REF TR-V33 VER 04.03.09 Avian A Tarama & H5N1Tipleme FRT Kullanılan Semboller REF Liste Numarası 2-8 C/ -20 C de saklayın RUO Sadece Araştırma Kullanımı için Dikkat! LOT Lot Numarası VER Versiyon Son Kullanma Tarihi Negatif Kontrol Kullanım Bilgileri Pozitif Kontrol Reaktif İçerir Üretici İSİM Avian A Screening & H5N1Typing FRT GİRİŞ Avian influenza (kuş gribi) gribi virüsü tip A suşların neden olduğu bir infeksiyon kuş hastalığıdır. İlk İtalya'da 100 yıl önce tespit edilmiş olan bu hastalık dünyada yaygın olarak oluşur. Bazı türlerin diğerlerinden daha fazla enfeksiyona dirençli olmasına rağmen, tüm kuşların kuş gribi enfeksiyonuna duyarlı olduğu düşünülmektedir. Şiddetli salgınlarla sonuçlanan son derece bulaşıcı ve hızlıca ölümcül hastalık aralığında kuşlarda belirtiler geniş bir spektruma neden olur. Sonraki "yüksek derecede patojenik kuş gribi" olarak bilinir. Hastalığın bu formunun yaklaşık % 100 ani ve şidderli ölüme neden olur. 15 kuş gribi virüsünün alt tiplerine ait H5N1 tip özellikle önemlidir. H5N1 hızlıca mutasyona uğrar ve diğer hayvan türlerine bulaşan virüslerin genlerinde oluşma eğilimine sahiptir. Bu eğilimin insanlarda ciddi hastalığa neden olduğu şimdi birçok vakada kanıtlanmıştır. Ayrıca, laboratuvar çalışmaları gösterir ki virüsten izole edilen yüksek patojenite sahiptir ve insanlarda ağır hastalığa neden olabilir. KULLANIM AMACI Avian A Screening & H5N1Typing FEP H5N1 alt tipi için pozitif örneklerin genotiplemesinin ve klinik örneklerde Avian influenza A virüsü RNA in kalitatif tespiti için Real-Time amplifikasyon testidir. Bu kit Rotor- Gene 2000/3000/6000 (Corbett Research) ve iq5 yada iq icycler (Bio-Rad) ile kullanım için optimize edilmiştir. TEST PRENSİBİ Avian A Screening & H5N1Typing FRT Test dört temel aşamaya dayanır: örneklerden Avian influenza A virus RNA izolasyonu, RNA nın reverse transkripsiyonu, H5N1 alt tipinin sonraki tanımlanması ile Avian influenza A virus ün cdna'nın Real Time amplifikasyonu. KİT İÇERİĞİ Part N 1 Ribo-Sorb : klinik örneklerden RNA izolasyonu (bir alternatif olarak Ribo Virus spin kolon extraction kit cat. No. K-2/C); Part N 2 Reverta-L : RNA ın reverse transkripsiyon ; Part N 3 Avian A : Real Time tarama amplifikasyon kit; Part N 4 Avian H5N1 : Real Time genotipleme amplifikasyon kit;
Part N 1 Ribo-Sorb : Lysis Solution, 22,5 ml; Washing Solution, 20 ml; Sorbent, 1,25 ml. RNA-eluent, 5 x 0,5ml; 50 test için gerekli reaktif içerir. Part N 2 Reverta-L : RT-G-mix-1, 5 x 0,01 ml; RT-mix, 5 x 0,125 ml; Reverse transcriptase (M-MLV), 0,03 ml; TE-buffer, 1,2 ml. 60 test için gerekli reaktif içerir. Part N 3 Avian A : PCR-mix-1 Screening, 55 ready-to-use single-dose test tubes; PCR-mix-2-Flu, 0,77 ml; Positive Control cdna Avian A C+, 0,1 ml; Negative Control, 5 x 1,2 ml; Internal Control, 5 x 0,12 ml; DNA buffer, 0,5 ml; 55 reaksiyon için gerekli reaktif içerir. Part N 4 Avian H5N1 : PCR-mix-1 H5N1, 55 ready-to-use single-dose test tubes; Positive Control cdna H5 C+, 0,1 ml; Positive Control cdna N1 C+, 0,1 ml 55 reaksiyon için gerekli reaktif içerir. