DG-APTT Ürünü kullanmadan önce dikkatle okuyun. Sadece laboratuvar tanısında kullanılır. KULLANIM AMACI DG-APTT APTT nin belirlenmesi için bir reaktiftir. Testin kullanım alanları: - İntrensek yol faktör eksikliklerinin belirlenmesinde. - Kusurlu faktör içeren plazma kullanarak tek tek faktör VIII, IX, XI ve XII nin ölçülmesi. - Lupus Antikogülant ın belirlenmesi. - Heparinli tedavinin izlenmesi. GİRİŞ Koagülasyon süreci normal hemostaz için gerekli olan ekstrensek ve intrensek yolları kapsar. Aktif Parsiyel Tromboplastin Zamanı (APTT) aşağıdaki plazma koagülasyon faktörlerini içeren bir tarama testidir. Faktör II, V, VIII, IX, X, XI ve XII, fibrinojen, ve de temas fazı (kallikrein, yüksek molekül ağırlıklı kininojen), platelet faktör 3 ve kalsiyum iyonları. TESTİN PRENSİBİ APTT testi, içinde platelet faktör 3'ün yerini aldığı için fosfolipidlerin bulunduğu bir temas aktivatörü ile plazmanın aktivasyonuna dayanır. Sonra kalsiyum iyonlarının aşırısı eklenir. Örnekte bulunan koagülasyon faktörleri ile orantılı olarak koagülasyon zamanı elde edilir. Bu bakımdan bazı faktörlerin eksikliğini kapsar, spesifik ve spesifik olmayan intrensek yol inhibitörlerinin örnekte bulunması, ve de bu faktörlerden bazılarının sentezini etkleyen (oral antikoagülant tedavisi) veya onların inhibisyonunu arttıran (heparin) ilaçlı tedavi, koagülasyon zamanında uzama yaratır. BİLEŞİM Her bir DG-APTT'nin içeriği: - Sıvı sefalin in 5 ml lik veya 10 ml lik 6 şişesi. Herbir şişe temas aktivatöri olarak ellagic asit (0.10 mmol/l), tavşan beyninin kloroformlu ekstrat ı (0.006% fosfolipid), tampon ve stabilizör. Sarımtırak berrak sıvı. Reaktiflerin hazırlanması DG-APTT: Kullanıma hazırdır. Oda sıcaklığına erişinceye kadar bekletin ve kullanmadan önce tersyüz ederek karıştırın. Açıldığı zaman kararlılığı: Kullanılmadığı zaman şişe tapa ile kapalı ve kapağı sıkı olarak muhafaza edildiğinde 2-8 ºC de 30 gün. Depolama için uygun olmayan koşullardan, içeriğin kontaminasyonundan ve uzun süre sıcaklığa maruz kalmasından sakının. Eğer doğru bir şekilde sızdırmaz yapılmazsa, reaktif kararlılığında azalma gerçekleşebilir. Beklemeye bırakıldığında ellagic asit/lipid in yeşilimsi tortusu gözlenebilir, şişe içeriği karıştırıldığında ortadan kaybolur. Eğer reaktifin renginde değişim olursa ve/veya çözünmez tortuların bulunduğu gözlenirse şişeyi atın. Dondurmayın. KARARLILIK Açılmamış tüm reaktifler 2-8 ºC de saklandığında etikette belirtilen son kullanma tarihine kadar kararlılığını korur. GEREKLİ MATERYAL (TEMİN EDİLMEMİŞTİR) - Kalsiyum Klorür 0,025 mol/l (DG-CaCl2 0,025M). - Test edilmiş kontrol plazmaları: DG-C1 ve DG-C2. - Kontrol plazmalarının kullanıma hazırlanması için uygun saf su. - 100 μl kalibrasyonlu otomatik pipetler. - Tek kullanımlık plastik pipet uçları. - Tek kullanımlık plastik Pasteur pipetleri. - Tek kullanımlık plastik tüpler. - Tek kullanımlık eldivenler - 37 ºC'lik su banyosu. - Kronometre. - Optik veya mekanik koagülometre. ÖRNEK 1. Koagülasyon testlerini gerçekleştirmek için, örnek toplanırken ve/veya sonrasında laboratuvar içi değişimlere neden olan durumlardan mümkün olduğunca kaçınmak amacıyla, venöz kan örneği prosedürlerde tavsiye edildiği gibi ekstrakte edilmeli, toplanmalı, taşınmalı, saklanmalı ve kullanılmalıdır. 