jacobs JA, Nieman F. Cytocentrifugation conditions affecting the differential cell count in BAL fluids. Anal Quant Cytol Histol 2000;22:416-22. 8. Haslam PL, Baughwan RP. ERS Task force report on measurement of a cellular components in BAL. Eur Resp Rev 1999;9:25-7. 9. Saltini C, Hance AJ, Ferrans VJ, et al. Accurate quantitation of cells recovered by BAL. Am Rev Resp Dis 1984;130:650-8. 10. Maldonado F, Parambil JG, Yi ES, et al. Haemosiderin-Laden macrophages in the BAL fluids of patients with diffuse alveolar damage. Eur Respir J 2009;33:1361. 11. Dağıstanlı FK, Tunçdemir M, Kaner G, et al. Analysis of Inflammatory cells with Immunohistochemical method in BAL fluids of Sarcoidosis Patients. Türkiye Klinikleri J Med Sci 2012;32:652-8.