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Zone 1: örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D ya da benzeri 60 C ± 2 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler (5-40 µl; 40-200 µl; 200-1000 µl) 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Tek kullanımlık eldiven, pudrasız Tüp raklar 70% Etanol (% 96 etanol ve saf su ile reaktifin taze hazırlanan karışım) Aseton Buzdolabı Dondurucu Zone 2: RT ve amplifikasyon: PCR Fluorescence Detector Aladin (Sacace) Workstation Aerosol bariyerli pipetörler (0,5-10 μl; 5-40 μl) Tüp rakları UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Lizis Solusyonu, guanidine tiyosiyanat içerir. Guanidine tiyosiyanat solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysisi ve göz koruyucu kullanın. Çalışmalardan sonra ellerinizi yıkayın. 3. Ağızla pipetleme yapmayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın.
6. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 7. Şüpheli influenza A (H5N1) vakasından alınan klinik örnekler Sınıf II biyolojik kabinlerde standart BSL2 iş uygulamaları kullanılarak test edilebilir. 8. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 9. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 10. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 11. Bu kit Ribo-Sorb ekstraksiyon kiti ile kullanılmak için dizayn edilmiştir. Eğer Ribo-Sorb dan başka bir kit ile RNA ekstraksiyonu yapılıyorsa bu kullanıcı sorumluluğundadır. 12. Bu kiti ancak DNA amplifikasyon tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 13. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alanından başlayıp Amplifikasyon ve Belirleme alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI Avian A Screening & H5N1Typing FRT +2-8 C de saklanmalıdır ( Reverta-L -20 C de). Kit 3-4 boyunca 2-8 C de taşınabilir fakat 2-8 C de ve -20 C de saklanmalıdır. KARARLILIK Avian A Screening & H5N1Typing FRT etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. Ürünün performansı etiket üzerinde yazılı kontrol tarihi ile sağlanacaktır. Işık, ısı ya da neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerin raf ömrünü etkileyebilir. Tekrarlanan çözdürme ve bu reaktiflerin dondurulması duyarlılığı azaltabildiği için bu durumdan kaçınılmalıdır. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT Avian A Screening & H5N1Typing FRT aşağıdaki materyallerden Ribo-Sorb (REF K-2-1) ile ekstre edilmiş RNA lar ile analiz edilebilir: İnsan diagnostik: mukozal swablar (nazal,oral): swab alın ve 0,5 ml tuzlu su yada PBS sterilli Eppendorf tüp içine koyun. Kuvvetlice sallayın. Swabı tekrar edin ve aynı tüp içinde sallayın. 