KULLANICI KILAVUZU Kod Genequality AZF M EKSTANSİYON Kod Kod. 04-24A Kod. 04-24R AZF lokus da mikrodelesyonların ekstansiyon tespiti için kit Compliant to the European Guidelines EAA/EQMN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions. State of the art 2004 Simoni M., Bakker E., Krausz C. Int. J. Andrology, 2004, 27: 240-249.
1 ÜRÜN BİLGİSİ 1 1.1 Kullanım Amacı 2 KİT İÇERİĞİ 2 3 REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTES 4 4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 4 5 GÜVENLİK KURALLARI 5 5.1 Genel Güvenlik Kuralları 5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları 6 GEREKLİ OLAN, KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN MALZEMELER 6 6.1 Reaktifler 6.2 Cihazlar 6.3. Materyaller 7 REAKTİF HAZIRLAMA 7 8 GİRİŞ 7 9 TEST PRENSİBİ 8 10 ÜRÜN TANIMI 8 11 ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ 10 12 PROSEDÜR 10 12.1. DNA Ekstraksiyon 12.2 DNA Amplifikasyon 12.3 Amplifikasyon Ürünlerinin Görüntülenmesi 12.3.1Yüksek Resolüsyon agaroze jel elektroforezi
12.3.2 Örnek yükleme 13 SONUÇLARIN YORUMLANMASI 13 14 SORUN GİDERME 15 15 CİHAZ LİMİTLERİ 16 16 CİHAZ PERFORMANSLARI 16 16.1 Analitik Özgünlük 16.2 Diagnostik Özgünlük 16.3 Diagnostik duyarlılık 16.4 Doğruluk 17 REFERANSLAR 17
1 ÜRÜN BİLGİSİ 1.1 Kullanım Amacı AZF ETENSION kit, erkek infertilitesine neden olan AZF lokusta mikrodelesyonların ekstansiyon tespiti için bir IVD dir. Aşağıdaki ürünler için mevcut olan manuele bakın: AZF-M EKSTANSİYON Agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme ve amplifikasyon için gerekli tüm reaktifleri içerir. Kod Ürün Format 04-24A-12 AZF-M ETANSİYON 12 test 04-24A-24 AZF-M ETANSİYON 24 test AZF-M ETENSION- amplifikasyon reaktifleri Amplifikasyon için gerekli tüm reaktifleri içerir. Kod Ürün Format 04-24R-12 AZF-M ETANSİYON 12 test 04-24R-24 AZF-M ETANSİYON 24 test Sayfa.1
2 KİT İÇERİĞİ Dikkat: Kit içeriğinde farklı kodlarda farklı komponentler bulunur. (kısaltma: = kit içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent) KUTU P 30 / 20 C DE SAKLANIR kod. 04-24A kod. 04-24R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YADA KAPAK RENGİ 12 test 24 test AZFa-MI1 için tek-doz premikslenmiş tüpler. Renksiz (T) 2 4 AZFa-MI2 için tek-doz premikslenmiş tüpler. Mavi (T) 2 4 AZFa-MI3 için tek-doz premikslenmiş tüpler. Sarı (T) 3 6 AZFa-MI4 için tek-doz premikslenmiş tüpler. Turuncu (T) 3 6 AZFa-MI5 için tek-doz premikslenmiş tüpler. Yeşil (T) 7 14 AZFa-MI6 için tek-doz premikslenmiş tüpler. Kırmızı (T) 7 14 Termostable Hot start Taq DNA polimeraz Süper AB Taq 5 U/μL Kırmızı 25 μl 50 μl KÜÇÜK ÇANTA -30 o C/ 20 C DE SAKLANIR kod. 04-24A kod. 04-24R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YADA KAPAK RENGİ 12 test 24 test Referans DNA (delesyon olmayan bir erkekten alınan) Referans DNA (delesyon olmayan erkek) Mavi 1 20 μl 1 40 μl Sayfa.2