2. Dokuz ölçü yakın zamanda ekstrakte edilmiş kan ile bir ölçü sodyum sitrat ın (dehidrate trisodyum sitrat) plastik veya silikon tüpte tersyüz ederek yavaşça karışmasını sağlayın. Karıştırmayın! Her ne kadar çoğu laboratuvarda normal uygulamada 3.8% trisodyum sitrat (0.129 mol/l) kullanılıyorsa da, NCCLS13 3.2% (0.109 mol/l) lik konsantrasyonda kullanılmasını öneriyor (bu konsantrasyon kan ile izoozmotik olduğu için). APTT zamanı testi preanalitik değişikliklere karşı çok hassastır. Kalsiyumun olması nedeniyle, sitrat konsantrasyonu test sonucunu etkileyebilir. Bu yüzden, her zaman aynı konsantrasyonda sitrat ile çalışılması ve sabit antikoagülantın (örnek hacmi oranı) devam ettirilmesi çok önemlidir. 3. Yukarıdaki hematokrit değerlerine göre hastaların son sitrat konsantrasyonları ayarlanmalıdır. 4. Pıhtılı veya hemolizli örnekleri atın, bunlar yanlış tüplere alınmış veya son hacmi (antikoagülant:örnek oranı) yanlış olan örneklerdir. 5. Lipemik veya ikterik örnekler optik koagülometrelerde kullanılmamalıdır.
6. Yüksek sıcaklığa ve/veya direkt güneş ışığına maruz kalmasından kaçının. 7. Plazma örneği elde etme işlemi süresince ve örnek işleme konulana kadar, uçucu karbonik asitlerin buharlaşmasından dolayı örnekte ph değişimlerini önlemek için tüpler usulüne uygun bir şekilde kapalı tutulmalıdır. 8. Kapaklı tüpler oda sıcaklığında 1500 g'de en az 15 dakika veya eşdeğer hız ve sürede plateleti az plazma (<10000 platelet/μl) elde etmek için santrifüjlenmelidir, tercihen dışa dönüşlü rotorda. Heparinli örnekler 60 dakika içinde santrifüjlenmelidir. 9. Tek kullanımlık plastik Pasteur pipeti veya plastik uçlu pipet kullanarak plazmayı plastik tübe aktarın. 10. Tavsiye edilen süre, kanın ekstraksiyonu ve örneğin analizlenmesi arasındaki zaman aralığı, örneğin taşınması ve saklanması sırasındaki sıcaklığa bağlıdır. Eğer kapalı tüpte oda sıcaklığında (18-25 ºC) tutulmuşsa, örnek 4 saat içinde analizlenmelidir. TEST METODU DG-APTT manuel, yarı otomatik veya otomatik cihazlarda kullanılabilir. Otomatik sistem için cihazın kullanıcı kılavuzuna bakın. Manuel Metod 1. Kullanımdan önce, örnekleri ve reaktifleri oda sıcaklığına gelmesi için bekletin (18-25 ºC). DG-APTT reaktifini kullanmadan önce tersyüz ederek karıştırın. 2. Kalsiyum klorür ü 0.025 mol/l (DG-CaCl2 0.025 M) 37 ºC'de inkübe edin. 3. Tek kullanımlık plastik uçları kullanarak örneğin 0.1 ml sini plastik tüplere dağıtın. 4. 18-25 ºC sıcaklıktaki DG-APTT nin 0.1 ml sini ekleyin ve karıştırın. 5. 37 ºC de 3 dakika inkübe edin. 6. 0.1 ml kalsiyum klorür 0.025 mol/l (DG-CaCl2 0,025M) ekleyin ve aynı zamanda kronometreyi başlatın. 