1000g/min de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı atın ve 100 µl saline suda pelleti tekrar süspanse edin. bronşiyal lavaj, nazal yıkama: 2000 g/dk da 10-15 dakika boyunca santrifüj edin. Eğer pellet görünmezse, 10 ml sıvı ekleyin ve tekrar santrifüj edin. Süpernatantı alın ve atın. 100 µl saline su içinde pelleti tekrar suspense edin. Hayvan diagnostic: Dışkı: o Saline solüsyonlu 10% dışkı (4-5 g) süspansiyonu hazırlayın. Suspensiyon homojen olana kadar vorteksleyin, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Steril 1,5 ml polipropilen tüpe süpernatantı aktarın ve 5 dakika 7000-12000g de santrifüj edin. RNA ekstaraksiyonu için süpernatantı kullanın. animals feeds and feeds for poultry: cam çubuklar, teflon tokmak, skalpel ya da mekanik homojenizör ile homojenize edilmiş. cloaca swabs: 1,0 ml saline su ve PBS steril tekrar süspanse edin ve 1000g/min de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı alın ve atın. 100 µl saline suda pelleti tekrar süspanse edin. doku: cam çubuklar, teflon tokmak, skalpel ya da mekanik homojenizör ile homojenize edilmiş ve 1,0 ml tuzlu su ya da PBS sterilde çözülmüş 1,0 gr (parenchimatous organları, trakea, akciğer, beyin). Kuvvetlice vorteksleyin ve oda ısısında 30 dakika inkübe edin. Supernatantı yeni 1,5 ml tüpe aktarın; 12 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri +2-8 C de ya da daha uzun saklamak için 20/80 C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik ajanların transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solüsyonu ve Yıkama Solüsyonu (diğerleri +2-8 C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar 60 65 C ye kadar ısıtılır. Negatif Kontrol Ekstraksiyonu için bir tüp içeren 1,5 ml polipropilen tüplere gerekli miktarda hazırlayın. 2. Her bir tüpe 450 μl Lizis Solüsyonu, 10 µl Internal Kontrol (IC RNA) ve 50 µl Negative Controlekleyin. Pipetleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 3. Lizis Solüsyonu, IC ve C- uygun tüplere 50 μl örnek ekleyin. 4. Aşağıdaki gibi Kontrolleri hazırlayın: Cneg işaretli tüpe 50 μl C Negatif Kontrol ekleyin.
5.Tüpleri vorteksleyin ve 5000g de 5 sn santrifüj edin. Eğer örnek tamamen çözülmezse, maksimum hızda (12000-16000 g.) 1 dakika tüpleri tekrar santirifüj edin ve RNA ekstraksiyonu için yeni bir tüp içine supernatantı aktarın. 6. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve her bir tüpe 25 μl ekleyin. 7. 5-7 saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 10 dakika inkübe edin. Periyodik olarak vorteksleyin. 8. Tüm tüpleri 10000g de 1 dk santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 9. Her bir tüpe 400 μl Yıkama Solusyonu ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıpalı bir aerosol bariyerli uçlu mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 10. Her bir tüpe 500 μl 70% Etanol ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıpalı bir aerosol bariyerli uçlu mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 11. Adım 10 tekrar edin. 12.Her bir tüpe 400 µl Aseton ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıpalı bir aerosol bariyerli uçlu mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 13. 