KUTU F +2 / +8 C DE SAKLANIR kod. 04-24A kod. 04-24R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YADA KAPAK RENGİ 12 test 24 test 0 0 0 Elektroforez yükleme buffer (6 solüsyon) Etidyum Bromür solüsyonu (2,5 mg/ml) DNA Moleküler Ağırlık Marker Bromofenol mavi Etidyum Bromür TOIC R 23 68 S 36/37 45 Mavi 200 μl 350μL Kırmızı 100 μl 200 μl MW Marker Sarı 100 μl 200 μl KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR kod. 04-24A kod. 04-24R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YADA KAPAK RENGİ 12 test 24 test 0 0 Yüksek resolüsyon agaroz moleküler biyoloji aşaması HR AGAROZ 110 g 120 g Elektroforez buffer TRIS-Asetat -EDTA ph 8.0 50 TAE 140 ml 170 ml Sayfa.3
3 REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTESİ Kitin her bir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara göre saklanmalıdır. Özellikle: P kutusu -30 /-20 C de saklanır Küçük Paket -30 /-20 C de saklanır F kutusu +2/+8 C de saklanır A kutusu +15/+25 C de saklanır Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. 4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve deneyimli araştırmacı tarafından ve sadece IVD olarak kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da yöntem uygulaması ile ilgili her hangi bir şüpheniz olduğunda, kit kullanmadan önce AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it ; Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli-uç kullanın; Biyolojik örnekler, saflaştırılmış DNA, kit içeriğindeki referans DNA ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Ekstrakte edilmiş DNA kısa bir zaman için +2 / +8 C de saklanmalı veya uzun bir zaman için -30 / -20 C de dondurulmalıdır. Kullanmadan önce PCR premiksi oda ısısında eritin; Taq DNA polymerase ekleyin ve oda ısısında ya da buz kabında oldukça hızlı DNA purifiye edin. Sayfa.4
5 GÜVENLİK KURALLARI 5.1 Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik yöntem enfektif faktörlerin yok olduğunu garanti etmez. Tüm klinik örnekleri potansiyel enfeksiyonu ajanı olarak kabul edip o şekilde kullanmak gerekir; Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 hacim %5 Sodyum Hipoklorit solüsyonu her bir 10 hacim kontaminasyonlu sıvı için) solüsyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solüsyonları otoklavlamayın!!) 5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: ETİDYUM BROMÜR (04-24A içerir) 3,8-diamin-1-etil-6-fenilfenantridyumbromür (Etidyum Bromür) <2% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. Sayfa.5
R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Etidyum Bromür için, agaroz jelde dilüsyona kadar. Konsantre Etidyum Bromür uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Etidyum solüsyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları takip edin. Etidyum Bromür kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin. Kitin materyal güvenlik bilgi formu (MSDS) istendiğinde elde edilebilir. 6 KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 6.1 Reaktifler DNA ekstraksiyonu için reaktifler; Steril DNase ve RNase serbest su; Distile su; Agaroz jel elektroforezi için reaktifler (Kod. 04-24R için gerekli). 6.2 Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNA eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 μl; 0,5-10 μl; 2-20 μl; 20-100 μl; 100-1000 μl); Thermalcycler; Termoblok veya termal banyo; Mikrosantrifüj (max 12-14.000 rpm); Tartı; Vorteks; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Kimyasal kabin (Etidyum Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi; Güç kaynağı (50-150 V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör. 6.3 Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 μl; 0,5-10 μl; 2-20 μl; 20-100 μl; 100-1000 μl); TAE dilusyonu için dereceli silindirler (1L); Agaroz jel hazırlamak için pireks şişe ya da Beher; Parafilm. Sayfa.6