7. Pıhtı oluşumunu gözlemleyin ve ilk fibrin net olarak belirdiğinde kronometreyi durdurun. Plazma örnekleri 37 ºC de 5 dakikadan fazla kalmamalıdır. Daha fazla hassasiyet için, bireysel laboratuvarların prosedürlerine göre inkübasyon süresi standardize edilmelidir. APTT kullanılarak heparinin izlenmesi APTT testi heparinin izlenmesi için çok kullanılmaktadır, çünkü koagülasyonda heparinin tüm etkilerini göstermektedir. Heparinin izlenmesinde aşağıdaki ölçümler dikkate alınmalıdır. 1. Heparinin yarı ömrü 1.5 saattir, bunun için örneğin ekstraksiyon zamanı önemlidir. 2. APTT testi ekstraksiyondan sonra hızlıca gerçekleştirilmelidir, çünkü geçen zaman APTT'yi uzatır. 3. Hastanın tedaviye cevabının derecesini belirleyebilmek için, tedaviye başlamadan önce herbir hasta için taban değer ayarlanmalıdır. 4. Heparin ile tedavide APTT değerinin takibinde koagülometre kullanılmasının büyük önemi vardır. Kullanılan cihaz ve reaktif dikkate alınarak her laboratuvarda heparin için terapötik aralık oluşturulmalıdır. Benzer şekilde her yeni reaktif lotunda terapötik aralık yeniden belirlenmelidir. 5. Uygunsuz kan ekstraktsiyonunda olduğu gibi plazma örneğinin düşük sıcaklıkta saklanması platelet faktör 4 ün salınmasına yardımcı olabilir, bu şekilde heparin nötralize olur. Bu nedenle, örnek ekstrakte edildiğinde çok özen gösterilmelidir ve oda sıcaklığında saklanmalıdır. SONUÇLAR Saniyeler APTT sonuçları saniye olarak rapor edilebilir. Bu durumda, sonuçlar APTT testinin her laboratuvarda her cihaz ve reaktif lotu değişiminde kontrol edilerek oluşturulan normalite aralığı ile karşılaştırılmalıdır. Normal aralık, en az 20 sağlıklı donörün ortalaması ± 2SD olarak hesaplanmalıdır. Ne DG-C1 değeri ne de referans plazma (DG-REF) değerleri normal aralık yerine kullanılmamalıdır. R (Oran) APTT sonuçları aşağıdaki gibi hesaplanan oran ile rapor edilebilir. R= saniye olarak örneğin APTT değeri / saniye olarak sağlıklı donörlerin plazma APTT değeri ortalaması veya DG- REF değeri. KALİTE KONTROL PT için bir normal ve bir anormal kontrol plazması test edilir (sırasıyla DG-C1 ve DG-C2), sistemin (cihaz-reaktif) doğru performans vermesi kontrol edilmiş, herbir analiz serisi örnek ile aynı şekilde analizlenmiş plazma kullanılır. Kullanıma hazırlanmış dondurularak kurutulmuş kontrollerin kullanımı için uygun talimatları izleyin. İş günü başlangıcında, gün içinde olduğu gibi tespitin yapılması ve kontroller için elde edilen APTT değerlerinin oluşturulan aralıkta olup olmadığının kontrol edilmesi uygundur. Aynı zamanda her reaktif değişiminde veya büyük cihaz ayarlamalarında kontroller kullanılmalıdır. Analitik hata reaktifler, cihazlar, örnek ve reaktif dağıtıcılardan ölçümdeki hatada artış vererek etkilenir. Tayinlerin iki kopya şeklinde gerçekleştirilmesi tavsiye edilir. İki kopya arasındaki farkın, ortalama değerlerinin %10'u içinde olması gerekir. Eğer değer oluşturulan aralığın dışında elde edilirse reaktifler, kontroller ve kullanılan ekipman kontrol edilmelidir. Verileri raporlamadan önce sebebini araştırın.