65 C de 10 dakika açık kapakla bütün tüpleri inkübe edin. 14. Pelleti 40 μl RNA-eluent içinde yeniden suspense edin. 60 C de 10 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. Maksimum hızda (12000-16000 g) 2 dakika boyunca tüpleri santrifüjleyin. 15.Supernatant amplifikasyon için hazır RNA içerir. RT-PCR ile aynı günde yapılmalıdır. Eğer çalışılmayacaksa, RNA çökeltisini -80 C de bir aya kadar saklayabilirsiniz. RT VE AMPLİFİKASYON Reverse Transkripsiyon: 1) Reaktif Miks hazırlayın: 12 reaksiyon için, RT-mix içeren tüplere 5,0 μl RT-G-mix-1 ekleyin ve en az 5-10 saniye vorteksleyin, kısa süre santrifüjleyin. Bu karışım -20 C de 1 ay boyunca stabildir. Reaksiyon Miks olan tüplere 6 μl M-MLV ekleyin, pipetle karıştırın,3 saniye vorteksleyin, 5-7 saniye santrifüj edin (hazırlandıktan sonra hemen kullanılmalıdır). (Eğer 12 örnekten daha az test gerekirse, steril bir tüp içine RT-mix ile 10*N μl RT-G-mix-1 ve 0,5*N μl M-MLV her bir numune için ekleyin) 2)Her bir örnek tüpüne 10 μl Reaksiyon Mix ekleyin. 3) Uygun tüplere 10 μl RNA örneği ekleyin (Eğer Ribo-Sorb izolasyon kit RNA ekstraksiyon kiti olarak kullanırsa, ekstre RNA ile bütün tüpleri 2 dakika boyunca maksimum hızda (12000-16000 g) tekrar santrifüj edin ve supernatantı dikkatlice alın. Reaksiyonla inhibe olan sorbent pellete dokunmayın ). Pipet kullanarak dikkatlice karıştırın. 4) Tüpleri termocycler içine yerleştirin ve 37 o С de 30 dakika inkübe edin. 5) Her bir cdna örneğini TE-Buffer ile 1: 2 seyreltin (her bir tüpe 20 μl TE-buffer ekleyin). cdna örnekleri -20 o С de 1 hafta ya da -70 o С de bir yıl saklanabilir. Real Time Amplifikayson (Tarama kit): Reaksiyon Mix 25 µl 1. Örnekler ve kontroller için gerekli miktarda PCR-mix-1-Screening tüpleri hazırlayın. 2. Her bir tüpe 7 μl PCR-mix-2 Flu ekleyin. 3. Uygun tüplere cdna samples den 10 µl örnek ekleyin. 4. Her bir panel için 2 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Negatif Kontrol işaretli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; A pos işaretli tüpe 10 µl Positive Control Avian A C+ ekleyin. Rotor-Gene 2000/3000/6000 ile Real Time Amplifikasyon 1. PCR-mix-1 tüpleri açın ve Rotor-Gene 2000/3000/6000 içine transfer edin. 2. Aşağıdaki gibi Rotor-Gene 2000/3000/6000 programlayın: Reaksiyon Hacmi (μl): 25 Karousel: 36-kuyu Sıcaklık Profili: 1. Bekleme: 95 C 5 dk 2. Döngü 1 95 C 10 sn 54 C 20 sn 72 C 10 sn Döngü tekrarı 10 kez 3. Döngü 2 95 C 10 sn 54 C 20 sn - Fam (Green) ve Joe (Yellow) kanalında floresans tespit 72 C 10 sn Döngü tekrarı 35 kez
3. Floresan kanal duyarlılık düzenlemesi yapın: Channel Setup (Kanal Kurulum) Calibrate (Kalibrasyon) Auto Gain Calibration Calibrate Acquiring (Kalibrasyon Elde edilmesi) ve Perform Calibration (Perform Kalibrasyon) (Optimizasyon) 1. devralmadan önce seçin. Fam/Sybr kanalı için Min Okuma 10, Max Okuma 20 ve Joe kanalı için Min Okuma 5, Max Okuma 10 görünür. Tüp pozisyon kolonunda Rotor-Gene 2000/3000 karuselinde tüp pozisyonunu programlayın. Auto Gain Calibration Setup kapatın. ANALİZ SONUÇLARI IC amplifikasyon analizleri (Rotor-Gene 6000 için kanal Cycling A.Joe yada Cycling A.Yellow ) 1. Analysis basın ve sonra Quantitation Cycling A.Joe Show seçin. 