Mikrotüpler (1,5 2,0 ml). 7 REAKTİFLERİ HAZIRLAMA 1 L 1TAE Buffer hazırlamak için: 20 ml 50 TAE ile 980 ml distile suyu karıştırın. 8 GİRİŞ Y kromozomunun uzun kolunda mikodelesyonların analizi infertil bireyler için önemli bir teşhis aracı haline gelmiştir: halen, Y kromozomunun mikrodelesyon taraması tıp merkezlerinde androloji ve üreme birimleri tarafından yapılır. Ayrıca, ICSI in hızlı büyümesi kişinin çocuğuna geçecek olası genetik nedenlerin araştırılmasına katkıda bulunmuştur. Aslında, Y kromozom mikrodelesyonlu hastalar ICSI için en önemli adaylardandır, çünkü TESE (TEstiküler sperm ekstraksiyon) tarafından kullanılabilen testislerin içindeki spermatoz varlığı ile şiddetli oligozoospermi veya azoospermiye sahiptir. Bu hastalarda mikrodelesyon sıklığı % 10-15 civarında olduğu tahmin ediliyor (Foresta et al., 2000a; Hargreave, 1999; Ma et al., 2000). Mikrodelesyonlar bir veya birden fazla AZF adlandırılmış bölgeleri kapsar: mikrodelesyon vakalarının %14 daha büyük ve fazla AZF bölgeleri içeriyorken AZFc bölgesinde % 60, AZFb bölgesinde % 16 ve AZFa bölgede % 5 dir. Mikrodelesyon vakalarının % 5 i AZF bölgeleri dışında yer alır. Delesyonun ektensiyon tespiti klinik olarak önemli görünür. Tüm AZFa lokusun delesyonlu hastaları her zaman Sertoli-cell-only (SCO) sendromlu azospermiktir, sonuç olarak ICSI için hastadan testiküler sperm toplamak imkansızdır. (Vogt et al., 1996; Krausz et al., 2000; Kamp et al., 2000; Hopps et al., 2003). Bunun yerine, gen-spesifik AFZa delesyonları ile ilişkili fenotip değiştirilebilir. DBY yokluğunu hem hipospermatogenez (Sun et al., 1999; Foresta et al., 2000b), hem de Sertoli-cell-only (SCO) sendromuna neden oluyorken, delesyonlar ve USP9Y nokta mutasyonları şiddetli hipospermatogenez gene neden olur (Foresta et al., 2000b). AZFb ve AZFb+c lokusun komplet delesyonları histolojik SCO ve azoospermide sonuçlanan arest spermatogenetik tarafından karakterizedir. Çeşitli çalışmalar AZFa komple delesyonlu hastalarda olan benzerlikleri göstermiştir, ICSI tekniği için bu hastadan alınan testiküler spermi elde etmek mümkün değildir (Krausz et al., 2000; Hopps et al., 2003). AZFb de kısmi delesyonlar yerine,ancak nadiren orta oligozoospermia ile ilişkilendirilebilir (Pryor et al., 1997; van der Ven et al., 1998; Krausz et al., 1999a). AZFc bölgenin delesyonları değişken histolojik ve klinik fenotip ile ilişkilidir (Reijo et al., 1996; Oates et al., 2002). Genel olarak, AZFc lokus delesyonları azoospermia veya şiddetli oligospermi sahip erkeklerde bulunmuştur ve nadir durumlarda bile iletilebilir (Kühnert et al., 2004). AZFc delesyonlu azoospermik hastalarda, ICSI için testikular sperm elde etmenin makul bir olasılığı vardır. (Kent-First et al., 1996; Mulhall et al., 1997; Kamischke et al., 1999; Cram et al., 2000; van Golde et al., 2001; Oates et al., 2002; Peterlin et al., 2002). Bu hastaların çocukları doğal olarak aynı delesyonları alacaktır. Sayfa.7