REFERANS ARALIK Cihazlar, laboratuvarlar ve yerel popülasyonlar arasında farklılıklar bulunduğu için her laboratuvar kullandığı ekipmana göre kendi referans aralığını oluşturmalıdır. Örneğin, mekanik ve optik AMGA koagülometrede 30 normal birey çalışılarak elde edilen APTT değerleri kullanılarak normal aralık oluşturulur. Aralık ortalama ± 2SD olarak belirlenir. Bu aralıklar yol göstermek içindir ve asla referans olarak kullanılamaz; reaktif lotu, cihaz veya örnek toplama sistemindeki herbir değişim kontrol edilerek her laboratuvar kendi aralığını oluşturmalıdır. Özellikle yarı otomatik cihazların kullanımında, analist, kullanılan teknik ve cihazlardaki değişikliklere bağlı olarak sonuçlarda değişme olabileceği dikkate alınmalıdır. PERFORMANS KARAKTERİSTİKLERİ Her kullanıcı kullandığı cihazlara göre kendi performans karakteristiklerini oluşturmalıdır. Doğruluk DG-APTT'nin doğruluğu normal aralıkta yer alan (DG-C1, DG-REF) ve anormal aralıkta yer alan (DG-C2) dondurularak kurutulmuş plazma kullanılarak elde edilen APTT değerleri ile belirlenir. Doğruluk farklı günlerde, farklı lotlarla, farklı analist ve cihazlarla (KC10 yarıotomatik koagülometre ve otomatik koagülometre) (Amax, mekanik ve optik sistem) APTT çalışılarak belirlenmiştir. Test içi doğruluk Test içi doğruluk KC10 ve Amax koagülometrelerinde DG-APTT nin 3 lotunda, DG-REF in 1 lotu, DG-C1 nin 2 lotu ve DGC2 nin 2 lotu kullanılarak belirlenmiştir. DG-APTT nin herbir lotu için plazma başına en az 3 test gerçekleştirilir. Her plazma için gerçekleştirilen testlerin toplamından elde edilen varyasyon katsayısı (%CV) aşağıdaki tabloda gösterilmiştir. Testler arası doğruluk DG-APTT 1 lotu için testler arası doğruluk KC10 koagülometre kullanılarak, 10 farklı günde DG-REF in 1 lotu, DG- C1 in 1 lotu ve DG-C2 nin 1 lotu ile belirlenmiştir. DG-APTT 2 lotu için testler arası doğruluk Amax koagülometre kullanılarak, 10 farklı günde DG-REF in 1 lotu, DG-C1 in 1 lotu ve DG-C2 nin 1 lotu ile belirlenmiştir. Elde edilen (%)CV aşağıdaki tabloda gösterilmiştir: Lotlar arası doğruluk Lotlar arası doğruluk KC10 koagülometre (testler 3 analist ile gerçekleştirilmiştir) ve Amax koagülometre (mekanik sistem) kullanılarak DG-APTT'nin 3 lotu için DG-REF in 1 lotu, DG-C1 in 1 lotu ve DG-C2 nin 1 lotu ile belirlenmiştir. Aşağıdaki tabloda elde edilen (%) CV ler sınıflandırılmıştır:
Laboratuvar içi tekrarlanabilirlik DG-APTT nin laboratuvar içi tekrarlanabilirliği farklı lotlar, farklı cihazlar, farklı günler ve analistleri kapsamaktadır. Laboratuvar içi tekrarlanabilirlik DG-C1'in 1 lotu (n=120) ve DG-C2 nin 1lotu (n=118) ile DG-APTT nin 3 lotu ve 2 koagülometre (KC10, 3 analist; Amax mekanik) kullanılarak belirlenmiştir. Aşağıdaki tabloda sonuçlar gösterilmiştir: Duyarlılık Faktörlere duyarlılık DG-APTT ağır intrensek yol faktör eksikliklerine duyarlıdır. Faktör VIII, IX, XI veya XII eksikliği olan hastalarla yapılan 2 eksternal