2. Threshold otomatik seçeneğini kapatın. 3. Dynamic Tube, Slope Correct butonlarına basın. 4. More Setting penceresinde (Rotor-Gene 6000 için Outlier Removal ) NTC Threshold 20% a ayarlayın. 5. Threshold: 0,1 seçin. 6. Ct değeri (Eşik döngüsü) görünen sonuç tablosunda (Quantitation Analisis) değer 31 olmalıdır (Eğer > 31ise, tüm örneğin tekrar test edilmesi gereklidir). Avian cdna amplifikasyon analizleri (Rotor-Gene 6000 için kanal Cycling A.Fam yada Cycling A.Green ) 1. Analysis basın ve sonra Quantitation Cycling A.Fam Showseçin. 2. Threshold otomatik seçeneğini kapatın. 3. Dynamic Tube, Slope Correct butonlarına basın. 4. More Setting penceresinde (Rotor-Gene 6000için Outlier Removal ) set NTC Threshold 10% a ayarlayın. 5. Ct calculation menüsünde Threshold: 0,1 seçin. 6. Sonuç tablosunda (Quantitation Analisis) Ct değeri (Eşik döngüsü) görünür. 7. Fam kanalında Ct < 33 lı örnekler Avian A Virus için pozitif olarak yorumlanır. 8. Fam kanalında Ct değeri olmayan örnekler Avian A Virus için negatif yorumlanır. AVIAN INFLUENZA A VIRUS ÖRNEKLERİ İÇİN POZİTİF H5N1 GENOTİPLEME Real Time Amplifikasyon (Genotipleme kit): 1. Örnekler ve kontroller için gerekli miktarda PCR-mix-1-H5N1 tüpleri hazırlayın. 2. Her bir tüpe 7 μl PCR-mix-2 Flu ekleyin. 3. Uygun tüplere cdna samples den 10 µl örnek ekleyin. 4. Her bir panel için 3 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Negatif Kontrol işaretli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; H5 pos işaretli tüpe 10 µl Positive Control cdna H5 C+ ekleyin; N1 pos işaretli tüpe 10 µl Positive Control cdna N1 C+ ekleyin. Rotor-Gene 3000 ile Real Time Amplifikasyon 1. PCR-mix-1 tüpleri açın ve Rotor-Gene 2000/3000/6000 içine transfer edin. 2. Aşağıdaki gibi Rotor-Gene 2000/3000/6000 programlayın: Reaksiyon Hacmi (μl): 25 Karousel: 36-kuyu Sıcaklık Profili: 1. Bekleme: 95 C 5 dk 2. Döngü 1 95 C 10 sn 54 C 20 sn 72 C 10 sn Döngü tekrarı 10 kez 3. Döngü 2 95 C 10 sn 54 C 20 sn - Fam (Green) ve Joe (Yellow) kanalında floresans tespit 72 C 10 sn Döngü tekrarı 35 kez 3.Floresan kanal duyarlılık düzenlemesi yapın: Channel Setup (Kanal Kurulum) Calibrate (Kalibrasyon) Auto Gain Calibration Calibrate Acquiring (Kalibrasyon Elde edilmesi) ve Perform Calibration (Perform Kalibrasyon) (Optimizasyon) 1. devralmadan önce seçin. Fam/Sybr ve Joe kanalı için Min Okuma 5, Max Okuma 10 görünür. Tüp pozisyon kolonunda Rotor-Gene 2000/3000 karuselinde tüp pozisyonunu programlayın.
ANALİZ SONUÇLARI cdna N1 amplifikasyon analizleri (Rotor-Gene 6000 için kanal Cycling A.Joe yada Cycling A.Yellow ) 1. Analysis basın ve sonra Quantitation Cycling A.Joe Show seçin. 2. Threshold otomatik seçeneğini kapatın. 3. Dynamic Tube, Slope Correct butonlarına basın. 4. More Setting penceresinde (Rotor-Gene 6000 için Outlier Removal ) NTC Threshold 10% a ayarlayın. 5. Threshold: 0,1 seçin. 6. Sonuç tablosunda (Quantitation Analisis) Ct değeri (Eşik döngüsü) görünür. 