9 TEST PRENSİBİ PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu metodudur (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Termo-stable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polimeraz primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solüsyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli döngülerden sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuvar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Multipleks amplifikasyon seçilen bir primer karışımı olan aynı reaksiyonda farklı DNA dizilerinin eş zamanlı amplifikasyonunu sağlar. 10 ÜRÜN TANIMI AZF lokusta (AZF-M kod 04-23) delesyonların yokluğu veya varlığını tespit etmek için kullanılan ilk seviye analizi sonrası, Avrupa Kılavuzu tarafından gösterilen her AZF lokusun proksimal veya distal bölgesi yanında lokalize olmuş STS amplifikasyonu tarafından önceden belirlenen ekstansiyonu tespit etmek mümükündür (Simoni et al., 1999; Simoni et al., 2004). Özellikle, uygulanan strateji gözlenen bölge için bazı spesifik markörların amplifikasyonunu önceden görmektedir. Amplifiye bölgeler şunlardır: AZFa: sy82 (+), sy83 (-/+), (proximal) // (distal) sy87 (-),12f2(-/+),sY88(+) AZFb: sy105 (+), Y6BaH34 (-)(proximal) // (distal) sy143 (-), sy152 (+) AZFc: sy1197 (+), sy1192 (-)(proximal) // (distal) sy1206 (-), sy1125 (+) Yq12 (heterokromatik bölge, AZFc a distal): sy160 (+) Sayfa.8
Amplifiye edilmiş markörler 1999 ve 2004 yıllarında Simoni ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada açıklananlar ile örtüşür. AZFa bölgesi ile ilgili olarak, 12f2 işaretleyici ID1 konformasyonuna sahip markördan gelen ID2 konformasyonuna sahip bir delesyonu ayırt etmeyi sağlamak için eklendi (Kamp et al, 2001). AZFb bölgesi ile ilgili olarak sy114, amplifikasyon ürünün farklı boyutlarından yararlanarak aynı gen lokusun (DYS206) bir parçasını oluşturan Y6BaH34 markırı ile yer değiştirir. Tüm AZFc bölgesinin yokluğu, AZF-M (04-23) tarafından STS sy254 ve sy255 amplifikasyon ürünlerinin eksikliğini tespit eder (Simoni et al., 2004). AZF ETENSION kiti, en çok bu bölgede bulunan b2/b4 tipi delesyonun tespitini sağlar (Ferlin et al, 2005). Bu delesyon b2 ve b4 olarak adlandırılan iki benzer dizi arasında rekombinasyon ile oluşur ve bu iki dizisi arasındaki tüm bölgenin kaybını tespit eder. İnternal kontrol (ZF / ZFY gen) amplifikasyonu ekstra edilmiş DNA nın miktarını sağlar, aynı zamanda, amplifikasyon inhibitörlerinin yokluğu doğrular ve bu doğrulama yanlış pozitif sonuçları önler. Kit, delesyon olmayan erkekten alınan referans DNA içerir. Referans DNA amplifikasyonu (tüm beklenen bantların varlığı ile) reaksiyonun doğru çalıştığını gösterir. Referans DNA insan kaynaklıdır ama operatör için tehlikeli değildir. Kiti premiks formatında: amplifikasyon için tüm reaktifleri önceden karıştırılmıştır ve tek doz tüplerde eşit miktarda bulunan örnek Taq polimeraz ve ekstrate DNA ya eklenir. Bu premiks format pre-amplifikasyon adımlarında manipülasyon azaltmayı verir, reaktiflerin (bu ürünlerin performansını değiştirebilir) tekrarlanan donma/çözdürmesinden Sayfa.9