çalışmada hastaların %30 undan azında APTT değeri normal aralığın dışında uzama göstermiştir. Heparine duyarlılık DG-APTT 0.25 U/ml üstündeki konsantrasyonda un-fraksiyone heparine duyarlıdır. Amax mekanik cihazda heparinin farklı konsantrasyonlarında dondurularak kurutulmuş referans plazma ile gerçekleştirilen çalışmalarda görülmüştür. Lupus Antikoagülanta duyarlılık DG-APTT, Lupus Antikoagülant (LA) a karşı duyarlıdır. Diluted Russell Viper Venom Time (DRVVT) ile doğrulanan LA lı hastalara ait 22 örnek eksternal çalışmada test edilmiştir. Örneklerin %55 i DG-APTT ile belirlenmiştir, diğer APTT reaktiflerinin kullanıldığı çalışma ile belirlenenlere benzer yüzdedir. SINIRLAMALAR Toplama, taşıma, saklama ve kullanma ve de standardize edilmiş prosedürlerin kullanımıyla analitik metodun gelişimi koagülasyon testi sonuçlarının kalite ve güvenilirliğini sağlaması açısından çok önemlidir. Örneğe dair sınırlamalar: - Örnek alınırken ve/veya sonrasında laboratuvar içi değişikliklerin neden olduğu: 1. Örneğin hatalı alınması: vücudun pozisyonu, kan alma metodu, kontaminasyon (tüplerin heparinle), kan/antikoagülant karışım oranı, antikoagülant (hacim, tip, konsantrasyon). 2. Yanlış depolama ve/veya taşıma: sıcaklık ve süre 3. Yanlış kullanım: santrifüjleme, dondurma, tekrar eritme. 4. Pıhtılı, hemolizli, ikterik veya lipemik örnekler. - Örnek alınmadan önce meydana gelen laboratuvar dışı" değişiklikler: Hasta örneğinin APTT sonucunu değiştiren koşullar aşağıda tanımlanmıştır: stres, hamilelik, doğum sonrası, cerrahi, derin ven trombozu ile ilişkili protrombin değişiklikleri, tromboembolik bozuklar ve östrojen kullanımı. Benzer şekilde, karaciğer hastalığı, yaygın damar içi pıhtılaşma, bazı ilaçların kullanımı (oral antikoagülantlar, heparin ve trombolitik ajanlar) olan hastalarda APTT değişir. Yeni doğanlarda uzamış APTT tanımlanmıştır. Genel olarak cinsiyet, yaş, kilo, bioritim, diyet, ilaçla tedavi, etnik ve coğrafi karakteristikler ve haplar sonuçların doğru yorumlanması için dikkate alınmalıdır. Reaktife dair sınırlamalar: 1. Kontamine olmuş reaktif. 2. Yanlış depolama ve/veya taşıma. 3. Açılmamış veya kullanıma hazırlanmış ürünün son kullanma tarihinden sonra kullanımı. 4. Tavsiye edilen depolama süresini aşan reaktifin artan kısmının şişelere doldurulması. 5. Aynı şişenin tekrar doldurulması. 6. Farklı lotlardaki reaktiflerin karıştırılması. Analize dair sınırlamalar: 1. Yanlış teknik prosedür: inkübasyon, süreler, sıcaklıklar, hacimler. 2. Örnekler veya diğer reaktiflerle geçişli kontaminasyondan kaçınmak için tek kullanımlık plastik pipet uçları ve tüpler kullanılmalıdır. 3. Cihazın kullanımında yanlış prosedür uygulanması. UYARILAR VE ÖNLEMLER Laboratuvar içi" tanı reaktiflerinin profesyonel kullanımı aşağıdaki talimatları dikkate almayı gerektirir: - DG-PT biyolojik (hayvansal) orjinli bir üründür. Bulaşıcı hastalıkların aktarılmasında potansiyel risk yaratır. - Ürün sadece kalifiye personel tarafından kullanılmalıdır. - Kullanılan ürün özel biyolojik atık kabına konulmalıdır. - Ürünün kullanımıyla ilgili kuşkunuz varsa veya daha fazla bilgiye ihtiyaç duyarsanız, ülkenizdeki yetkili dağıtıcıya danışın. KAYNAKÇA 1. Langdell R et al. Effect of Antihemophilic Factor on One-Stage Clotting Tests. J.Lab.Clin.Med., 41: 637-647,1953. 