7. Joe kanalında Ct < 33 lı örnekler Avian A N1 alt tipi için pozitif olarak yorumlanır. 8. Joe kanalında Ct değeri olmayan örnekler Avian A N1 alt tipi için negatif yorumlanır. cdna H5 amplifikasyon analizleri (Cycling A.Fam kanal) 1. Analysis basın ve sonra Quantitation Cycling A.Joe Show seçin. 2. Threshold otomatik seçeneğini kapatın. 3. Dynamic Tube, Slope Correct butonlarına basın. 4. More Setting penceresinde (Rotor-Gene 6000 için Outlier Removal ) NTC Threshold 10% a ayarlayın. 5. Ct calculation menüsünde Threshold: 0,1 seçin. 6. Sonuç tablosunda (Quantitation Analisis) Ct değeri (Eşik döngüsü) görünür. 7. Fam kanalında Ct < 33 lı örnekler Avian A H5 alt tipi için pozitif olarak yorumlanır. 8. Fam kanalında Ct değeri olmayan örnekler Avian A H5 alt tipi için negatif yorumlanır. Örnekte Joe ve Fam kanalında sinyalin aynı anda tespiti Avian influenza H5N1 alt tipin varlığını veya Avian Influenza virüsün farklı tiplerinin eş zamanlı varlığını gösterir ve kendi yapısı haemoagglutinin 5 ve nöraminidaz 1 türlerinde bulunur. iq icycler aşağıdaki gibi programlayın: Ana menüde Define Protocols seçin ve Create a new protocol tıklayın. Aşağıdaki parametreleri ayarlayın: 95 C 5 dakika 10 döngü: 95 C 10 sn/54 C 25 sn/72 C 25 sn 35 döngü: 95 C 10 sn/54 C 25 sn (tespit)/72 C 25 sn Protocol File Name teks kutusunu çift tıklayın ve protokol için bir yeni isim girin. Save this protocol tıklayın. Örnek ve controller için plate oluşturmak için Edit Plate Setup seçin. Yeni pencerede Samples: Whole Plate loading tıklayın. Örnek içeren kuyular için Unknown, Negatif Kontrol için -Control ve Pozitif kontrol için +Control simgesi kullanın. Edit Plate Setup penceresinde Select and Load Fluorophores tıklayın ve Joe-530 ve FAM-490 seçin. Save this plate setup tıklayın. Pencerenin sol üst kısımda Plate Setup Filename alanını çift tıklayın ve plaka ayar dosyası için bir isim girin ve Save this plate setup tıklayın. Run with selected protocol tıklayın. Reaksiyon hacmi, 25 µl görünür. Select Well Factor Source pencerede ve «Experimental Plate seçin. Begin Run tıklayın. ANALİZ SONUÇLARI IC amplifikasyon analizleri (Joe kanal) Data Analysis modülün penceresinde PCR Quantification seçin ve Select a Reporter da JOE-530 simgesini ayarlayın. Threshold Cycle Calculation alanında Baseline Cycles yanında Auto Calculated ve Threshold Position yanında User Defined seçin. Recalculate Threshold Cycles tıklayın. Select Analysis Mode penceresinde PCR Baseline Subtracted Curve Fit seçildiğinden emin olun. Sonuç tablosunda Ct değeri görünür. Avian cdna amplifikasyon analizleri (Fam kanalı) Data Analysis modülün penceresinde PCR Quantification seçin ve Select a Reporter da Fam-490 simgesini ayarlayın. Threshold Cycle Calculation alanında Baseline Cycles yanında Auto Calculated ve Threshold Position yanında User Defined seçin. Recalculate Threshold Cycles tıklayın. Select Analysis Mode penceresinde PCR Baseline Subtracted Curve Fit seçildiğinden emin olun.