kaçınılır ve her şeyden önce, bu form örnek kontaminasyon riskini aza indirir ve yanlış pozitif sonuçlar elde etmek için bir risk oluşturur. Yine de, her zaman uygun amplifikasyon kontrol kullanmanız önerilir. Üç AZF lokusda delesyon frekansı farklı olduğu için (AZFc bölgesinde 60%, AZFb bölgesinde %16 ve AZFa bölgede% 5) kit premikslerin aşağıdaki sayılarını içerir: 04-24-12 (12 TEST) 04-24-24 (24 TEST) AZFa Premix 2 4 AZFb Premix 3 6 AZFc Premix 7 14 AZF-M (04-23) testi ile örneğin analizden elde edilen sonuçlara dayalı olan araştırmanın doğru lokusunu belirlemek kullanıcının sorumluluğundadır. 11 ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, MANİPULASYON VE ÖN HAZIRLIKLARI Y kromozom mikrodelesyonların analizi için prosedür tam kan numunelerinin toplanması ile başlar. Numune toplamak için tüm steril önlemler takip etmelidir. Kan EDTA ile işlenmelidir. Diğer pıhtılaştırma ajanları, heparin gibi Taq polimeraz ın güçlü inhibitörleridir ve bundan dolayı amplifikasyon reaksiyonunun verimliliğini değiştirebilir. Taze kan kısa bir zaman için +2 / +8 C de saklanmalıdır; eğer DNA ekstraksiyonu kısa bir zamanda yapılamazsa, numunenin dondurulması gereklidir. AZF-M ETENSION (04-24) ile analiz olan örnek AZF-M (04-23) test ile zaten silinmiş sonuçlara ulaşır. 12 PROSEDÜR 12.1 DNA ekstraksiyonu Herhangi bir DNA ekstraksiyon yöntemi kullanılabilir ve ayrıca saf ve integral DNA nın ekstraksiyonunu sağlar. Ekstre edilmiş DNA nın spektrofotometrik ölçümü ile miktarı belirlenmelidir. Her multipleks amplifikasyonda kullanmak için DNA nın miktarı 100 ng eşittir, bu nedenle, saflaştırılmış DNA solüsyonu 10 μl ye eşit her primeks tüpünde saflaştırılmış DNA için mevcut olan hacim ile dilüe edilmelidir. Bu ard arda bir analiz olduğu için, kullanılan DNA genellikle zaten önceki test için ekstre edilmiş olmalıdır. Ekstrate nükleik asit eğer maksimum 1 yılda 20 C de saklanırsa, integral olarak kalır. Yöntemin uygulanmasında oluşacak herhangi bir sorun için, AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçebilirsiniz: laboratorio@abanalitica.it. Sayfa.10
12.2 DNA AMPLİFİKASYONU Kullanıcı kullanım için seçebilir: Eğer AZFa bölgesinde bir delesyon bulunursa, miks 1 ve 2; Eğer AZFb bölgesinde bir delesyon bulunursa, miks 3 ve 4; Eğer AZFc bölgesinde bir delesyon bulunursa, miks 5 ve 6; Her numune için, iki premiks edilmiş tüpüne her birini ekleyin: Süper AB Taq 0,2 µl DNA 100ng H 2 O 10 µl getir V FİNAL 50 µl DİKKAT: Eğer termocycler gerekli ise, her premikse 2 damla minarel yağ (dahil değildir) ekleyin. Farklı işaretlerin tüm bantlarını gösterecek olan referans DNA yı (delesyon olmayan bir erkeğin DNA sı) ve kontaminasyonu (ekstrakte DNA yerine karışıma distile su ekleyin) izlemek için her deneyde bir negatif kontrolün dahil edilmesi önemlidir. Mikrotüpleri aşağıdaki programda termalcyclera koyun: 1 döngü 94 C 5 dk 35 döngü 94 C 58 C 72 C 1 dk 1 dk 1 dk 1 döngü 72 C 7 dk Depolama 4 C Tablo 1: Multipleks Amplifikasyondan amplifikasyon ürünlerinin uzunluğu Sayfa.11