2. Bell WN and Alton HG. A brain extract as a substitute for platelet suspensions in the thromboplastin generation test. Nature, 174: 880-881, 1954. 3. Ratnoff O, Crum JD. Activation of Hageman factor by solutions of ellagic acid. J.Lab.Clin.Med., 63: 359-377, 1964. 4. Brandt JT, Triplett DA. Laboratory Monitoring of Heparin. Effect of Reagents and Instruments on the Activated Partial Thromboplastin Time. Am.J.Clin.Path., 76: 530-537, 1981. 5. Creagh MD et al. Screening for lupus anticoagulant and anticardiolipin antibodies in women with fetal loss. J.Clin.Path., 44: 45-47, 1991. 6. Hirsh J, Raschke R, Warkentin TE, Dalen JE, Deykin D, Poller L. Heparin: mechanism of action, pharmacokinetics,
dosing considerations, monitoring, efficacy and safety. Chest, 108: 258S-275S, 1995. 7. NCCLS Standard H47-A: One stage Prothrombin time (PT) test and Activated Partial Thromboplastin time (APTT) test; Approved Guideline, 1996. 8. Jespersen J et al, Laboratory Techniques in Thrombosis. A manual, p 37-44, 2nd edition, Kluwer Academic Publishers, London, 1999. 9. Kitchen. Problems in laboratory monitoring of heparin dosage. British J. of Haematol., 111: 397-406, 2000. 10. Guder WG. Samples: From the patient to the laboratory, p 52-53, 66-67, 2nd edition, Git-Verlag, Germany, 2001. 11. Informe DR-H03/02, DG-APTT LA. Estudios de repetibilidad y reproducibilidad., Diagnostic Grifols, 2002. 12. Kitchen S, Makris M, Preston FE. Evaluation of two new APTT reagents in comparison with a reagent widely used in the UK: Sensitivity to Factor deficiencies and Lupus anticoagulant (Poster). XXV International Congress of the World Federation of Haemophilia, Haemophilia, 8: 502-506, 2002. 13. Unitat d Hemostàsia i Trombosi, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Evaluación de los reactivos de cefalina de Diagnostic Grifols para la determinación de los tiempos de tromboplastina parcial activada (TTPA). Barcelona, 2002. (Assessment of the cephalin reagents of Diagnostic Grifols for determining the activated partial thromboplastin times (APTT). Barcelona, 2002.) 14. NCCLS Standard H21-A3: Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Coagulation Testing and General Performance of Coagulation Assays; Approved Guideline-3rd Edition, 1998. SUNUM 213888 DG-APTT 6 x 5 ml 213889 DG-APTT 6 x 10 ml Revizyon tarihi: eylül 2003 Bu döküman birkaç dilde mevcuttur. Çeviriler ingilizce olan ana dökümandan yapılmıştır. Şüpheler veya farklılıklar olması durumunda ingilizce olan ana dökümandaki anlatıma öncelik verilmelidir. Diagnostic Grifols, S.A. Passeig Fluvial, 24-08150 Parets del Vallès, ESPAÑA (SPAIN)