Sonuç tablosunda Ct değeri görünür. Fam kanalında Ct < 33 değerine sahip örnekler Avian A Virus için pozitif olarak yorumlanır. Fam kanalında Ct değeri olmayan örnekler Avian A Virus için negatif olarak yorumlanır. Eğer Joe kanalında (Internal Kontrol) örneğin Ct değeri 33 den daha yüksekse, örneğin tekrar test edilmesi gerekir. AVIAN INFLUENZA A VIRUS ÖRNEKLER İÇİN POZİTİF H5N1 GENOTİPLEME Real Time Amplifikasyon (Genotipleme kit): 1. Örnekler ve kontroller için gerekli miktarda PCR-mix-1-H5N1 tüpleri hazırlayın. 2. Her bir tüpe 7 μl PCR-mix-2 Flu ekleyin. 3. Uygun tüplere cdna samples den 10 µl örnek ekleyin. 4. Her bir panel için 3 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Negatif Kontrol işaretli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; H5 pos işaretli tüpe 10 µl Positive Control cdna H5 C+ ekleyin; N1 pos işaretli tüpe 10 µl Positive Control cdna N1 C+ ekleyin. Aşağıdaki gibi iq icycler programlayın: 95 C 5 dk 10 döngü: 95 C 10 sn/54 C 25 sn/72 C 25 sn 35 döngü: 95 C 10 sn/54 C 25 sn (tespit)/72 C 25 sn ANALİZ SONUÇLARI cdna N1 amplifikasyon analizleri (kanal Joe) 1. Data Analysis modülün penceresinde PCR Quantification seçin ve Select a Reporter da JOE-530 simgesini ayarlayın. 2. Threshold Cycle Calculation alanında Baseline Cycles yanında Auto Calculated ve Threshold Position yanında User Defined seçin. Recalculate Threshold Cycles tıklayın. Select Analysis Mode penceresinde PCR Baseline Subtracted Curve Fit seçildiğinden emin olun. 3. Sonuç tablosunda Ct değeri görünür. 4. Joe kanalında Ct < 33 değerine sahip örnekler Avian A N1alt tip için pozitif olarak yorumlanır. 5. Joe kanalında Ct değeri olmayan örnekler Avian A N1 alt tip için negatif olarak yorumlanır. cdna H5 amplifikasyon analizleri (kanal Fam) 1. Data Analysis modülün penceresinde PCR Quantification seçin ve Select a Reporter da Fam-490 simgesini ayarlayın. 2. Threshold Cycle Calculation alanında Baseline Cycles yanında Auto Calculated ve Threshold Position yanında User Defined seçin. Recalculate Threshold Cycles tıklayın. Select Analysis Mode penceresinde PCR Baseline Subtracted Curve Fit seçildiğinden emin olun. 3. Sonuç tablosunda Ct değeri görünür. 4. Fam kanalında Ct < 33 değerine sahip örnekler Avian A H5 alt tip için pozitif olarak yorumlanır. 5. Fam kanalında Ct değeri olmayan örnekler Avian A H5 alt tip için negatif olarak yorumlanır. Örnekte Joe ve Fam kanalında sinyalin aynı anda tespiti Avian influenza H5N1 alt tipin varlığını veya Avian Influenza virüsün farklı tiplerinin eş zamanlı varlığını gösterir ve kendi yapısı haemoagglutinin 5 ve nöraminidaz 1 türlerinde bulunur.
Klinik örneklerde Avian influenza A virus RNA ın kalitatif tespiti ve H5N1 alt tipi için pozitif örneğin genotiplemesi Avian A FAM IC JOE Avian H5 FAM Avian А N1 JOE PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Analitik özgüllük Primerler ve probların analitik özgüllüğünü negatif numuneler ile doğrulanmıştır. Bu numuneler spesifik Avian H5N1 primerler ve problar ile sinyal vermezler. Kit Avian A Screening & H5N1Typing FRT özgüllüğü 100% dir. Kit Avian A Screening & H5N1Typing FRT ın potansiyel çapraz-reaktivitesi kontrol grubuna karşı test edilmiştir. Diğer patojenler ile herhangi bir çapraz-reaktivite gözlenmedi. Analitik hassasiyet Kit Avian A Screening & H5N1Typing FRT, 2500 kopya/ ml den az olmayan bir %100 duyarlılıkla testlerin Avian H5N1 RNA tespitini sağlar. Tespit, negatif numuneler ile kontrol standardını ve dilüsyonlarını gerçekleştirir. Hedef bölge: A-matrix, Ha5, N1 Sacace Biotechnologies Srl 18 San Carlo str., 81100 Caserta, Italy *PCR: The Polymerase Chain Reaction (PCR) process is covered by patents owned by Hoffmann-La Roche and applicable in certain countries. Sacace does not encourage or support the unauthorized or unlicensed use of the PCR process. Use of this kit is recommended for persons that either have a license to perform PCR or are not required to obtain a license