12.3 AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ 12.3.1 HR agaroz jel elektroforezi Restriksiyondan elde edilen bantları görüntülemek için, %3 yüksek resolüsyon agaroz jel hazırlamak gereklidir. Büyük kuyuları oluşturabilen dişli bir tarak kullanılması önerilir (40-50 μl). 1,5 g HR agaroz tartın ve 50 ml 1 TAE içine ekleyin. Agaroz jelin bu türü hazırlandığında özellikle dikkat edilmelidir: HR agaroz toz tartın ve soğuk TAE (not prewarmed!) içinde çözün, sonra her pıhtı çözünene kadar karıştırın. Solüsyonu sadece bu noktada magnetik karıştırıcı üzerine ya da mikrodalga içine koyun. Isınma adımda kısa süre sonra solüsyonu alarak solüsyonu kaynatmaktan kaçının, sonra solüsyon berraklaşana kadar tekrar ısıtıcı üzerine koyun. Agoraz solüsyonu bir kaç dakika boyunca soğuyana kadar bekletin ve sonra 2.5 mg/ml Etidyum Bromür solüsyonundan 10 μl ekleyin. DİKKAT! Etidyum Bromür güçlü bir mutajenik ajandır: Daima eldiven kullanın ve bu reaktifle ya da içeren jel ile çalışırken tercihen kimyasal güvenlik kabini altında çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jeli katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Sayfa.12
Jel katılaştığında tarakları dikkatlice alın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin) ve trayi elektroforez tankına geçirin. Jeli tamamen kaplayacak şekilde (jel yüzeyinin 1-2 mm üzerinde) uygun miktarda 1 TAE buffer dökün. 12. 3.2 Örnek yükleme Amplifikasyon ürünlerin görüntülenmesi için, test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: ve 2 µl 6 Mavi* 10 µl Her multipleks PCR ın Ampifikasyon ürünü 2 µl 6 Mavi* 10 µl DNA Moleküler Ağırlık Markır * Jel kuyularına karışımı yükleyin: güç kaynağını açın ve 80-90 V arasında voltajı ayarlayın. Yaklaşık 2 saat boyunca jeli çalışın, sonra jeli UV transilluminatör üzerine koyun ve referans Moleküler Ağırlık Markır lı amplifikasyon ürünlerinin boyutlarını karşılaştırarak sonuçları analiz edin. *= 6 Blue ve DNA Moleküler Ağırlık Markör kod. 04-24A içinde bulunur; Başka bir yükleme buffer ya da Moleküler Ağırlık Markör kullanıldığında üretici bilgilerini takip edin. * DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW Markör, 04-24A içerir): 501-489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34x2, 26 bp. (NOT: 3% agaroz jelde 501-489 bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları 3% agaroz jelde bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın. 13 SONUÇLARIN YORUMLANMASI Kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir: KONTROL SONUÇ YORUM referans DNA Beklenen tüm bantların varlığı Multipleks PCR amplifikasyon doğru çalışır. Negatif kontrol Bantların yokluğu Kontaminasyon yokluğu Sayfa.13
Sonra, agaroz jelde bantların yorumlanması için aşağıdaki tabloya bakın (Tablo 1, sayfa 19 bakın): SONUÇ ZF/ZFY bandın yokluğu Biraz veya bütün markörlerin yokluğu YORUM Örnek amplifikasyon için uygun değildir AZFa SONUÇ ZF/ZFY bandın varlığı SY82, SY 88, ve 12f2 bantlarının varlığı SY83 ve SY87 bantlarının varlığı ZF/ZFY bandın varlığı SY82, SY 88, ve SY83 bantlarının varlığı 12f2 ve SY87 bantlarının varlığı YORUM Bir ID1 konformasyonunda tüm AZFa bölge ile amplifibe olabilen örnek delesyonu Bir ID2 konformasyonunda tüm AZFa bölge ile amplifibe olabilen örnek delesyonu AZFb SONUÇ ZF/ZFY bandın varlığı SY105 ve SY152 bantlarının varlığı SY143 ve Y6BaH34 bantlarının varlığı YORUM Tüm AZFb bölge ile amplifibe olabilen örnek delesyonu AZFc SONUÇ ZF/ZFY bandın varlığı SY1125, sy 1197, ve SY160 bantlarının varlığı SY1192 ve SY1106 bantlarının varlığı YORUM Tüm AZFc bölge ile amplifibe olabilen örnek delesyonu (tip b2/b4) SONUÇ ZF/ZFY bandın varlığı Araştırılan tüm markörlerin varlığı YORUM İnceleme bölgesinde kısmi delesyon ile Amplifibe olabilen örnek Eğer örnek sonuçları amplifiye değilse (ZF/ZFY gen ile ilgili bandın yokluğu bildirildi), analiz tekrar edilmelidir. Sayfa.14
Şekil 2. Altı Multiplex Amplifikasyonun 3% Nusieve agaroz jel elektroforezi 14 SORUN GİDERME Amplifikasyon ürünü ya da pozitif kontrol DNA bandı yoksa TAQ polymerase premikse doğru eklenememiştir - Uygun hacimde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); -Görsel olarak TAQ polimerazın premiksi difüze olduğunu gözleyin: Bu basittir, çünkü enzim, yüksek bir yoğunluğa sahip olan gliserolde çözülür; - Alternatif olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polimerazı görsel olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır. - Thermalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini kontrol edin ve doğru program ile amplifikasyon adımlarını tekrar edin. Kit uygun şekilde çalışmaz. - Premiks, enzim ve referans DNAyı 30 / 20 C de saklayın; - Premiks ve reaktifleri tekrar dondurup/çözdürmekten kaçının. Amplifikasyon bandı (ya da sadece bazı markırlar için) ZF/ZFY bandın yokluğunda yoktur fakat referans DNA için iyi bir bant vardır. Ekstraksiyon adımı sırasında olası problemler: -Ekstraksiyon kitinin yeterli olup olmadığından emin olun ve bütün kılavuzu doğru şekilde takip edin. -Ekstraksiyon kitinin kullanıcı kılavuzu bölümünde giderme bakın. -Yeni bir örnekten alınan DNA ekstaraksiyonu tekrar edin. Sayfa.15
Amplifikasyon inhibe oldu. -Elde edilen DNA solüsyonu saf değildir (Ekstrate DNA için A260/A 280 oranı düşüktür). İzlenen ekstraksiyon protokolünü doğru şekilde yapılıp yapılmadığını kontrol edin ve yeni bir örnekten başlayarak ekstraksiyonu tekrar edin; -Elde edilen DNA solüsyonunda kalan RNA bulunur(ekstrate DNA için A260/A 280 oranı çok yüksektir). RNAase ile sindirim adımında elimine edilir. Her hangi bir sorun için, AB ANALITICA teknik destek ile temasa geçebilirsiniz: e-mail: laboratorio@abanalitica.it, fax (+39) 049-8709510, ya da tel. (+39) 049-761698. 15 CİHAZ SINIRLARI Eğer klinik örnek bu analiz için uygun değilse, kit performansını azalabilir (kan örneği doğru şekilde saklanmamış veya anti-koagülant olarak heparin ile işlenmemiş ya da tekrar dondurulup/çözündürülmüş). 16 TEST PERFORMANSI 16.1 Analitik Özgünlük AZF-M Extension kitin analitik özgünlüğü primerlerin doğru seçimi ile garanti altındadır. İnsan genomik DNA nın diğer bölgeleri ile çapraz reaktivite belirginliği yoktur. Analitik özgüllüğü, aspecific amplifikasyonun olasılığını azaltan bir Hot start enzimi ile ve bağlayıcı amplifikasyon koşullarının kullanımı ile de garanti altına alınmıştır. 16.2 Diagnostik Özgünlük Diagnostik özgünlük, daha önce AZF-M (04-23) kitte delesyon bulunmayan seçilmiş örneklerin bir setinin analizi tarafından AZF-M Extension kitle hesaplandı. Elde edilen sonuçlar % 100 diagnostik özgünlüğü göstermiştir. 16.3 Diagnostik Duyarlılık Diagnostik duyarlılığı, araştırma altında AZF lokusa referansla silinmiş örnekleri doğru şekilde tanımlamak için cihazın kapasitesi olarak kabul edilir. Deneysel bir araştırmadan elde edilen sonuçlar gösteriyor ki sistemin diagnostik duyarlılığı %100'dür. 16.4 Doğruluk Doğruluk, yapılmış amplifikasyon toplam sayısı üzerinden doğru amplifikasyon sayısı olarak hesaplanır. Cihaz GENEQUALITY AZF-M Extension % 100 doğruluk gösterdi. Sayfa.16
17 REFERANSLAR Simoni M., Bakker E., Eurlings M. C. M., Matthijs G., Moro E., Muller C. R. Et Vogt P. H., Intern, Journal. of Andrology, 22:292-299, 1999. Simoni M., Bakker E., Krausz C., International Journal of Andrology, 27: 240-249, 2004. Vogt P.H., Edelmann A., Kirsch S.; Hum. Mol. Genet., 5:933-943, 1996 Cram, Ma, Bhasin, Ariasc, Pandjaitanc, Chu, Audrins, Saunders, Quinn et al. Fertil steril; Vol 74, pp. 909-915; 2000; Foresta, Ferlin, Moro, et al. Y chromosome. Lancet, 355, pp. 234-235; 2000. Foresta, Ferlin, Moro; Hum. Mol. Genet., 9, pp.1161-1169; 2000b. Hargreave; Understanding the Y chromosome; Lancet, Vol. 354; pp.: 1746-1747; 1999. Hopps, A Mielnik, M. Goldstein, G.D. Palermo, Z. Rosenwaks, P.N. Schlegel; Human Reproduction, Vol.18; No.8; pp.1660-1665, 2003; Kamischke, Gromoll, Simoni, Behre, Nieschlag; Hum Reprod.; Vol. 14; pp.2320-2322; 1999; Kamp et al., Human Mol Genet 9, 2563-2572, 2000 Kamp et al., Human Hum Reprod 7(10), 987-984,2001 Kent-First, Kol, Muallem, Ofir, Manor, Blazer, First et al.; Mol Hum Reprod; Vol. 2,pp.943-950, 1996; Krausz ; K. McElreavey, Bishop CE; The genetic basis of male infertilità; Berlin: Sprinter.Verlag;pp.211-232; 1999. Krausz, L. Quintana-Murci, K. McElreavey; Human Reproduction, vol. 15, No 7, pp. 1431-1434, 2000; Kühnert, KuÈhnert, Gromoll, Kostova, Tschanter, Luetjens, Simoni and E.Nieschlag*; Hum Reprod; Vol.19, No.4 pp. 886-888, 2004 Ma, Mallidis, Bhasin; Eur. J. Endocrinol, Vol.142, pp:418-430; 2000. Mulhall, Reijo, Alagappan, et al.; Hum. Reprod., Vol 12, pp.503 508; 1997; Oates, Silber, Brown, Page; Hum. Reprod; Vol 17, pp. 2813-2824, 2002; Peterlin, Kunej, Sinkovec, Gligorievska, Zorn; Hum. Reprod., Vol. 17, No. 1, 17-24; 2002. Pryor; Kent First M.,; Muallem A. et Al.; N Engl J Med.;pp.336:534-539; 1997; Sayfa.17
Reijo, Alagappan, Patrizio et al.; Lancet 347, pp.:1290-1293; 1996; Repping Am.J.Hum.Genet.,71; 906-922,2002 Simoni M., Bakker E., Krausz C. EAA/EQMN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions. State of the art 2004 Int. J. Andrology, 2004, 27: 240-249 Simoni, M., Bakker, E., Eurlings, M.C.M. et al. Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions,. Int. J. Andrology. 1999, 22:292-299. Sun, Skaletsky, Birren, et al. Nature Genet., Vol.23, pp.429-432; 1999. Van der Ven, Montag, Peschka, et al.; Mol. Hum. Reprod., vol.3; pp. 699-704; 1997. Van Golde Wetzels, de Graaf,Tuerlings, Braat, Kremer; Hum. Reprod, 16,pp.289-292; 2001; Vogt P.H., et al. Hum. Mol. Genet.; Vol.5, No7, 1996; Sayfa.18
AB ANALITICA srl Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it